Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الجزء الأمامي منصة ثقافة الجهاز لتتبع إصابات الكرة الأرضية المفتوحة والأداء العلاجي

Published: August 25, 2021 doi: 10.3791/62649
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Sensory Trauma, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, 2Engineering Processes and Product Development Group, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston

Summary

قد تستمر إصابات العين المفتوحة في العالم دون علاج لعدة أيام في السيناريوهات الريفية أو ذات الصلة بالجيش ، مما يؤدي إلى العمى. هناك حاجة إلى العلاجات لتقليل فقدان البصر. هنا، ونحن بالتفصيل ثقافة الجهاز نموذج إصابة الكرة الأرضية المفتوحة. مع هذا النموذج، يمكن تقييم العلاجات المحتملة لتحقيق الاستقرار في هذه الإصابات بشكل صحيح.

Abstract

إصابات الكرة الأرضية المفتوحة لها نتائج بصرية ضعيفة، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى فقدان دائم للرؤية. ويعزى ذلك جزئيا إلى التأخير الممتد بين الإصابات والتدخل الطبي في البيئات الريفية وتطبيقات الطب العسكري حيث لا تتوفر رعاية العيون بسهولة. الإصابات غير المعالجة عرضة للعدوى بعد أن فقدت العين ختمها المائي ، وكذلك فقدان صلاحية الأنسجة بسبب انخفاض ضغط الدم داخل العين. قد تكون العلاجات لختم إصابات الكرة الأرضية المفتوحة مؤقتا ، إذا تم تطويرها بشكل صحيح ، قادرة على استعادة الضغط داخل العين ومنع العدوى حتى تكون الرعاية المناسبة للأفتولام ممكنة. لتسهيل تطوير المنتج ، مفصل هنا هو استخدام منصة إصابة مفتوحة في العالم المفتوح لثقافة الجهاز الجزء الأمامي لتتبع الأداء العلاجي لمدة 72 ساعة على الأقل بعد الإصابة. يمكن الحفاظ على أنسجة الجزء الأمامي Porcine في أطباق ثقافة الأعضاء المصممة خصيصا وعقد في الضغط الفسيولوجي داخل العين. يمكن إنشاء إصابات ثقب مع نظام يعمل بالهواء المضغوط قادرة على توليد أحجام الإصابات تصل إلى 4.5 ملم في القطر، على غرار أحجام الإصابات ذات الصلة العسكرية. يمكن ملاحظة فقدان الضغط داخل العين لمدة 72 ساعة بعد الإصابة مما يؤكد التعريفي السليم للإصابة وفقدان ختم العين محكم. يمكن تتبع الأداء العلاجي عن طريق التطبيق على العين بعد تحريض الإصابة ومن ثم تتبع الضغط داخل العين لعدة أيام. علاوة على ذلك ، ينطبق نموذج إصابة الجزء الأمامي على الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتتبع فسيولوجيا الجزء الأمامي وظيفيا وبيولوجيا ، مثل تقييم الشفافية ، وميكانيكا العين ، وصحة ظهارة القرنية ، وقابلية بقاء الأنسجة. بشكل عام ، فإن الطريقة الموصوفة هنا هي خطوة تالية ضرورية نحو تطوير علاجات المواد الحيوية لإغلاق إصابات الكرة الأرضية المفتوحة مؤقتا عندما لا تكون رعاية العيون متاحة بسهولة.

Introduction

يمكن أن تؤدي إصابات الكرة الأرضية المفتوحة (OG) إلى فقدان دائم للرؤية عند عدم علاجها أو على الأقل استقرارها بعد الإصابة1. غير أن حالات التأخير منتشرة في المناطق النائية حيث لا تتوفر بسهولة إمكانية الوصول إلى التدخل في العيون، كما هو الحال في المناطق الريفية أو في ساحة المعركة في السيناريوهات العسكرية. عندما لا يكون العلاج متاحا بسهولة، فإن المعيار الحالي للرعاية هو حماية العين بدرع صلب حتى يصبح التدخل الطبي ممكنا. في الطب العسكري، هذا التأخير حاليا تصل إلى 24 ساعة، ولكن من المتوقع أن تزيد تصل إلى 72 ساعة في العمليات القتالية في المستقبل في البيئات الحضرية حيث الإخلاء الجوي غير ممكن2،3،4. ويمكن أن تكون هذه التأخيرات أطول في التطبيقات المدنية الريفية النائية حيث يكون الوصول إلى التدخل في العيون محدودا5و6. إصابة OG غير المعالجة عرضة بشدة للعدوى وفقدان الضغط داخل العين (IOP) بسبب الختم المائي للعين التي تتعرض للخطر7،8. فقدان IOP يمكن أن تؤثر على صلاحية الأنسجة، مما يجعل أي تدخل طبي من غير المرجح أن استعادة الرؤية إذا كان التأخير بين الإصابة والعلاجية طويلة جدا9.

لتمكين تطوير العلاجات سهلة التطبيق لختم إصابات OG حتى يمكن الوصول إلى أخصائي العيون ، تم تطوير نموذج إصابة OG على سطح المقعد سابقا10،11. مع هذا النموذج، تم إنشاء إصابات عالية السرعة في عيون porcine كله في حين تم القبض على IOP من قبل محولات الضغط. ويمكن بعد ذلك أن تطبق العلاجات لتقييم قدرتها على ختم موقع إصابة OG12. ومع ذلك ، لأن هذا النموذج يستخدم عيون porcine كاملة ، فإنه لا يمكن تقييم الأداء العلاجي الفوري إلا مع عدم وجود طريقة لتتبع الأداء على المدى الطويل عبر نافذة 72 ساعة المحتملة التي يجب أن يستقر فيها العلاج في موقع الإصابة حتى يصل المريض إلى الرعاية المتخصصة. ونتيجة لذلك، تم تطوير نموذج إصابة OG لجزء من الجزء الأمامي (ASOC) ومفصل في هذا البروتوكول كمنصة لتتبع الأداء العلاجي طويل الأجل13.

ASOC هو تقنية تستخدم على نطاق واسع للحفاظ على الأنسجة الوعائية للجزء الأمامي، مثل القرنية، لعدة أسابيع بعد التلقيح14،15،16،17. يتم الحفاظ على الجزء الأمامي تحت IOP الفسيولوجية عن طريق تغلغل السوائل بمعدلات التدفق الفسيولوجي والحفاظ على منطقة تدفق الشبكة trabecular ، الأنسجة المسؤولة عن تنظيم IOP ، أثناء إعداد ASOC18،19. يمكن لمنصة ASOC الحفاظ على الأنسجة من الناحية الفسيولوجية ، والحث على إصابة OG باستخدام جهاز يعمل بالهواء المضغوط ، وتطبيق تثبيت علاجي ، وتتبع الإصابة لمدة 72 ساعة على الأقل بعد الإصابة13.

هنا، يوفر البروتوكول منهجية خطوة بخطوة لاستخدام النظام الأساسي ASOC. أولا تفاصيل كيفية إعداد وتصنيع منصة ASOC. بعد ذلك ، يفصل البروتوكول كيفية تشريح الجزء الأمامي بشكل مطهر والحفاظ على الشبكة الطرية ، تليها إعداد أنسجة الجزء الأمامي في أطباق ثقافة الأعضاء المصممة خصيصا. ثم، فإنه تفاصيل كيفية خلق إصابات الكرة الأرضية المفتوحة وتطبيق العلاجية مباشرة بعد الإصابة. وأخيرا، يقدم البروتوكول لمحة عامة عن معلمات التوصيف الممكن استخدامها مع هذه الطريقة التي تقيم الخصائص الوظيفية والميكاميكاتية والبيولوجية للعين ومدى استقرار الإصابة. وعموما، يوفر هذا النموذج منصة تشتد الحاجة إليها لتسريع تطوير المنتجات لتحقيق الاستقرار وعلاج إصابات الكرة الأرضية المفتوحة وتحسين تشخيص الرؤية الضعيفة بعد الإصابة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

قبل تنفيذ هذا البروتوكول، يجب أن تدرك أن هناك متطلبات قانونية وأخلاقية لاستخدام الحيوانات في البحث والتدريب. إذا تم استخدام الحيوانات الحية لمصدر الأنسجة العينية، اطلب موافقة السلطة الأخلاقية أو القانونية المحلية (IACUC أو لجنة الأخلاقيات، وما إلى ذلك) قبل البدء. إذا كان هناك أي سؤال في الحصول على الموافقة على استخدام الحيوانات، لا المضي قدما. نحن حددت سابقا وذكرت أن عيون porcine الطازجة التي تم الحصول عليها واستخدامها في غضون 24 ساعة بعد الوفاة مقارنة الأقرب إلى في فسيولوجيا الجسم الحي وبلي بلاء حسنا لهذه الدراسات (تقنيات الحيوان، تايلر، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية)10،13. لم يتم استخدام أي حية في جميع أنحاء هذا البروتوكول ، وذلك باستخدام بائع الأنسجة للحصول على الأنسجة في غضون 24 ساعة.

ملاحظة: قبل وصول الأنسجة، وتلفيق أطباق زراعة الجهاز (البروتوكول التكميلي 1)،حلقات لقط (البروتوكول التكميلي 1)،صحن تقف (البروتوكول التكميلي 1)،ضغط محول إعداد البيانات جمع (البروتوكول التكميلي 2)،ومنصة ثقب هوائي (البروتوكول التكميلي 3). تعقيم الأطباق والأدوات والمستلزمات وإعداد مناطق العمل. من المفيد أن يكون لديك منطقة غير معقمة لإجراء تشريح إجمالي على العينين ، لأنها عادة ما تأتي مع النسيج الضام المداري الإضافي المرفق. تنفيذ هذه الخطوات الأولى على سطح عمل مفتوح ونظيف، ومن ثم نقل العينين بشكل مطهر إلى خزانة BSC II للتشريح الجزئي (مجلس الوزراء # 1). على النحو الأمثل، يتم فصل مجلس الوزراء BSC II المستخدمة لتشريح الصغرى من مجلس الوزراء BSC الثاني تجميع طبق (مجلس الوزراء # 2) للحد من تدفق الهواء وتعظيم مساحة العمل. إعداد مجلس الوزراء تشريح الصغرى مع المجهر تشريح وطريقة لتصور سطح العمل (الكاميرا أو العدسة جاحظ من مجلس الوزراء).

1. خطوات التعقيم واللوازم (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل) ، والإعداد

  1. إعداد وتعقيم الغاز العناصر التالية (1 عدة لكل عين): طبق ASOC، حلقة لقط، موصلين السوائل مع O-الحلقات، واثنين من محاور إبرة 18 G، أربعة مسامير، بطولين من أنابيب PE-100 (طول المسافة يجب أن تكون طويلة بما يكفي لتمتد من الطبق داخل الحاضنة إلى مضخة الحقنة والضغط إعداد جمع البيانات محول)، اثنين من 18 G 90° محاور إبرة عازمة, اثنين من الصمامات 3-الاتجاه.
  2. إعداد وautclave مجموعات التالية.
    1. إعداد وautclave مجموعة أدوات تشريح الصغرى، التي تحتوي على زوج واحد من ملقط غرامة، زوج واحد من مقص فاناس، زوج واحد من ملقط مسنن متوسطة، زوج واحد من مقص كبير، مسحات القطن، وشفرة حلاقة أو مشرط.
    2. إعداد وautclave مجموعة أدوات التجميع، التي تحتوي على زوج واحد من ملقط مسنن متوسطة، زوج واحد من مقص الجراحية، واحد L-مفتاح.
    3. إعداد وautclave عدة اليومية (كمية: واحد في اليوم الواحد من الثقافة)، التي تحتوي على مفتاح L واحد لتشديد حلقات لقط إلى أطباق كل يوم حسب الحاجة.
    4. أوتوكلاف أربعة أكواب 100 مل لتطهير وتخزين العيون وشرائح الأمامي.
    5. أوتوكلاف الكائنات ثقب.
  3. جمع العناصر المعقمة التالية: طبق بيتري (طبق واحد / عين)، شاش (1-2/eye)، حامل طبق، 20 مسيل محاقن (1/عين)، 10 مسيل حقن (1/عين)، مرشحات حقن نايلون (1/عين).
  4. إعداد وسائل الإعلام العقيمة: DMEM مع 4٪ FBS، 1x الجلوتاماكس، 1x جنتاميسين، 1x المضادات الحيوية المضادة للميكويت (AA؛ ما يقرب من 30-40 مل وسائل الإعلام كاملة / العين).
  5. إعداد AA-PBS: برنامج تلفزيوني مع 1x AA (~ 500 مل).
  6. إعداد حزمة أداة تشريح الإجمالي: نظيفة وجافة مقص الجراحية الكبيرة والمملقط.
  7. إعداد مساحة عمل تشريح غير معقمة: جمع الإمدادات من حزمة أداة تشريح الإجمالي، عيون porcine الممتلأة غارقة في برنامج تلفزيوني وعلى الجليد، الستائر الجراحية، 100 مل كوب مع برنامج تلفزيوني. وضع الستائر الجراحية والبنود اللازمة لتشريح الإجمالي.
  8. إعداد مساحة عمل التشريح العقيمة: جمع الإمدادات من مجموعة أدوات التشريح الدقيق ، الشاش العقيم ، المجهر التشريحي ، محلول بيتادين ، PBS العقيم ، الوسائط العقيمة ، أربعة أكواب معقمة 100 مل ، طبق بيتري معقم. نقل بلطف إلى مجلس الوزراء BSC الثاني # 1. إعداد مجلس الوزراء لتصور العيون على المجهر تشريح.
  9. إعداد مساحة عمل تجميع ASOC: جمع مجموعات معقمة بالغاز (طقم الصحون ومجموعة الغطاء) ، ومجموعة أدوات التجميع ، والوسائط المعقمة ، ومواقف الأطباق ، وأطباق بيتري المعقمة ، والمحاقن المعقمة ، ومرشحات المحاقن. نقل بلطف إلى مجلس الوزراء BSC الثاني # 2. إعداد مجلس الوزراء لتجميع الطبق.
  10. عندما تستقر العيون وجاهزة للثقب (72 ساعة بعد الإعداد)، نقلها بشكل مطهر إلى خزانة BSC II. إعداد مساحة عمل التعريفي إصابة OG: جهاز التعريفي إصابة تعمل بالطاقة الهوائية (التجميع مفصلة في التكميلية 3)وجاك مختبر وعبر تتبع vise لعقد طبق ASOC.

2. تشريح الأنسجة

  1. إعداد الأنسجة porcine باستخدام مساحة عمل تشريح غير معقمة.
    1. شراء عيون porcine المتعلمين من مسلخ المحلية، والدراسات الحيوانية، أو بائع. الحفاظ على عيون على الجليد المغمورة في برنامج تلفزيوني أثناء التسليم واستخدامها على الفور عند تلقي.
    2. قطع الأنسجة خارج المدار وتقليم الملتحمة ترك قذيفة فقط corneoscleral والعصب البصري. إجراء تشريح تحت ظروف غير معقمة مع مقص جراحي كبير والملقط في حزمة أداة تشريح الإجمالي.
    3. وضع العينين مرة أخرى إلى برنامج تلفزيوني جديد على الجليد حتى جميع العيون المطلوبة لإعداد التجريبية قد تم تشريح الأولية / الإجمالي.
    4. غمر العينين في محلول بيتادين 10٪ لمدة 2 دقيقة في حاويات مغلقة ونقلها بشكل مطهر إلى خزانة BSC II # 1. تنفيذ جميع الأعمال اللاحقة في ظل ظروف معقمة لتقليل التلوث أثناء الإعداد.
  2. تشريح العقيم الأجزاء الأمامية.
    1. بعد 2 دقيقة في محلول بيتادين، نقل العينين إلى ثلاثة يغسل المسلسل من العقيمة AA-PBS لإزالة محلول بيتادين الزائد من سطح العين مع الحفاظ على عقم الأنسجة العينية. بعد ثلاث يغسل، والحفاظ على الأنسجة في AA-PBS حتى مزيد من الاستخدام.
    2. Hemisect العين باستخدام شفرة حلاقة / مشرط ومقص منحني. ضع العين على شاش غارق في AA-PBS وخلق شق مع شفرة حلاقة معقمة أو مشرط بالقرب من خط الاستواء للعين (60/40 انقسام مع 40 على الجانب الأمامي). باستخدام مقص جراحي منحني، قم بتقطيع العين لعزل العين الأمامية (نصف القرنية).
      ملاحظة: قطع حول الجزء الأمامي يحتاج إلى أن تكون مستمرة لمنع خشنة، حواف خشنة في الصلبة التي من شأنها أن تخلق تسرب السوائل بعد الإعداد في ثقافة الجهاز.
    3. استخدام microscissors كمجرفة لغرف الفكاهة الزجاجية من الجزء الأمامي. قم بإزالة العدسة من الجزء الأمامي باستخدام الميكروسيسورات. اترك الأجزاء الأمامية في AA-PBS حتى خطوات تشريح أخرى.
      ملاحظة: يمكن أن تعقد جميع العيون التي سيتم تشريحها في هذه الخطوة واحدا تلو الآخر التي اتخذت من خلال ما تبقى من عملية تشريح.
    4. مع المجهر تشريح، خفض القزحية إلى جذر القزحية تدريجيا، شعاعيا حتى شبكة trabecular (TM) مرئية. و TM هو نسيج مصطبغة التي تضم الألياف الموجهة محيطيا حول قذيفة كورنيلوسكليرال. سوف تخفيضات دقيقة في القزحية نحو جذر القزحية فضح عمق TM تحت الأنسجة.
    5. قطع 360 درجة حول القزحية في نفس عمق قطع الأولي في الأنسجة لفضح منطقة TM بأكملها. تنظيف أي القزحية المتبقية المتبقية التي تغطي TM حسب الضرورة.
    6. تقليم بقايا الجسم السيلاري الخلفي إلى TM، وترك فقط شريط رقيقة من الأنسجة الخلفية إلى منطقة TM (حوالي 1 ملم).
    7. ضع الجزء الأمامي تشريح (AS) في الوسائط حتى إعداد آخر في ASOC في BSC II مجلس الوزراء # 2.
      ملاحظة: يمكن أن تعقد جميع العيون في هذه المرحلة قبل الإعداد ASOC إذا كان مستخدم واحد هو إجراء تشريح وتجميع طبق ثقافة الجهاز.

3. إعداد شرائح الأمامية في أطباق ثقافة الجهاز

  1. وضع AS واحد في طبق بيتري مع AS مقلوب (كوب يصل). باستخدام مسحة القطن، الرطب في وسائل الإعلام وداب بلطف في وسط القرنية لإزالة أي صباغ. باستخدام ملقط لعقد العين ونفس مسحة، مسح مسحة القطن حول الصلبة لإزالة الصباغ اضافية.
  2. عكس AS ومكان على الجزء العلوي من الجزء السفلي من الطبق على المنطقة المرتفعة، وتتمركز القرنية على المنطقة المرتفعة في الطبق. ضع حلقة اللقط على رأس AS الموضوع حديثا.
  3. ضع أربعة مسامير في الثقوب المقابلة لعقد الخاتم في مكانه مع AS تحت الحلبة. بلطف اليد تشديد مسامير مع مفتاح L.
    ملاحظة: سوف تحدث خطوة تشديد يوميا طوال التجربة، وبالتالي فإن الهدف من تشديد الأولي هنا هو ضمان وسائل الإعلام لا تسرب مع تجنب كسر حلقة لقط.
  4. مع مجموعة طبق بيتري معقمة، ضع الجزء العلوي فوق الطبق وعكس الإعداد. إرفاق موقف الطبق. قم بتوصيل الموصلات السائلة مع حلقات O بمنافذ مترابطة في الجزء السفلي من الطبق.
  5. إلى موصل واحد سائل، قم بتوصيل محور إبرة منحني 18 G 90 درجة، وطول أنابيب، ومركز إبرة 18 G، ومرشح حقنة نايلون، وصمام ثلاثي، وحقنة سعة 20 مل مليئة بالوسائط.
  6. إلى الموصل السائل الثاني، قم بإرفاق محور إبرة منحنية 18 G 90 درجة، وطول الأنابيب، ومركز إبرة 18 G، وصمام ثلاثي، وجزء برميل من حقنة معقمة 10 مل (وهذا سيكون بمثابة خزان للقبض على السائل والفقاعات من ASOC).
  7. مع فتح الصمامات الثلاثية بشكل مناسب للمحاقن ، ادفع الوسائط برفق عبر النظام باستخدام منفذ موصل fluidics المحدد في الخطوة 3.5 لتضخيم AS ، وملء الوسائط في الأنابيب ، وفي النهاية الخزان.
    ملاحظة: إذا تسرب الوسائط إلى طبق ASOC، لا يتم تأمين AS بإحكام بما فيه الكفاية مع حلقة لقط.
  8. إزالة فقاعات عن طريق دفع وسائل الإعلام بلطف في الطبق وعكس الطبق لدفع الفقاعات وإلى الخزان.
  9. ضع الطبق واقف منتصبا. ضع الجزء السفلي من طبق بيتري تحت أقدام المنصة ، مع الحرص على عدم تطويق الأنابيب.

4. بدء الجزء الأمامي ثقافة الجهاز

  1. و"أسوك" جاهزة الآن للحضانة. ضع طبق ASOC في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). تأكد من ارتفاع طبق ASOC في الحاضنة فوق محولات الضغط معروفة ومحاسبة لحساب IOPبدقة (البروتوكول التكميلي 4).
  2. توجيه خطوط أنابيب من خلال الجزء السفلي من 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 باب الحاضنة بحيث لا تتداخل مع فتح وإغلاق الباب. قم بإرفاق حقنة 20 مل إلى مضخة الحقنة المحددة عند 2.5 ميكرولتر/دقيقة.
  3. ضع خط الأنابيب مع الخزان عند أداة محول الضغط. قم بتوصيل الصمام الثلاثي الجانب بإعداد محول الضغط أثناء تدفق برنامج تلفزيوني عبر الخط لتجنب دخول فقاعات الهواء إلى خطوط الأنابيب.
    ملاحظة: إفراغ برنامج تلفزيوني من الخزانات بعد إعداد النظام للحد من احتمال تلوث الخزان مع النمو الميكروبي لمدة زراعة الأعضاء.
  4. بدء عملية جمع بيانات IOP من خلال ضمان وجود بطاقة microSD أولا لحفظ ملفات البيانات. ثم قم بتشغيل إعداد محول الضغط لبدء جمع البيانات.
    ملاحظة: يتم توفير تفاصيل لإعداد جهاز جمع البيانات محول الضغط في البروتوكول التكميلي 2.

5. الصيانة اليومية ل ASOC

  1. بعد أن كان لدى ASOC 24 ساعة للتوازن ، قم بإزالة الأطباق من حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ووضعها في خزانة BSC II.
    ملاحظة: عند الحصول على بيانات الضغط، تبدو هذه الفترات الزمنية مثل طفرات كما تتم إزالة ASOCs من الحاضنة (تغيير الارتفاع) وتعديلها في الخزانة.
  2. تحقق من وجود تسرب تحت كل طبق على طبق بيتري. إذا كان موجودا، تحقق من وجود اتصالات سائلة ضيقة تحت الطبق وإعادة تشديد إذا لزم الأمر. تحقق من وجود تسرب في أعلى الطبق باستخدام مفتاح L معقم لتشديد البراغي في حلقة لقط.
    ملاحظة: سوف ضغط النسيج الصلب AS وتقليل سمك من قبل 24 ساعة، وسوف تحتاج إلى تشديد حلقة لقط.
  3. يستنشق وسائل الإعلام من الطبق جيدا.
    ملاحظة: الشبكة الطرية تقوم بتصفية السوائل من الوسائط التي يتم ضخها في ASOC. لذلك، الوسائط ستكون موجودة في طبق ASOC على طول الحواف.
  4. كرر الخطوتين 3.7 و 3.8 لإزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين.
  5. إعادة ملء المحاقن على مضخات الحقن، وضمان مضخات حقنة تعمل، وتأكيد محاذاة الصمامات للتشويش في ASOC. أعد طبق ASOC إلى حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    ملاحظة: الأمثل، يجب تنفيذ هذه الخطوات يوميا. ومع ذلك، فإن استخدام 20 مل بدءا من حجم الوسائط، وحجم بئر طبق ASOC، ومعدل مضخة 2.5 ميكرولتر/دقيقة يجب أن يكون كافيا للسماح للنظام يعمل لعدة أيام دون إزعاج.

6. OG إصابة التعريفي مع جهاز ثقب هوائي بالطاقة

ملاحظة: يتم تفصيل بناء جهاز ثقب هوائي في البروتوكول التكميلي 3. يتم تحريض إصابات OG بعد استقرار IOP ، والذي يحدث عادة بعد 3 أيام في الثقافة. قيم IOP المقبولة هي 5-20 مم زئبق استنادا إلى IOP الفسيولوجية ، والتي يمكن تحديدها من خلال تقييم ملفات بيانات IOP أو وضع مؤشرات LED في نظام قياس الضغط كما هو موضح في البروتوكول التكميلي 2.

  1. إعداد مجلس الوزراء BSC الثاني لOG التعريفي الإصابة كما هو مفصل في الخطوة 1.10. قم بتوصيل منصة الثقب بخط الهواء المضغوط. إرفاق كائن ثقب معقم إلى تشاك.
    ملاحظة: يمكن استخدام ضاغط الهواء لتشغيل الجهاز، ولكن يمكن أن يكفي الهواء المضغوط للدبابات أو خطوط المختبر المدمجة إذا كان الضغط أكبر من 50 psi.
  2. تعيين منظم الضغط على منصة ثقب إلى 50 psi لقوة ثقب كافية على الكائنات تصل إلى 4.5 ملم في القطر. ضع الواجهة المتقاطعة على مقبس المختبر أمام منصة الثقب لعقد طبق ASOC أثناء تحريض الإصابة.
  3. إزالة الإعداد ASOC من 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة CO2، ومكان في عبر تتبع vise عمودي على منصة ثقب(الشكل 2)بعد إزالة الغطاء ووضعه جانبا. حافظ على تغلغل الجزء الأمامي ولكن أغلق منفذ الصمام الثلاثي إلى محول الضغط لمنع تلف الضغط الزائد على المحول.
  4. تمديد ذراع المكبس إلى أقصى مسافة لها ووضع قمة القرنية في غضون 1 ملم من الكائن ثقب. تراجع عن ذراع المكبس واحضر الجزء الأمامي 1 سم أقرب إلى جسم الثقب.
    ملاحظة: تم تحسين هذه المسافة للتحريض على الإصابة عالية الكفاءة دون ضرب طبق ASOC.
  5. أطلق جهاز الثقب عن طريق تشغيله وفتح الصمام السولينويد مع المفتاح الثاني على الجهاز. لسحب الجهاز، اضغط على المفتاح الثاني مرة أخرى لإزالة جهاز الثقب من العين. تحقق من تحريض الإصابة المناسب عن طريق الفحص البصري وتسرب الوسائط من موقع الإصابة.
  6. إزالة طبق ASOC من فيس; وضع الغطاء مرة أخرى على التجمع طبق وفتح خط السوائل إلى محول الضغط. ضع ASOC مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تطبيق العلاجية إلى AS لتقييم فعاليتها لختم إصابات OG.

7. إزالة ASOC من الثقافة

ملاحظة: اعتمادا على تحليل نقطة النهاية (راجع النتائج التمثيلية لأساليب نقطة النهاية المحتملة)، يجب أن يبقى AS في طبق ASOC مضخما بينما تتطلب الطرق الأخرى عزل أنسجة AS عن غرفة الثقافة. تصف المنهجية أدناه كيفية إخراج AS من أطباق ثقافة الأعضاء وإزالة بقية الإعداد.

  1. إزالة أطباق ASOC من 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة. أغلق الصمام الثلاثي إلى المحقنة والخزان وافصل الأنبوب عن النظام. تجاهل المحقنة والخزان والفلتر. ضع الصمامات ثلاثية الاتجاه والأنابيب ومراكز الإبر في حاوية منفصلة للغسيل والتعقيم.
  2. افصل محاور الإبر عن التوصيلات السائلة في الجزء السفلي من الطبق. إلغاء قراءة الموصلات السائلة و حلقات س. ضع جميع العناصر في وعاء لغسلها وتعقيمها.
  3. إزالة مسامير أربعة من حلقة لقط باستخدام مفتاح L. إزالة حلقة لقط بعناية.
  4. باستخدام ملقط، وإزالة AS من الطبق، واعتمادا على تحليل نقطة النهاية والصورة، مكان في النفايات الخطرة البيولوجية المثبتة أو المناسبة.

8. تحليل بيانات IOP

  1. قم بتوصيل بطاقة microSD بجهاز كمبيوتر لإزالة ملف .txt الذي يحتوي على بيانات من أحدث تشغيل تجريبي.
    ملاحظة: الملف هو المسمى في التعليمات البرمجية التحكم في المتحكم الدقيق و يجب تحديث لكل تجربة (راجع البروتوكول التكميلي 2).
  2. استيراد البيانات إلى جدول بيانات.
  3. تنظيم البيانات في 12 عمودا: إشارة الوقت (بالدقيقة) و mV لكل قناة من قنوات محول الضغط ال 11. القنوات العشر الأولى تتوافق مع عشرة الاجهزة التجريبية ASOC. إشارة محول النهائي هو لجهاز استشعار مفتوحة على الهواء كقناة التحكم لتأكيد إشارة mV لم يتغير بسبب التغيرات في إشارة الإدخال. كانت قناة التحكم في الرسم مقابل الوقت لتأكيد إشارة mV متسقة طوال الوقت.
  4. تحويل إشارات mV لعشر قنوات إلى مم زئبق باستخدام معادلات تقاطع الميل الناتجة عن المعايرة الأولية لكل مستشعر (انظر البروتوكول التكميلي 4).
  5. وقت الرسم (التحويل إلى أيام لتبسيط تفسير البيانات) مقابل كل قناة من القنوات العشر لتحديد كيفية تقلب IOP عبر الدورة الزمنية التجريبية.
  6. تحديد متوسط قيم IOP في النقاط الرئيسية في البيانات لمقارنة القيم بين كل طريقة وكيفية تغييرها قبل وبعد تحريض إصابة OG. متوسط 2-3 ساعة من البيانات لكل فاصل زمني 24 ساعة لتحديد IOP في كل يوم من ASOC.
    ملاحظة: تظهر نتائج IOP التمثيلية في الشكل 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم عرض الصور الملتقطة عبر التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) للعيون المصابة OG لتوضيح كيف يبدو تحريض الإصابة الناجح. الشكل 3 يظهر الصور للسيطرة وOG الجرحى AS الأنسجة مباشرة بعد الاصابة و 72 ساعة في وقت لاحق. يتم عرض عرضين: صور مقطعية من خلال موقع الإصابة وإسقاط الحد الأقصى للكثافة من أعلى إلى أسفل (MIPs) لتصور مساحة سطح الصورة. عيون التحكم لا تظهر أي اضطراب ملحوظ في القرنية، في حين يمكن تحديد الإصابات الواضحة التي تعبر القرنية بأكملها بعد إصابة OG. من MIPs ، من الواضح أن الإصابات غير منتظمة في الشكل والحجم ، ولكن حجم الإصابة ينخفض أكثر من 72 ساعة. سابقا, وقد أظهرت هذا التأثير أن تكون كبيرة لعدد من أحجام الإصابات اختبار13.

إخراج البيانات الأساسية لنموذج إصابة OG الموضحة في هذا البروتوكول هو الضغط داخل العين على مدار الإعداد التجريبي. يتم تسجيل البيانات في وحدات من ميليفولت كخرج من كل محول ضغط يمكن تحويله إلى مم زئبق عن طريق المعايرة(البروتوكول التكميلي 4). مثال يتم توفير بيانات IOP مقابل الدورة الزمنية التجريبية للعيون التي تعتبر مقبولة وغيرها من العيون التي لا يمكن اعتبارها قابلة للاستخدام(الشكل 4A). من بيانات تتبع الضغط ، تم إرفاق العيون بأجهزة الاستشعار بعد 24 ساعة في الثقافة ، ولكن IOP لا يزال يتقلب على مدى أول 72 ساعة في الثقافة. IOP الفسيولوجية للأنسجة AS في زراعة الأعضاء هو ما يقرب من 8-10 ملم زئبق، لذلك تم تحديد نطاق 2x و 1/2x كبوابة لقيم IOP القابلة للاستخدام بعد استقرار القيم (5-20 مم زئبق). ولن يسمح باستخدام ما تبقى من البروتوكول إلا للعيون التي كانت في هذا النطاق. من التجارب السابقة، كان لدينا نسبة نجاح 90٪ التي تحققت في الإعداد ASOC للعيون استقرار في النطاق المطلوب(الشكل 4B).

كما يتم توفير نتائج كيفية تغيير IOP بسبب إصابة OG والتدخل العلاجي(الشكل 4C، D). بعد تحريض إصابة OG ، يجب أن ينخفض الضغط بشكل كبير ويظل على هذا النحو حتى تتم إزالة الأنسجة من ASOC(الشكل 4C). إذا العين بعد الإصابة التعريفي لا يقلل في الضغط، وهذا يشير إلى أن إصابة ناجحة لم يتم تحريض كما ينبغي خفض IOP إذا تم اختراق ختم محكم للعين. ومع ذلك ، قد تلتئم أحجام الإصابات الأصغر ذاتيا ، مما قد يؤدي إلى استعادة IOP. إذا تم تطبيق العلاجية للعين بعد تحريض إصابة OG، يمكن تتبع استعادة IOP أثناء ASOC. ويتجلى هذا المفهوم مع البيانات التي تظهر لاصقة Dermabond تطبيقها على إصابات 2.4 ملم OG (الشكل 4D). يتم عرض متوسط النتائج لخمس تجارب ASOC منفصلة مع وبدون العلاجية ومن الواضح أن العلاجية هي زيادة IOP. يمكن لهذه الطريقة قياس فعالية العلاجية لاستعادة IOP وتتبع ما إذا كان يتم استعادة هذا الضغط عبر إصابة رئيسية 72 ساعة بعد OG.

علاوة على ذلك، فإن بروتوكول ASOC قابل للتكيف للاستخدام مع مجموعة واسعة من نقاط النهاية التوصيف لتلبية متطلبات المستخدم النهائي التجريبية. أثناء الثقافة ، يمكن جمع وسائل الإعلام الخارجة التي تترك العين على أساس يومي أو حتى كل ساعة والتي يمكن استخدامها لتتبع التغيرات في مستوى البروتين التي تحدث أثناء ASOC ، بعد تحريض إصابة OG ، أو بعد تطبيق العلاج. على سبيل المثال، وقد تم إجراء الجيلاتين zymography سابقا للكشف عن مستويات metalloproteinase مصفوفة لتتبع التئام الجروح وإعادة عرض الأنسجة20. مزيد من نقاط النهاية البيولوجية ممكنة بعد إزالة الأنسجة من الثقافة عن طريق أساليب الكيمياء المناعية التقليدية لتقييم صلاحية الأنسجة21،22، تتبع التغيرات المرضية الفسيولوجية للقرنية23،24، أو تلطيخ الأجسام المضادة لأي بروتين منالفائدة 25،26.

ويمكن أيضا الحصول على مقاييس القرنية الوظيفية من عيون الحفاظ عليها في ASOC. يمكن تقييم سلامة ظهارة القرنية عن طريق بقعة عين الفلورسين واكتساب الصورة باستخدام مصدر الضوء الأزرق27،28. بعد إزالة من الثقافة، ويمكن تقييم أنسجة القرنية للشفافية من خلال الحصول على صورةبسيطة 13. كما يمكن إجراء التصوير البصري التقليدي لتقييم بنية الأنسجة بتدخل علاجي أو بدونه. يمكن لصور OCT ، كما هو موضح في الشكل 3، إنشاء صور مقطعية عبر القرنية ويمكن التقاطها دون غزو ، مما قد يسمح بجمع الصور مع الحفاظ على الأنسجة في الثقافة. ويمكن أيضا تكييف طرائق التصوير الأخرى مثل المجهر شق مصباح، والموجات فوق الصوتية، أو في المجهر confocal في الجسم الحي للحصول على مزيد من المعلومات التشريحية.

وأخيرا، يمكن التقاط تقييم الخصائص الميكانيكية للجزء الأمامي لفهم تأثير إصابة OG أو العلاجية اللاحقة على الأنسجة الأساسية. في حين أن جمع بيانات IOP وحده يسلط الضوء على كيفية تعرض سلامة الختم المائي للعين للخطر ، فقد أظهرنا سابقا أنه يمكن قياس مقاييس الاختبار الإضافية لإثارة الميزات الميكانيكية الإضافية10،11. يمكن قياس الامتثال العيني ، وهو خاصية ميكانيكية مقطوعة تصف كيفية تغير الضغط داخل العين بسبب التضخم (التغير في الحجم / التغير في الضغط) ، بمضخة حقنة لحقن كميات صغيرة مفاجئة من السوائل في العين وتسجيل زيادة الضغط الناتجة عن ذلك مع محول الضغط. يشير الامتثال العالي إلى أن الأنسجة أقل صلابة ويمكن استخدامها لتتبع كيفية اختلاف خصائص المواد العلاجية عن أنسجة القرنية الأساسية. يمكن قياس معدل التسرب من العين أو مرفق التدفق التقليدي وحسابه لتحديد معدل التدفق السائل الدقيق الذي يترك العين لكل وحدة ضغط20،29. وأخيرا، فيما يتعلق بالاختبارات العلاجية، يمكن قياس ضغط الانفجار لتحديد الضغط الأقصى الذي يمكن للعين أن تحمله قبل الفشل العلاجي. ويمكن استخدام هذا لمقارنة الأداء إلى عيون غير مصاب أو لتتبع التغيرات في الأداء مع الوقت12،13.

Figure 1
الشكل 1:رسم تخطيطي لإعداد ASOC. وتعقد العيون في أطباق ثقافة الجهاز بنيت خصيصا وعقدت في مكان مع حلقة لقط. يتم غرس وسائط ASOC عبر مضخة حقنة من خلال الصمام A وتوصيلها بمحول الضغط ، ويتم تمييز اكتساب البيانات اللاحقة مع Valve B. المنافذ المفتوحة في كل صمام باللون الأزرق بينما يشير الأصفر إلى القنوات المغلقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:نظرة عامة على إعداد إصابة OG. (A) إعداد جهاز الإصابة بالطاقة الهوائية. من اليسار إلى اليمين، يتم إدخال الهواء المضغوط إلى الجهاز عبر خط الهواء المضغوط، الذي يمر عبر منظم لضبط الضغط في 50 psi كما يقاس بمقياس الضغط. يتم توصيل اثنين من الصمامات سولينويد إلى المحرك الخطي لتوسيع مباشر / التراجع عن تشاك الحفر عقد الكائن ثقب. يتم وضع Vise أمام جهاز الثقب لعقد العين في تحديد المواقع x، y، z المناسب. (ب)يتم وضع ممثل ASOC أمام جهاز تحريض الإصابة. تفاصيل إضافية للجهاز وبنائها مفصلة في البروتوكول التكميلي 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:صور التصوير المقطعي للتماسك البصري لتجارب إصابة ASOC OG. وتظهر الصور لعيون التحكم (غير مصاب) وOG عيون الجرحى على الفور بعد الإصابة و 72 ساعة بعد الإصابة. وتظهر وجهات النظر كما المقاطع العرضية من خلال القرنية (الجانب الأيسر) وأعلى إلى أسفل الحد الأقصى شدة وجهات النظر الإسقاط من سطح القرنية (الجانب الأيمن). وقد تم تعديل هذا الرقم بإذن من سنايدر وآخرون13.

Figure 4
الشكل 4: نتائج IOP التمثيلية لتجارب ASOC. (A) بيانات IOP الخام لأول 72 ساعة من إعداد ASOC. يتم ثقب العينين عند 72 ساعة بحيث يتم تقييم أول 3 أيام من البيانات لتحديد ما إذا كان IOP يستقر في نطاق IOP المقبول (5-20 مم زئبق). من النتائج التمثيلية ، تقع ثلاث من العيون الخمسة ضمن نطاق IOP المقبول ، في حين أن واحدة لديها IOP عالية جدا وواحدة لديها IOP منخفضة جدا (تقع خارج المنطقة الصفراء البارزة على المؤامرة). (B) استقرت IOP لن = 50 الاجهزة ASOC من التجارب السابقة لإثبات معدل النجاح النموذجي مع الأسلوب ASOC. (ج) IOP للعيون غير المصابة مقارنة بثلاثة أحجام مختلفة من إصابات OG بعد تحريض الإصابة لمدة 72 ساعة. فقدان IOP واضح، مع عدم وجود علامات على الانتعاش. (د) نتائج IOP المصاب مقارنة بالإصابات المعالجة بمادة لاصقة من Dermabond. في حين أن معدل الخطأ مرتفع بسبب إغلاق بعض العيون والبعض الآخر لا ، يمكن للطريقة تتبع التغييرات في IOP على مدى فترة 72 ساعة بعد الإصابة. وقد تم تعديل هذا الرقم بإذن من سنايدر وآخرون13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملفات تكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذه الملفات. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك خطوات حاسمة مع منصة الإصابات ASOC OG التي ينبغي تسليط الضوء عليها لتحسين احتمال النجاح عند استخدام المنهجية. أولا ، خلال تشريح الجزء الأمامي ، يعد الحفاظ على الشبكة الطرية أمرا ضروريا ولكنه صعب القيام به بشكل صحيح. إذا تعطلت TM ، فإن العين لن تحافظ على الضغط الفسيولوجي ولن تفي بمعايير الأهلية للاستخدام التجريبي. من المستحسن ممارسة عملية التشريح في ظل الظروف العادية أولا بدلا من إدخال تحديات تقنية العقيم الإضافية حتى يتم الحصول على تشريح مناسب. ثانيا، عند وضع العينين في أطباق ASOC، فمن الضروري أن تكون ضيقة بما يكفي لمنع السوائل من التسرب ولكن فضفاضة بما يكفي لمنع إتلاف أطباق ASOC. إذا لم يتم تأمين العين بإحكام، سوف تسرب السوائل من العين من خلال وسائل غير فسيولوجية مما يؤدي إلى القليل أو معدومة IOP. ومع ذلك ، فإن حلقة اللقط التي تحمل العين لأسفل هي من البلاستيك ويمكن كسرها بسهولة إذا تم تقييدها. من الضروري تضييق العينين على مدى يومين حيث أن النسيج الصلب تحت الحلقة سيضغط ويخفف الأنسجة خلال أول 24 ساعة. فمن المستحسن لتشديد الحلقات فقط حتى يشعر مقاومة لتشديد في اليوم 1 ومتابعة هذا عن طريق إعادة تشديد إلى مستويات مماثلة بعد 24 ساعة في الثقافة للحصول على أفضل النتائج.

ثالثا، من المهم أن نفهم تماما أين يتم توجيه تدفق السوائل في جميع الأوقات عند استخدام هذا النموذج. يرتبط كل طبق ASOC بصمامات ثلاثية متعددة لتوجيه تدفق السوائل من مضخة الحقنة أو خزان حقنة 10 مل والاتصال بمحولات الضغط. تتطلب الحالات المختلفة لعملية الإعداد وضع الصمامات بطريقة تمكن من طرد فقاعات الهواء من العين أو لحماية محولات الضغط من الضغط المفرط. يجب أن يكون لا يزال يجب توخي الحذر لفهم ما هو مفتوح / إغلاق في جميع الأوقات قبل خطوات البروتوكول الهامة. وأخيرا، الحفاظ على العقم في جميع أنحاء بروتوكول الإصابة ASOC OG أمر بالغ الأهمية ولكن من السهل أن تفقد عبر عملية متعددة الخطوات، لعدة أيام. تحتوي وسائط Perfusion على مستويات عالية من المضادات الحيوية ومضادات الميكولوجيات لمنع ذلك ، وتغمر العينين في بيتادين قبل إعدادها لمنع التلوث ، ولكن لا تزال هناك خطوات حاسمة حيث الأخطاء هي الأكثر احتمالا. أثناء الإعداد الأولي في الطبق، تجنب ملامسة العينين مع تشديد حلقات اللقط في مكانها والحفاظ على الأغطية على الأطباق في جميع الأوقات عندما لا تكون قيد الاستخدام. وهناك خطوة التعرض أكثر احتمالا هو خلال الصيانة اليومية ASOC. من المهم القيام بهذه الخطوات الروتينية في خزانة السلامة البيولوجية ، حتى لو كان يبدو أنه يمكن إنجازها بسرعة دون إزالة العينين من الحاضنة. وينبغي اتباع البروتوكول بعناية والحفاظ على تقنية جيدة العقيم تقليل مخاطر التلوث عبر التجارب ASOC لمدة 6 أيام.

بشكل عام ، فإن منصة ASOC OG للإصابات فريدة من نوعها من المنهجيات الأخرى التي تبحث في إصابات الكرة الأرضية المفتوحة بسبب معيارين رئيسيين. الأول هو طريقة تحريض الإصابة. جهاز الإصابة الهوائية عالية السرعة المستخدمة يؤدي إلى إصابات مع كمية عالية من القوة. وهذا يسمح للإصابات مع الحث على الأشياء التي ليست حادة خاصة ولا مع قطر صغير. وهذا يحاكي عن كثب الإصابات غير المنتظمة في الشكل. إصابة شظايا عالية السرعة ناتجة عن عبوات ناسفة30و31. يمكن بسهولة تزويد الجهاز الهوائي بشظايا غير منتظمة الشكل تحاكي الأشياء لخلق إصابات أكثر صعوبة للشفاء مقارنة بالطرق السابقة باستخدام الليزر أو الإبر أو شفرات المشرط لإنشاء هندسات إصابة نظيفة ودقيقة32و33و34. ثانيا، تسمح منهجية ASOC بتتبع تقدم الإصابة والأداء العلاجي بعد تحريض الإصابة الأولي. لم يكن من الممكن أن تكون قادرة على تتبع إلى 72 ساعة في منصة إصابة OG سطح مقاعد البدلاء المتقدمة سابقا10،11،12 وكان الدافع وراء تطوير هذا البروتوكول. في الواقع، ظلت صلاحية الخلية عالية في بطانة القرنية لمدة أسبوع واحد على الأقل في ASOC13. ASOC هو الوسيلة الوحيدة لتحقيق هذا الوصف على المدى الطويل دون الانتقال إلى تجارب حيوية مكلفة.

التطبيقات الرئيسية لمنصة ASOC ذات شقين. أولا، يمكن استخدام النموذج لزيادة توصيف إصابات الكرة الأرضية المفتوحة، لا سيما بالنظر إلى كيفية تغييرها مع مرور الوقت. في الدراسة السابقة، تم وصف إصابات OG بهذه الطريقة ولوحظ التئام الجروح أكثر من 72 ساعة بعد الإصابة13. إن مواصلة تتبع أحجام الإصابات المختلفة والأشكال والمواقع لمدة 72 ساعة أو حتى لفترة أطول فيما يتعلق بالتغيرات البيولوجية التي تحدث سوف تسترشد بها القرارات الطبية الحرجة التي يجب اتخاذها بعد إصابات OG. قد تسمح بعض معلمات الإصابة بالشفاء الذاتي من القرنية ، أو قد تكون المعلمات الأخرى أكثر حدة إذا لم يتم تطبيق التدخل خلال أول 24 ساعة. وستكون هذه المعلومات لا تقدر بثمن بالنسبة للمرضى الذين يقومون بفرز الرؤى عندما تتوفر إمدادات طبية محدودة أو موارد إجلاء.

ثانيا، يمكن استخدام منصة ASOC OG لتطوير واختبار تطوير المنتجات. لهذا التطبيق، يمكن للنظام الأساسي ثقافة الجهاز ملء عدد من الأدوار. خلال تطوير المنتج الأولي، يمكن اختبار الأطر الزمنية الأقصر مع مجموعة من تركيبات المنتجات لتحديد ما هو الأكثر فعالية. يمكن تكوين نظام ثقافة الجهاز لزيادة الإنتاجية العالية لهذا التطبيق مع مضخات حقنة إضافية لتجاوز التجارب العشرة المتزامنة الممكنة مع النظام المفصل هنا. بالنسبة للمنتجات الأكثر دقة، يمكن تقييم النقاط الزمنية الأطول لتقييم الأداء لمدة 72 ساعة أو ربما لفترة أطول. وأخيرا، قد يكون تقييم التئام الجروح ممكنا عند تقييم المنتجات النشطة بيولوجيا التي قد تعالج إصابات OG بشكل دائم بدلا من الاستقرار المؤقت.

ومع ذلك، هناك قيود مع منصة ASOC OG التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. أولا ، في حين أن النموذج يسمح بتقييم طويل الأجل للعلاجات ، إلا أنه يفتقد جميع أنسجة العين خارج القشرة القرنية ، مثل القزحية والعدسة. هذه الأنسجة الإضافية من المرجح أن تتأثر بإصابة OG وقد تلعب دورا في تطور الإصابة. وبالمثل، يفتقد الجزء الأمامي المعزول عناصر الاستجابة المناعية التي سيتم تضمينها عند الانتقال من نموذج ASOC إلى الاختبار الحيواني اللاحق. بعد ذلك ، فإن النموذج مناسب فقط لإنشاء إصابات القرنية OG وإصابات OG الجانبية المحتملة. لا يمكن أن يسبب إصابات أو OG تصلب الخلفي مع هذه الطريقة. ومع ذلك، فإن العديد من هذه الأنواع من الإصابات تؤدي إلى تلف شبكية العين، مما يجعل أي استقرار مؤقت علاجي من غير المرجح أن يمنع فقدان الرؤية35،36. وأخيرا، تم تتبع الإصابات مع النموذج إلى 72 ساعة بعد الإصابة فقط. وقد استخدمت ASOC في تطبيقات أخرى إلى 2 أسابيع، لذلك يمكن أن تستخدم على الأرجح نموذج لهذه التطبيقات، ولكن لم يتم اختباره في هذا الوقت37،38،39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة. الآراء الواردة في هذه المقالة هي آراء المؤلف (المؤلفين) ولا تعكس السياسة الرسمية أو الموقف الرسمي للإدارة الطبية للجيش الأمريكي أو وزارة الجيش أو وزارة الدفاع أو حكومة الولايات المتحدة.

Acknowledgments

تستند هذه المواد إلى العمل الذي تدعمه وزارة الدفاع الأمريكية من خلال اتفاقية مشتركة بين الوكالات (رقم 19-1006-IM) مع برنامج الاستحواذ المؤقت على إصلاح القرنية (وكالة تطوير العتاد الطبي التابعة لجيش الولايات المتحدة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector McMaster-Carr 51525K431
10-32 Socket cap screw, ½" McMaster-Carr 92196A269
10 mL syringe BD 302995
20 mL syringe BD 302830
Anti-Anti Gibco 15240-096
Ball-End L key McMaster-Carr 5020A25
Betadine Fisher Scientific NC1696484
BD Intramedic PE 160 Tubing Fisher Scientific 14-170-12E
Cotton swabs Puritan 25-8061WC
DMEM media ATCC 30-2002
FBS ATCC 30-2020
Fine forceps World Precision Instruments 15914
Gauze Covidien 8044
Gentamicin Gibco 15710-064
Glutamax Gibco 35050-061
High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID McMaster-Carr 5233T47
Large forceps World Precision Instruments 500365
Large surgical scissors World Precision Instruments 503261
Medium toothed forceps World Precision Instruments 501217
Nail (puncture object) McMaster-Carr 97808A503
Nylon syringe filters Fisher 09-719C
PBS Gibco 10010-023
Petri dish (100 mm) Fisher FB0875713
Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock Fisher NC9593742
Razor blade Fisher 12-640
Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle McMaster-Carr 75165A81
Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle McMaster-Carr 75165A675
Sterile 100 mL beakers with lids VWR 15704-092
Vannas scissors World Precision Instruments WP5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
  2. Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
  3. Riesberg, J., Powell, D., Loos, P. The loss of the golden hour. Special Warfare. , 49-51 (2017).
  4. Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
  5. Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
  6. Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954 (2012).
  7. Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
  8. Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
  9. Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
  10. Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218 (2020).
  11. Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98 (2020).
  12. Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
  13. Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546 (2021).
  14. Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
  15. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
  16. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  17. Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).
  18. Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
  19. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
  20. Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18 (2021).
  21. Ren, H., Wilson, G. Apoptosis in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (6), 1017-1025 (1996).
  22. Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
  23. Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732 (2020).
  24. Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
  25. Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
  26. Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
  27. Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
  28. Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).
  29. Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
  30. Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
  31. Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
  32. Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
  33. Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
  34. Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
  35. Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541 (2013).
  36. Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
  37. Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
  38. Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
  39. Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 174،
الجزء الأمامي منصة ثقافة الجهاز لتتبع إصابات الكرة الأرضية المفتوحة والأداء العلاجي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boice, E. N., Snider, E. J. Anterior … More

Boice, E. N., Snider, E. J. Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance. J. Vis. Exp. (174), e62649, doi:10.3791/62649 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter