Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לאריזת פסאודו-וירוס ולמדידת פעילות נטרול נוגדנים.
Abstract
מאז 1996, נגיפי H5 מסוג A/goose/Guangdong/1/96-lineage מאוד פתוגניים של שפעת העופות (HPAI) גורמים להתפרצויות שפעת בעופות ובעופות בר. לעיתים, גם בני אדם נופלים קורבן לכך, מה שמוביל לתמותה גבוהה. עם זאת, מחקר וירוס HPAI מעוכב לעתים קרובות, בהתחשב בכך שהוא חייב להיות מטופל בתוך מעבדות בטיחות ביולוגית רמה 3. כדי לטפל בבעיה זו, פסאודו-וירוסים מאומצים כחלופה לנגיפים מסוג פרא בחלק מהניסויים של מחקרי H5 HPAI. Pseudoviruses להוכיח להיות הכלים האידיאליים לחקר נוגדנים מנטרלים נגד וירוסים HPAI H5. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים והצעדים הקריטיים של ההכנות הפסאודו-וירוס H5 HPAI ומבחני נטרול פסאודו-וירוס. כמו כן, הוא דן בפתרון בעיות, הגבלה ושינויים של בדיקות אלה.
Introduction
מאז 1996, נגיפי H5 מסוג A/goose/Guangdong/1/96-lineage מאוד פתוגניים של שפעת העופות (HPAI) גורמים להתפרצויות שפעת מתמשכות בעופות ובעופות בר, ואחראים להפסדים סוציו-אקונומיים עצומים בתעשיית העופות העולמית. לפעמים, בני אדם גם נדבקים בו, מתמודדים עם שיעור תמותה גבוה 1,2. עם זאת, מחקר וירוס HPAI הוא לעתים קרובות מעוכב, בהתחשב בכך שזה לא יכול להיות מטופל מחוץ למעבדות בטיחות ביולוגית רמה 3. כדי לטפל בבעיה זו, פסאודו-וירוסים מאומצים כחלופה לנגיפים מסוג פרא בחלק מהניסויים של מחקרי H5 HPAI. פסאודו-וירוסים בטוחים מספיק כדי להתאמן במעבדות ברמת בטיחות ביולוגית 2.
פסאודו-וירוסים H5 HPAI שייכים לנגיפים כימריים המורכבים מליבות וירוסים חלופיים, מעטפות שומנים עם פני השטח של גליקופרוטאינים מנגיפי שפעת, וגנים מדווחים. ליבות פסאודו-וירוס נגזרות בדרך כלל מנגיף הכשל החיסוני האנושי הלנטי-ויראלי (HIV), רטרו-וירוסים כגון וירוס לוקמיה מורין (MLV) ונגיף סטומטיטיס שלפוחית השתן (VSV)3. באופן ספציפי, מערכת האריזה של HIV-1 נמצאת בשימוש נרחב לייצור פסאודו-וירוס שפעת, שבו הגנים העיקריים שסופקו הם gag ו- pol. גן ה- HIV gag מבטא חלבוני ליבה. הגן pol מבטא את האינטגראז ואת השעתוק ההפוך, שניהם נחוצים לביטוי הגן המדווח בתאים מותמרים. תוך חיקוי הגנום של הנגיף החלופי, הגן המדווח מאומץ לתוך ליבת הפסאודו-וירוס בצורת RNA. גן הכתב יבטא את החלבון בתאים המארחים. ניתן להשתמש ברמות ביטוי הגנים של גנים מדווחים כדי למדוד יעילות זיהום פסאודו-וירוס 3,4. המדווח העיקרי הוא לוציפראז גחלילית כדי למדוד את יחידות הלומינסנציה היחסית (RLU) או פעילות הלוציפראז היחסית (RLA) בתאים מותמרים. כתבים אחרים כגון lacZ, Gaussia, ו Renilla luciferase משמשים גם, רק במידה פחותה5.
פסאודו-וירוסים הם כלים אידיאליים לחקר נוגדנים מנטרלים נגד נגיפי H5 HAPI. כדי למדוד את עוצמת הנוגדנים המנטרלים, נעשה שימוש במבחני ניטרול פסאודו-וירוס (PN)6. Hemagglutinin (HA) ו neuraminidase (NA) הם גליקופרוטאינים על פני השטח של שפעת A וירוס 7,8. ה-HA מורכב מתחום ראש כדורי לקשירת קולטנים ותחום גזע לאיחוי ממברנה. חלבון NA יש את פעילות sialidase כדי להקל על שחרור וירוס 7,8. בדיקת נוירופתיה היקפית יכולה למדוד נוגדנים מנטרלים המופנים לחלבוני HA. נוגדנים מנטרלים המכוונים לאזור הראש והגזע של HA יכולים להיות מזוהים גם על ידי התקשרות נגיפית ומבחני כניסה. בהשוואה לנגיפים מסוג פראי, לניסויי נטרול פסאודו-וירוסים יש ערכי זיהוי רגישים יותר, ניתן לטפל בהם בבטחה במעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 2, ובדרך כלל קלים יותר לתפעול בפועל.
פרוטוקול זה מציג בפירוט את הנהלים והצעדים הקריטיים של H5 HPAI pseudovirus ההכנות ומבחני PN. כמו כן, הוא דן בפתרון בעיות, הגבלה ושינויים של בדיקות אלה. במחקר זה, זן A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) מנגיפי H5N1 HPAI שימש כדוגמה. כדי להשיג את סרה החיסון המשמשת בבדיקות, פרוטוקול זה בחר בחלבון HA שמקורו בזן TH כאימונוגן לחיסון עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פעולות הניסוי הקשורות לפסאודו-וירוס בוצעו בתנאי ABSL2 במכון פסטר של האקדמיה הסינית למדעים בשנחאי (IPS, CAS). ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתבסס על פרוטוקולים מוסדיים של הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של IPS, CAS.
1. אריזה Pseudovirus עם transfection סידן פוספט
- צור תרחיפים חד-תאיים של HEK293FT תאים (9 x 10,5 למ"ל) בתווך DMEM מלא (טבלה 1). הוסף 10 מ"ל של תרחיפים חד-תאיים לצלוחית T75, דגר את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני (CO2) במשך 20 שעות לפני הטרנספקציה.
הערה: מומלץ HEK293FT מעבר נמוך (<20 קטעים). ודא כי monolayer התא הוא 80-90% confluent. - החלף את המדיום עם 10 מ"ל של מדיום שלם טרי המכיל כלורוקין (100 מיקרומטר) 2 שעות לפני transfection.
- ערבבו את הריאגנטים ואת הדנ"א של פלסמיד כפי שמוצג בטבלה 2 ובאיור 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8.9, 2.5 M CaCl2ו-2x HEPES buffer. פיפטה למעלה ולמטה 5 פעמים בעדינות, לדגור על התערובת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות.
- מעבירים את התערובת לתווך שמעל התאים, ומנדנדים את הבקבוק בעדינות. לדגור על התאים באינקובטור התא במשך 15 שעות.
- החלף את המדיום עם 15 מ"ל של מדיום DMEM שלם טרי. לדגור על התאים באינקובטור של 37°C, 5% CO2 למשך 65 שעות.
הערה: צבע התווך יהיה כתום בהיר או צהוב מעט, ולפחות 80% מהתא צריך להראות את האפקט הציטופתי (CPE) תחת מיקרוסקופ האור ההפוך. - קצור את supernatant, וצנטריפוגה אותו ב 2095 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. לאסוף את supernatant, aliquot אותו, ולאחסן אותו ב -80 ° C.
2. זיהוי ביטוי חלבון HA, NA ו- HIV-1 p24 של פסאודו-וירוס שפעת
- זהה את ביטוי חלבון HA על ידי בדיקת Hemagglutinin (HA).
- הוסף 50 μL של PBS לעמודות 2-12, שורות A, B ו- C של לוח עגול בעל תחתית עגולה של 96 בארות.
הערה: שורות A, B ו- C שייכות ל- 3 בדיקות שכפול עצמאיות, ועמודה 12 משמשת כפקד השלילי. - הוסף 100 μL של pseudovirus לתוך הבארות של עמודה 1. מעבירים 50 μL מטור 1 לטור 2, מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה 5 פעמים, מבצעים את הדילולים הכפולים עד לטור 11 האחרון, ומשליכים את 50 μL הנוספים מטור 11.
- הוסף 50 μL של 0.5% אריתרוציטים לתוך כל באר, פיפטה אותו למעלה ולמטה בעדינות פעמיים. לדגור על הצלחת במשך 30-60 דקות ב RT או עד אריתרוציטים של בקרה שלילית טופס כתמים רגילים בתחתית הבאר.
- התבונן ורשום טיטרים HA של pseudovirus.
הערה: יחידת HA של הפסאודו-וירוסים היא גורם הדילול הגבוה ביותר של הנגיף שיכול לגרום ל-100% המגלולציה של תאי הדם האדומים.
- הוסף 50 μL של PBS לעמודות 2-12, שורות A, B ו- C של לוח עגול בעל תחתית עגולה של 96 בארות.
- זיהוי ביטוי חלבוני HA ו-NA על ידי בדיקת הכתם המערבי.
הערה: כל שלבי הכתם המערבי מבוצעים על פי המדריך לשיבוט מולקולרי(מהדורה 4 ). - זהה את ביטוי החלבון HIV-1 p24 על ידי ערכת ELISA של HIV-1 p24 (רשימת חומרים).
- הוסף 50 μL של חיץ lysis לתוך 450 μL של דגימה pseudovirus. מערבבים היטב.
- הוסף 300 μL של חיץ הכביסה לכל באר של microplate. הכו את הצלחת הפוכה כדי להסיר את חיץ הכביסה לחלוטין. חזרו על הכביסה 5 פעמים.
- הוסף 200 μL של התקן ודוגמאות לכל באר בנפרד. לדגור אותם ב 37 ° C במשך הלילה או במשך 2 שעות.
- שאפו את תכולת הצלחת ושטפו את הצלחת כמתואר בשלב 2.3.2.
הערה: השאר באר אחת של לוח הבדיקה ריקה לשימוש כמצע ריק. - הוסף 200 μL של נוגדנים גלאי p24 לכל באר. לדגור אותם ב 37 ° C במשך 1 שעה. שאפו ושטפו את הצלחת כמתואר בשלב 2.3.2.
- הוסף 100 μL של תמיסת עבודה סטרפטווידין-Peroxidase לכל באר, ודגר אותם ב 37 ° C במשך 30 דקות. שאפו ושטפו את הצלחת כמתואר בשלב 2.3.2.
- הוסף 100 μL של פתרון העבודה substate לכל באר, כולל המצע ריק היטב, ודגר אותם ב 37 ° C במשך 30 דקות.
הערה: צבע כחול יתפתח בבארות. - הוסף 100 μL של חיץ עצירה לכל באר.
הערה: הצבע הכחול ישתנה לצהוב באופן מיידי. - קרא את הצפיפות האופטית ב- 450 ננומטר תוך 15 דקות. רשום את titers p24 של pseudovirus
3. טיטרציה Pseudovirus
- צור תרחיפים חד-תאיים של תאי MDCK (5 x 104 למ"ל) בתווך DMEM מלא, הוסף תאים 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 ו- 40000 לבארות שונות של צלחת שטוחה בעלת 96 בארות. לדגור על התאים באינקובטור של 37°C, 5% CO2 למשך 20 שעות.
- הוציאו את הפסאודו-וירוס מהמקרר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, הפשירו אותו על הקרח וערברו את הפסאודו-וירוס.
- הוסף 6 HAU (6x יחידות HA) pseudoviruses לכל באר של צלחת עגולה 96 באר וחדש כל באר עם DMEM מלא עד 120 μL.
- פיפטה מעלה ומטה את התערובת 5 פעמים כדי לערבב היטב. לדגור את צלחת תערובת ב 37 ° C, 5% CO2 אינקובטור במשך 1 שעה.
- מעבירים 100 μL מהתערובת לתאים בצלחת 96 בארות. החזירו את צלחת תרבית התאים לאינקובטור למשך 48 שעות, 60 שעות ו-72 שעות לאחר ההדבקה בנגיף.
- מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומבצעים את בדיקת הלוציפראז (טבלת חומרים).
- מוציאים את המדיום מבארות הצלחת בזהירות. לשטוף את התאים עם 200 μL של PBS ולהסיר את PBS ככל האפשר.
הערה: הפוך את הצלחת והשלך את הסופרנאטנט על ידי סטירה הפוכה על נייר סופג. אם קו תאי הבדיקה לא הצליח להתחבר בחוזקה לתחתית, הסר את השאיפה הבינונית בזהירות. - מוסיפים 50 μL של חיץ הליזיס לכל באר, ומנדנדים את צלחת התרבית מספר פעמים. אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.
הערה: יש לערבב נפח אחד של חיץ ליזיס 5x עם 4 נפחי מים כדי ליצור את מאגר הליזיס 1x. אזנו את מאגר הליזיס 1x ל-RT לפני השימוש. נענעו את הצלחת כדי להבטיח שהתאים מכוסים לחלוטין בחיץ הליזיס. תהליך ההקפאה-הפשרה היחיד יכול לעזור לתא להיות ליזה לחלוטין. - מוציאים את הצלחת, מאזנים ב-RT למשך שעתיים.
הערה: התא צריך להיות lysed לחלוטין. - רוקדים את הצלחת מספר פעמים בעדינות, ומעבירים את כל הליזטים התאיים לצלחות אטומות בנות 96 בארות.
- מוסיפים 50 μL של המצע לכל באר, מנערים את הצלחת מספר פעמים בעדינות, ומערבבים היטב את המצע ואת חיץ הליזיס.
- מדוד את האור המופק תוך 5 דקות באמצעות לומינומטר. רשום את titers luciferase של pseudovirus.
הערה: כאשר מוסיפים מצע תקין, האור נפלט כתוצר לוואי באמצעות תגובה כימית שבה לוציפרין מומר לאוקסילוציפרין על ידי האנזים לוציפראז. כמות האור המיוצרת פרופורציונלית לכמות האנזים לוציפראז.
4. הכנת סרה חיסונית
הערה: הסרום החיסוני ישמש לניסויים הקשורים לתאים, והפעולה הניסיונית צריכה להתבצע בתנאים אספטיים.
- הכינו 12 נקבות עכברי BALB/c בנות שמונה שבועות. חלקו את העכברים באופן שווה לשתי קבוצות.
הערה: קבוצה אחת הייתה קבוצת DDV והשנייה הייתה קבוצת הביקורת השלילית. - חיסון קבוצת DDV: פריים פעמיים תוך שרירית עם 100 מיקרוגרם של פלסמיד DNA ממוטב קודון המקודד A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) חלבון HA בשבוע 0 ובשבוע 3 ולהגביר פעם אחת תוך צפקית עם 512 חלקיקים דמויי וירוס TH HAU (VLP) בשבוע 6.
- חיסון קבוצת ביקורת: פריים פעמיים תוך שרירית עם 100 מיקרוגרם DNA פלסמיד וקטורי ריק בשבוע 0 ובשבוע 3 ולהגביר פעם אחת תוך צפקית עם HIV-1 gag VLP בשבוע 6.
- לאסוף את דם העכבר 2 שבועות לאחר החיסון האחרון.
הערה: כאן, העכברים היו מורדמים עם נתרן pentobarbital (65 מ"ג / ק"ג) בזמן איסוף הדם. לאחר איסוף הדם מהווריד התת-לסתי, העכברים הומתו מיד עםCO2. - שמור את הדם ב RT במשך 2 שעות, ולאחר מכן 4 ° C במשך הלילה. צנטריפוגה ב 900 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולאסוף את supernatant. נטרלו את הסרה על ידי הצבתה בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות.
- אחסנו את סרה החיסון במקרר בטמפרטורה של -80°C לשימוש.
הערה: עיין באיור משלים 1 עבור תרשים הזרימה המתאר את ההליכים העיקריים של חיסון עכברים.
5. בדיקת נטרול פסאודו-וירוס (PN)
- צור תרחיפים חד-תאיים של תאי MDCK (5 x 104 למ"ל) בתווך DMEM מלא, והוסף 100 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת שטוחה בעלת 96 בארות. לדגור על התאים באינקובטור של 37°C, 5% CO2 למשך 20 שעות.
- מוציאים את הפסאודו-וירוס והסרה מהמקרר בטמפרטורה של -80°C, מפשירים אותו על הקרח ומערבלים היטב.
- לדלל את sera בתווך השלם 20 פעמים, ולהוסיף 100 μL של מדיום DMEM שלם לבארות של צלחת עגולה 96 באר תחתית מעמודות 2-10.
- הוסף 200 μL של הסרה המדוללת לבארות של טור 2, העבר 100 μL מטור 2 לטור 3, דלל את הסרה כ- 1:20, 1:40, 1:80 וכו ', ל- 1:10240 ברציפות מטור 2 לטור 10, והשלכת 100 μL מטור 10.
- הוסף 100 μL של מדיום שלם DMEM לבארות של עמודה 11 כבקרה השלילית.
- מוסיפים 100 מיקרוליטר של פסאודו-וירוסים לכל באר, פיפטה מעלה ומטה את התערובת 5 פעמים ביסודיות, ודגרים על צלחת התערובת בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך שעה אחת.
- מעבירים 100 μL של התערובת מהצלחת בעלת 96 הבאר בעלת תחתית עגולה לבאר המתאימה של צלחת תרבית התאים בעלת 96 הבארות. מחזירים את הצלחת לאינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך 60 שעות.
- מוציאים את הצלחת מהאינקובטור. בצע את בדיקת luciferase כמתואר בשלבים 3.7-3.12.
6. בדיקת קבצים מצורפים Pseudovirus
- צור תרחיפים חד-תאיים של תאי MDCK (4 x 104 למ"ל) בתווך DMEM מלא, והוסף מתלי תאים של 100 μL לכל באר בלוח שטוח בעל 96 בארות. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 20 שעות.
- לדגור את pseudovirus עם sera ב DMEM המכיל 1% BSA ב 4 ° C במשך הלילה.
הערה: נפח התערובת הוא 100 μL. - חסום את תאי MDCK עם 100 μL לכל באר של DMEM המכיל 1% BSA ב 4 ° C במשך 1 שעות.
- חסן את תערובת הפסאודו-וירוס והסרום (100 μL) על השכבה החד-שכבתית MDCK ודגר עליה ב-4°C למשך שעתיים.
- שטפו את צלחת התא 4 פעמים עם PBS המכיל 1% BSA כדי להסיר כל וירוס לא קשור.
- Lyse את התאים עם 100 μL של חיץ luciferase lysis ב RT במשך 30 דקות.
- כמת את כמות הנגיף הכבול על התאים באמצעות ערכת ELISA של HIV-1 p24 כמתואר לעיל (סעיף 2.3).
7. הערכה של כניסה ויראלית
- צור תרחיפים חד-תאיים של תאי MDCK (5 x 104 למ"ל) בתווך DMEM מלא, והוסף 100 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת שטוחה בעלת 96 בארות. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 20 שעות לפני הבדיקה.
- חסן את הפסאודו-וירוס (100 μL) על שכבה חד-שכבתית MDCK בצלחת של 96 בארות ב-4°C למשך 6 שעות.
- שטפו את צלחת התא 4 פעמים עם PBS המכיל 1% BSA כדי להסיר פסאודו-וירוסים לא מאוגדים.
- הוסף 100 μL של סרה חיסונית בדילול סדרתי או סרה מעכברי חיסון דמה ב- DMEM המכיל 1% BSA לחד-שכבתי, ודגר על התא ב -4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
- הסר את supernatant התא, ולשטוף את צלחת תרבית התא 4 פעמים עם PBS המכיל 1% BSA.
- הוסף DMEM טרי לתאים ודגור במשך 60 שעות באינקובטור 37°C, 5% CO2 .
- מדוד את פעילות הלוציפראז היחסית (RLA) של התאים כמתואר בשלבים 3.7-3.12.
הערה: ערך ויראלי, כפי שצוין על ידי RLA, התבטא כאחוז מהקריאה המתקבלת בהיעדר סרה, שנקבע כ -100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA, NA ו- HIV-1 p24 ביטוי חלבון של פסאודו-וירוס שפעת
כדי לזהות את יעילות האריזה הנגיפית, מלאי פסאודו-וירוס של שפעת זוהה לראשונה על-ידי בדיקת HA (איור 2A). יחידות HA למיליליטר של פסאודו-וירוסים של שפעת הן 643 (טבלה 3). בדיקות כתם מערבי ומבחני ELISA סנדוויץ' שימשו לבדיקת ביטוי חלבון HA, NA ו- HIV-1 p24. לאחר מכן חושבו היחסים של יחידת HA וכמות p24 gag עבור pseudoviruses. תוצאות בדיקת הכתם המערבי הראו שהיו 4 סוגי חלבונים: חלבוני HA0, HA1, HA2 ו-NA (איור משלים 2). זה מצביע על כך שחלבוני המעטפת של פסאודו-וירוסים של שפעת דומים לאלה של וירוסים מסוג פראי. היחסים בין HA ו-Gag p24 היו בטווח הנורמה כפי שדווח (טבלה 3)9.
| זנים פסאודו-וירוסים | HAU/מ"ל | 1.00E + 05 pg/mL | יחס של HAU/1.00E+05 עמ'* |
| P A/תאילנד/(KAN-1)/2004 | 642.52 ± 30.26 | 4.20 ± 0.17 | 152.98 |
| *היחסים בין יחידות HA וכמות HIV-1 Gag p24 בפסאודו-וירוסים חושבו באופן הבא: יחידות HA/כמות Gag p24. | |||
טבלה 3: כימות של פסאודו-וירוס H5.
טיטרציה Pseudovirus
כדי למדוד את ריכוז החלקיקים הנגיפיים הפונקציונליים, זוהתה פעילות לוציפראז יחסית (RLA) של פסאודו-וירוס. קריאות RLA תלויות במשתנים רבים. כדי לזהות את ההשפעה של כמות תאים מומרת על קריאות RLA, זרענו את התאים של 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 ו-40000 לכל באר של צלחת 96 בארות (איור 2). התוצאות הראו שקריאות RLA של פסאודו-וירוס הן הגבוהות ביותר, ושגיאת התקן של הממוצע היא הנמוכה ביותר כאשר 5,000 תאים נזרעים בבאר של צלחת בת 96 בארות (איור 4A). כדי לזהות את ההשפעה של זמן הדגירה, קריאות RLA מזוהות ב 48 שעות, 60 שעות, ו 72 שעות לאחר זיהום הנגיף. התוצאות הראו שכאשר מודגרים במשך 60 שעות, קריאות ה-RLA של פסאודו-וירוס גבוהות יותר בערכים וטובות יותר בחזרתיות עם שגיאת תקן נמוכה של הממוצע (איור 4B). התוצאות מצביעות על כך שהוא מתאים לזרוע 5000 תאים בבאר של צלחת 96 בארות ולזהות קריאות RLA 60 שעות לאחר הדבקה בנגיף.
מבחני PN
טיטרים מנטרלים של סרה חיסונית מקבוצת הביקורת ומקבוצת ה-DDV נמדדו על-ידי מבחני PN (איור 5). כפי שניתן לראות באיור 5A, סרה חיסונית מקבוצת ה-DDV הציגה טיטרים מנטרלים גבוהים נגד זן פסאודו-וירוס A/Thailand/1(KAN)-1/04. לעומת זאת, סרה מקבוצת הביקורת לא הראתה פעילות נטרול כלשהי (איור 5B). בהשוואה לבדיקות סרולוגיות מסורתיות (מבחני HI ו- MN), מבחני PN רגישים יותר (הנתונים אינם מוצגים).
בדיקת נטרול התקשרות
נוגדנים מנטרלים מסוימים יכולים לעכב את היצמדות הנגיפים לקולטני החומצה הסיאלית. נוגדנים אלה מכוונים לראש החומצה ההיאלורונית והם דומיננטיים לאחר חיסון על ידי חיסון מסחרי או זיהום של נגיף השפעת. כדי לזהות את הפעילות המנטרלת של הנוגדנים האלה, מבוצעות בדיקות נטרול התקשרות (איור 3). בהשוואה לסרה הביקורתית, הפעילות המנטרלת של סרה חיסונית היא חזקה, מה שמצביע על כך שיש הרבה נוגדנים המכוונים לראש החומצה ההיאלורונית בסרה החיסונית (איור 6A).
הערכת כניסה ויראלית
בדיקה זו משמשת לזיהוי נוגדנים המעכבים את האיחוי של מעטפת הנגיף והקרומים האנדוזומליים במהלך הדבקה בנגיף השפעת. נוגדנים אלה מכוונים לתחום גבעול החומצה ההיאלורונית והם בדרך כלל פחות חזקים. כדי למדוד את מטיטרי הנטרול של הנוגדנים האלה, מבוצעות בדיקות לאחר התקשרות (איור 3). ישנם הבדלים משמעותיים בין סרה חיסונית לבין סרה הביקורת, מה שמצביע על כך שיש נוגדנים המכוונים לאזור גזע החומצה ההיאלורונית בסרה החיסונית (איור 6B).
איור 1: תרשים זרימה של טרנספקציה בתיווך סידן. תרשים זרימה זה משמש לתיאור הליכים עיקריים של טרנספקציה בתיווך סידן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כימות וטיטרציה של פסאודו-וירוס . (A) תרשים זרימה של בדיקת חומצה היאלורונית מדומה המתאר את השלבים העיקריים של בדיקת חומצה היאלורונית מדומה. (B) תרשים זרימה של בדיקת Pseudovirus P24 המתאר את השלבים העיקריים של בדיקת P24 של פסאודו-וירוס. (C) תרשים זרימה של בדיקת טיטרציה של Pseudovirus המתאר את השלבים העיקריים של בדיקת טיטרציה של פסאודו-וירוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מבחני נטרול מבוססי פסאודו-וירוס. (A) תרשים זרימה של בדיקת PN המתאר את השלבים העיקריים של בדיקת PN. (B) תרשים זרימה של בדיקת קבצים מצורפים פסאודו-וירוסים המתאר את השלבים העיקריים של בדיקת התקשרות. (C) תרשים זרימה של הערכת בדיקת כניסה נגיפית המתאר את השלבים העיקריים של בדיקת כניסה ויראלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: טיטרציה של פסאודו-וירוס. (A) כמויות תאים שונות לכל באר בלוח של 96 בארות משפיעות על קריאות RLA. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 ו-40000 תאים נזרעו בצלחת בת 96 בארות. (B) זמן קציר שונה משפיע על קריאות RLA. קריאות RLA מזוהות ב 48 שעות, 60 שעות, ו 72 שעות לאחר זיהום הנגיף. נתונים שנאספו משלושה ניסויים עצמאיים מוצגים כממוצע ± SEM; קווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). בוצע מבחן ANOVA חד כיווני עם Tukey. P < 0.0001; NS, לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תגובות נוגדנים מנטרלות H5 שזוהו עם פסאודו-וירוס. (A) טיטרציה של תגובות נוגדנים מנטרלות של סרה חיסונית מקבוצת ה- DDV. (B) טיטרציה של תגובות נוגדנים מנטרלים של סרה חיסונית מקבוצת הביקורת. IC50 מוגדר כדילול הדדי של הנוגדן המנטרל שיכול לעכב 50% מהפסאודו-וירוס. נתונים שנאספו משלושה ניסויים עצמאיים מוצגים כממוצע ± SEM; קווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). VSVG pseudovirus שימש כבקרה שלילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: זיהוי עוצמת נוגדנים מנטרלים על-ידי קשירה ומבחני כניסה נגיפיים . (A) סרה חיסונית מקבוצת ה-DDV, לא מקבוצת הביקורת, מעכבת את ההתקשרות הנגיפית לתאים. (B) סרה חיסונית מקבוצת ה-DDV, לא זו מקבוצת הביקורת, מעכבת חלקית זיהום נגיפי לאחר התקשרות. נתונים שנאספו משלושה ניסויים עצמאיים מוצגים כממוצע ± SEM; קווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| הרכב DMEM בינוני מלא | ריכוז |
| מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) | 1x |
| סרום בקר עוברי | 10% |
| פניצילין(1 U/מ"ל)/סטרפטומיצין | 1 מיקרוגרם/ מ"ל |
טבלה 1: הרכב DMEM בינוני מלא.
| חומרים | ריכוז | נפח |
| 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675.0 μL |
| CaCl 2 (2.5 מטר) | -- | 67.5 μL |
| ddH2O | -- | 529.2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 נ"ג/מיקרוליטר | 18.9 מיקרוליטר |
| pCMV/R-HA | 100 נ"ג/מיקרוליטר | 27.0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 נ"ג/מיקרוליטר | 13.5 מיקרוליטר |
| pHR-לוק | 1000 נ"ג/מיקרוליטר | 18.9 מיקרוליטר |
טבלה 2: מערכת אריזה Pseudovirus.
תרשים משלים 1: תרשים זרימה של חיסון עכברים. תרשים זרימה זה מתאר את ההליכים העיקריים של חיסון עכברים. הסרה החיסונית שימשה כדגימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: ביטוי חלבוני HA, NA ו-HIV-1 p24 של פסאודו-וירוס שפעת. כתם מערבי של חלבונים פסאודו-וירוסים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאי HEK293FT משמשים בדרך כלל כתאי אריזה לייצור פסאודו-וירוסים. זיהוי מיקופלסמה קבוע חיוני במהלך תרבית התא. זיהום מיקופלסמה יכול להפחית באופן דרסטי את תפוקת הפסאודו-וירוס ולפעמים קרוב לאפס. בהשוואה לזיהומים אחרים, זיהומי מיקופלסמה אינם מובילים לשינויים בערך ה- pH או לעכירות של מדיום תרבית התא. אפילו ריכוז גבוה של מיקופלסמה אינו נראה בעיניים בלתי או תחת מיקרוסקופ. שלוש שיטות פופולריות לזיהוי מיקופלסמה הן תרבית מיקופלסמה, צביעת DNA עם DAPI פלואורסצנטי או Hoechst 33258, ותגובת שרשרת פולימראז (PCR). PCR הגברת DNA מיקופלסמה בדגימות תרבית נמצא בשימוש נרחב לבדיקת מיקופלסמה מהירה, קלה ואמינה10.
טרנספקציה בתיווך סידן פוספט משמשת לאריזות פסאודו-וירוסים של שפעת במשך שנים רבות בשל יעילותה הגבוהה, עלותה הנמוכה ותפעולה הקל11. עם זאת, שיטה זו רגישה מאוד לערך ה- pH של תמיסה חוצצת HEPES, מדיום תרבית התאים HEK293FT, וערך H2O. pH מזוקק כפול השפיע על היווצרות המשקע ומשך הזמן של שהיית המשקע על תאי HEK293FT. לכן, הוא יכול לקבוע את כמות הדנ"א שנקלטת על ידי תאי HEK293FT. ה- pH עבור תמיסה חוצצת HEPES הוא מוגבל מאוד, נע בין 7.05-7.1212,13,14, במצב זה, משקע המכיל סידן פוספט ו- DNA נוצר לאט בתמיסה חוצצת HEPES. אם ה- pH גבוה מדי, גודלו של המשקע יהיה כה גדול שהוא יכול אפילו להרוג את תאי HEK293T. להיפך, אם ה- pH נמוך מדי, המשקע לא יכול להיווצר, או שהמשקע יהיה קטן מכדי להתיישב על פני התא. יתר על כן, ה- pH של מדיום תרבית התאים HEK293FT גם משחק תפקיד ביעילות הטרנספקציה. במהלך הטרנספקציה, המדיום התא צריך להישמר בין pH של 7.2-7.4. גם מדיה חומצית וגם בסיסית ישנו את גודל המשקע ואת זמן הספיחה של תערובת הדנ"א על פני התא. בנוסף, H2O מזוקק כפול עם מקורות שונים המשמשים בתערובת ה- DNA יכול לשנות את ה- pH של תמיסת חציצה HEPES. לכן, שמירה על ערך pH יציב של תמיסת טרנספקציה ומדיום תרבית היא חיונית כדי להבטיח יעילות טרנספקציה גבוהה. בנוסף, יעילות הטרנספקציה מושפעת גם מתמיסת CaCl 2 2.5 M ומריכוז הפחמן הדו-חמצני (CO2) באינקובטור התא. במהלך תהליך הטרנספקציה, חיוני לאחסן את תמיסת CaCl 2 כראוי ולייצב את ריכוז ה- CO2 באינקובטור.
מערכת האריזה הפופולרית ביותר של פסאודו-וירוס שפעת כוללת גישה משותפת פלסמידים מרובים. הגנים HA, NA, reporter ו-lentiviral gag ו-pol משובטים בנפרד לווקטורי ביטוי פלסמיד, ואז הם מועתקים לתאים בו זמנית. כדי להגביר את ביטוי החלבון, לעתים קרובות מוסיפים רצף קונצנזוס של קוזאק לפני אתר התחלת השעתוק.
יש צורך להכין DNA פלסמיד טהור, סליל-על ונטול אנדוטוקסין15. מאז יחס פלסמיד משפיע ישירות על תשואות pseudovirus. פרוטוקול זה ייעל את יחס הפלסמיד של "הליבה: כתב: HA: NA" ל- 28:28:4:1 והשווה אותו לשיטות טרנספקציה אחרות. זה נדרש כי כמות ה- DNA פלסמיד בטרנספקציה סידן פוספט צריך להגיע עד 30.5 מיקרוגרם לכל צלחת 100 מ"מ.
טיטרים של Pseudovirus מזוהים על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR), בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), בדיקת hemagglutination ומבחני זיהוי RLA. בדיקת qRT-PCR משמשת להערכת מספרי העתקה של גנים RNA של פנים פסאודו-וירוס5. בדיקת ELISA משמשת לזיהוי התוכן של חלבון p24, שהוא המרכיב העיקרי בליבת ה- HIV. בדיקת Hemagglutination מודדת את כמות הספייק של HA על פני השטח של חלקיקי הפסאודו-וירוס. שלוש בדיקות אלה משמשות לכימות חלקיקים נגיפיים לא פונקציונליים. בדיקת זיהוי RLA היא השיטה העיקרית למדידת הריכוז של חלקיקים נגיפיים פונקציונליים שיכולים להדביק תאים מותמרים ולשחרר גנים מדווחים במלאי פסאודו-וירוס. תאי MDCK משמשים בדרך כלל כתאים מותמרים. תאים מותמרים נזרעים בלוחות תרבית של 96 בארות, נגועים בפסאודו-וירוס, עוברים ליזה על ידי חיץ ליזיס, ולאחר מכן מועברים ללוחות לומנומטר של 96 בארות כדי לקרוא ערכים. כמויות תאים שונות וזמני דגירה שונים משפיעים על ערכי RLA. בהתבסס על התוצאות, ביטוי הגן של המדווח גבוה כאשר 5000 תאים נזרעים לכל באר על צלחת של 96 בארות, ו- RLA מזוהה לאחר 60 שעות לאחר ההדבקה בנגיף.
מבחני H5 HPAI pseudovirus neutralization (PN) יושמו באופן נרחב לזיהוי נוגדנים בגלל בטיחותם, רגישותם, דיוקם והתאמתם לסינון בתפוקה גבוהה. פרוטוקול כללי של בדיקת נוירופתיה היקפית כולל את ארבעת השלבים הבאים: כמויות פסאודו-וירוס, דילול בסרום, דגירה של נוגדנים פסאודו-וירוסים וזיהוי פעילות לוציפראז. כמויות pseudovirus מנורמל מבוסס על קריאות RLA. ערכי RLA של 106 לכל באר בצלחת של 96 בארות משמשים להשגת תוצאות ניסוי הניתנות לשחזור. נקודת ההתחלה של דילול דגימת הסרום חייבת להיות מעל 40. מרכיב דגימת הסרום יגדיל כמובן את ערכי הלוציפראז של פסאודו-וירוס כאשר גורם הדילול של דגימת הסרום הוא פחות מ -40. תערובת נוגדנים פסאודו-וירוס מודגרת במשך שעה אחת ב-37°C ולאחר מכן מועברת לתאי MDCK, ולאחר מכן מזהה קריאות RLA תוך 60 שעות. רמות Luciferase נלקחים בדרך כלל ככלי כדי לקבוע יעילות זיהום pseudovirus.
בבדיקת נוירופתיה היקפית, ישנם ארבעה יסודות חשובים: חלבון כתב לוציפראז, כימיית המבחן, לומינומטר ומיקרו-צלחות16. ראשית, הגן luciferase הוא codon אופטימיזציה כדי לשפר את רמות ביטוי חלבון בתאים מותמרים. הנדסת הגנים של המדווח ועמוד השדרה הווקטורי מפחיתה את מספר אתרי הקישור של פקטורי שעתוק קונצנזואליים כדי לצמצם את סיכון השעתוק החריג. שנית, ריאגנטים מתאימים לגילוי נבחרים בהתאם למטרת הניסוי. בדיקות נוירופתיה היקפית משמשות בדרך כלל כשיטות בעלות תפוקה גבוהה לזיהוי תגובות מנטרלות של דגימות סרום או נוגדנים. פרוטוקול זה השתמש במערכת הבדיקה bright-Glo luciferase, המציעה את האות הבהיר ביותר, טווח דינמי רחב ורגישות גבוהה. חשוב מכך, זמן מחצית החיים של האות הוא כ -10 דקות, והתאים נבדקים מיד לאחר הוספת המצע. לומינומטר משמש לזיהוי ריכוז לוציפראז. סוגים רבים ושונים של לומינומטרים מיוצרים. העיקרון הבסיסי הוא כי המכונה בשימוש יכול לזהות במדויק הבדלים בפעילות luciferase בין דגימות שונות. יש להשתמש במיקרו-לוחות פוליסטירן שחורים או לבנים עבור אטימות ורקעים זוהרים נמוכים. מיקרו-לוחות לבנים יכולים לשפר אותות זוהרים ויש להם בהירות רקע נמוכה, בעוד שמיקרו-לוחות שחורים יכולים למזער את פיזור האור כדי להפחית דיבור צולבטוב היטב 17.
בדיקות נוירופתיה היקפית עולות בקנה אחד עם שיטות מסורתיות לזיהוי תגובות נוגדנים מנטרלות. עם זאת, כולל רק חלבוני HA ו-NA מנגיפי פרא מסוג שפעת, פסאודו-וירוסים רחוקים מהנגיף הפראי. חומצה היאלורונית יכולה להיקשר לקולטן החומצה הסיאלית של התא המקבל כדי ליזום זיהום. לאחר מכן, השינויים בקונפורמציה של חומצה היאלורונית באנדוזום מעוררים את האיחוי של הקרומים הנגיפיים והאנדוזומלים, ומשחררים את הריבונוקלאו פרוטאינים הנגיפיים (vRNPs) לתוך הציטופלסמה. פסאודו-וירוסים של שפעת יכולים רק לחקות תהליכים אלה והם מיושמים במחקרים קשורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המחקר מפרויקט בניית יכולת החדשנות של מחוז ג'יאנגסו (BM2020019), הפרויקט המדעי והטכנולוגי של שנזן (לא. JSGG20200225150702770), תוכנית מחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDB29030103), הפרויקט המדעי והטכנולוגי של גואנגדונג (מס '2020B1111340076) ותוכנית המחקר הפתוח של מעבדת מפרץ שנזן (לא. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al.
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R.
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
- Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).
