Summary
여기에서는 유사 바이러스 패키징 및 항체 중화 활성 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통의 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 독감 발병을 일으키고 있습니다. 때때로 인간도 희생되어 사망률이 높습니다. 그럼에도 불구하고 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실에서 처리되어야 한다는 점을 고려할 때 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 H5 HPAI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구임이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 유사바이러스 중화 분석의 절차와 중요한 단계를 설명합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다.
Introduction
1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 지속적인 독감 발병을 일으켜 전 세계 가금류 산업에서 막대한 사회경제적 손실을 초래했습니다. 때로는 인간도 감염되어 높은 치사율 1,2에 직면합니다. 그러나 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실 밖에서 처리 할 수 없기 때문에 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 생물안전성 레벨 2 실험실에서 실습할 수 있을 만큼 안전합니다.
H5 HPAI 슈도바이러스는 대리 바이러스 코어, 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질이 있는 지질 외피 및 리포터 유전자로 구성된 키메라 바이러스에 속합니다. 슈도바이러스 코어는 일반적으로 렌티바이러스 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)와 같은 레트로바이러스에서 파생됩니다.3. 특히, HIV-1 패키징 시스템은 인플루엔자 슈도바이러스를 생산하기 위해 널리 사용되며, 여기서 제공되는 주요 유전자는 gag 및 pol입니다. HIV gag 유전자는 핵심 단백질을 발현합니다. pol 유전자는 인테그라제 및 역전사효소를 발현하며, 둘 다 형질도입된 세포에서 리포터 유전자의 발현에 필요합니다. 대리 바이러스의 게놈을 모방한 리포터 유전자는 RNA 형태로 유사바이러스 코어에 흡수됩니다. 리포터 유전자는 숙주 세포에서 단백질을 발현합니다. 리포터 유전자의 유전자 발현 수준은 슈도바이러스 감염 효율을 측정하는데 사용될 수 있다 3,4. 1차 리포터는 형질도입된 세포에서 상대 발광 단위(RLU) 또는 상대 루시페라아제 활성(RLA)을 측정하기 위한 반딧불이 루시페라아제입니다. lacZ, Gaussia, Renilla luciferase 와 같은 다른 리포터들도 사용되지만 그 정도는 적습니다5.
슈도바이러스는 H5 HAPI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구입니다. 중화 항체 효능을 측정하기 위해, 슈도바이러스 중화(PN)분석법(6)이 사용된다. 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)는 인플루엔자 A 바이러스 7,8의 표면에 있는 당단백질입니다. HA는 수용체 결합을 위한 구형 헤드 도메인과 막 융합을 위한 줄기 도메인으로 구성됩니다. NA 단백질은 바이러스 방출을 촉진하는 시알리다아제 활성을 가지고 있습니다 7,8. PN 분석은 HA 단백질에 대한 중화 항체를 측정할 수 있습니다. HA의 머리 및 줄기 영역으로 향하는 중화 항체는 또한 바이러스 부착 및 진입 분석에 의해 검출될 수 있다. 야생형 바이러스에 비해 유사 바이러스 중화 실험은 검출 값이 더 민감하고 레벨 2 생물 안전 실험실에서 안전하게 처리 할 수 있으며 일반적으로 실제로 작동하기가 더 쉽습니다.
이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 PN 분석의 절차와 중요한 단계를 자세히 제시합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다. 본 연구에서는 H5N1 HPAI 바이러스의 A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) 균주를 예로 들어 설명하였다. 분석에 사용되는 면역 혈청을 얻기 위해, 이 프로토콜은 마우스를 면역화하기 위한 면역원으로서 TH 균주로부터 유래된 HA 단백질을 선택하였다.
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Protocol
모든 슈도바이러스 관련 실험 작업은 상하이 중국과학원 파스퇴르 연구소(IPS, CAS)에서 ABSL2 조건 하에서 수행되었습니다. 동물 실험은 IPS, CAS의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 동물 프로토콜을 기반으로 수행되었습니다.
1. Calcium-phosphate transfection을 사용한 유사바이러스 패키징
- 완전한 DMEM 배지에서 HEK293FT 세포(mL당 9 x 105)의 단일 세포 현탁액을 만듭니다(표 1). 단세포 현탁액 10 mL를 T75 플라스크에 넣고, 형질감염 전에 20 시간 동안 37°C, 5% 이산화탄소 (CO2) 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션한다.
알림: HEK293FT 낮은 통로(<20통로)를 권장합니다. 셀 단층이 80-90% 합류하는지 확인하십시오. - 형질감염 2시간 전에 배지를 클로로퀸(100μM)을 함유하는 완전한 신선한 배지 10mL로 교체합니다.
- 표 2 및 도 1에 나타낸 바와 같이 시약 및 플라스미드 DNA를 혼합한다: ddH2O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8.9, 2.5 MCaCl2, 및 2x HEPES 완충액. 부드럽게 위아래로 5회 피펫팅하고, 혼합물을 실온(RT)에서 20분 동안 배양한다.
- 혼합물을 세포 위의 배지로 옮기고 플라스크를 부드럽게 흔듭니다. 세포 배양기에서 세포를 15시간 동안 배양합니다.
- 배지를 15mL의 새로운 완전 DMEM 배지로 교체합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 65시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 배지의 색상은 밝은 주황색 또는 약간 노란색이며 세포의 최소 80%가 도립 광학 현미경에서 세포 변성 효과(CPE)를 보여야 합니다. - 상청액을 수확하고, 4°C에서 20분 동안 2095 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 수집하고, 분취하고, -80 °C에서 저장한다.
2. 인플루엔자 슈도바이러스의 HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현 검출
- 헤마글루티닌(HA) 분석법으로 HA 단백질 발현을 검출합니다.
- 50μL의 PBS를 96웰 둥근 바닥 플레이트의 컬럼 2-12, 행 A, B 및 C에 추가합니다.
참고: 행 A, B 및 C는 3개의 독립적인 복제 테스트에 속하며 열 12는 음성 대조군으로 사용됩니다. - 100μL의 슈도바이러스를 컬럼 1의 웰에 추가합니다. 컬럼 1에서 컬럼 2로 50μL를 옮기고, 위아래로 5회 피펫팅하여 잘 혼합하고, 마지막 컬럼 11까지 2배 희석을 수행하고, 컬럼 11에서 추가로 50μL를 버립니다.
- 0.5% 적혈구 50μL를 각 웰에 넣고 위아래로 부드럽게 두 번 피펫팅합니다. RT에서 30-60 분 동안 또는 음성 대조군의 적혈구가 우물 바닥에 규칙적인 반점을 형성 할 때까지 플레이트를 배양하십시오.
- 슈도바이러스의 HA 역가를 관찰하고 기록합니다.
참고: 슈도바이러스의 HA 단위는 적혈구의 100% 혈구 응집을 유발할 수 있는 바이러스의 가장 높은 희석 인자입니다.
- 50μL의 PBS를 96웰 둥근 바닥 플레이트의 컬럼 2-12, 행 A, B 및 C에 추가합니다.
- 웨스턴 블롯 분석에 의한 HA 및 NA 단백질 발현 검출.
참고: 모든 웨스턴 블롯 단계는 분자 복제 매뉴얼(4판 )에 따라 수행됩니다. - HIV-1 p24 ELISA 키트(Table of Materials)로 HIV-1 p24 단백질 발현을 검출한다.
- 용해 완충액 50μL를 450μL의 유사바이러스 샘플에 추가합니다. 철저히 섞는다.
- 세척 완충액 300 μL를 마이크로플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 거꾸로 쳐서 세척 버퍼를 완전히 제거합니다. 세탁을 5 번 반복하십시오.
- 200 μL의 표준물질과 시료를 각 웰에 개별적으로 추가합니다. 37°C에서 하룻밤 또는 2시간 동안 배양합니다.
- 플레이트의 내용물을 흡인하고 2.3.2 단계에 설명 된대로 플레이트를 세척하십시오.
참고: 기판 블랭크로 사용하기 위해 분석 플레이트의 한 웰을 비워 둡니다. - 각 웰에 p24 검출기 항체 200μL를 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 2.3.2 단계에 설명 된대로 플레이트를 흡인하고 세척하십시오.
- 스트렙타비딘-퍼옥시다제 작업 용액 100μL를 각 웰에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 2.3.2 단계에 설명 된대로 플레이트를 흡인하고 세척하십시오.
- 기판 블랭크 웰을 포함한 각 웰에 100μL의 substate 작업 용액을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
알림: 우물에서 파란색이 발생합니다. - 100 μL의 정지 완충액을 각 웰에 추가합니다.
알림: 파란색은 즉시 노란색으로 바뀝니다. - 450nm에서 15분 이내에 광학 밀도를 판독합니다. 슈도바이러스의 p24 역가를 기록합니다.
3. 슈도바이러스 적정
- 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 5 x 104 )을 만들고 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 및 40000 세포를 96웰 평평한 바닥 플레이트의 다른 웰에 추가합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
- -80°C 냉장고에서 슈도바이러스를 꺼내 얼음 위에서 해동한 후 슈도바이러스를 소용돌이친다.
- 96웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 6개의 HAU(6x HA 단위) 슈도바이러스를 추가하고 각 웰에 최대 120μL의 완전한 DMEM을 보충합니다.
- 혼합물을 위아래로 5번 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 혼합물 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 혼합물 100 μL를 96-웰 플레이트의 세포로 옮긴다. 바이러스 감염 후 48시간, 60시간 및 72시간 동안 세포 배양 접시를 다시 배양기에 넣습니다.
- 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 루시페라아제 분석(Table of Materials)을 수행합니다.
- 플레이트의 웰에서 매체를 조심스럽게 제거하십시오. 200 μL의 PBS로 세포를 헹구고 가능한 한 PBS를 제거합니다.
알림: 접시를 뒤집고 흡수성 종이에 거꾸로 두드려 상등액을 버립니다. 테스트 세포주가 바닥에 단단히 부착되지 않으면 배지 흡인을 조심스럽게 제거합니다. - 용해 완충액 50μL를 각 웰에 넣고 배양 플레이트를 여러 번 흔듭니다. 플레이트를 -80°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
알림: 1x 용해 버퍼 5개와 물 4개를 혼합하여 1x 용해 버퍼를 만듭니다. 사용하기 전에 1x 용해 버퍼를 RT로 평형화하십시오. 세포가 용해 완충액으로 완전히 덮이도록 플레이트를 흔듭니다. 단일 동결-해동 공정은 세포가 완전히 용해되도록 도울 수 있습니다. - 플레이트를 꺼내 RT에서 2시간 동안 평형을 이룹니다.
알림: 셀은 완전히 용해되어야 합니다. - 플레이트를 여러 번 부드럽게 흔들고 모든 세포 용해물을 불투명한 96웰 플레이트로 옮깁니다.
- 기질 50μL를 각 웰에 넣고 플레이트를 부드럽게 여러 번 흔든 다음 기질과 용해 완충액을 완전히 혼합합니다.
- 광도계를 사용하여 5분 이내에 생성된 빛을 측정합니다. 슈도바이러스의 루시페라아제 역가를 기록합니다.
참고: 적절한 기질이 첨가되면 루시페린이 루시페라아제 효소에 의해 옥시루시페린으로 전환되는 화학 반응을 통해 부산물로 빛이 방출됩니다. 생성되는 빛의 양은 루시페라아제 효소의 양에 비례합니다.
4. 면역 혈청 준비
참고: 면역 혈청은 세포 관련 실험에 사용되며 실험 작업은 무균 조건에서 수행되어야 합니다.
- 8주령의 암컷 BALB/c 마우스 12마리를 준비합니다. 마우스를 두 그룹으로 균등하게 나눕니다.
참고: 한 그룹은 DDV 그룹이었고 다른 그룹은 음성 대조군이었습니다. - DDV 그룹 면역화: 0주 및 3주에 A/Thailand/(KAN-1)/2004(TH) HA 단백질을 암호화하는 코돈 최적화 DNA 플라스미드 100μg으로 근육내 2회 프라이밍하고 6주차에 512 HAU TH 바이러스 유사 입자(VLP)로 복강내 1회 증폭합니다.
- 대조군 면역화: 0주 및 3주에 100μg의 빈 벡터 플라스미드 DNA로 근육내 2회 프라이밍하고 6주에 HIV-1 gag VLP로 복강내 1회 부스팅합니다.
- 마지막 예방 접종 후 2 주 후에 마우스 혈액을 수집합니다.
참고: 여기에서 마우스는 채혈 시 펜토바르비탈 나트륨(65mg/kg)으로 마취되었습니다. 턱밑 정맥으로부터 혈액을 채취한 후, 마우스를CO2로 즉시 안락사시켰다. - 혈액을 RT에서 2시간 동안 유지한 다음 밤새 4°C로 유지합니다. 4°C에서 10분 동안 900 x g 로 원심분리하고 상층액을 수집합니다. 혈청을 56°C에서 30분 동안 두어 비활성화합니다.
- 면역 혈청을 -80°C 냉장고에 보관하여 사용하십시오.
참고: 마우스 예방 접종의 주요 절차를 설명하는 순서도는 보충 그림 1 을 참조하십시오.
5. 슈도바이러스 중화(PN) 분석
- 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 5 x 104 )을 만들고 96웰 평면 바닥 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100μL를 추가합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
- -80°C 냉장고에서 슈도바이러스와 혈청을 꺼내 얼음 위에서 해동한 후 완전히 소용돌이칩니다.
- 완전한 배지에서 혈청을 20배 희석하고, 컬럼 2-10에서 96웰 둥근 바닥 플레이트의 웰에 완전한 DMEM 배지 100μL를 추가합니다.
- 희석된 혈청 200μL를 2열의 웰에 넣고 100μL를 2열에서 3열로 옮기고 혈청을 1:20, 1:40, 1:80 등으로 1:10240으로 연속적으로 2열에서 10열로 희석하고 100μL를 10열에서 버립니다.
- 100μL의 DMEM 완전 배지를 음성 대조군으로 컬럼 11의 웰에 추가합니다.
- 100 μL의 슈도바이러스를 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 5회 완전히 위아래로 피펫팅하고, 혼합물 플레이트를 37°C, 5%CO2 에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 혼합물 100μL를 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 96웰 세포 배양 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 플레이트를 다시 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 60시간 동안 넣었다.
- 인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다. 3.7-3.12단계에 설명된 대로 루시페라아제 분석을 수행합니다.
6. 슈도바이러스 부착 분석
- 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 4 x 104 개)을 만들고 96웰 평평한 바닥 플레이트의 각 웰에 100μL 세포 현탁액을 추가합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
- 4°C에서 하룻밤 동안 1% BSA를 함유하는 DMEM에서 혈청과 함께 슈도바이러스를 인큐베이션한다.
참고: 혼합물의 부피는 100μL입니다. - MDCK 세포를 1시간 동안 4°C에서 1% BSA를 함유하는 DMEM의 웰 당 100 μL로 차단하였다.
- 유사 바이러스 및 혈청 혼합물(100μL)을 MDCK 단층에 접종하고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 세포판을 1% BSA가 함유된 PBS로 4회 세척하여 결합되지 않은 바이러스를 제거합니다.
- RT에서 100μL의 루시페라아제 용해 완충액으로 30분 동안 세포를 용해합니다.
- 상술한 바와 같이 HIV-1 p24 ELISA 키트로 세포에 결합된 바이러스의 양을 정량화한다(섹션 2.3).
7. 바이러스 진입 평가
- 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 5 x 104 )을 만들고 96웰 평면 바닥 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100μL를 추가합니다. 분석 전에 세포를 37°C, 5%CO2 에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
- 슈도바이러스(100μL)를 4°C에서 6시간 동안 96웰 플레이트의 MDCK 단층에 접종합니다.
- 세포판을 1% BSA를 함유하는 PBS로 4회 세척하여 결합되지 않은 슈도바이러스를 제거한다.
- 1% BSA를 함유하는 DMEM에서 가짜 백신 접종 마우스에서 연속적으로 희석된 면역 혈청 또는 혈청 100μL를 단층에 추가하고 4°C에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.
- 세포 상층액을 제거하고, 세포 배양 접시를 1% BSA가 함유된 PBS로 4회 세척하였다.
- 신선한 DMEM을 세포에 첨가하고 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 60시간 동안 인큐베이션한다.
- 3.7-3.12 단계에 설명된 대로 세포의 상대적 루시페라아제 활성(RLA)을 측정합니다.
참고: RLA에 표시된 바이러스 항목은 혈청이 없을 때 얻은 판독값의 백분율로 표시되었으며 100%로 설정되었습니다.
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Representative Results
HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현 인플루엔자 슈도바이러스
바이러스 패키징 효율을 확인하기 위해, 인플루엔자 슈도바이러스 스톡을 먼저 HA 분석에 의해 검출하였다(도 2A). 인플루엔자 슈도바이러스의 밀리리터당 HA 단위는 643입니다(표 3). 웨스턴 블롯 분석 및 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현을 테스트했습니다. 이어서, HA 단위의 비율 및 슈도바이러스에 대한 gag p24의 양을 계산하였다. 웨스턴 블롯 분석의 결과는 HA0, HA1, HA2 및 NA 단백질의 4가지 단백질 유형이 있음을 보여주었습니다(보충 그림 2). 이는 인플루엔자 슈도바이러스의 외피 단백질이 야생형 바이러스의 외피 단백질과 유사함을 나타냅니다. HA와 Gag p24의 비율은 보고된 바와 같이 정상 범위 내에 있었다(표 3)9.
| 슈도바이러스 균주 | HAU/mL | 1.00E + 05pg/mL | HAU/1.00E+05pg의 비율* |
| P A/태국/(KAN-1)/2004 | 642.52 ± 30.26 | 4.20 ± 0.17 | 152.98 |
| *HA 단위의 비율과 유사바이러스에서 HIV-1 Gag p24의 양은 다음과 같이 계산되었습니다: HA 단위/Gag p24의 양. | |||
표 3: H5 유사바이러스의 정량화.
슈도바이러스 적정
기능성 바이러스 입자의 농도를 측정하기 위해 슈도바이러스의 상대적 루시페라아제 활성(RLA)을 검출하였다. RLA 판독값은 많은 변수에 따라 달라집니다. 형질도입된 세포 양이 RLA 판독값에 미치는 영향을 확인하기 위해 96웰 플레이트의 웰당 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 및 40000의 세포를 시딩했습니다(그림 2). 결과는 슈도바이러스의 RLA 판독값이 가장 높고 평균의 표준 오차가 5000개의 세포가 96웰 플레이트의 웰에 파종될 때 가장 낮다는 것을 보여주었습니다(그림 4A). 배양 시간의 영향을 확인하기 위해 바이러스 감염 후 48시간, 60시간 및 72시간에 RLA 판독값을 검출합니다. 결과는 60시간 동안 배양했을 때 유사바이러스의 RLA 판독값이 평균의 낮은 표준 오차와 함께 값이 더 높고 반복성이 더 우수하다는 것을 보여주었습니다(그림 4B). 결과는 96웰 플레이트의 웰에 5000개의 세포를 시딩하고 바이러스 감염 후 60시간 후에 RLA 판독값을 검출하는 것이 적합함을 나타냅니다.
PN 어세이
대조군 및 DDV 군으로부터의 면역 혈청의 중화 역가는 PN 분석법으로 측정하였다(도 5). 그림 5A에 나타난 바와 같이, DDV 그룹의 면역 혈청은 슈도바이러스 A/Thailand/1(KAN)-1/04 균주에 대해 높은 중화 역가를 나타냈다. 대조적으로, 대조군으로부터의 혈청은 어떠한 중화 활성도 나타내지 않았다(도 5B). 전통적인 혈청학적 분석(HI 및 MN 분석)과 비교하여 PN 분석은 더 민감합니다(데이터가 표시되지 않음).
부착 중화 분석
일부 중화 항체는 시알산 수용체에 대한 바이러스의 부착을 방해할 수 있습니다. 이 항체는 HA 헤드로 향하며 상업용 백신에 의한 면역 또는 인플루엔자 바이러스 감염 후 우세합니다. 이러한 항체의 중화 활성을 확인하기 위해 부착 중화 분석이 수행됩니다(그림 3). 대조군 혈청과 비교했을 때, 면역 혈청의 중화 활성은 강력하며, 이는 면역 혈청에서 HA 헤드로 향하는 많은 항체가 있음을 나타냅니다(그림 6A).
바이러스 진입 평가
이 분석은 인플루엔자 바이러스 감염 동안 바이러스 외피와 엔도솜 막의 융합을 방해하는 항체를 식별하는 데 사용됩니다. 이러한 항체는 HA 줄기 도메인으로 향하며 일반적으로 덜 강력합니다. 이러한 항체의 중화 역가를 측정하기 위해 부착 후 분석이 수행됩니다(그림 3). 면역 혈청과 대조군 혈청 사이에는 상당한 차이가 있으며, 이는 면역 혈청에서 HA 줄기 영역에 대한 항체가 있음을 나타냅니다(그림 6B).
그림 1: 칼슘 매개 형질감염의 흐름도. 이 순서도는 칼슘 매개 형질감염의 주요 절차를 설명하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 슈도바이러스의 정량화 및 적정. (A) 슈도바이러스 HA 분석의 주요 단계를 설명하는 슈도바이러스 HA 분석의 흐름도. (B) 슈도바이러스 P24 분석의 주요 단계를 설명하는 슈도바이러스 P24 분석의 흐름도. (C) 슈도바이러스 적정 분석의 주요 단계를 설명하는 슈도바이러스 적정 분석의 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 슈도바이러스 기반 중화 분석. (A) PN 분석의 주요 단계를 설명하는 PN 분석의 순서도. (B) 부착 분석의 주요 단계를 설명하는 유사 바이러스 부착 분석의 순서도. (C) 바이러스 진입 분석의 주요 단계를 설명하는 바이러스 진입 분석의 평가 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 슈도바이러스 적정. (A) 96웰 플레이트의 웰당 다른 세포 양은 RLA 판독값에 영향을 미칩니다. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 및 40000 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. (B) 다른 수확 시간은 RLA 판독값에 영향을 미칩니다. RLA 판독값은 바이러스 감염 후 48시간, 60시간 및 72시간에 감지됩니다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수집된 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다; 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. Tukey 검정을 이용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 수행하였다. P < 0.0001; ns, 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 슈도바이러스로 검출된 H5 중화 항체 반응. (A) DDV 그룹에서 면역 혈청의 중화 항체 반응 적정. (B) 대조군에서 면역 혈청의 중화 항체 반응의 적정. IC50 은 슈도바이러스의 50%를 억제할 수 있는 중화 항체의 상호 희석액으로 정의됩니다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수집된 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다; 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. VSVG 슈도바이러스는 음성 대조군으로 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 결합 및 바이러스 진입 분석에 의한 중화 항체 효능 검출 . (A) 대조군의 면역 혈청이 아닌 DDV 그룹의 면역 혈청은 세포에 대한 바이러스 부착을 억제합니다. (B) 대조군이 아닌 DDV 그룹의 면역 혈청은 바이러스 부착 후 감염을 부분적으로 억제합니다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수집된 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다; 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 완전한 DMEM 배지 구성 | 농도 |
| 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM) | 1배 |
| 소태아혈청 | 10% |
| 페니실린(1U/mL)/스트렙토마이신 | 1 μg/mL |
표 1: 완전한 DMEM 배지 조성.
| 자료 | 농도 | 음량 |
| 2x 헤페스(pH 7.1) | -- | 675.0 마이크로리터 |
| CaCl 2 (2.5 m) | -- | 67.5 마이크로리터 |
| ddH2O | -- | 529.2 마이크로리터 |
| 피CMV Δ 8.9 | 1000ng/μL | 18.9 마이크로리터 |
| pCMV/R-HA | 100ng/μL | 27.0 마이크로리터 |
| pCMV/R-NA | 50ng/μL | 13.5 μL |
| pHR-루크 | 1000ng/μL | 18.9 마이크로리터 |
표 2: 유사 바이러스 패키징 시스템.
보충 그림 1: 마우스 예방 접종 순서도. 이 순서도는 마우스 예방 접종의 주요 절차를 설명합니다. 면역 혈청을 샘플로 사용하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 인플루엔자 슈도바이러스의 HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현. 의사 바이러스 단백질의 웨스턴 블롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
HEK293FT 세포는 일반적으로 슈도바이러스를 생산하기 위한 포장 세포로 사용됩니다. 정기적인 마이코플라스마 검출은 세포 배양 중에 필수적입니다. 마이코플라스마 오염은 슈도바이러스 수율을 급격히 감소시킬 수 있으며 때로는 0에 가까울 수 있습니다. 다른 오염과 비교할 때, 마이코플라스마 오염은 세포 배양 배지의 pH 값 변화 또는 탁도를 유발하지 않습니다. 고농도의 마이코 플라스마조차도 육안이나 현미경으로 볼 수 없습니다. 마이코플라스마 검출의 세 가지 인기 있는 방법은 마이코플라스마 배양, 형광 DAPI 또는 Hoechst 33258을 사용한 DNA 염색, 중합효소 연쇄 반응(PCR)입니다. 배양 샘플에서 마이코플라스마 DNA를 증폭하는 PCR은 빠르고 쉽고 신뢰할 수 있는 마이코플라스마 검사에 널리 사용된다10.
칼슘 포스페이트 매개 형질감염은 고효율, 저비용 및 쉬운 조작으로 인해 수년 동안 인플루엔자 슈도바이러스 패키징에 사용되어 왔다11. 그러나 이 방법은 HEPES 완충 용액, HEK293FT 세포 배양 배지 및 이중 증류된H2O의 pH 값에 매우 민감합니다. pH 값은 침전물의 형성 및 침전물이 HEK293FT 세포에 머무르는 지속 시간에 영향을 미쳤습니다. 따라서 HEK293FT 세포가 흡수하는 DNA 양을 결정할 수 있습니다. hepes 완충 용액의 pH는 7.05-7.1212,13,14 범위로 매우 좁게 제한되어 있으며,이 조건에서 인산 칼슘과 DNA를 함유 한 침전물이 HEPES 완충 용액에서 천천히 형성됩니다. pH가 너무 높으면 침전물의 크기가 너무 커져 HEK293T 세포를 죽일 수도 있습니다. 반대로, pH가 너무 낮 으면, 침전물이 형성 될 수 없거나, 침전물이 너무 작아서 세포 표면으로 침전되지 않을 것이다. 또한, HEK293FT 세포 배양 배지의 pH도 형질감염 효율에 중요한 역할을 합니다. 형질감염 동안, 세포 배지는 7.2-7.4의 pH 사이에서 유지되어야 한다. 고산성 및 알칼리성 배지는 침전물의 크기와 세포 표면의 DNA 혼합물의 흡착 시간을 변경합니다. 또한, DNA 혼합물에 사용되는 다른 기원을 가진 이중 증류 H2O는 HEPES 완충 용액의 pH를 변경할 수 있습니다. 따라서, 형질주입 용액 및 배양 배지의 안정적인 pH 값을 유지하는 것은 높은 형질주입 효율을 보장하는 데 중요하다. 또한, 형질전환 효율은 세포 배양기 내의 2.5 M CaCl2 용액 및 이산화탄소(CO2)의 농도에 의해서도 영향을 받는다. 형질주입 과정에서 CaCl2 용액을 적절하게 보관하고 인큐베이터에서CO2 농도를 안정화하는 것이 중요합니다.
인플루엔자 슈도바이러스의 가장 인기 있는 패키징 시스템은 다중 플라스미드 공동-형질감염 접근법을 포함한다. HA, NA, 리포터, 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 개별적으로 플라스미드 발현 벡터에 클로닝한 후 동시에 세포 내로 형질감염시킨다. 단백질 발현을 증가시키기 위해, Kozak 합의 서열은 종종 전사 시작 부위 앞에 추가됩니다.
순수하고, 수퍼코일링하고, 내독소가 없는 플라스미드 DNA15를 제조할 필요가 있다. 플라스미드 비율은 슈도바이러스 수율에 직접적인 영향을 미치기 때문이다. 이 프로토콜은 "코어: 리포터: HA:NA"의 플라스미드 비율을 28:28:4:1로 최적화하고 다른 형질주입 방법과 비교했습니다. 인산칼슘 형질감염에서 플라스미드 DNA의 양은 100mm 접시당 최대 30.5μg에 도달해야 합니다.
슈도바이러스 역가는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR), 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 적혈구 응집 분석 및 RLA 검출 분석으로 검출됩니다. qRT-PCR 분석법은 슈도바이러스 내부의 RNA 유전자의 복제 수를 추정하기 위해 사용된다5. ELISA 분석은 HIV 코어의 주성분인 p24 단백질의 함량을 검출하는 데 사용됩니다. 적혈구 응집 분석은 슈도바이러스 입자 표면의 HA 스파이크 양을 측정합니다. 이 세 가지 분석은 기능하지 않는 바이러스 입자를 정량화하는 데 사용됩니다. RLA 검출 분석은 형질도입된 세포를 감염시키고 유사바이러스 스톡에서 리포터 유전자를 방출할 수 있는 기능성 바이러스 입자의 농도를 측정하는 주요 방법입니다. MDCK 세포는 일반적으로 형질도입된 세포로 사용됩니다. 형질도입된 세포를 96웰 배양 플레이트에 파종하고, 슈도바이러스에 감염시키고, 용해 완충액으로 용해한 다음, 96웰 광도계 플레이트로 옮겨 값을 판독합니다. 다른 세포 양과 배양 시간은 RLA 값에 영향을 미칩니다. 그 결과에 따르면 96웰 플레이트에 웰당 5000개의 세포를 시딩하면 리포터 유전자 발현이 높고, 바이러스 감염 후 60시간째에 RLA가 검출된다.
H5 HPAI 유사바이러스 중화(PN) 분석은 안전성, 높은 감도, 정확도 및 고처리량 스크리닝에 대한 적합성으로 인해 항체 검출에 널리 적용되었습니다. PN 분석의 일반적인 프로토콜에는 슈도바이러스 양, 혈청 희석, 슈도바이러스-항체 배양 및 루시페라아제 활성 검출의 4단계가 포함됩니다. 슈도바이러스의 양은 RLA 판독값을 기반으로 정규화됩니다. 96웰 플레이트에서 웰당10:6 의 RLA 값을 사용하여 재현 가능한 실험 결과를 얻습니다. 혈청 샘플 희석의 시작점은 40 이상이어야 합니다. 혈청 샘플 성분은 혈청 샘플의 희석 계수가 40 미만일 때 슈도바이러스의 루시페라아제 값을 분명히 증가시킵니다. 슈도바이러스-항체 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 MDCK 세포로 옮기고 60시간 내에 RLA 판독값을 검출합니다. 루시페라아제 수치는 일반적으로 슈도바이러스 감염 효율을 결정하는 도구로 사용됩니다.
PN 분석에는 루시페라아제 리포터 단백질, 분석 화학, 광도계 및 마이크로플레이트의 네 가지 중요한 요소가 있습니다16. 첫째, 루시페라아제 유전자는 형질도입된 세포에서 단백질 발현 수준을 개선하기 위해 코돈에 최적화되어 있습니다. 리포터 및 벡터 백본 유전자를 조작하면 합의 전사 인자 결합 부위의 수를 줄여 변칙적 전사 위험을 줄일 수 있습니다. 둘째, 실험의 목적에 따라 적절한 검출 시약을 선택합니다. PN 분석은 일반적으로 혈청 또는 항체 샘플의 중화 반응을 검출하기 위한 고처리량 방법으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 가장 밝은 신호, 넓은 다이내믹 레인지 및 높은 감도를 제공하는 bright-Glo 루시페라아제 분석 시스템을 사용했습니다. 더 중요한 것은 신호의 반감기가 약 10분이며 기판이 추가된 직후 셀이 테스트된다는 것입니다. 광도계는 루시페라아제 농도를 감지하는 데 사용됩니다. 다양한 유형의 광도계가 제조됩니다. 기본 원리는 사용된 기계가 서로 다른 샘플 간의 루시페라아제 활성의 차이를 정확하게 식별할 수 있다는 것입니다. 검은색 또는 흰색 폴리스티렌 마이크로플레이트는 불투명도와 저발광 배경에 사용해야 합니다. 백색 마이크로플레이트는 발광 신호를 향상시키고 배경 발광을 낮출 수 있는 반면, 흑색 마이크로플레이트는 광 산란을 최소화하여 웰 투 웰(well-to-well) 혼선을 감소시킬 수 있다(17).
PN 분석은 중화 항체 반응을 검출하는 전통적인 방법과 일치합니다. 그러나, 인플루엔자 야생형 바이러스로부터의 HA 및 NA 단백질만을 포함하여, 슈도바이러스는 야생형 바이러스와는 거리가 멀다. HA는 수용자 세포의 시알산 수용체에 결합하여 감염을 시작할 수 있습니다. 그런 다음 엔도솜의 HA 구조적 변화가 바이러스막과 엔도솜막의 융합을 유발하여 바이러스 리보핵단백질(vRNP)을 세포질로 방출합니다. 인플루엔자 슈도바이러스는 이러한 과정을 모방할 수 있을 뿐이며 관련 연구에 적용됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 장쑤성 혁신 역량 강화 프로젝트(BM2020019), 선전 과학 기술 프로젝트(No. JSGG20200225150702770), 중국과학원(XDB29030103)의 전략적 우선 연구 프로그램, 광동 과학 기술 프로젝트(No. 2020B1111340076) 및 Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program(No. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
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