Summary
Aquí describimos un protocolo para el empaquetado de pseudovirus y la medición de la actividad neutralizante de anticuerpos.
Abstract
Desde 1996, los virus H5 de la influenza aviar altamente patógena (HPAI) de linaje A/ganso/Guangdong/1/96 han estado causando brotes de influenza en aves de corral y aves silvestres. Ocasionalmente, los humanos también son víctimas de ella, lo que resulta en una alta mortalidad. No obstante, la investigación del virus HPAI a menudo se ve obstaculizada, teniendo en cuenta que debe manejarse dentro de los laboratorios de nivel 3 de bioseguridad. Para abordar este problema, los pseudovirus se adoptan como una alternativa a los virus de tipo salvaje en algunos experimentos de estudios de HPAI H5. Los pseudovirus demuestran ser las herramientas ideales para estudiar anticuerpos neutralizantes contra los virus H5 HPAI. Este protocolo describe los procedimientos y pasos críticos de las preparaciones de pseudovirus H5 HPAI y los ensayos de neutralización de pseudovirus. Además, se analiza la solución de problemas, la limitación y las modificaciones de estos ensayos.
Introduction
Desde 1996, los virus H5 de la influenza aviar altamente patógena (HPAI) de linaje A/goose/Guangdong/1/96 han estado causando brotes continuos de gripe en aves de corral y aves silvestres, lo que representa enormes pérdidas socioeconómicas en la industria avícola mundial. A veces, los humanos también se infectan con ella, enfrentándose a una alta tasa de mortalidad 1,2. Sin embargo, la investigación del virus HPAI a menudo se ve obstaculizada, dado que no se puede manejar fuera de los laboratorios de nivel 3 de bioseguridad. Para abordar este problema, los pseudovirus se adoptan como una alternativa a los virus de tipo salvaje en algunos experimentos de estudios de HPAI H5. Los pseudovirus son lo suficientemente seguros como para practicarlos en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad.
Los pseudovirus H5 HPAI pertenecen a virus quiméricos que consisten en núcleos de virus sustitutos, envolturas lipídicas con glicoproteínas de superficie de los virus de la influenza y genes reporteros. Los núcleos de pseudovirus generalmente se derivan del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) lentiviral, retrovirus como el virus de la leucemia murina (MLV) y el virus de la estomatitis vesicular (VSV)3. Específicamente, el sistema de empaquetado del VIH-1 es ampliamente utilizado para producir pseudovirus de la influenza, donde los genes primarios proporcionados son gag y pol. El gen gag del VIH expresa proteínas centrales. El gen pol expresa la integrasa y la transcriptasa inversa, las cuales son necesarias para la expresión del gen reportero en las células transducidas. Imitando el genoma del virus sustituto, el gen reportero se adopta en el núcleo del pseudovirus en forma de ARN. El gen reportero expresará la proteína en las células huésped. Los niveles de expresión génica de los genes reporteros pueden ser utilizados para medir la eficiencia de la infección por pseudovirus 3,4. El reportero principal es luciferasa luciérnaga para medir las unidades de luminiscencia relativa (RLU) o la actividad relativa de luciferasa (RLA) en células transducidas. También se utilizan otros reporteros como lacZ, Gaussia y Renilla luciferasa, solo que en menor medida5.
Los pseudovirus son herramientas ideales para estudiar anticuerpos neutralizantes contra los virus H5 HAPI. Para medir la potencia de los anticuerpos neutralizantes, se utilizan ensayos de neutralización de pseudovirus (PN)6. La hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) son glicoproteínas en la superficie del virus de la gripe A 7,8. El AH está compuesto por un dominio globular de la cabeza para la unión al receptor y un dominio del tallo para la fusión de la membrana. La proteína NA tiene la actividad sialidasa para facilitar la liberación del virus 7,8. Un ensayo de PN puede medir anticuerpos neutralizantes dirigidos a proteínas HA. Los anticuerpos neutralizantes dirigidos a la región de la cabeza y el tallo de HA también se pueden detectar mediante ensayos de unión viral y entrada. En comparación con los virus de tipo salvaje, los experimentos de neutralización de pseudovirus tienen valores de detección más sensibles, se pueden manejar de manera segura en un laboratorio de bioseguridad de Nivel 2 y, en general, son más fáciles de operar en la práctica.
Este protocolo presenta en detalle los procedimientos y pasos críticos de las preparaciones de pseudovirus H5 HPAI y los ensayos de PN. Además, se analiza la solución de problemas, la limitación y las modificaciones de estos ensayos. En este estudio, se utilizó como ejemplo la cepa A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) de los virus H5N1 HPAI. Para obtener los sueros inmunes utilizados en los ensayos, este protocolo seleccionó la proteína HA procedente de la cepa TH como inmunógeno para inmunizar ratones.
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Protocol
Todas las operaciones experimentales relacionadas con pseudovirus se realizaron bajo la condición ABSL2 en el Instituto Pasteur de la Academia China de Ciencias de Shanghai (IPS, CAS). Los experimentos con animales se realizaron con base en los protocolos animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de IPS, CAS.
1. Envasado de pseudovirus con transfección de fosfato de calcio
- Hacer suspensiones unicelulares de células HEK293FT (9 x 105 por ml) en medio DMEM completo (Tabla 1). Añadir 10 ml de las suspensiones unicelulares a un matraz T75, incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono (CO2) al 5% a 37 °C durante 20 h antes de la transfección.
NOTA: Se recomienda HEK293FT paso bajo (<20 pasajes). Asegúrese de que la monocapa celular sea 80-90% confluente. - Reemplace el medio con 10 ml de medio completo fresco que contenga cloroquina (100 μM) 2 h antes de la transfección.
- Mezclar los reactivos y el ADN plásmido como se muestra en la Tabla 2 y la Figura 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8.9, 2.5 M CaCl2y 2x tampón HEPES. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 5 veces suavemente, incubar la mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 20 min.
- Transfiera la mezcla al medio por encima de las células y balancee el matraz suavemente. Incubar las células en la incubadora de células durante 15 h.
- Reemplace el medio con 15 ml de medio DMEM completo fresco. Incubar las células en una incubadora deCO2 a 37 °C, 5% durante 65 h.
NOTA: El color del medio será naranja claro o ligeramente amarillo, y al menos el 80% de la célula debe mostrar el efecto citopático (CPE) bajo el microscopio de luz invertida. - Cosechar el sobrenadante y centrifugarlo a 2095 x g durante 20 min a 4 °C. Recoger el sobrenadante, alícuota y almacenarlo a -80 °C.
2. Detección de la expresión de la proteína HA, NA y VIH-1 p24 del pseudovirus de la gripe
- Detectar la expresión de la proteína HA mediante el ensayo de hemaglutinina (HA).
- Agregue 50 μL de PBS en las columnas 2-12, filas A, B y C de una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
NOTA: Las filas A, B y C pertenecen a 3 pruebas de replicación independientes, y la columna 12 se utiliza como control negativo. - Añadir 100 μL de pseudovirus en los pocillos de la columna 1. Transfiera 50 μL de la columna 1 a la columna 2, mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces, realice las diluciones dobles hasta la última columna 11 y deseche los 50 μL adicionales de la columna 11.
- Añadir 50 μL de eritrocitos al 0,5% en cada pocillo, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces. Incubar la placa durante 30-60 min en RT o hasta que los eritrocitos del control negativo formen las manchas regulares en el fondo del pozo.
- Observar y registrar los títulos de HA del pseudovirus.
NOTA: La unidad HA de los pseudovirus es el factor de dilución más alto del virus que puede causar el 100% de hemaglutinación de los glóbulos rojos.
- Agregue 50 μL de PBS en las columnas 2-12, filas A, B y C de una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
- Detectar la expresión de proteínas HA y NA mediante el ensayo de Western blot.
NOTA: Todos los pasos de Western blot se realizan de acuerdo con el manual de clonación molecular (4ª edición). - Detectar la expresión de la proteína VIH-1 p24 mediante el kit ELISA VIH-1 p24 (Tabla de materiales).
- Añadir 50 μL del tampón de lisis en 450 μL de muestra de pseudovirus. Mézclalo bien.
- Agregue 300 μL del tampón de lavado a cada pocillo de la microplaca. Golpee la placa invertida para eliminar el tampón de lavado por completo. Repita el lavado 5 veces.
- Agregue 200 μL del patrón y muestree a cada pocillo por separado. Incubarlos a 37 °C durante la noche o durante 2 h.
- Aspirar el contenido de la placa y lavarla como se describe en el paso 2.3.2.
NOTA: Deje un pocillo de la placa de ensayo vacío para usarlo como sustrato en blanco. - Agregue 200 μL de anticuerpos del detector p24 a cada pocillo. Incubarlos a 37 °C durante 1 h. Aspirar y lavar la placa como se describe en el paso 2.3.2.
- Añadir 100 μL de la solución de trabajo estreptavidina-peroxidasa a cada pocillo e incubarlos a 37 °C durante 30 min. Aspirar y lavar la placa como se describe en el paso 2.3.2.
- Añadir 100 μL de la solución de trabajo del subestado a cada pocillo, incluido el pocillo en blanco del sustrato, e incubarlos a 37 °C durante 30 min.
NOTA: El color azul se desarrollará en los pozos. - Agregue 100 μL del tope de parada a cada pocillo.
NOTA: El color azul cambiará a amarillo inmediatamente. - Lea la densidad óptica a 450 nm en 15 min. Registrar los títulos de p24 del pseudovirus
3. Titulación de pseudovirus
- Haga suspensiones unicelulares de células MDCK (5 x 104 por ml) en medio DMEM completo, agregue 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 y 40000 células a diferentes pocillos de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las células en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 20 h.
- Saque el pseudovirus del refrigerador a -80 °C, descongélelo en el hielo y haga un vórtice con el pseudovirus.
- Agregue 6 pseudovirus HAU (6x unidades HA) a cada pocillo de placa de fondo redondo de 96 pocillos y reponga cada pocillo con DMEM completo de hasta 120 μL.
- Pipetear arriba y abajo de la mezcla 5 veces para mezclar bien. Incubar la placa de mezcla en una incubadora deCO2 a 37 °C, al 5 % durante 1 hora.
- Transfiera 100 μL de la mezcla a las células en la placa de 96 pocillos. Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en la incubadora durante 48 h, 60 h y 72 h después de la infección por virus.
- Saque la placa de la incubadora y realice el ensayo de luciferasa (Tabla de materiales).
- Retire el medio de los pocillos de la placa con cuidado. Enjuague las células con 200 μL de PBS y retire el PBS tanto como sea posible.
NOTA: Voltea la placa y desecha el sobrenadante golpeándolo hacia atrás sobre papel absorbente. Si la línea celular de prueba no pudo adherirse firmemente a la parte inferior, retire la aspiración del medio con cuidado. - Agregue 50 μL del tampón de lisis a cada pocillo y balancee la placa de cultivo varias veces. Conservar el plato a -80 °C durante la noche.
NOTA: Mezcle 1 volumen de tampón de lisis 5x con 4 volúmenes de agua para hacer el tampón de lisis 1x. Equilibre el búfer de lisis 1x a RT antes de usarlo. Balancee la placa para asegurarse de que las células estén cubiertas completamente con el tampón de lisis. El proceso único de congelación-descongelación puede ayudar a que la célula se lise por completo. - Sacar el plato, equilibrar a RT durante 2 h.
NOTA: La célula debe ser lisada completamente. - Balancee la placa varias veces suavemente y transfiera todos los lisados celulares a placas opacas de 96 pocillos.
- Agregue 50 μL del sustrato a cada pocillo, balancee la placa varias veces suavemente y mezcle bien el sustrato y el tampón de lisis.
- Mida la luz producida en 5 minutos con un luminómetro. Registre los títulos de luciferasa del pseudovirus.
NOTA: Cuando se agrega un sustrato adecuado, la luz se emite como un subproducto a través de una reacción química en la que la luciferina se convierte en oxiluciferina por la enzima luciferasa. La cantidad de luz producida es proporcional a la cantidad de la enzima luciferasa.
4. Preparación de sueros inmunes
NOTA: El suero inmune se utilizará para experimentos relacionados con células, y la operación experimental debe llevarse a cabo en condiciones asépticas.
- Prepare 12 ratones hembra BALB/c de ocho semanas de edad. Divida por igual a los ratones en dos grupos.
NOTA: Un grupo fue el grupo DDV y el otro fue el grupo de control negativo. - Inmunización del grupo DDV: Prepare dos veces por vía intramuscular con 100 μg de un plásmido de ADN optimizado para codón que codifica la proteína HA A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) en la semana 0 y la semana 3 y aumente una vez por vía intraperitoneal con 512 partículas similares al virus HAU TH (VLP) en la semana 6.
- Inmunización del grupo control: Prepara dos veces por vía intramuscular con 100 μg de ADN plásmido vectorial vacío en la semana 0 y la semana 3 y aumenta una vez por vía intraperitoneal con VLP gag VIH-1 en la semana 6.
- Recolectar la sangre del ratón 2 semanas después de la última inmunización.
NOTA: Aquí, los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico (65 mg / kg) en el momento de la recolección de sangre. Después de la recolección de sangre de la vena submandibular, los ratones fueron sacrificados inmediatamente conCO2. - Mantener la sangre en RT durante 2 h, luego 4 °C durante la noche. Centrifugar a 900 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Inactivar el suero colocándolo a 56 °C durante 30 min.
- Guarde los sueros inmunes en una nevera de -80 °C para su uso.
NOTA: Consulte la Figura suplementaria 1 para el diagrama de flujo que describe los principales procedimientos de inmunización en ratones.
5. Ensayo de neutralización de pseudovirus (PN)
- Haga suspensiones unicelulares de células MDCK (5 x 104 por ml) en medio DMEM completo, y agregue 100 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las células en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 20 h.
- Saque el pseudovirus y los sueros del refrigerador a -80 ° C, descongélelos en el hielo y haga un vórtice a fondo.
- Diluir los sueros en el medio completo 20 veces y agregar 100 μL de medio DMEM completo a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos de las columnas 2-10.
- Añadir 200 μL de sueros diluidos en los pocillos de la columna 2, transferir 100 μL de la columna 2 a la columna 3, diluir los sueros como 1:20, 1:40, 1:80, etc., a 1:10240 sucesivamente de la columna 2 a la columna 10, y desechar los 100 μL de la columna 10.
- Añadir 100 μL de medio completo DMEM a los pocillos de la columna 11 como control negativo.
- Añadir 100 μL de pseudovirus a cada pocillo, pipetear hacia arriba y hacia abajo de la mezcla 5 veces a fondo, e incubar la placa de mezcla a 37 °C, 5% deCO2 durante 1 h.
- Transfiera 100 μL de la mezcla de la placa de fondo redondo de 96 pocillos al pocillo correspondiente de la placa de cultivo celular de 96 pocillos. Volver a colocar la placa en la incubadora (37 °C, 5%CO2) durante 60 h.
- Saque el plato de la incubadora. Realice el ensayo de luciferasa como se describe en los pasos 3.7-3.12.
6. Ensayo de unión de pseudovirus
- Haga suspensiones unicelulares de células MDCK (4 x 104 por ml) en medio DMEM completo, y agregue suspensiones celulares de 100 μL a cada pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las células a 37 °C, 5%CO2 durante 20 h.
- Incubar el pseudovirus con sueros en DMEM que contenga 1% de BSA a 4 °C durante la noche.
NOTA: El volumen de la mezcla es de 100 μL. - Bloquear las células MDCK con 100 μL por pocillo de DMEM que contenga 1% de BSA a 4 °C durante 1 h.
- Inocular la mezcla de pseudovirus y suero (100 μL) en la monocapa de MDCK e incubarla a 4 °C durante 2 h.
- Lave la placa celular 4 veces con PBS que contenga 1% de BSA para eliminar cualquier virus no unido.
- Lise las células con 100 μL de tampón de lisis luciferasa a RT durante 30 min.
- Cuantificar la cantidad de virus unido en las células con un kit ELISA VIH-1 p24 como se describió anteriormente (sección 2.3).
7. Evaluación de la entrada viral
- Haga suspensiones unicelulares de células MDCK (5 x 104 por ml) en medio DMEM completo, y agregue 100 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las células a 37 °C, 5% deCO2 durante 20 h antes del ensayo.
- Inocular el pseudovirus (100 μL) en una monocapa de MDCK en una placa de 96 pocillos a 4 °C durante 6 h.
- Lave la placa celular 4 veces con PBS que contiene 1% de BSA para eliminar los pseudovirus no unidos.
- Añadir 100 μL de sueros inmunes diluidos en serie o sueros de ratones de vacunación simulada en DMEM que contiene 1% de BSA a la monocapa, e incubar la célula a 4 °C durante 2 h.
- Retire el sobrenadante celular y lave la placa de cultivo celular 4 veces con PBS que contenga 1% de BSA.
- Añadir DMEM fresco a las células e incubar durante 60 h en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 .
- Mida la actividad relativa de la luciferasa (RLA) de las células como se describe en los pasos 3.7-3.12.
NOTA: La entrada viral, según lo indicado por RLA, se expresó como un porcentaje de la lectura obtenida en ausencia de sueros, que se fijó en 100%.
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Representative Results
Expresión de la proteína HA, NA y VIH-1 p24 del pseudovirus de la gripe
Para identificar la eficiencia del empaquetado viral, las existencias de pseudovirus de la influenza se detectaron primero mediante el ensayo de AH (Figura 2A). Las unidades de AH por mililitro de pseudovirus de influenza son 643 (Tabla 3). Se utilizó el ensayo Western blot y los ensayos ELISA sándwich para probar la expresión de la proteína p24 de HA, NA y VIH-1. Luego se calcularon las proporciones de la unidad HA y la cantidad de gag p24 para pseudovirus. Los resultados del ensayo de Western blot mostraron que había 4 tipos de proteínas: proteínas HA0, HA1, HA2 y NA (Figura complementaria 2). Esto indica que las proteínas envolventes de los pseudovirus de la influenza son similares a las de los virus de tipo salvaje. Las razones de AH y Gag p24 estaban dentro de un rango normal según lo informado (Tabla 3)9.
| Cepas de pseudovirus | HAU/ml | 1.00E + 05 pg/mL | Relación de HAU/1.00E+05 pg* |
| P A/Tailandia/(KAN-1)/2004 | 642,52 ± 30,26 | 4,20 ± 0,17 | 152.98 |
| *Las proporciones de las unidades de AH y la cantidad de VIH-1 Gag p24 en pseudovirus se calcularon de la siguiente manera: unidades de HA/la cantidad de Gag p24. | |||
Tabla 3: Cuantificación del pseudovirus H5.
Titulación de pseudovirus
Para medir la concentración de partículas virales funcionales, se detectó actividad relativa de luciferasa (RLA) del pseudovirus. Las lecturas de RLA dependen de muchas variables. Para identificar el efecto de la cantidad de células transducidas en las lecturas de RLA, sembramos las células de 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 y 40000 por pocillo de placa de 96 pocillos (Figura 2). Los resultados mostraron que las lecturas de RLA de pseudovirus son las más altas, y el error estándar de media es el más bajo cuando se siembran 5000 células en un pocillo de placa de 96 pocillos (Figura 4A). Para identificar el efecto del tiempo de incubación, las lecturas de RLA se detectan a las 48 h, 60 h y 72 h después de la infección por el virus. Los resultados mostraron que cuando se incuban durante 60 h, las lecturas de RLA del pseudovirus son más altas en valores y mejores en repetibilidad con bajo error estándar de la media (Figura 4B). Los resultados indican que es adecuado para sembrar 5000 células en un pocillo de una placa de 96 pocillos y detectar lecturas de RLA 60 h después de la infección por virus.
Ensayos de PN
Los títulos de neutralización de sueros inmunes del grupo control y del grupo DDV se midieron mediante ensayos de PN (Figura 5). Como se muestra en la Figura 5A, los sueros inmunes del grupo DDV exhibieron altos títulos de neutralización contra la cepa del pseudovirus A/Thailand/1(KAN)-1/04. En contraste, los sueros del grupo control no exhibieron ninguna actividad de neutralización (Figura 5B). En comparación con los ensayos serológicos tradicionales (ensayos HI y MN), los ensayos de NP son más sensibles (no se muestran datos).
Ensayo de neutralización de accesorios
Algunos anticuerpos de neutralización pueden dificultar la unión de los virus a los receptores de ácido siálico. Estos anticuerpos se dirigen a la cabeza de HA y son predominantes después de la inmunización mediante vacuna comercial o infección por el virus de la gripe. Para identificar la actividad neutralizante de estos anticuerpos, se realizan ensayos de neutralización de unión (Figura 3). En comparación con los sueros de control, la actividad neutralizante de los sueros inmunes es potente, lo que indica que hay muchos anticuerpos dirigidos a la cabeza de HA en los sueros inmunes (Figura 6A).
Evaluación de la entrada viral
Este ensayo se utiliza para identificar anticuerpos que dificultan la fusión de la envoltura del virus y las membranas endosomales durante la infección por el virus de la influenza. Estos anticuerpos se dirigen al dominio del tallo HA y comúnmente son menos potentes. Para medir los títulos de neutralización de estos anticuerpos, se realizan ensayos posteriores a la unión (Figura 3). Existen diferencias significativas entre los sueros inmunes y los sueros control, lo que indica que hay anticuerpos dirigidos a la región madre HA en los sueros inmunes (Figura 6B).
Figura 1: Diagrama de flujo de transfección mediada por calcio. Este diagrama de flujo se utiliza para describir los principales procedimientos de transfección mediada por calcio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cuantificación y titulación del pseudovirus. (A) Diagrama de flujo del ensayo de HA de pseudovirus que describe los pasos principales del ensayo de HA de pseudovirus. (B) Diagrama de flujo del ensayo de pseudovirus P24 que describe los pasos principales del ensayo de pseudovirus P24. (C) Diagrama de flujo del ensayo de titulación de pseudovirus que describe los pasos principales del ensayo de titulación de pseudovirus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayos de neutralización basados en pseudovirus. (A) Diagrama de flujo del ensayo de PN que describe los pasos principales del ensayo de PN. (B) Diagrama de flujo del ensayo de unión de pseudovirus que describe los pasos principales del ensayo de apego. (C) Diagrama de flujo de evaluación del ensayo de entrada viral que describe los pasos principales del ensayo de entrada viral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Titulación de pseudovirus. (A) Diferentes cantidades de células por pocillo en una placa de 96 pocillos influyen en las lecturas de RLA. Se sembraron 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 y 40000 células en una placa de 96 pocillos. (B) El tiempo de cosecha diferente influye en las lecturas de RLA. Las lecturas de RLA se detectan a las 48 h, 60 h y 72 h después de la infección por el virus. Los datos recopilados de tres experimentos independientes se presentan como media ± SEM; las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Se realizó ANOVA unidireccional con prueba de Tukey. P < 0,0001; ns, no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Respuestas de anticuerpos neutralizantes H5 detectadas con pseudovirus. (A) Titulación de las respuestas de anticuerpos neutralizantes de los sueros inmunes del grupo DDV. (B) Titulación de las respuestas de anticuerpos neutralizantes de los sueros inmunes del grupo control. El IC 50 se define como las diluciones recíprocas del anticuerpo neutralizante que puede inhibir el50 % del pseudovirus. Los datos recopilados de tres experimentos independientes se presentan como media ± SEM; las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). El pseudovirus VSVG se utilizó como control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Detección de la potencia de anticuerpos de neutralización mediante ensayos de unión y entrada viral. (A) Los sueros inmunes del grupo DDV, no los del grupo control, inhiben la unión viral a las células. (B) Los sueros inmunes del grupo DDV, no los del grupo de control, inhiben parcialmente la infección viral posterior al apego. Los datos recopilados de tres experimentos independientes se presentan como media ± SEM; las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Composición media DMEM completa | Concentración |
| Medio Águila Modificada de Dulbecco (DMEM) | 1x |
| Suero bovino fetal | 10% |
| Penicilina(1 U/ml)/estreptomicina | 1 μg/ ml |
Tabla 1: Composición media DMEM completa.
| Materiales | Concentración | Volumen |
| 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675,0 μL |
| CaCl 2 (2,5 m) | -- | 67,5 μL |
| ddH2O | -- | 529,2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27,0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13,5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
Tabla 2: Sistema de empaquetado de pseudovirus.
Figura complementaria 1: Diagrama de flujo de la inmunización del ratón. Este diagrama de flujo describe los principales procedimientos de inmunización del ratón. Los sueros inmunes se utilizaron como muestras. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Expresión de la proteína HA, NA y VIH-1 p24 del pseudovirus de la gripe. Western blot de proteínas pseudovirus. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
HEK293FT células se utilizan generalmente como células de empaquetamiento para producir pseudovirus. La detección regular de micoplasmas es esencial durante el cultivo celular. La contaminación por micoplasma puede disminuir drásticamente los rendimientos de pseudovirus y, a veces, cerca de cero. En comparación con otras contaminaciones, las contaminaciones por micoplasma no provocan cambios en el valor del pH ni en la turbidez del medio de cultivo celular. Incluso una alta concentración de micoplasma no es visible a simple vista o bajo un microscopio. Tres métodos populares de detección de micoplasmas son el cultivo de micoplasma, la tinción de ADN con DAPI fluorescente o Hoechst 33258 y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La amplificación por PCR del ADN del micoplasma en muestras de cultivo se utiliza ampliamente para realizar pruebas de micoplasma rápidas, fáciles y fiables10.
La transfección mediada por fosfato de calcio se ha utilizado para el envasado de pseudovirus de la influenza durante muchos años debido a su alta eficiencia, bajo costo y fácil operación11. Sin embargo, este método es muy sensible al valor de pH de una solución tamponada con HEPES, al medio de cultivo celular HEK293FT y al H2O de doble destilación. El valor del pH afectó la formación del precipitado y el tiempo de duración de la permanencia del precipitado en HEK293FT células. Por lo tanto, puede determinar la cantidad de ADN que es absorbida por HEK293FT células. El pH de una solución tamponada con HEPES es extremadamente estrecho, oscilando entre 7,05-7,1212,13,14, condición en la que se forma lentamente un precipitado que contiene fosfato de calcio y ADN en una solución tamponada con HEPES. Si el pH es demasiado alto, el tamaño del precipitado se volverá tan grande que incluso puede matar las células HEK293T. Por el contrario, si el pH es demasiado bajo, el precipitado no se puede formar, o el precipitado será demasiado pequeño para asentarse en la superficie celular. Además, el pH del medio de cultivo celular HEK293FT también juega un papel en la eficiencia de la transfección. Durante la transfección, el medio celular debe mantenerse entre un pH de 7.2-7.4. Tanto los medios hiperácidos como los alcalinos cambiarán el tamaño del precipitado y el tiempo de adsorción de la mezcla de ADN en la superficie celular. Además, elH2Ode doble destilación con diferentes orígenes utilizado en la mezcla de ADN puede alterar el pH de una solución tamponada con HEPES. Por lo tanto, mantener un valor de pH estable de la solución de transfección y el medio de cultivo es crucial para garantizar una alta eficiencia de transfección. Además, la eficiencia de la transfección también se ve afectada por la solución de CaCl 2 de 2,5 M y la concentración de dióxido de carbono (CO2) en la incubadora celular. Durante el proceso de transfección, es crucial almacenar la solución de CaCl2 adecuadamente y estabilizar la concentración deCO2 en la incubadora.
El sistema de empaquetado más popular del pseudovirus de la influenza implica un enfoque de co-transfección de plásmidos múltiples. Los genes HA, NA, reportero y lentiviral gag y pol se clonan en vectores de expresión de plásmidos por separado, y luego se transfectan en las células simultáneamente. Para aumentar la expresión de proteínas, a menudo se agrega una secuencia de consenso de Kozak antes del sitio de inicio de la transcripción.
Es necesario preparar ADN plásmido puro, superenrollado y libre de endotoxinas15. Dado que la proporción de plásmidos afecta directamente a los rendimientos de pseudovirus. Este protocolo optimizó la proporción de plásmidos del "núcleo: reportero: HA: NA" a 28:28:4:1 y lo comparó con otros métodos de transfección. Se requiere que la cantidad de ADN plásmido en la transfección de fosfato de calcio alcance hasta 30,5 μg por plato de 100 mm.
Los títulos de pseudovirus se detectan mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo de hemaglutinación y ensayos de detección de RLA. El ensayo qRT-PCR se utiliza para estimar el número de copias de genes de ARN del interior del pseudovirus5. El ensayo ELISA se utiliza para detectar el contenido de la proteína p24, que es el componente principal del núcleo del VIH. El ensayo de hemaglutinación mide la cantidad de pico de HA en la superficie de las partículas de pseudovirus. Estos tres ensayos se emplean para cuantificar partículas virales no funcionales. El ensayo de detección de RLA es el método principal para medir la concentración de partículas virales funcionales que pueden infectar células transducidas y liberar genes reporteros en el stock de pseudovirus. Las células MDCK se usan comúnmente como células transducidas. Las células transducidas se siembran en placas de cultivo de 96 pocillos, se infectan con pseudovirus, se lisan mediante tampón de lisis y luego se transfieren a placas luminómetros de 96 pocillos para leer los valores. Diferentes cantidades de células y tiempos de incubación influyen en los valores de RLA. Según los resultados, la expresión del gen reportero es alta cuando se siembran 5000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos, y RLA se detecta a las 60 h después de la infección por el virus.
Los ensayos de neutralización del pseudovirus (NP) H5 HPAI se han aplicado ampliamente para la detección de anticuerpos debido a su seguridad, mayor sensibilidad, precisión e idoneidad para el cribado de alto rendimiento. Un protocolo general de ensayo de NP incluye los siguientes cuatro pasos: cantidades de pseudovirus, dilución sérica, incubación de anticuerpos pseudovirus y detección de actividad luciferasa. Las cantidades de pseudovirus se normalizan en función de las lecturas de RLA. Se utilizan valores de RLA de 106 por pocillo en una placa de 96 pocillos para obtener resultados de experimentos reproducibles. El punto de inicio de la dilución de la muestra de suero debe ser superior a 40. El componente de la muestra de suero obviamente aumentará los valores de luciferasa del pseudovirus cuando el factor de dilución de la muestra de suero sea inferior a 40. La mezcla de pseudovirus y anticuerpo se incuba durante 1 h a 37 °C y luego se transfiere a las células MDCK, seguida de la detección de lecturas de RLA en 60 h. Los niveles de luciferasa generalmente se toman como una herramienta para determinar la eficiencia de la infección por pseudovirus.
En el ensayo de NP, hay cuatro elementos importantes: la proteína reportera de luciferasa, la química del ensayo, un luminómetro y microplacas16. En primer lugar, el gen de la luciferasa está optimizado para el codón para mejorar los niveles de expresión de proteínas en las células transducidas. La ingeniería de los genes de la columna vertebral del reportero y del vector reduce el número de sitios de unión al factor de transcripción de consenso para reducir el riesgo de transcripción anómala. En segundo lugar, los reactivos de detección adecuados se seleccionan de acuerdo con el objetivo del experimento. Los ensayos de PN se utilizan generalmente como métodos de alto rendimiento para detectar respuestas neutralizantes de muestras de suero o anticuerpos. Este protocolo utilizó el sistema de ensayo de luciferasa bright-Glo, que ofrece la señal más brillante, un amplio rango dinámico y una alta sensibilidad. Más importante aún, la vida media de la señal es de aproximadamente 10 minutos, y las células se prueban inmediatamente después de agregar el sustrato. Se utiliza un luminómetro para detectar la concentración de luciferasa. Se fabrican muchos tipos diferentes de luminómetros. El principio básico es que la máquina utilizada puede identificar con precisión las diferencias en la actividad de la luciferasa entre diferentes muestras. Las microplacas de poliestireno blanco o negro deben usarse para la opacidad y los fondos poco luminiscentes. Las microplacas blancas pueden mejorar las señales luminiscentes y tienen baja luminiscencia de fondo, mientras que las microplacas negras pueden minimizar la dispersión de la luz para reducir la diafonía de pozo a pozo17.
Los ensayos de NP están en línea con los métodos tradicionales para detectar respuestas de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, incluyendo solo las proteínas HA y NA de los virus de tipo salvaje de la influenza, los pseudovirus están lejos del virus de tipo salvaje. HA puede unirse al receptor de ácido siálico de la célula receptora para iniciar la infección. Luego, los cambios conformacionales de HA en el endosoma desencadenan la fusión de las membranas viral y endosomal, liberando las ribonucleoproteínas virales (vRNP) en el citoplasma. Los pseudovirus de la influenza solo pueden imitar estos procesos y se aplican en investigaciones relacionadas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las becas de investigación del Proyecto de Desarrollo de Capacidades de Innovación de la provincia de Jiangsu (BM2020019), el Proyecto Científico y Tecnológico de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), el Programa de Investigación Estratégica Prioritaria de la Academia China de Ciencias (XDB29030103), el Proyecto Científico y Tecnológico de Guangdong (No. 2020B1111340076) y el Programa de Investigación Abierta del Laboratorio de la Bahía de Shenzhen (No. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al.
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R.
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
- Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).
