Summary
Травмы глаз с открытым глобусом могут быть без лечения в течение нескольких дней в сельских или военных сценариях, что приводит к слепоте. Терапевтические средства необходимы, чтобы свести к минимуму потерю зрения. Здесь мы подробно описываем модель повреждения открытого глобуса культуры органов. С помощью этой модели можно правильно оценить потенциальные терапевтические средства для стабилизации этих травм.
Abstract
Травмы открытого земного шара имеют плохие визуальные результаты, что часто приводит к постоянной потере зрения. Отчасти это связано с длительной задержкой между травмами и медицинским вмешательством в сельских районах и применением военной медицины, где офтальмологическая помощь недоступна. Нелеченные травмы подвержены инфекции после того, как глаз потерял свое водонепроницаемое уплотнение, а также потере жизнеспособности тканей из-за внутриглазной гипотензии. Терапевтические средства для временной герметизации травм открытого земного шара, если они правильно разработаны, могут восстановить внутриглазное давление и предотвратить инфекцию до тех пор, пока не станет возможным надлежащий офтальмологический уход. Чтобы облегчить разработку продукта, здесь подробно описано использование платформы для травмы органов переднего сегмента с открытым глобусом для отслеживания терапевтической эффективности в течение не менее 72 ч после травмы. Ткань переднего сегмента свиньи может поддерживаться в специально разработанных блюдах для культуры органов и удерживаться при физиологическом внутриглазном давлении. Колотые повреждения могут быть созданы с помощью пневматической системы, способной генерировать травмы диаметром до 4,5 мм, аналогичные размерам травм, имеющих отношение к военным. Потеря внутриглазного давления может наблюдаться в течение 72 ч после травмы, подтверждая надлежащую индукцию травмы и потерю водонепроницаемого уплотнения глаза. Терапевтическая эффективность может быть отслежена путем нанесения на глаз после индукции травмы, а затем отслеживания внутриглазного давления в течение нескольких дней. Кроме того, модель повреждения переднего сегмента применима к широко используемым методам функционального и биологического отслеживания физиологии переднего сегмента, таким как оценка прозрачности, глазной механики, здоровья эпителия роговицы и жизнеспособности тканей. В целом, метод, описанный здесь, является необходимым следующим шагом на пути к разработке биоматериалной терапии для временного уплотнения травм открытого земного шара, когда офтальмологическая помощь недоступна.
Introduction
Травмы открытого глобуса (OG) могут привести к постоянной потере зрения, если их не лечить или, по крайней мере, стабилизировать после травмы1. Однако задержки распространены в отдаленных районах, где доступ к офтальмологической интервенции недоступен, например, в сельских районах или на поле боя в военных сценариях. Когда лечение недоступно, текущий стандарт ухода заключается в защите глаза жестким щитом до тех пор, пока медицинское вмешательство не будет возможным. В военной медицине эта задержка в настоящее время составляет до 24 ч, но ожидается, что она увеличится до 72 ч в будущих боевых операциях в городских условиях, где воздушная эвакуация невозможна2,3,4. Эти задержки могут быть еще более длительными в сельских, отдаленных гражданских приложениях, где доступ к офтальмологической интервенции ограничен5,6. Нелеченная травма ОГ очень восприимчива к инфекции и потере внутриглазного давления (ВГД) из-за того, что водонепроницаемое уплотнение глаза скомпрометировано7,8. Потеря ВДМ может повлиять на жизнеспособность тканей, что делает любое медицинское вмешательство маловероятным для восстановления зрения, если задержка между травмой и терапией слишком длинна9.
Чтобы обеспечить разработку простых в применении терапевтических средств для герметизации травм ОГ до тех пор, пока не будет достигнут специалист по офтальмологу, ранее была разработана настольная модель травмы ОГ10,11. С этой моделью высокоскоростные травмы были созданы в целых глазах свиней, в то время как ВГОД было захвачено датчиками давления. Затем терапевтические средства могут быть применены для оценки их способности герметизировать место поврежденияОГ 12. Однако, поскольку эта модель использует целые глаза свиней, она может оценивать только немедленную терапевтическую эффективность без возможности отслеживания долгосрочной производительности через возможное 72-ч окно, в котором терапевтическое средство должно стабилизировать место травмы, пока пациент не достигнет специализированной помощи. В результате была разработана и детализирована модель повреждения OG культуры органов переднего сегмента (ASOC) в качестве платформы для отслеживания долгосрочной терапевтической эффективности13.
ASOC является широко используемым методом поддержания аваскулярной ткани переднего сегмента, такого как роговица, в течение нескольких недель после энуклеации14,15,16,17. Передний сегмент поддерживается при физиологическом ВГД путем перфузии жидкости на физиологических скоростях потока и сохранения области оттока трабекулярной сетки, ткани, ответственной за регулирование ВГД, во время установки ASOC18,19. Платформа ASOC может поддерживать ткани физиологически, индуцировать травму ОГ с помощью пневматического устройства, применять терапевтическое средство и отслеживать стабилизацию травмы в течение не менее 72 ч после травмы13.
Здесь протокол предоставляет пошаговую методологию использования платформы ASOC. Сначала подробно описывается, как настроить и изготовить платформу ASOC. Затем в протоколе подробно описывается, как асептически рассекать передний сегмент и поддерживать трабекулярную сетку, а затем настраивать ткань переднего сегмента в специально построенных блюдах для культуры органов. Затем в нем подробно описывается, как создать травмы открытого глобуса и применять терапевтические средства сразу после травмы. Наконец, протокол предоставляет обзор параметров характеристики, которые можно использовать с этим методом, который оценивает функциональные, механические и биологические свойства глаза и то, насколько хорошо травма была стабилизирована. В целом, эта модель обеспечивает столь необходимую платформу для ускорения разработки продуктов для стабилизации и лечения травм с открытым глобусом и улучшения прогноза плохого зрения после травмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Прежде чем выполнять этот протокол, имейте в виду, что существуют юридические и этические требования к использованию животных в исследованиях и обучении. Если живые животные используются в качестве источника глазной ткани, обратитесь за одобрением в местный этический или юридический орган (IACUC или Комитет по этике и т. Д.) Если есть какие-либо вопросы в получении разрешения на использование животных, не приступайте. Ранее мы определили и сообщили, что свежие глаза свиней, полученные и использованные в течение 24 ч после вскрытия, сравнивались с физиологией in vivo и хорошо себя показали для этих исследований (Animal Technologies, Tyler, TX, США)10,13. Ни одно живое животные не использовались на протяжении всего этого протокола, используя поставщика тканей для получения ткани в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: До прибытия ткани изготовьте посуду для посева органов(Дополнительный протокол 1),зажимные кольца(Дополнительный протокол 1),подставки для посуды(Дополнительный протокол 1),установку для сбора данных датчика давления(Дополнительный протокол 2)и пневматическую проколотую платформу(Дополнительный протокол 3). Стерилизуйте посуду, инструменты и принадлежности и подготовьте рабочие зоны. Полезно иметь нестерильную область для выполнения грубого рассечения на глазах, так как они обычно поставляются с соединительной, дополнительной орбитальной тканью. Выполните эти первые шаги на открытой, чистой рабочей поверхности, а затем перенесите глаза асептически в шкаф BSC II для микродифекции (шкаф No 1). Оптимально, чтобы шкаф BSC II, используемый для микродифлекции, отделялся от шкафа BSC II (шкаф No 2) для минимизации воздушного потока и максимизации рабочего пространства. Настройте микрофекционный шкаф с рассекающим микроскопом и способом визуализации рабочей поверхности (камеры или окуляров, выступающих из шкафа).
1. Этапы стерилизации, расходные материалы (см. Таблицу материалов для получения более подробной информации) и настройка
- Подготовьте и стерилизуйте газом следующие элементы (1 комплект для каждого глаза): противососольная тарелка, зажимное кольцо, два жидких соединителя с уплотнительными кольцами, две ступицы иглы 18 G, четыре винта, две длины трубки PE-100 (длина расстояния должна быть достаточной, чтобы простираться от чашки внутри инкубатора до шприцевого насоса и установки сбора данных датчика давления), две 18 G 90° изогнутые игольчатые ступицы, два 3-х хидных клапана.
- Подготовьте и автоклавьте следующие комплекты.
- Подготовьте и автоклавите набор инструментов для микродисперсирования, содержащий одну пару тонких щипцов, одну пару ножниц Vannas, одну пару щипцов со средними зубами, одну пару больших ножниц, ватные тампоны и лезвие бритвы или скальпель.
- Подготовьте и автоклавите комплект инструментов для сборки, содержащий одну пару средних зубчатых щипцов, одну пару хирургических ножниц и один L-ключ.
- Подготовьте и автоклавите ежедневный набор (количество: один в день культивирования), содержащий один L-ключ для затягивания зажимных колец к посуде каждый день по мере необходимости.
- Автоклавные четыре 100 мл для дезинфекции и хранения глаз и передних сегментов.
- Автоклав проколотых объектов.
- Соберите следующие стерильные предметы: чашка Петри (1 чашка / глаз), марля (1-2 / глаз), подставка для посуды, шприцы 20 мл (1 / глаз), шприцы 10 мл (1 / глаз), нейлоновые шприцевые фильтры (1 / глаз).
- Готовят стерильные среды: DMEM с 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Гентамицин, 1x Антибиотик-Антимикотик (AA; приблизительно 30-40 мл полной среды / глаз).
- Приготовьте AA-PBS: PBS с 1x AA (~500 мл).
- Подготовьте набор инструментов для грубого вскрытия: очистите и высушите большие хирургические ножницы и щипцы.
- Настройте рабочее пространство для нестерильного рассечения: соберите расходные материалы из набора инструментов для грубого вскрытия, энуклеированных глаз свиней, погруженных в PBS и на лед, хирургическую драпировку, 100 мл клюва с PBS. Выложите хирургическую драпировку и предметы, необходимые для грубого рассечения.
- Настройте рабочее пространство для стерильного вскрытия: соберите расходные материалы из набора инструментов для микропарекции, стерильной марли, рассекающего микроскопа, раствора бетадина, стерильного PBS, стерильных сред, четырех стерилизованных 100 мл закромок, стерильной чашки Петри. Асептически перенести в кабинет BSC II No1. Настройте шкаф для визуализации глаз на рассекаемом микроскопе.
- Настройте рабочее пространство для сборки ASOC: соберите газостерилизованные наборы (комплект для посуды и комплект крышки), комплект сборочных инструментов, стерильные носители, подставки для посуды, стерильные чашки Петри, стерильные шприцы и шприцевые фильтры. Асептически перенести на БСК II кабинет No2. Настройте шкаф для сборки посуды.
- Когда глаза стабилизируются и готовы к проколу (72 ч после установки), асептически перенесите их в шкаф BSC II. Настройте рабочее пространство для индукции травм OG: пневматическое индукционное устройство травмы (сборка подробно описана в дополнении 3)и лабораторный разъем и перекрестные тиски для удержания антенны ASOC.
2. Рассечение ткани
- Подготовьте свиную ткань, используя нестерильное рабочее пространство для рассечения.
- Приобретите энуклеированные глаза свиней на местной скотобойне, в исследованиях на животных или у продавца. Следите за льдом, погруженным в PBS во время доставки и используйте его сразу после получения.
- Отрежьте экстраорбитальную ткань и обрежьте конъюнктиву, оставив только корнеосклеральную оболочку и зрительный нерв. Выполните рассечение в нестерильных условиях большими хирургическими ножницами и щипцами в грубом наборе инструментов для рассечения.
- Поместите глаза обратно в свежий PBS на льду до тех пор, пока все глаза, необходимые для экспериментальной установки, не будут предварительно / грубо вскрыты.
- Погружают глаза в 10% раствор бетадина на 2 мин в закрытые емкости и асептически переложат в шкаф 1 БСК II. Выполняйте все последующие работы в стерильных условиях, чтобы свести к минимуму загрязнения во время установки.
- Стерильно рассекает передние сегменты.
- Через 2 мин в растворе бетадина переводят глаза в три последовательных промывания стерильным AA-PBS для удаления избытка раствора бетадина с глазной поверхности при сохранении стерильности глазной ткани. После трех промываний выдерживайте ткани в АА-ПБС до дальнейшего использования.
- Прихрамывайте глаз с помощью лезвия бритвы/скальпеля и изогнутых ножниц. Поместите глаз на пропитанную AA-PBS марлю и создайте разрез стерильным лезвием бритвы или скальпелем вблизи экватора глаза (60/40 разделено с 40 на передней стороне). Используя изогнутые хирургические ножницы, гемисект глаз, чтобы изолировать передний глаз (половину роговицы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез вокруг переднего сегмента должен быть непрерывным, чтобы предотвратить зубчатые, шероховатые края в склере, которые создадут утечки жидкости после установки в культуре органа. - Используйте микросубчики в качестве лопаты, чтобы зачерпнуть стекловидное тело из переднего сегмента. Снимите хрусталик с переднего сегмента с помощью микроциплин. Оставьте передние сегменты в AA-PBS до дальнейших этапов рассечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все глаза, которые будут рассечены, могут быть проведены на этом этапе и один за другом проходить через оставшуюся часть процесса рассечения. - С помощью рассекающего микроскопа срезайте радужную оболочку до корня радужки постепенно, радиально до тех пор, пока не будет видна трабекулярная сетка (ТМ). ТМ представляет собой пигментированную ткань, которая содержит волокна по окружности, ориентированные вокруг корнеосклеральной оболочки. Осторожные срезы в радужной оболочке по направлению к корню радужной оболочки обнажат глубину ТМ под тканью.
- Отрежьте 360° вокруг радужной оболочки на той же глубине, что и первоначальный врез в ткань, чтобы обнажить всю область ТМ. Очистите все оставшиеся остаточные радужные оболочки, покрывающие ТМ, по мере необходимости.
- Обрежьте остатки цилиарного тела с задней части ТМ, оставив только тонкую полосу ткани с задней стороны области ТМ (примерно 1 мм).
- Поместите рассеченный передний сегмент (AS) в носитель до дальнейшей установки в ASOC в шкафу BSC II No2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все глаза могут быть проведены на этом этапе перед настройкой ASOC, если один пользователь выполняет вскрытие и сборку чашки для культуры органа.
3. Установка передних сегментов в блюдах для культуры органов
- Поместите одну AS в чашку Петри с перевернутой AS (чашка вверх). Используя ватный тампон, смочите в среде и аккуратно нанесите на центр роговицы, чтобы удалить любой пигмент. Используя щипцы, чтобы удерживать глаз и тот же тампон, протрите ватный тампон вокруг склеры, чтобы удалить лишний пигмент.
- Перевернить АС и поместить сверху нижней части блюда над возвышенной областью, центрируя роговицу над возвышенной областью в блюде. Поместите зажимное кольцо поверх вновь размещенного AS.
- Поместите четыре винта в соответствующие отверстия, чтобы удерживать кольцо на месте с AS под кольцом. Аккуратно вручную затяните винты с помощью L-ключа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этап затяжки будет происходить ежедневно на протяжении всего эксперимента, поэтому цель первоначального затяжки здесь заключается в том, чтобы гарантировать, что среда не протекает, избегая при этом разрыва зажимного кольца. - С помощью стерильной чашки Петри поместите верхнюю часть над чашкой и перевертите установку. Прикрепите подставку для посуды. Прикрепите жидкостные соединители с уплотнительными кольцами к резьбовым портам на дне тарелки.
- К одному жидкостному разъему прикрепите изогнутую игольчатую ступицу 18 G 90°, трубку длиной, игольчатый концентратор 18 G, фильтр нейлонового шприца, трехсторонний клапан и шприц объемом 20 мл, заполненный средой.
- Ко второму жидкостному разъему прикрепите изогнутую игольчатую ступицу 18 G 90° градусов, длину трубки, игольчатую ступицу 18 G, трехсторонний клапан и бочковую часть стерильного шприца 10 мл (это будет действовать как резервуар для улавливания жидкости и пузырьков из ASOC).
- С трехходовыми клапанами, соответствующим образом открытыми для шприцев, осторожно проталкивайте жим через систему, используя порт разъема жидкости, определенный на этапе 3.5, для надувания AS, заполнения среды в трубке и, в конечном итоге, резервуара.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если среда просачивается в тарелку ASOC, AS недостаточно плотно закреплена зажимным кольцом. - Удалите пузырьки, осторожно вдавливая жим в посуду и переворачивая блюдо, чтобы вытолкнуть пузырьки в резервуар.
- Положите блюдо и встаньте вертикально. Поместите нижнюю часть чашки Петри под ножки подставки, стараясь не зацепить трубку.
4. Начало культуры органов переднего сегмента
- ASOC теперь готова к инкубации. Поместите тарелку ASOC в инкубатор клеточных культур (37 °C, 5% CO2). Убедитесь, что высота асокарелки в инкубаторе выше датчиков давления известна и учитывается для точного расчета ВГОД(Дополнительный протокол 4).
- Направляйте линии труб через нижнюю часть дверцы инкубатора 37 °C, 5% CO2, чтобы они не мешали открытию и закрытию двери. Прикрепите шприц 20 мл к шприцевой насосной установке со скоростью 2,5 мкл/мин.
- Расположите линию НКТ с резервуаром на приборе преобразователя давления. Подключите боковой 3-ходовой клапан к установке датчика давления во время протекания PBS через линию, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в трубные линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите PBS от резервуаров после настройки системы, чтобы уменьшить вероятность загрязнения резервуара ростом микробов в течение всего периода культуры органов. - Начните сбор данных IOP, предварительно убедив наличие карты microSD для сохранения файлов данных. Затем включите настройку датчика давления, чтобы начать сбор данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о настройке устройства сбора данных преобразователя давления приведена в Дополнительном протоколе 2.
5. Ежедневное обслуживание АСОК
- После того, как ASOC будет 24 ч, чтобы уравновесить, удалите посуду из инкубатора 37 ° C, 5% CO2 и поместите ее в шкаф BSC II.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе данных о давлении эти периоды времени выглядят как всплески, поскольку ASOC удаляются из инкубатора (изменение высоты) и регулируются в шкафу. - Проверьте наличие утечек под каждой чашкой на тарелке Петри. Если они присутствуют, проверьте наличие плотных жидкостных соединений под блюдом и при необходимости снова затяните. Проверьте наличие утечек в верхней части тарелки с помощью стерильного L-ключа, чтобы затянуть винты в зажимном кольце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань склеры AS будет сжиматься и уменьшать толщину на 24 ч, а зажимное кольцо нужно будет затянуть. - Хорошо аспирировать СМИ от блюда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трабекулярная сетка фильтрует жидкость из среды, закачиваемой в ASOC. Поэтому носители будут присутствовать в АСОК тарелке по краям. - Повторите шаги 3.7 и 3.8, чтобы удалить все захваченные пузырьки воздуха.
- Заправляйте шприцы на шприцевых насосах, убедитесь, что шприцевые насосы работают, и подтвердите выравнивание клапанов для перфузии в ASOC. Верните посуду ASOC в инкубатор 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимально, чтобы эти шаги выполнялись ежедневно. Тем не менее, использование начального объема среды 20 мл, объема скважины ASOC и скорости насоса 2,5 мкл / мин должно быть достаточным, чтобы система работала в течение нескольких дней без помех.
6. Индукция травмы ОГ с помощью проколотого устройства с пневматическим приводом
ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция пневматического проколотого устройства подробно описана в Дополнительном протоколе 3. Травмы ОГ индуцируются после стабилизации ВГД, что обычно происходит через 3 дня в культуре. Допустимые значения ВГД составляют 5-20 мм рт.ст. на основе физиологического ВГД, которые могут быть определены путем оценки файлов данных ВГД или установки светодиодных индикаторов в системе измерения давления, как описано в Дополнительном протоколе 2.
- Подготовьте шкаф BSC II для индукции травмы OG, как описано в шаге 1.10. Подключите проколовую платформу к линии сжатого воздуха. Прикрепите стерильный прокол к патрону.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для питания устройства может использоваться воздушный компрессор, но сжатого воздуха в резервуаре или встроенных лабораторных линий может быть достаточно, если давление превышает 50 фунтов на дюйм. - Установите регулятор давления на проколовой платформе на 50 psi для адекватного прокола на объектах диаметром до 4,5 мм. Расположите тиски поперечного слежения на лабораторном домкрате перед проколотой платформой, чтобы удерживать тарелку ASOC во время индукции травмы.
- Снимите установку ASOC с инкубатора 37 °C, 5% CO2 и поместите в крестовые тиски перпендикулярно проколотой платформе(рисунок 2)после снятия крышки и откладывания ее в сторону. Держите передний сегмент перфузным, но закройте 3-образное отверстие клапана к датчику давления, чтобы предотвратить повреждение датчика под избыточным давлением.
- Вытяните кронштейн поршня на максимальное расстояние и расположите вершину роговицы в пределах 1 мм от объекта прокола. Втяните кронштейн поршня и поднесите передний сегмент на 1 см ближе к объекту прокола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это расстояние было оптимизировано для высокоэффективной индукции травм без попадания в тарелку ASOC. - Выстрелите проколом, включив его и открыв электромагнитный клапан вторым переключателем на устройстве. Чтобы втянуть устройство, нажмите второй переключатель еще раз, чтобы удалить прокол из глаза. Проверьте правильную индукцию травмы путем визуального осмотра и утечки среды из места травмы.
- Снимите с тисков тарелку ASOC; поместите крышку обратно на тарелку в сборе и откройте жидкостную линию к датчику давления. Поместите ASOC обратно в инкубатор 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе терапевтическое средство может быть применено к АС для оценки его эффективности для герметизации травм ОГ.
7. Удаление ASOC из культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от анализа конечных точек (см. Репрезентативные результаты для возможных методов конечных точек), AS должен оставаться в чашке ASOC раздутым, в то время как другие методы требуют, чтобы ткань AS была изолирована из культуральной камеры. Приведенная ниже методика описывает, как вывести АС из посуды для посева органов и удалить остальную часть установки.
- Удалите посуду ASOC из инкубатора с 37 °C, 5% CO2. Закройте 3-х точный клапан к шприцевой шприц и резервуару и отсоедините трубку от системы. Выбросьте шприц, резервуар и фильтр. Поместите 3-х хозяйковые клапаны, трубки и игольчатые ступицы в отдельный контейнер для промывки и стерилизации.
- Отсоедините ступицы игл от жидкостных соединений на дне тарелки. Отсоединайте жидкостные разъемы и уплотнители. Поместите все предметы в контейнер для мытья и стерилизации.
- Снимите четыре винта с зажимного кольца с помощью L-ключа. Осторожно снимите зажимное кольцо.
- Используя щипцы, удалите АС из чашки и, в зависимости от анализа конечной точки и изображения, поместите в фиксатор или соответствующие биологические отходы.
8. Анализ данных ВГОД
- Подключите карту microSD к компьютеру, чтобы удалить .txt файл, содержащий данные из последнего экспериментального запуска.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файл назван в коде, управляющем микроконтроллером, и должен обновляться для каждого эксперимента (см. Дополнительный протокол 2). - Импортируйте данные в электронную таблицу.
- Организуйте данные в 12 столбцов: время (в мин) и сигнал мВ для каждого из 11 каналов преобразователя давления. Первые десять каналов соответствуют десяти экспериментальным установкам ASOC. Последний сигнал преобразователя предназначен для датчика, открытого для воздуха в качестве канала управления для подтверждения того, что сигнал мВ не изменился из-за изменений во входном сигнале. График канала управления временем для подтверждения того, что сигнал мВ был согласован во всем.
- Преобразуйте сигналы мВ для десяти каналов в мм рт.ст., используя уравнения наклона-перехвата, генерируемые начальной калибровкой каждого датчика (см. Дополнительный протокол 4).
- Постройте график времени (преобразуйте в дни для упрощения интерпретации данных) по каждому из десяти каналов, чтобы определить, как ВГД колебалась в течение экспериментального времени.
- Определите средние значения ВГД в ключевых точках данных, чтобы легче сравнивать значения между каждым из них и то, как они изменяются до и после индукции травмы ОГ. В среднем 2-3 ч данных для каждого 24-ч интервала для определения ВГОД в каждый день АСОК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты ВГД показаны на рисунке 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изображения, полученные с помощью оптической когерентной томографии (OCT), показаны для глаз с травмированным OG, чтобы проиллюстрировать, как выглядит успешная индукция травмы. На рисунке 3 показаны изображения для контроля и OG поврежденной ткани AS сразу после травмы и через 72 ч. Показаны два вида: изображения поперечного сечения через место повреждения и проекция максимальной интенсивности сверху вниз (MMP) для визуализации площади поверхности изображения. Контрольные глаза не показывают заметных нарушений в роговице, в то время как могут быть обнаружены явные травмы, которые пересекают всю роговицу после травмы ОГ. Из МИП видно, что травмы имеют неправильную форму и размер, но размер травмы уменьшается в течение 72 ч. Ранее этот эффект показал свою значительность для ряда травм, протестированных13.
Основным выводом данных для модели повреждения ОГ, описанной в этом протоколе, является внутриглазное давление в ходе экспериментальной установки. Данные регистрируются в единицах милливольт в качестве выхода от каждого преобразователя давления, который может быть преобразован в мм рт.ст. с помощью калибровки(Дополнительный протокол 4). Пример данных ВГД по сравнению с экспериментальным временным курсом приведен для глаз, которые считаются приемлемыми, и других, которые не будут считаться пригодными для использования(рисунок 4A). Из данных о следах давления глаза были прикреплены к датчикам через 24 ч в культуре, но ВГОД продолжает колебаться в течение первых 72 ч в культуре. Физиологическое ВГД для ткани АС в культуре органов составляет примерно 8-10 мм рт.ст., поэтому диапазон 2x и 1/2x был определен в качестве затвора для полезных значений ВГД после стабилизации значений (5-20 мм рт.ст.). Только глаза, которые находились в этом диапазоне, будут разрешены для использования с остальной частью протокола. Из предыдущих экспериментов у нас был 90% успех, который был достигнут в установке ASOC для стабилизации глаз в требуемом диапазоне(рисунок 4B).
Также представлены результаты того, как ВГД изменяется из-за травмы ОГ и терапевтического вмешательства(рисунок 4C,D). После индукции травмы ОГ давление должно значительно снизиться и оставаться таким до тех пор, пока ткань не будет удалена из АСОК(Рисунок 4С). Если индукция глаза после травмы не снижает давление, это указывает на то, что успешная травма не была вызвана, поскольку ВГД должно быть уменьшено, если водонепроницаемое уплотнение глаза скомпрометировано. Тем не менее, меньшие размеры травм могут самозаживетствовали, что может привести к восстановлению ВГОД. Если терапевтическое средство применяется к глазу после индукции травмы ОГ, восстановление ВГД может быть отслежено во время ASOC. Эта концепция демонстрируется данными, показывающими клей Dermabond, нанесенный на повреждения OG 2,4 мм(рисунок 4D). Показаны средние результаты пяти отдельных экспериментов ASOC с терапией и без нее, и очевидно, что терапевтическое увеличение ВГОД увеличивается. Этот метод может измерить эффективность терапевтического средства для восстановления ВГД и отслеживать, восстанавливается ли это давление в течение ключевых 72 ч после травмы ОГ.
Кроме того, протокол ASOC адаптируется для использования с широким спектром конечных точек характеризации для удовлетворения экспериментальных требований конечного пользователя. Во время культивирования оттоковые среды, выходящие из глаза, могут собираться ежедневно или даже ежечасно, что может быть использовано для отслеживания изменений уровня белка, происходящих во время ASOC, после индукции травмы OG или после применения терапевтического средства. Например, ранее была проведена желатиновая зимография для определения уровней матричной металлопротеиназы для отслеживания заживления ран и ремоделирования тканей20. Дальнейшие биологические конечные точки возможны после удаления ткани из культуры с помощью традиционных методов иммуногистохимии для оценки жизнеспособноститканей 21,22,отслеживания патофизиологических изменений роговицы23,24или окрашивания на основе антител для любого интересующего белка25,26.
Функциональные показатели роговицы также могут быть получены из глаз, поддерживаемых в ASOC. Целостность эпителия роговицы может быть оценена с помощью флуоресцеинового пятна глаз и получения изображения с использованием источника синего света27,28. После удаления из культуры ткань роговицы может быть оценена на прозрачность с помощью простого получения изображения13. Традиционная глазная визуализация также может быть выполнена для оценки структуры ткани с терапевтическим вмешательством или без него. Изображения OCT, как показано на рисунке 3,могут создавать изображения поперечного сечения через роговицу и могут быть захвачены неинвазивно, потенциально позволяя коллекционировать изображения при сохранении ткани в культуре. Другие методы визуализации, такие как щелевая ламповая микроскопия, ультразвук или конфокальная микроскопия in vivo, также могут быть адаптированы для получения дополнительной анатомической информации.
Наконец, оценка механических свойств переднего сегмента может быть получена для понимания влияния травмы ОГ или последующего терапевтического воздействия на подлежащую ткань. В то время как сбор данных ВГД сам по себе показывает, как целостность водонепроницаемого уплотнения глаза была скомпрометирована, ранее мы показали, что дополнительные тестовые метрики могут быть измерены, чтобы выявить дополнительные механические функции10,11. Глазное соответствие, сгруппированное механическое свойство, описывающее, как внутриглазное давление изменяется из-за инфляции (изменение объема / изменение давления), может быть измерено с помощью шприцевого насоса для введения внезапных небольших объемов жидкости в глаз и регистрации результирующего повышения давления с помощью датчика давления. Более высокое соответствие указывает на то, что ткань менее жесткая и может быть использована для отслеживания того, как свойства терапевтического материала отличаются от подлежащей ткани роговицы. Скорость утечки из глаза или традиционной установки оттока может быть измерена и рассчитана для определения точной скорости потока жидкости, выходящей из глаза на единицу давления20,29. Наконец, что касается терапевтического тестирования, давление разрыва может быть измерено, чтобы определить максимальное давление, которое глаз может удерживать до терапевтического провала. Это может быть использовано для сравнения производительности с неповредимыми глазами или для отслеживания изменений производительности со временем12,13.
Рисунок 1:Схема установки ASOC. Глаза держатся в специально изготовленных посудах для органной культуры и удерживаются на месте с помощью зажимного кольца. Носители ASOC вливаются через шприцевой насос через клапан A и подключаются к преобразователю давления, а последующий сбор данных осуществляется с помощью клапана B. Открытые порты в каждом клапане выделены синим цветом, а желтый цвет указывает на закрытые каналы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Обзор установки травмы OG. (A) Настройка устройства повреждения с пневматическим питанием. Слева направо сжатый воздух вводится в устройство через линию сжатого воздуха, которая проходит через регулятор для установки давления на уровне 50 фунтов на дюйм, измеренного манометром. Два электромагнитных клапана соединены с линейным приводом для прямого расширения/втягивания сверлильной чаки, удерживающей прокол. Тиски располагаются перед проколом, чтобы удерживать глаз в соответствующем положении x, y, z. (B)Репрезентативная АСОК размещается перед индукционным устройством травмы. Более подробная информация об устройстве и его конструкции подробно описана в Дополнительном протоколе 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Изображения оптической когерентной томографии экспериментов с повреждениями ASOC OG. Изображения показаны для контрольных глаз (невредимых) и OG поврежденных глаз сразу после травмы и через 72 ч после травмы. Виды показаны в виде поперечных сечений через роговицу(левая сторона)и сверху вниз проекционных видов максимальной интенсивности поверхности роговицы(правая сторона). Рисунок был адаптирован с разрешения Snider et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Репрезентативные результаты ВГД для экспериментов ASOC. (A) Необработанные данные ВГД за первые 72 ч установки ASOC. Глаза прокалываются через 72 ч, поэтому первые 3 дня данных оцениваются, чтобы определить, стабилизируется ли ВГД в приемлемом диапазоне ВГД (5-20 мм рт.ст.). Из репрезентативных результатов три из пяти глаз попадают в допустимый диапазон ВДМ, в то время как один имеет слишком высокое ВД, а другой слишком низкое ВД (выпадая за пределы выделенной желтой области на графике). (B) Стабилизированное ВГОД для n = 50 установок ASOC из предыдущих экспериментов для демонстрации типичного коэффициента успеха с помощью метода ASOC. (C)ВГД для неповредимых глаз по сравнению с тремя различными размерами травмы ОГ после индукции травмы в течение 72 ч. Потеря ВГОД очевидна, без каких-либо признаков выздоровления. (D) Результаты травмированного ВГД по сравнению с травмами, обработанными клеем Dermabond. Хотя частота ошибок высока из-за того, что некоторые глаза запечатаны, а другие нет, метод может отслеживать изменения ВГД в течение 72-х ч после травмы. Рисунок был адаптирован с разрешения Snider et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существуют критические шаги с платформой asoc OG injury, которые следует выделить, чтобы повысить вероятность успеха при использовании методологии. Во-первых, во время рассечения переднего сегмента сохранение трабекулярной сетки является важным, но сложным для правильного выполнения. Если ТМ нарушена, глаз не будет поддерживать физиологическое давление и не будет соответствовать критериям приемлемости для экспериментального использования. Рекомендуется сначала практиковать процесс рассечения в нормальных условиях, а не вводить дополнительные проблемы асептической техники до тех пор, пока не будут получены надлежащие рассечения. Во-вторых, при установке глаз в посуду ASOC крайне важно, чтобы они были достаточно плотными, чтобы предотвратить утечку жидкости, но достаточно свободными, чтобы предотвратить повреждение посуды ASOC. Если глаз не закреплен плотно, жидкость будет вытекать из глаза нефизиологическими средствами, что приведет к небольшому ВГД или его отсутствию. Тем не менее, зажимное кольцо, удерживающее глаз вниз, является пластиковым и может быть легко сломано при чрезмерном затягиваении. Важно зажать глаза в течение 2 дней, так как склеральная ткань под кольцом будет сжимать и ослаблять ткань в течение первых 24 ч. Рекомендуется затягивать кольца только до тех пор, пока на 1-й день не будет ощущаться сопротивление затягиванию, и следить за этим, повторно затягивая до аналогичных уровней через 24 ч в культуре для достижения наилучших результатов.
В-третьих, при использовании этой модели важно полностью понять, куда направлен поток жидкости. Каждая тарелка ASOC соединена с несколькими трехполосными клапанами для направления потока жидкости из шприцевого насоса или резервуара для шприцев 10 мл и подключения к преобразователям давления. Различные случаи процесса настройки требуют, чтобы клапаны были расположены таким образом, чтобы смывать пузырьки воздуха из глаза или защищать преобразователи давления от избыточного давления. Следует по-прежнему проявлять осторожность, чтобы понять, что всегда открыто/закрыто до критических шагов протокола. Наконец, поддержание стерильности во всем протоколе травм ASOC OG имеет решающее значение, но его легко потерять в многоэтапном, многодневном процессе. Перфузионные среды содержат высокий уровень антибиотиков и антимикотиков для предотвращения этого, и глаза погружаются в бетадин перед установкой для предотвращения загрязнения, но все еще есть критические шаги, где ошибки наиболее вероятны. Во время первоначальной установки в тарелке избегайте контакта с глазами, затягивая зажимные кольца на месте и держите крышки на посуде в любое время, когда они не используются. Более вероятным этапом воздействия является ежедневное обслуживание ASOC. Важно делать эти рутинные шаги в шкафу биобезопасности, даже если кажется, что их можно быстро выполнить, не удаляя глаза из инкубатора. Тщательное следование протоколу и поддержание хорошей асептической техники должно свести к минимуму риски загрязнения в течение 6-дневных экспериментов ASOC.
В целом, платформа ASOC OG для травм уникальна среди других методологий, рассматривая травмы открытого земного шара из-за двух ключевых критериев. Во-первых, это метод индукции травмы. Высокоскоростное пневматическое устройство для травмирования, используемое в использовании, вызывает травмы с высокой силой. Это позволяет индуцирование травм предметами, которые не особенно острые или с небольшим диаметром. Это более точно имитирует травмы, которые имеют неправильную форму; высокоскоростных осколочных ранений в результате взрывных устройств30,31. Пневматическое устройство может быть легко оснащено осколками неправильной формы, имитирующих объекты, чтобы создать травмы, более сложные для заживления по сравнению с предыдущими методами с использованием лазеров, игл или лезвий скальпеля для создания чистой, точной геометрии травм32,33,34. Во-вторых, методология ASOC позволяет отслеживать прогресс травмы и терапевтическую эффективность за пределами первоначальной индукции травмы. Возможность отследить до 72 ч была невозможна в ранее разработанной настольная платформа травм OG10,11,12 и была мотивацией для разработки этого протокола. Фактически, жизнеспособность клеток оставалась высокой в эндотелии роговицы в течение как минимум 1 недели в ASOC13. ASOC является единственным средством, с помощью которого эта долгосрочная характеристика может быть выполнена без перехода к дорогостоящим экспериментам in vivo.
Основные приложения для платформы ASOC двоякие. Во-первых, модель может быть использована для дальнейшей характеристики травм открытого земного шара, особенно учитывая, как они меняются со временем. В предыдущем исследовании травмы ОГ характеризовались таким образом, и заживление ран наблюдалось в течение 72 ч после травмы13. Дальнейшее отслеживание различных размеров травм, форм, мест в течение 72 ч или даже дольше в отношении происходящих биологических изменений будет информировать о критических медицинских решениях, которые должны быть приняты после травм ОГ. Некоторые параметры травмы могут позволить самозаживление роговицы, или другие параметры могут быть более серьезными, если вмешательство не применяется в течение первых 24 ч. Эта информация будет бесценной для сортировки пациентов при наличии ограниченных медицинских принадлежностей или ресурсов для эвакуации.
Во-вторых, платформа ASOC OG может быть использована для разработки и тестирования разработки продуктов. Для этого приложения платформа культуры органов может выполнять ряд ролей. Во время первоначальной разработки продукта более короткие временные рамки могут быть протестированы с помощью ряда составов продуктов, чтобы определить, что является наиболее эффективным. Система культуры органов может быть сконфигурирована для еще большей высокой пропускной способности для этого применения с дополнительными шприцевыми насосами, чтобы выйти за рамки десяти одновременных экспериментов, возможных с системой, подробно описанной здесь. Для более изысканных продуктов можно оценить более длительные временные точки для оценки производительности в течение 72 часов или, возможно, даже дольше. Наконец, оценка заживления ран может быть возможна при оценке биологически активных продуктов, которые могут постоянно лечить травмы ОГ, а не временную стабилизацию.
Тем не менее, существуют ограничения с платформой ASOC OG, которые следует учитывать. Во-первых, хотя модель позволяет проводить долгосрочную оценку терапевтических средств, в ней отсутствуют все ткани глаза за пределами роговой оболочки, такие как радужная оболочка и хрусталик. Эти дополнительные ткани, вероятно, будут подвержены влиянию травмы ОГ и могут играть роль в прогрессировании травмы. Аналогичным образом, в изолированном переднем сегменте отсутствуют элементы иммунного ответа, которые будут включены при переходе от модели ASOC к последующему тестированию на животных. Далее, модель подходит только для создания травм РОГОВИЦы и потенциально лимбальных травм ОГ. Склеральные или задние повреждения ОГ не могут быть вызваны этим методом. Однако многие из этих типов травм приводят к повреждению сетчатки, что делает любую временную стабилизацию терапевтической вряд ли предотвратит потерюзрения 35,36. Наконец, травмы с моделью до 72 ч после травмы отслеживались только. ASOC использовался в других приложениях до 2 недель, поэтому модель, вероятно, может быть использована для этих приложений, но она не была протестирована в настоящее время37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Мнения, выраженные в этой статье, являются мнениями автора (авторов) и не отражают официальную политику или позицию Медицинского департамента армии США, Министерства армии, Министерства обороны или правительства США.
Acknowledgments
Этот материал основан на работе, поддержанной Министерством обороны Соединенных Штатов в рамках межведомственного соглашения (No 19-1006-IM) с программой приобретения временного ремонта роговицы (Агентство по развитию медицинской техники армии США).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
- Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
- Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
- Riesberg, J., Powell, D., Loos, P.
- Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
- Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
- Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954 (2012).
- Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
- Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
- Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
- Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218 (2020).
- Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98 (2020).
- Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
- Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546 (2021).
- Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).
- Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
- Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18 (2021).
- Ren, H., Wilson, G.
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
- Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732 (2020).
- Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
- Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
- Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
- Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
- Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).
- Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
- Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
- Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
- Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
- Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
- Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541 (2013).
- Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
- Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
- Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
- Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).
