Summary
오픈 글로브 눈 부상은 시골 또는 군사 관련 시나리오에서 며칠 동안 치료되지 않을 수 있으며, 그 결과 실명이 발생할 수 있습니다. 시력 상실을 최소화하기 위해 치료법이 필요합니다. 여기서, 우리는 장기 문화 오픈 글로브 부상 모델을 자세히 설명합니다. 이 모형을 사용하면 이러한 부상을 안정화하기위한 잠재적 인 치료법을 적절하게 평가 할 수 있습니다.
Abstract
오픈 글로브 부상은 시각적 결과가 좋지 않아 시력이 영구적으로 상실되는 경우가 많습니다. 이것은 부분적으로 안과 배려가 쉽게 유효하지 않는 시골 환경 및 군사 약 응용에 있는 상해 그리고 의학 내정간섭 사이 연장된 지연 때문입니다. 치료되지 않은 부상은 눈이 방수 씰을 잃은 후 감염에 취약할 뿐만 아니라 안구 내 저혈압으로 인한 조직 생존 능력의 상실에 취약합니다. 일시적으로 오픈 글로브 부상을 밀봉하는 치료법은 제대로 발달되면 적절한 안과 치료가 가능해질 때까지 안구 압력을 복원하고 감염을 예방할 수 있습니다. 제품 개발을 용이하게하기 위해, 여기에 상세한 전방 세그먼트 장기 문화 오픈 글로브 부상 플랫폼의 사용으로 최소 72 h 부상 후 치료 성능을 추적할 수 있습니다. 돼지 전방 세그먼트 조직은 사용자 정의 된 장기 문화 접시에서 유지 및 생리 내 혈압에서 개최 할 수 있습니다. 펑크 부상은 군관련 부상 크기와 유사하게 직경 4.5mm의 부상 크기를 생성할 수 있는 공압 구동 시스템으로 생성될 수 있습니다. 안구 압력의 손실은 적절한 부상 유도 및 눈의 방수 씰의 손실을 확인하는 72 시간 후 부상에 대해 관찰 할 수있다. 치료 성능은 부상 유도 후 눈에 응용 프로그램에 의해 추적 한 다음 며칠 동안 안구 압력을 추적 할 수 있습니다. 또한, 전방 세그먼트 상해 모델은 투명성, 안구 역학, 각막 상피 건강 및 조직 생존 가능성을 평가하는 것과 같은 전방 분단 생리학을 기능적 및 생물학적으로 추적하는 널리 사용되는 방법에 적용가능하다. 전반적으로, 여기서 설명된 방법은 안과 치료가 쉽게 제공되지 않을 때 일시적으로 오픈 글로브 부상을 밀봉하기 위한 생물재료 치료제 를 개발하기 위한 필요한 다음 단계이다.
Introduction
오픈 글로브 (OG) 부상은 치료하지 않거나 적어도 부상 후 안정화 될 때 시력의 영구적 인 손실을 초래할 수있습니다 1. 그러나 지연은 시골 지역이나 군사 시나리오의 전장과 같이 안과 개입에 대한 접근이 쉽게 제공되지 않는 외딴 지역에서 만연합니다. 치료가 쉽게 제공되지 않을 때, 현재의 치료 기준은 의료 개입이 가능할 때까지 단단한 방패로 눈을 보호하는 것입니다. 군의학에서는 현재 24시간까지 지연되지만, 향후2, 3,4의대기 대피가불가능한도시 환경에서 전투 작전에서 최대 72시간까지 증가할 것으로 예상됩니다. 이러한 지연은 안과 개입에 대한 액세스가제한된시골, 원격 민간 응용 프로그램에서 더 길 어질 수 있습니다5,6. 치료되지 않은 OG 부상은 눈의 방수 씰이 손상되기 때문에 안구 압력(IOP)의 감염 및 손실에 매우 취약하여7,8. IOP의 손실은 조직 생존에 영향을 미칠 수 있으며, 부상과 치료 사이의 지연이 너무 길면 시력을 회복할 가능성이 낮은 의료 개입이가능합니다 9.
안과 전문의가 도달할 때까지 OG 부상을 밀봉하기 위한 적용하기 쉬운 치료법의 개발을 가능하게 하기 위해 벤치탑 OG 부상 모델은 이전에10,11을개발하였다. 이 모델로, IOP는 압력 트랜스듀서에 의해 포착되는 동안 전체 돼지 눈에서 고속 부상이 발생했습니다. 그런 다음 치료법을 적용하여 OG 부상부위(12)를밀봉하는 능력을 평가할 수 있다. 그러나, 이 모형은 전체 돼지 눈을 사용하기 때문에, 환자가 특수 치료에 도달할 때까지 치료가 상해 부위를 안정시켜야 하는 가능한 72h 창에 걸쳐 장기적인 성능을 추적하는 방법 없이 즉각적인 치료 성능을 평가할 수 있다. 그 결과, 전방 세그먼트 장기 배양(ASOC) OG 부상 모델이 개발되어 장기 치료성능을추적하는 플랫폼으로서 이 프로토콜에 상세하였다.
ASOC는 각막과 같은 전방 세그먼트의 혈관 조직을 유지 관리하는 데 널리 사용되는 기술로, 다주 동안 에뉴클레션 후14,15,16,17. 전방 세그먼트는 생리적 유량에서 유체를 침전하고, ASOC 설정18,19동안 IOP 조절을 담당하는 조직인 궤적 메쉬워크 유출 영역을 보존함으로써 생리적 IOP 하에서 유지된다. ASOC 플랫폼은 조직을 생리적으로 유지하고, 공압 구동 장치를 사용하여 OG 손상을 유도하고, 치료를 적용하고, 부상 후 최소 72시간 동안 의 상해 안정화를 추적할 수있다 13.
여기서 프로토콜은 ASOC 플랫폼을 사용하기 위한 단계별 방법론을 제공합니다. 먼저 ASOC 플랫폼을 설정하고 제작하는 방법을 자세히 설명합니다. 다음으로, 프로토콜은 전방 세그먼트를 무균하시키고 궤적 메쉬워크를 유지하는 방법을 자세히 설명한 다음, 맞춤형 장기 배양 접시에 전방 세그먼트 조직을 설정하는 것입니다. 그런 다음, 오픈 글로브 부상을 만들고 부상 직후 치료 적용하는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 눈의 기능적, 기계적 및 생물학적 특성과 부상이 얼마나 잘 안정화되었는지 를 평가하는 이 방법과 함께 사용할 수 있는 특성화 매개변수에 대한 개요를 제공합니다. 전반적으로,이 모델은 오픈 글로브 부상을 안정화하고 치료하기위한 제품 개발을 가속화하고 부상 후 가난한 비전 예후를 개선하는 데 필요한 플랫폼을 제공합니다.
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Protocol
이 프로토콜을 수행하기 전에 연구 및 훈련에 동물을 사용하기위한 법적 및 윤리적 요구 사항이 있음을 유의하십시오. 살아있는 동물이 안구 조직의 근원에 사용되는 경우, 시작 전에 지역 윤리 적 또는 법적 권한 (IACUC 또는 윤리위원회 등)의 승인을 구하십시오. 동물의 사용에 대한 승인을 얻는 데 문제가있는 경우, 진행하지 마십시오. 우리는 이전에 결정하고 생체 생리학에서 가장 가까운 비교 24 시간 사후 사후 내에서 신선한 돼지 눈이 얻고 사용보고하고 이러한 연구에 대한 잘 멀리 (동물 기술, 타일러, TX, 미국)10,13. 24 시간 이내에 조직을 얻기 위해 조직 공급 업체를 사용하여이 프로토콜 을 통해 살아있는 동물이 사용되지 않았습니다.
참고: 조직 도착 전에 장기 배양접시(보충 프로토콜 1),클램핑 링(보충프로토콜 1),접시 스탠드(보충프로토콜 1),압력 트랜스듀서 데이터 수집 설정(보충프로토콜 2),공압 천자 플랫폼(보충프로토콜 3)을제조한다. 요리, 도구 및 소모품을 소독하고 작업 영역을 준비하십시오. 그것은 일반적으로 연결, 여분의 궤도 조직 부착와 함께 와서, 눈에 총 해부를 수행하는 비 멸균 영역을 갖는 것이 유용합니다. 열린 깨끗한 작업 표면에서 이러한 첫 번째 단계를 실행한 다음 눈을 미세 해부(캐비닛 #1)에 대한 BSC II 캐비닛으로 무균으로 전달합니다. 최적으로, 마이크로 해부에 사용되는 BSC II 캐비닛은 공기 흐름을 최소화하고 작업 공간을 최대화하기 위해 접시 조립BSC II 캐비닛 (캐비닛 #2)에서 분리됩니다. 해부 현미경과 작업 표면 (캐비닛에서 튀어나온 카메라 또는 안구)을 시각화하는 방법으로 미세 해부 캐비닛을 설정합니다.
1. 살균 단계, 소모품 (자세한 내용은 재료 표 참조), 및 설정
- 다음 항목 준비 및 가스 살균 (각 눈에 대한 키트 1 개): ASOC 접시, 클램핑 링, O-링이있는 두 개의 유동성 커넥터, 18 G 바늘 허브 2 개, 4 개의 나사, 4 개의 PE-100 튜브 (거리의 길이는 인큐베이터 내부의 접시에서 주사기 펌프 및 압력 변환기 데이터 집합까지 확장 될 만큼 길어야한다) 두 개의 18 G 90° 구부러진 바늘 허브, 두 개의 3방향 밸브.
- 다음 키트를 준비하고 자동 복제합니다.
- 미세 한 쌍의 미세 집게, 반나스 가위 1 켤레, 중간 이빨 집게 1 켤레, 큰 가위, 면 봉면, 면도날 또는 메스가 들어있는 마이크로 해부 기기 키트를 준비하고 자동 복제하십시오.
- 중간 이빨이 있는 집게 1켤레, 수술 가위 1켤레, L키 1켤레가 포함된 조립 기기 키트를 준비하고 자동 복제합니다.
- 필요에 따라 매일 클램핑 링을 요리에 조여기 위해 L 키 하나를 포함하는 일일 키트(수량: 문화의 일일 1개)를 준비하고 자동 복제합니다.
- 눈과 전방 세그먼트를 소독하고 저장하는 자동 경사비커 4개.
- 펑크 오브젝트를 자동으로 복제합니다.
- 페트리 접시 (1 접시 / 눈), 거즈 (1-2 / 눈), 접시 스탠드, 20 mL 주사기 (1 /눈), 10 mL 주사기 (1/눈), 나일론 주사기 필터 (1/눈)를 수집합니다.
- 멸균 매체 준비: 4% FBS, 1x 글루타맥스, 1x 겐타미신, 1x 항생제-항진균제(AA; 약 30-40mL 완전 미디어/눈)를 갖춘 DMEM.
- AA-PBS 준비: 1x AA(~500mL)를 갖춘 PBS.
- 깨끗하고 건조한 대형 수술 가위와 집게 : 총 해부 도구 팩을 준비합니다.
- 비멸 해부 작업 공간 설정: 총 해부 도구 팩에서 공급을 수집, PBS와 얼음에 잠긴 에핵 돼지 눈, 수술 커튼, PBS와 100 mL 비커. 총 해부에 필요한 수술 커튼과 항목을 배치합니다.
- 멸균 해부 작업 공간 설정: 마이크로 해부 기기 키트, 멸균 거즈, 해부 현미경, 베타딘 솔루션, 멸균 PBS, 멸균 매체, 멸균 된 100 mL 비커, 멸균 페트리 접시에서 소모품을 수집합니다. 무균 BSC II 캐비닛 #1로 전송합니다. 해부 현미경에 눈을 시각화하기 위해 캐비닛을 설정합니다.
- ASOC 조립 작업 공간 설정: 가스 멸균 키트(접시 키트 및 뚜껑 키트), 조립 기기 키트, 멸균 미디어, 접시 스탠드, 멸균 페트리 접시, 멸균 주사기 및 주사기 필터를 수집합니다. 무균 BSC II 캐비닛으로 전송 #2. 접시 조립캐비닛을 설정합니다.
- 눈이 안정되고 펑크 (72 시간 사후 설정)에 대한 준비가되면, 무균BSC II 캐비닛으로 전송합니다. OG 부상 유도 작업 영역 설정: 공압 구동 부상 유도 장치 (보충 3에자세히 설명 된 어셈블리) 및 실험실 잭 및 교차 추적 vise ASOC 접시를 개최 합니다.
2. 조직의 해부
- 비멸 해부 작업 공간을 사용하여 돼지 조직을 준비합니다.
- 현지 아바토이르, 동물 연구 또는 공급 업체에서 에뉴클레오드 돼지 눈을 조달합니다. 배달 중에 PBS에 잠긴 얼음에 눈을 유지하고 수신 시 즉시 사용하십시오.
- 외형 조직을 잘라 내고 결막을 손질하여 코네클레성 껍질과 시신경만 남깁니다. 총 해부 도구 팩에서 큰 수술 가위와 집게로 비멸 조건에서 해부를 수행하십시오.
- 실험 용 설정에 필요한 모든 눈이 예비 / 총 해부 될 때까지 얼음에 다시 신선한 PBS에 눈을 배치합니다.
- 닫힌 용기에서 2 분 동안 10 % 베타 딘 솔루션에 눈을 잠그고 무균으로 BSC II 캐비닛 #1로 전송하십시오. 멸균 조건에서 모든 후속 작업을 수행하여 설치 시 오염을 최소화합니다.
- 멸균적으로 전방 세그먼트를 해부합니다.
- 베타딘 용액에서 2분 후, 안구 조직의 멸균을 유지하면서 안구 표면에서 과도한 베타딘 용액을 제거하기 위해 멸균 AA-PBS의 3개의 시리얼 세공으로 눈을 이송한다. 세 번의 세차후, AA-PBS에서 조직을 유지하여 추가 사용까지 유지하십시오.
- 면도날/메스와 구부러진 가위를 사용하여 눈을 헤비합니다. AA-PBS에 흠뻑 젖은 거즈에 눈을 뜨고 눈의 적도 근처에 멸균 면도날이나 메스로 절개를 만듭니다(전방에 40개로 60/40 분할). 구부러진 외과 가위를 사용하여 눈을 막아 전방 눈 (각막 반)을 분리합니다.
참고: 전방 세그먼트 주위의 절단은 기관 배양에 설정된 후 유체 누출을 생성하는 clera의 들쭉날쭉하고 거친 가장자리를 방지하기 위해 연속되어야 합니다. - 마이크로시저를 삽으로 사용하여 전방 세그먼트에서 유리체 유머를 스쿱합니다. 미세 시저를 사용하여 전방 세그먼트에서 렌즈를 제거합니다. 전방 세그먼트를 추가 해부 단계까지 AA-PBS에 둡니다.
참고: 해부될 모든 눈은 이 단계에서, 그리고 해부 과정의 나머지 부분을 하나씩 씩 떼어붙일 수 있습니다. - 해부 현미경으로, 홍채를 서서히 홍채 뿌리로 잘라, 반구 메쉬 워크 (TM)가 볼 때까지 복사. TM은 코네클레성 껍질 주위를 일주하는 섬유를 포함하는 안료 조직입니다. 홍채 뿌리를 향해 홍채로 조심스럽게 잘라 조직 아래 TM의 깊이를 노출합니다.
- 초기 절단조직으로 절단된 것과 동일한 깊이의 홍채 주위360°를 잘라 전체 TM 영역을 노출시합니다. 필요에 따라 TM을 덮는 잔여 홍채를 정리합니다.
- TM 영역(약 1mm)에 얇은 조직 후방 밴드만 남기고, 주모 체잔해를 TM으로 트리밍합니다.
- BSC II 캐비닛 #2에서 ASOC에 추가 설정될 때까지 해부된 전방 세그먼트(AS)를 미디어에 배치합니다.
참고: 단일 사용자가 해부 및 장기 문화 접시 조립을 수행하는 경우 ASOC 설정 전에 모든 눈을 이 시점에서 잡을 수 있습니다.
3. 장기 문화 요리에 전방 세그먼트 설정
- AS 반전 (컵 업)와 페트리 접시에 하나의 AS를 배치합니다. 면 봉면을 사용하여 미디어에 젖어 각막 중앙에 부드럽게 두드려 안료를 제거합니다. 집게를 사용하여 눈과 동일한 면봉을 잡고, 추가 안료를 제거하기 위해 sclera 주위에 면봉을 닦아.
- AS를 반전시키고 접시의 높은 부위를 중심으로 접시의 하단 부분에 놓습니다. 새로 배치된 AS 위에 클램핑 링을 놓습니다.
- 4개의 나사를 해당 구멍에 배치하여 반지 아래에 AS가 있는 링을 제자리에 고정시합니다. L 키로 나사를 부드럽게 손으로 조입니다.
참고: 조임 단계는 실험 전반에 걸쳐 매일 발생하므로 여기서 초기 조임의 목표는 클램핑 링을 깨는 것을 피하면서 미디어가 누출되지 않도록 하는 것입니다. - 멸균 페트리 접시 세트로 접시 위에 올려 놓고 설정을 반전시다. 접시 스탠드를 부착합니다. 오링과 함께 유체 커넥터를 접시 하단의 나사 포트에 부착합니다.
- 하나의 유체 커넥터에 18 G 90° 구부러진 바늘 허브, 튜브 길이, 18 G 바늘 허브, 나일론 주사기 필터, 3 방향 밸브 및 미디어로 채워진 20 mL 주사기를 부착하십시오.
- 제2 유체 커넥터에, 18 G 90° 도 구부러진 바늘 허브, 튜브 길이, 18G 바늘 허브, 3 방향 밸브 및 멸균 10 mL 주사기의 배럴 부분을 부착하십시오 (이것은 ASOC에서 액체와 거품을 잡기 위한 저수지 역할을 합니다).
- 3방향 밸브가 주사기에 적절하게 개방되어 3.5단계에서 확인된 유체 커넥터 포트를 사용하여 시스템을 통해 미디어를 부드럽게 밀어 AS를 팽창시키고 튜브에 미디어를 채우고 결국 저수지를 채웁니다.
참고: 미디어가 ASOC 접시에 누출되면 AS가 클램핑 링으로 충분히 단단히 고정되지 않습니다. - 미디어를 부드럽게 접시에 밀어 넣고 접시를 뒤집어 거품을 밀어 내고 저수지로 밀어 넣습니다.
- 접시를 놓고 똑바로 서라. 페트리 접시의 아래쪽 부분을 스탠드 의 발 아래에 놓고 튜브를 가지지 않도록주의하십시오.
4. 전방 세그먼트 장기 문화 시작
- ASOC는 이제 인큐베이션을 준비했습니다. ASOC 접시를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에넣습니다. 압력 트랜스듀서 위의 인큐베이터에서 ASOC 접시의 높이를 정확하게 계산하여 IOP(보충프로토콜 4)를계산합니다.
- 튜브 라인을 37°C, 5% CO2 인큐베이터 도어를 통해 튜브 라인을 직접 전달하여 도어의 개폐를 방해하지 않도록 합니다. 20mL 주사기를 2.5 μL/min로 설정된 주사기 펌프에 부착합니다.
- 압력 변환기 기기에서 저장소와 튜브 라인을 배치합니다. 측면 3방향 밸브를 압력 변환기 설정에 연결하면서 PBS를 라인을 통해 흐르면서 튜브 라인에 유입되는 기포를 피하십시오.
참고: 시스템이 설정된 후 저장소에서 PBS를 비우면 장기 배양 기간 동안 미생물 이성장으로 저장오염 가능성을 줄입니다. - 먼저 데이터 파일을 저장하기 위한 microSD 카드가 있는지 확인하여 IOP 데이터 수집을 시작합니다. 그런 다음 압력 변환기 설정을 켜서 데이터 수집을 시작합니다.
참고: 압력 변환기 데이터 수집 장치 설정에 대한 세부 정보는 보충 프로토콜 2에제공됩니다.
5. ASOC의 일일 유지 보수
- ASOC가 24h를 가지고 계면 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 요리를 제거하고 BSC II 캐비닛에 넣습니다.
참고: 압력 데이터 수집시 ASOC가 인큐베이터(높이 변경)에서 제거되고 캐비닛에서 조정되므로 이러한 기간은 스파이크처럼 보입니다. - 페트리 플레이트의 각 접시 아래에서 누출을 확인하십시오. 있는 경우, 접시 아래 꽉 유체 연결을 확인하고 필요한 경우 다시 조인. 멸균 L-키를 사용하여 접시 상단의 누출을 확인하여 클램핑 링의 나사를 조입니다.
참고: AS clera 조직은 24시간까지 두께를 압축하고 감소시키고 클램핑 링을 조여야 합니다. - 접시에서 미디어를 잘 흡인.
참고: 궤적 메쉬워크는 ASOC로 펌핑되는 매체에서 유체를 필터링합니다. 따라서, 미디어는 가장자리를 따라 ASOC 접시에 존재합니다. - 3.7 및 3.8 단계를 반복하여 갇힌 기포를 제거합니다.
- 주사기 펌프의 주사기를 리필하고, 주사기 펌프가 작동하고, ASOC에 관류용 밸브의 정렬을 확인합니다. ASOC 접시를 37°C, 5% CO2 인큐베이터로 되돌려 보입니다.
참고: 최적으로 이러한 단계는 매일 수행해야 합니다. 그러나 20mL 의 미디어 시동 량, ASOC 접시 의 양, 펌프 속도 2.5 μL/min의 사용은 며칠 동안 시스템을 방해받지 않고 실행하도록 충분해야 한다.
6. 공압 구동 펑크 장치와 OG 부상 유도
참고 : 공압 천자 장치의 건설은 보충 프로토콜 3에자세히 설명되어 있습니다. OG 부상은 IOP가 안정화 된 후 유도되며, 이는 일반적으로 문화3 일 후에 발생합니다. 허용 되는 IOP 값은 생리 IOP에 따라 5-20 mmHg, IOP 데이터 파일을 평가 하거나 보충 프로토콜 2에설명 된 압력 측정 시스템에서 LED 지표를 설정 하 여 결정할 수 있다.
- 1.10 단계에서 자세히 설명된 대로 OG 부상 유도에 대한 BSC II 캐비닛을 준비합니다. 펑크 플랫폼을 압축 공기 라인에 연결합니다. 멸균 천자 오브젝트를 척에 부착합니다.
참고: 공기 압축기를 사용하여 장치에 전원을 공급할 수 있지만 압력이 50psi를 초과하는 경우 탱크 압축 공기 또는 내장 실험실 라인으로 충분할 수 있습니다. - 천자 플랫폼의 압력 레귤레이터를 50 psi로 설정하여 직경이 최대 4.5mm의 물체에 적절한 천자 력을 제공합니다. 상처 유도 중에 ASOC 접시를 보관하기 위해 펑크 플랫폼 앞에 실험실 잭에 교차 추적 바이스를 배치합니다.
- 37°C에서 ASOC 설정을 제거하고, 5%CO2 인큐베이터에서 제거하고, 뚜껑을 제거하고 따로 설정한 후 천자플랫폼(도 2)에수직으로 교차 추적 바이스에 배치한다. 전방 세그먼트를 인내상태로 유지하지만 3방향 밸브 포트를 압력 변환기로 닫아 트랜스듀서의 과압 손상을 방지합니다.
- 피스톤 암을 최대 거리로 확장하고 각막 정점을 천자 오브젝트의 1mm 내에 배치합니다. 피스톤 암을 철회하고 전방 세그먼트를 천자 오브젝트에 1cm 더 가깝게 가져옵니다.
참고: 이 거리는 ASOC 접시에 닿지 않고 고효율 부상 유도에 최적화되었습니다. - 천자 장치를 켜고 장치에 두 번째 스위치를 통해 솔레노이드 밸브를 열어 발사합니다. 장치를 철회하려면 두 번째 스위치를 다시 눌러 눈에서 펑크 장치를 제거합니다. 상해 현장에서 육안 검사 및 미디어 유출에 의한 적절한 부상 유도를 확인합니다.
- 비스에서 ASOC 접시를 제거; 뚜껑을 접시 어셈블리에 다시 놓고 유체 선을 압력 변환기로 엽니다. ASOC를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 다시 넣습니다.
참고: 이 시점에서, 치료 는 OG 부상 밀봉에 대 한 그것의 효능을 평가 하기 위해 AS에 적용 될 수 있습니다.
7. 문화권에서 ASOC 제거
참고: 엔드포인트 분석에 따라(가능한 엔드포인트 방법에 대한 대표 결과 참조), AS는 ASOC 접시에 남아 있어야 하며 다른 방법은 배양실에서 분리된 AS 조직을 필요로 합니다. 아래 방법론은 장기 문화 접시에서 AS를 꺼내 나머지 설정을 제거하는 방법을 설명합니다.
- 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 ASOC 요리를 제거합니다. 3방향 밸브를 주사기와 저수지에 닫고 튜브를 시스템에서 분리합니다. 주사기, 저수지 및 필터를 폐기합니다. 3방향 밸브, 튜브 및 바늘 허브를 별도의 용기에 넣고 세척 및 살균을 합니다.
- 접시 바닥에 있는 유체 연결에서 바늘 허브를 분리합니다. 유체 커넥터와 o-링의 스레드를 해제합니다. 모든 품목을 세척 및 살균용 용기에 보관하십시오.
- L 키를 사용하여 클램핑 링에서 4개의 나사를 제거합니다. 클램핑 링을 조심스럽게 제거합니다.
- 집게를 사용하여 접시에서 AS를 제거하고 엔드포인트 분석 및 이미지에 따라 고정 또는 적절한 생체 위험 폐기물에 배치하십시오.
8. IOP 데이터 분석
- microSD 카드를 컴퓨터에 연결하여 가장 최근 실험 실행에서 데이터가 포함된 .txt 파일을 제거합니다.
참고: 파일은 마이크로 컨트롤러를 제어하는 코드에 이름이 지정되며 각 실험에 대해 업데이트해야 합니다(보충 프로토콜 2참조). - 데이터를 스프레드시트로 가져옵니다.
- 12개의 열로 데이터를 구성합니다: 11개의 압력 트랜스듀서 채널 각각에 대한 시간(분) 및 mV 신호. 처음 10개의 채널은 10개의 ASOC 실험 설정에 해당합니다. 최종 트랜스듀서 신호는 입력 신호의 변화로 인해 mV 신호가 변경되지 않았음을 확인하기 위해 제어 채널로서 센서가 공중에 개방되어 있는지 확인하는 것입니다. 플롯 제어 채널과 시간 대 mV 신호가 전체적으로 일관되었음을 확인합니다.
- 각 센서의 초기 교정에서 생성된 경사 차단 방정식을 사용하여 10개 채널의 mV 신호를 mmHg로 변환합니다(보충 프로토콜 4참조).
- IOP가 실험 시간 과정 전반에 걸쳐 변동하는 방식을 결정하기 위해 10개 채널에 비해 시간(데이터 해석을 단순화하기 위해 일로 변환)을 플롯합니다.
- 데이터의 핵심 포인트에서 평균 IOP 값을 결정하여 OG 손상 유도 전후에 각각과 변경 방법 사이의 값을 보다 쉽게 비교할 수 있습니다. ASOC의 매일 IOP를 결정하기 위해 각 24 시간 간격에 대한 데이터의 평균 2-3 h.
참고: 대표적인 IOP 결과는 그림 4에표시됩니다.
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Representative Results
광학 일관성 단층 촬영 (OCT)을 통해 캡처 된 이미지는 성공적인 부상 유도가 어떻게 보이는지 설명하기 위해 OG 부상 눈을 위해 표시됩니다. 그림 3은 부상 직후와 72시간 후 AS 조직을 부상시키고 OG가 부상한 후 제어 및 OG 부상에 대한 이미지를 보여줍니다. 두 개의 뷰가 표시됩니다: 부상 부위를 통과하는 단면 이미지와 이미지의 표면적을 시각화하기 위해 하향식 최대 강도 투영(MIP)이 표시됩니다. 제어 눈은 각막에 눈에 띄는 혼란을 보여주지, 명확한 부상은 OG 부상 후 전체 각막을 교차 위치 할 수있는 동안. MIP에서 부상은 모양과 크기가 불규칙하다는 것이 분명하지만 부상 크기는 72 h 이상 감소합니다. 이전에는 이 효과가테스트된여러 부상 크기에 대해 중요한 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜에 설명된 OG 부상 모델의 기본 데이터 출력은 실험 설정 과정에서 내혈관 압력입니다. 데이터는교정(보충 프로토콜 4)을통해 mmHg로 변환할 수 있는 각 압력 변환기의 출력으로서 밀리볼트 단위로 기록됩니다. 실시예 IOP 데이터 대 실험 시간 과정은 허용 가능한 것으로 간주되는 눈과 사용할 수 없는 다른 사람에 대해제공됩니다(그림 4A). 압력 추적 데이터에서 24시간 후 센서에 눈이 부착되었지만 IOP는 문화에서 처음 72시간 동안 계속 변동하고 있습니다. 장기 배양에서 AS 조직을 위한 생리적 IOP는 약 8-10mmHg이므로 2x 및 1/2x 범위는 값이 안정화된 후 사용 가능한 IOP 값의 게이트로 결정되었다(5-20 mmHg). 그 범위에 있던 눈만 프로토콜의 나머지 부분과 함께 사용할 수 있습니다. 이전 실험에서, 우리는 필요한 범위에서 눈 안정화에 대한 ASOC 설정에서 달성 된 90 %의 성공률을 했다(그림 4B).
OG 부상 및 치료 개입으로 인한 IOP 변경 방법에 대한 결과도제공됩니다(도 4C,D). OG 손상 유도 후, 압력이 크게 떨어지고 조직이 ASOC(도 4C)에서제거 될 때까지 그런 식으로 유지되어야한다. 부상 유도 후 눈이 압력을 감소시키지 않으면 눈의 방수 씰이 손상될 경우 IOP가 감소해야 하므로 성공적인 부상이 유도되지 않았다는 것을 나타냅니다. 그러나 부상 크기가 작으면 자가 치유가 되어 IOP가 복원될 수 있습니다. OG 부상 유도 후 치료에 적용되는 경우, IOP의 복원은 ASOC 동안 추적될 수 있다. 이 개념은 2.4mm OG부상(도 4D)에적용된 Dermabond 접착제를 보여주는 데이터로 입증된다. 치료 없이 5개의 별도 ASOC 실험에 대한 평균 결과가 나타나며 치료가 IOP를 증가하고 있음이 분명하다. 이 방법은 IOP를 복원하기위한 치료의 효능을 측정하고 그 압력이 주요 72 h 후 OG 부상을 통해 회복되는지 여부를 추적 할 수 있습니다.
또한 ASOC 프로토콜은 최종 사용자의 실험 요구 사항을 충족하기 위해 광범위한 특성화 끝점에서 사용할 수 있습니다. 문화 동안, 눈을 떠나는 유출 매체는 ASOC 도중, OG 상해 유도 후에, 또는 치료 후에 생기는 단백질 수준 변경을 추적하는 데 이용될 수 있는 매일 또는 시간 단위로 수집될 수 있습니다. 예를 들어, 젤라틴 zymography는 이전에 상처 치유 및 조직 리모델링20을추적하기 위해 매트릭스 메탈로프로테나아제 수준을 검출하기 위해 수행되었다. 추가 생물학적 종점은 조직 생존가능성을 평가하기 위한 전통적인 면역조직화학 방법을 통해 배양으로부터 조직을 제거한 후가능21,22,각막(23,24)또는 항체 기반 염색에 대한 모든 관심있는 단백질에 대한 추적 병리학적변화(25,26).
기능성 각막 측정항목은 ASOC에서 유지되는 눈으로부터 얻을 수도 있다. 각막 상피 무결성은 블루광원(27,28)을이용하여 형광눈 얼룩 및 이미지 수집을 통해 평가될 수 있다. 문화에서 제거 한 후, 각막 조직은 간단한 이미지 수집(13)을통해 투명성을 평가 할 수 있습니다. 전통적인 안구 화상 진찰은 또한 치료 내정간섭의 유무에 관계없이 조직 구조를 평가하기 위하여 수행될 수 있습니다. 도 3에도시된 바와 같이 OCT 이미지는 각막을 통해 단면 이미지를 생성할 수 있으며 비침습적으로 캡처할 수 있어 문화에서 조직을 유지하면서 이미지 수집을 가능하게 할 수 있다. 슬릿 램프 현미경 검사법, 초음파 또는 생체 내 공초점 현미경 검사법과 같은 다른 이미징 양식도 추가 해부학 적 정보를 획득하기 위해 적응 될 수있다.
마지막으로, 전방 세그먼트의 기계적 특성에 대한 평가는 기본 조직에 대한 OG 손상 또는 후속 치료의 효과를 이해하기 위해 포착될 수 있다. IOP 데이터 수집만으로도 눈의 방수 씰의 무결성이 손상된 방법을 강조하지만, 이전에는 추가 테스트 메트릭을 측정하여 추가 기계적 특징10, 11을애타게 할 수 있음을보여주었습니다. 안구 준수, 인플레이션으로 인한 안구 압력이 어떻게 변화하는지 설명하는 덩어리 기계형 특성(압력의 부피/변화)은 주사기 펌프로 측정하여 갑자기 적은 양의 유체를 눈에 주입하고 압력 트랜스듀서로 그 결과로 발생하는 압력 증가를 기록할 수 있습니다. 규정 준수가 높을수록 조직이 덜 뻣뻣하고 치료 물질 특성이 기본 각막 조직과 어떻게 다른지 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 눈 또는 전통적인 유출 시설에서 누출 속도를 측정하고 계산하여압력(20,29)의단위당 눈을 떠나는 정확한 유체 유량을 결정할 수 있다. 마지막으로, 치료 테스트와 관련하여, 파열 압력은 치료 실패 전에 눈이 보유할 수 있는 최대 압력을 결정하기 위해 측정될 수 있다. 이는 성능과 부상없는 눈과 비교하거나시간 12,13로성능 의 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1: ASOC 설정의 다이어그램입니다. 눈은 맞춤형 장기 문화 요리로 유지되며 클램핑 링으로 제자리에 보관됩니다. ASOC 미디어는 밸브 A를 통해 주사기 펌프를 통해 주입되고 압력 변환기와 연결되어 있으며, 각 밸브의 Valve B. Open 포트를 사용한 후속 데이터 수집은 파란색으로 강조 표시되고 노란색은 폐쇄 채널을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: OG 부상 설정개요. (A)공압 구동 부상 장치 설정. 왼쪽에서 오른쪽으로 압축 공기가 압축 공기 선을 통해 장치에 도입되어 조절기를 통과하여 압력 게이지에 의해 측정된 대로 50 psi로 압력을 설정합니다. 두 개의 솔레노이드 밸브가 선형 액추에이터에 연결되어 펑크 오브젝트를 잡고 있는 드릴 척의 직접 팽창/후퇴를 합니다. Vise는 적절한 x, y, z 포지셔닝에서 눈을 고정하기 위해 천자 장치 앞에 배치됩니다. (B)대표 ASOC는 부상 유도 장치 앞에 배치됩니다. 장치 및 그 구조의 자세한 내용은 보충 프로토콜 3에자세히 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ASOC OG 부상 실험의 광학 일관성 단층 촬영 이미지. 사진은 제어 눈 (부상되지 않은)과 OG 부상 눈이 즉시 부상 후 72 시간 후 표시됩니다. 뷰는 각막표면(오른쪽)의각막(왼쪽) 및 하향식 최대 강도 투영 뷰를 통해 단면으로 표시됩니다. 이 그림은 Snider 등의 허가하에 적용되었습니다.13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ASOC 실험에 대한 대표적인 IOP 결과. (A)ASOC 설정의 첫 번째 72h에 대한 원시 IOP 데이터. 눈은 72h로 천공되므로 첫 3일간의 데이터를 평가하여 IOP가 허용 가능한 IOP 범위(5-20 mmHg)에서 안정화되는지 여부를 결정합니다. 대표적인 결과에서 5개의 눈 중 3개는 허용 가능한 IOP 범위 내에 속하며, 하나는 IOP가 너무 높고 IOP가 너무 낮습니다(플롯에서 강조 표시된 노란색 영역 외부로 떨어지는). (B)이전 실험에서 n = 50 ASOC 설정에 대한 IOP를 안정화하여 ASOC 방법을 사용하여 일반적인 성공률을 입증하였다. (C)72h에 대한 부상 유도 후 세 가지 다른 OG 부상 크기에 비해 부상 눈의 IOP. IOP의 손실은 회복의 흔적없이 분명하다. (D)더마본드 접착제로 치료된 부상과 비교하여 IOP 결과가 손상되었습니다. 일부 눈이 밀봉되고 다른 눈으로 인해 오류율이 높지만 다른 눈은 밀봉되지 않지만, 방법은 72 시간 동안 IOP에 대한 변화를 추적 할 수 있습니다 부상 후. 이 그림은 스나이더 외13의허가하에 적용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
방법론을 사용할 때 성공 가능성을 높이기 위해 강조해야 하는 ASOC OG 부상 플랫폼의 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 전방 세그먼트 해부 동안, 궤적 메쉬워크를 보존하는 것은 필수적이지만 올바르게 수행하는 것은 어렵습니다. TM이 중단되면 눈은 생리적 압력을 유지하지 않으며 실험용 자격 기준을 충족시키지 못합니다. 적절한 해부를 얻을 때까지 추가 무균 기술 과제를 도입하는 대신 먼저 정상적인 조건에서 해부 과정을 연습하는 것이 좋습니다. 둘째, ASOC 접시에 눈을 설정할 때, 유체가 누출되는 것을 방지할 만큼 단단하지만 ASOC 접시에 손상을 입히는 것을 방지할 수 있을 만큼 느슨합니다. 눈이 단단히 고정되지 않으면, 액체는 IOP의 거의 또는 전혀 결과로 비 생리적 수단을 통해 눈에서 누출됩니다. 그러나 눈을 아래로 잡고 있는 클램핑 링은 플라스틱이며 과도하게 조여지면 쉽게 깨질 수 있습니다. 반지 아래의 경구 조직이 처음 24 시간 동안 조직을 압축하고 풀어 주면서 2 일 동안 눈을 아래로 고정하는 것이 필수적입니다. 1일째에 조임에 대한 저항이 느껴지고 24시간 이후에 유사한 수준으로 다시 조여 최상의 결과를 얻으려면 링을 강화하는 것이 좋습니다.
셋째, 이 모델을 사용할 때 유체 흐름이 항상 어디로 향할지 완전히 이해하는 것이 중요합니다. 각 ASOC 접시는 주사기 펌프 또는 10mL 주사기 저수지에서 유체 흐름을 직접 하고 압력 변환기에 연결하기 위해 여러 3방향 밸브에 연결됩니다. 설정 공정의 다른 인스턴스는 눈에서 기포를 플러시하거나 과압화로부터 압력 변환기를 보호하기 위해 밸브를 이러한 방식으로 배치해야합니다. 중요한 프로토콜 단계 이전에 항상 열려 있는 내용을 이해하려면 주의해야 합니다. 마지막으로 ASOC OG 부상 프로토콜 전반에 걸쳐 멸균을 유지하는 것은 중요하지만 다중 단계의 다일 프로세스에서 쉽게 손실될 수 있습니다. 관류 매체는 이를 방지하기 위해 높은 수준의 항생제와 항mycotics를 포함하고 있으며, 눈은 오염을 방지하기 위해 설정하기 전에 베타딘에 잠겨 있지만 실수가 가장 가능성이 높은 중요한 단계가 여전히 있습니다. 접시의 초기 설정 중에 클램핑 링을 제자리에 조이면서 눈과 접촉하지 말고 사용하지 않을 때는 항상 요리에 뚜껑을 유지하십시오. 더 가능성이 노출 단계는 일상적인 ASOC 유지 보수 기간 동안입니다. 인큐베이터에서 눈을 떼지 않고 신속하게 달성 될 수 있다고 보더라도 생물 안전 캐비닛에서 이러한 일상적인 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 프로토콜을 신중하게 따르고 우수한 무균 기술을 유지 관리하면 6일 ASOC 실험전반에 걸쳐 오염 위험을 최소화해야 합니다.
전반적으로 ASOC OG 부상 플랫폼은 두 가지 주요 기준으로 인해 오픈 글로브 부상을 보는 다른 방법론에서 독특합니다. 첫 번째는 부상 유도 방법입니다. 활용된 고속 공압 손상 장치는 높은 힘의 양으로 부상을 유도합니다. 이렇게 하면 특히 날카롭지 않거나 직경이 작은 물체로 부상을 유도할 수 있습니다. 이것은 더 밀접하게 모양에 불규칙한 부상을 모방; 폭발 장치30,31로인한 고속 파편 부상. 공압 장치는 쉽게 깨끗하고 정확한 부상 기하학을 만들기 위해 레이저, 바늘, 또는 메스 블레이드를 사용하여 이전 방법에 비해 치유하기 어려운 부상을 만들기 위해 개체를 모방 불규칙한 모양의 파편을 장착 할 수 있습니다32,33,34. 둘째, ASOC 방법론은 초기 부상 유도를 넘어 부상 진행 및 치료 성능을 추적 할 수 있습니다. 72h까지 추적할 수 있는 것은 이전에 개발된 벤치탑 OG 부상 플랫폼10,11,12에서 불가능했고, 이 프로토콜을 개발하는 동기부여였다. 사실, 세포 생존가능성은 ASOC13에서적어도 1주일 동안 각막 내막에서 높게 남아 있었다. ASOC는 생체 내 실험에서 비용이 많이 드는 것으로 전환하지 않고도 이 장기적인 특성화를 달성할 수 있다는 유일한 수단입니다.
ASOC 플랫폼의 주요 응용 프로그램은 두 배입니다. 첫째, 모델은 오픈 글로브 부상을 더욱 특성화하는 데 사용할 수 있으며, 특히 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는지 고려할 수 있습니다. 이전 연구에서는, OG 부상은 이러한 방식으로 특징지어졌으며 부상 치유는 부상13에이어 72h 이상 관찰되었다. 다른 부상 크기, 모양, 72 시간 이상 에 대한 위치를 추가로 추적하면 OG 부상 후 내려야 할 중요한 의료 결정을 알릴 것입니다. 특정 상해 매개 변수는 각막에 의한 자가 치유를 허용할 수 있으며, 또는 개입이 처음 24h 내에서 적용되지 않으면 다른 매개 변수가 더 심각할 수 있다. 이 정보는 제한된 의료 용품이나 대피 자원을 사용할 수 있을 때 환자를 선별하는 데 매우 중요합니다.
둘째, ASOC OG 플랫폼은 제품 개발을 개발하고 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 응용 프로그램의 경우 장기 문화 플랫폼은 여러 가지 역할을 채울 수 있습니다. 초기 제품 개발 중에 다양한 제품 제형으로 더 짧은 시간 프레임을 테스트하여 가장 효과적인 것을 확인할 수 있습니다. 장기 배양 시스템은 여기에 상세한 시스템으로 가능한 10개의 동시 실험을 넘어서는 추가 주사기 펌프를 추가하여 이 적용을 위한 더 큰 고처리량을 위해 구성될 수 있다. 보다 세련된 제품의 경우 더 긴 시간 지점을 평가하여 72h 또는 잠재적으로 더 긴 성능을 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 일시적인 안정화보다는 OG 부상을 영구적으로 치료할 수 있는 생물학적 활성 제품을 평가할 때 상처 치유 평가가 가능할 수 있다.
그러나 고려해야 할 ASOC OG 플랫폼에는 제한이 있습니다. 첫째, 모델은 치료법의 장기 평가를 허용하지만, 홍채 및 렌즈와 같은 진피 껍질 외부의 모든 눈 조직을 누락합니다. 이러한 추가 조직은 OG 부상에 의해 영향을 받을 가능성이 있으며 부상 진행에 역할을 할 수 있습니다. 마찬가지로, 격리된 전방 세그먼트는 ASOC 모델에서 후속 동물 실험으로 전환할 때 포함될 면역 반응 요소가 누락되어 있습니다. 다음으로, 모델은 각막 OG 부상과 잠재적으로 팔다리 OG 부상을 만드는 데만 적합합니다. 이 방법으로 는 경상 또는 후방 OG 부상을 유도할 수 없습니다. 그러나, 이러한 부상 유형의 대부분은 망막에 손상을 초래, 어떤 임시 안정화 치료 비전의 손실을 방지 할 가능성이 만들기35,36. 마지막으로, 72h 부상 후 모델아웃부상은 추적되었습니다. ASOC는 2주 까지 다른 응용 분야에서 활용되었으므로 이러한 응용 분야에 모델을 활용할 수 있지만 현재37,38,39에서테스트되지 않았습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다. 이 기사에서 표현된 견해는 저자의 견해이며 미 육군 보건부, 육군, 국방부 또는 미국 정부의 공식 정책이나 입장을 반영하지 않습니다.
Acknowledgments
이 자료는 임시 각막 수리 획득 프로그램 (미국 육군 의료 마테리엘 개발 기관)과의 기관 간 협정 (#19-1006-IM)을 통해 미국 국방부가 지원하는 작업을 기반으로합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
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