Summary
Le lesioni agli occhi open globe possono non essere trattate per più giorni in scenari rurali o militari rilevanti, con conseguente cecità. Le terapie sono necessarie per ridurre al minimo la perdita della vista. Qui, descriviamo in dettaglio un modello di lesione open globe per la coltura di organi. Con questo modello, le potenziali terapie per stabilizzare queste lesioni possono essere valutate correttamente.
Abstract
Le lesioni open globe hanno scarsi risultati visivi, spesso con conseguente perdita permanente della vista. Ciò è in parte dovuto a un ritardo prolungato tra lesioni e interventi medici in ambienti rurali e applicazioni di medicina militare in cui l'assistenza oftalmica non è prontamente disponibile. Le lesioni non trattate sono suscettibili di infezione dopo che l'occhio ha perso il suo sigillo a tenuta stagna, così come la perdita di vitalità tissutale a causa dell'ipotensione intraoculare. Le terapie per sigillare temporaneamente le lesioni a globo aperto, se adeguatamente sviluppate, possono essere in grado di ripristinare la pressione intraoculare e prevenire l'infezione fino a quando non è possibile un'adeguata cura oftalmica. Per facilitare lo sviluppo del prodotto, qui è dettagliato l'uso di una piattaforma di lesioni open globe per la coltura di organi del segmento anteriore per il monitoraggio delle prestazioni terapeutiche per almeno 72 ore dopo l'infortunio. Il tessuto del segmento anteriore suino può essere mantenuto in piatti di coltura di organi progettati su misura e mantenuto a pressione intraoculare fisiologica. Le lesioni da foratura possono essere create con un sistema pneumatico in grado di generare lesioni fino a 4,5 mm di diametro, simili alle dimensioni delle lesioni rilevanti per l'esercito. La perdita di pressione intraoculare può essere osservata per 72 ore dopo l'infortunio confermando la corretta induzione della lesione e la perdita della tenuta stagna dell'occhio. Le prestazioni terapeutiche possono essere monitorate mediante applicazione all'occhio dopo l'induzione della lesione e quindi il monitoraggio della pressione intraoculare per più giorni. Inoltre, il modello di lesione del segmento anteriore è applicabile ai metodi ampiamente utilizzati per il monitoraggio funzionale e biologico della fisiologia del segmento anteriore, come la valutazione della trasparenza, della meccanica oculare, della salute dell'epitelio corneale e della vitalità dei tessuti. Nel complesso, il metodo qui descritto è un passo successivo necessario verso lo sviluppo di terapie biomateriali per sigillare temporaneamente le lesioni a globo aperto quando la cura oftalmica non è prontamente disponibile.
Introduction
Le lesioni a globo aperto (OG) possono causare la perdita permanente della vista se non trattate o almeno stabilizzate a seguito dilesioni 1. I ritardi, tuttavia, sono prevalenti in aree remote in cui l'accesso all'intervento oftalmico non è prontamente disponibile, come nelle aree rurali o sul campo di battaglia in scenari militari. Quando il trattamento non è prontamente disponibile, l'attuale standard di cura è quello di proteggere l'occhio con uno scudo rigido fino a quando non è possibile l'intervento medico. In medicina militare, questo ritardo è attualmente fino a 24 ore, ma si prevede che aumenterà fino a 72 ore nelle future operazioni di combattimento in ambienti urbani in cui l'evacuazione aerea non è possibile2,3,4. Questi ritardi possono essere ancora più lunghi nelle applicazioni civili rurali e remote in cui l'accesso all'intervento oftalmico è limitato5,6. Una lesione OG non trattata è altamente suscettibile alle infezioni e alla perdita di pressione intraoculare (IOP) a causa della compromissione della tenuta stagna dell'occhio7,8. La perdita di IOP può influire sulla vitalità dei tessuti, rendendo improbabile qualsiasi intervento medico per ripristinare la vista se il ritardo tra lesione e terapia è troppo lungo9.
Per consentire lo sviluppo di terapie facili da applicare per sigillare le lesioni OG fino a quando non è possibile raggiungere uno specialista oftalmico, è stato precedentemente sviluppato un modello di lesione OG da banco10,11. Con questo modello, sono state create lesioni ad alta velocità in interi occhi suini mentre la IOP è stata catturata dai trasduttori di pressione. Le terapie possono quindi essere applicate per valutare la loro capacità di sigillare il sito di lesione OG12. Tuttavia, poiché questo modello utilizza occhi suini interi, può solo valutare le prestazioni terapeutiche immediate senza alcun modo di monitorare le prestazioni a lungo termine attraverso la possibile finestra di 72 ore in cui il terapeutico deve stabilizzare il sito della lesione fino a quando il paziente non raggiunge cure specialistiche. Di conseguenza, un modello di lesione OG della coltura d'organo del segmento anteriore (ASOC) è stato sviluppato e dettagliato in questo protocollo come piattaforma per il monitoraggio delle prestazioni terapeutiche a lungo termine13.
ASOC è una tecnica ampiamente utilizzata per il mantenimento del tessuto avascolare del segmento anteriore, come la cornea, per più settimane post-enucleazione14,15,16,17. Il segmento anteriore viene mantenuto sotto IOP fisiologica perfondendo il fluido a portate fisiologiche e preservando la regione di deflusso della rete trabecolare, il tessuto responsabile della regolazione della IOP, durante la configurazione ASOC18,19. La piattaforma ASOC può mantenere fisiologicamente il tessuto, indurre una lesione OG utilizzando un dispositivo pneumatico, applicare una terapia e tracciare la stabilizzazione della lesione per almeno 72 ore dopo l'infortunio13.
Qui, il protocollo fornisce una metodologia passo-passo per l'utilizzo della piattaforma ASOC. Per prima cosa descrive in dettaglio come configurare e fabbricare la piattaforma ASOC. Successivamente, il protocollo descrive in dettaglio come sezionare asetticamente il segmento anteriore e mantenere la rete trabecolare, seguita dalla creazione di tessuto del segmento anteriore in piatti di coltura di organi personalizzati. Quindi, descrive in dettaglio come creare lesioni open globe e applicare la terapia immediatamente dopo l'infortunio. Infine, il protocollo fornisce una panoramica sui parametri di caratterizzazione che sono possibili per l'uso con questo metodo che valuta le proprietà funzionali, meccaniche e biologiche dell'occhio e quanto bene la lesione è stata stabilizzata. Nel complesso, questo modello fornisce una piattaforma tanto necessaria per accelerare lo sviluppo del prodotto per stabilizzare e trattare le lesioni open globe e migliorare la prognosi della vista sfavorevole dopo l'infortunio.
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Protocol
Prima di eseguire questo protocollo, essere consapevoli del fatto che esistono requisiti legali ed etici per l'uso degli animali nella ricerca e nella formazione. Se gli animali vivi vengono utilizzati per la fonte di tessuto oculare, chiedere l'approvazione dell'autorità etica o legale locale (IACUC o comitato etico, ecc.) prima di iniziare. Se c'è qualche dubbio nell'ottenere l'approvazione per l'uso di animali, non procedere. In precedenza abbiamo determinato e riportato che gli occhi suini freschi ottenuti e utilizzati entro 24 ore post-mortem rispetto al più vicino alla fisiologia in vivo e sono andati bene per questi studi (Animal Technologies, Tyler, TX, USA)10,13. Nessun animale vivo è stato utilizzato in tutto questo protocollo, utilizzando un fornitore di tessuti per ottenere tessuto entro 24 ore.
NOTA: Prima dell'arrivo dei tessuti, fabbricare le piatti di coltura degli organi (Protocollo supplementare 1), anelli di serraggio (Protocollo supplementare 1), portapiatti (Protocollo supplementare 1), configurazione della raccolta dei dati del trasduttore di pressione (Protocollo supplementare 2) e piattaforma di perforazione pneumatica (Protocollo supplementare 3). Sterilizzare i piatti, gli strumenti e le forniture e preparare le aree di lavoro. È utile avere un'area non sterile per eseguire una dissezione grossolana sugli occhi, poiché di solito vengono con tessuto connettivo orbitale extra attaccato. Eseguire questi primi passaggi su una superficie di lavoro aperta e pulita, quindi trasferire gli occhi in modo asettico in un armadio BSC II per la micro-dissezione (cabinet #1). In modo ottimale, l'armadio BSC II utilizzato per la micro-dissezione è separato dall'armadio BSC II del gruppo parabola (armadio n. 2) per ridurre al minimo il flusso d'aria e massimizzare lo spazio di lavoro. Impostare l'armadio di micro-dissezione con un microscopio di dissezione e un modo per visualizzare la superficie di lavoro (fotocamera o oculari sporgenti dall'armadio).
1. Fasi di sterilizzazione, forniture (vedere Tabella dei materiali per maggiori dettagli) e configurazione
- Preparare e sterilizzare a gas i seguenti elementi (1 kit per ogni occhio): piatto ASOC, anello di serraggio, due connettori fluidici con O-ring, due mozzi ad ago da 18 G, quattro viti, due lunghezze di tubo in PE-100 (la lunghezza della distanza deve essere abbastanza lunga da estendersi dalla parabola all'interno dell'incubatore alla pompa della siringa e alla configurazione della raccolta dati del trasduttore di pressione), due mozzi ad ago piegati a 18 G a 90°, due valvole a 3 vie.
- Preparare e autoclave i seguenti kit.
- Preparare e autoclave il kit di strumenti di micro-dissezione, contenente un paio di pinze fini, un paio di forbici Vannas, un paio di pinze a denti medi, un paio di grandi forbici, tamponi di cotone e una lama di rasoio o bisturi.
- Preparare e autoclavare il kit di strumenti di assemblaggio, contenente un paio di pinza a denti medi, un paio di forbici chirurgiche e una chiave a L.
- Preparare e autoclavare il kit giornaliero (quantità: uno al giorno di coltura), contenente un tasto a L per stringere gli anelli di serraggio ai piatti ogni giorno secondo necessità.
- Autoclave quattro beccatori da 100 ml per disinfettare e conservare occhi e segmenti anteriori.
- Autoclave degli oggetti foratura.
- Raccogliere i seguenti elementi sterili: capsula di Petri (1 piatto/occhio), garza (1-2/occhio), supporto per piatti, siringhe da 20 ml (1 occhio), siringhe da 10 mL (1 occhio), filtri per siringhe di nylon (1/occhio).
- Preparare mezzi sterili: DMEM con 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicina, 1x Antibiotico-Antimicotico (AA; circa 30-40 ml di media/occhio completo).
- Preparare AA-PBS: PBS con 1x AA (~500 mL).
- Preparare il pacchetto di strumenti di dissezione grossolana: forbici chirurgiche e pinza chirurgiche grandi e pulite e asciutte.
- Allestisci lo spazio di lavoro di dissezione non sterile: raccogli forniture da un pacco di strumenti di dissezione grossolana, occhi suini enucleati immersi in PBS e su ghiaccio, telo chirurgico, becher da 100 ml con PBS. Stendi il drappo chirurgico e gli elementi necessari per la dissezione grossolana.
- Allestire lo spazio di lavoro di dissezione sterile: raccogliere forniture da kit di strumenti di micro-dissezione, garza sterile, microscopio di dissezione, soluzione di betadina, PBS sterile, supporti sterili, quattro becchi sterilizzati da 100 ml, piastra di Petri sterile. Trasferimento asettico al cabinet BSC II #1. Impostare l'armadio per visualizzare gli occhi sul microscopio di dissezione.
- Configura lo spazio di lavoro di assemblaggio ASOC: raccogli kit sterilizzati a gas (kit per piatti e kit coperchio), kit strumenti di assemblaggio, supporti sterili, supporti per piatti, piastre di Petri sterili, siringhe sterili e filtri per siringhe. Trasferimento asettico al cabinet BSC II #2. Impostare l'armadio per l'assemblaggio del piatto.
- Quando gli occhi sono stabilizzati e pronti per la puntura (72 ore dopo l'installazione), trasferirli asetticamente in un cabinet BSC II. Impostare lo spazio di lavoro per l'induzione delle lesioni OG: dispositivo di induzione delle lesioni alimentato pneumaticamente (assemblaggio dettagliato nel supplemento 3)e jack da laboratorio e morsa a tracciamento incrociato per contenere la parabola ASOC.
2. Dissezione del tessuto
- Preparare il tessuto suino utilizzando uno spazio di lavoro di dissezione non sterile.
- Procurati occhi suini enucleati da un macello locale, studi sugli animali o venditore. Mantenere gli occhi sul ghiaccio immersi nel PBS durante la consegna e utilizzarli immediatamente dopo la ricezione.
- Tagliare via il tessuto extraorbitale e tagliare la congiuntiva lasciando solo il guscio corneosclerale e il nervo ottico. Eseguire la dissezione in condizioni non sterili con grandi forbici chirurgiche e pinza in un pacco di strumenti di dissezione grossolana.
- Rimettere gli occhi in PBS fresco sul ghiaccio fino a quando tutti gli occhi necessari per la configurazione sperimentale sono stati sezionati in modo preliminare / grossolano.
- Immergere gli occhi in una soluzione di betadina al 10% per 2 minuti in contenitori chiusi e trasferirli asetticamente all'armadio BSC II #1. Eseguire tutti i lavori successivi in condizioni sterili per ridurre al minimo le contaminazioni durante l'installazione.
- Sezioni sterili i segmenti anteriori.
- Dopo 2 minuti in soluzione di betadina, trasferire gli occhi in tre lavaggi seriali di AA-PBS sterile per rimuovere la soluzione di betadina in eccesso dalla superficie oculare mantenendo la sterilità del tessuto oculare. Dopo tre lavaggi, mantenere il tessuto in AA-PBS fino a nuovo utilizzo.
- Emisezionare l'occhio usando una lama di rasoio / bisturi e forbici curve. Posizionare l'occhio su una garza imbevuta di AA-PBS e creare un'incisione con una lama di rasoio sterile o un bisturi vicino all'equatore dell'occhio (60/40 diviso con 40 sul lato anteriore). Usando forbici chirurgiche curve, emisezionare l'occhio per isolare l'occhio anteriore (metà corneale).
NOTA: il taglio intorno al segmento anteriore deve essere continuo per evitare bordi frastagliati e ruvidi nella sclera che creeranno perdite di fluido dopo l'installazione nella coltura dell'organo. - Usa i microscissori come una pala per raccogliere l'umore vitreo dal segmento anteriore. Rimuovere la lente dal segmento anteriore utilizzando microscissori. Lasciare i segmenti anteriori in AA-PBS fino a ulteriori fasi di dissezione.
NOTA: Tutti gli occhi che verranno sezionati possono essere tenuti in questa fase e uno per uno presi attraverso il resto del processo di dissezione. - Con un microscopio di dissezione, tagliare l'iride alla radice dell'iride gradualmente, radialmente fino a quando la rete trabecolare (TM) è visibile. La Meditazione Trascendentale è un tessuto pigmentato che comprende fibre circonferenzialmente orientate attorno al guscio corneosclerale. Tagli accurati nell'iride verso la radice dell'iride esporranno la profondità della Meditazione Trascendentale sotto il tessuto.
- Tagliare a 360° intorno all'iride alla stessa profondità del taglio iniziale nel tessuto per esporre l'intera regione tm. Pulire l'eventuale residuo di iris che copre la Meditazione Trascendentale se necessario.
- Tagliare i resti del corpo ciliare posteriormente alla Meditazione Trascendentale, lasciando solo una sottile fascia di tessuto posteriore alla regione della Meditazione Trascendentale (circa 1 mm).
- Posizionare il segmento anteriore sezionato (AS) nel supporto fino a un'ulteriore configurazione in ASOC nel cabinet BSC II #2.
NOTA: tutti gli occhi possono essere tenuti a questo punto prima della configurazione ASOC se un singolo utente sta eseguendo la dissezione e l'assemblaggio del piatto di coltura dell'organo.
3. Impostazione di segmenti anteriori in piatti di coltura di organi
- Metti un singolo AS in una capsula di Petri con AS invertito (tazza in su). Usando un batuffolo di cotone, bagnare nel mezzo e tamponare delicatamente al centro della cornea per rimuovere qualsiasi pigmento. Usando una pinina per tenere l'occhio e lo stesso tampone, pulire il batuffolo di cotone intorno alla sclera per rimuovere il pigmento extra.
- Invertire l'AS e posizionare sopra la parte inferiore del piatto sopra la regione elevata, centrando la cornea sulla regione elevata nel piatto. Posizionare l'anello di serraggio sopra l'AS appena posizionato.
- Posizionare quattro viti nei fori corrispondenti per tenere l'anello in posizione con l'AS sotto l'anello. Stringere delicatamente a mano le viti con la chiave a L.
NOTA: la fase di serraggio avverrà quotidianamente durante l'esperimento, quindi l'obiettivo del serraggio iniziale qui è quello di garantire che il supporto non perda evitando di rompere l'anello di serraggio. - Con un set di piastre di Petri sterili, posizionare la parte superiore sopra il piatto e invertire l'impostazione. Attaccare il supporto per piatti. Collegare i connettori fluidici con O-ring alle porte filettate sul fondo della parabola.
- A un connettore fluidico, collegare un mozzo ad ago piegato a 18 G a 90 °, una lunghezza di tubo, un mozzo ad ago da 18 G, un filtro a siringa di nylon, una valvola a tre vie e una siringa da 20 ml riempita con supporti.
- Al secondo connettore fluidico, collegare un mozzo dell'ago piegato a 90 gradi da 18 G, la lunghezza del tubo, un mozzo dell'ago da 18 G, una valvola a tre vie e la porzione della canna di una siringa sterile da 10 ml (questo fungerà da serbatoio per catturare liquidi e bolle dall'ASOC).
- Con le valvole a tre vie aperte in modo appropriato alle siringhe, spingere delicatamente il fluido attraverso il sistema utilizzando la porta del connettore fluidica identificata nel passaggio 3.5 per gonfiare l'AS, riempire il fluido nel tubo e, infine, il serbatoio.
NOTA: se il supporto perde nella parabola ASOC, l'AS non è fissato abbastanza saldamente con l'anello di serraggio. - Rimuovere le bolle spingendo delicatamente il materiale nel piatto e invertendo il piatto per spingere fuori le bolle e nel serbatoio.
- Posizionare il piatto e stare in piedi. Posizionare la parte inferiore di una capsula di Petri sotto i piedi del supporto, facendo attenzione a non intrappolare il tubo.
4. Avvio della coltura di organi del segmento anteriore
- ASOC è ora pronto per l'incubazione. Posizionare la parabola ASOC nell'incubatore di colture cellulari (37 °C, 5% CO2). Assicurarsi che l'altezza della parabola ASOC nell'incubatore sopra i trasduttori di pressione sia nota e contabile per calcolare accuratamente la IOP (Protocollo supplementare 4).
- Dirigere le linee del tubo attraverso il fondo della porta dell'incubatore a 37 °C, 5% CO2 in modo che non interferiscano con l'apertura e la chiusura della porta. Collegare la siringa da 20 mL alla pompa della siringa impostata a 2,5 μL/min.
- Posizionare la linea del tubo con il serbatoio sullo strumento del trasduttore di pressione. Collegare la valvola laterale a 3 vie alla configurazione del trasduttore di pressione mentre si fa scorrere PBS attraverso la linea per evitare che le bolle d'aria entrino nelle linee del tubo.
NOTA: Svuotare il PBS dai serbatoi dopo che il sistema è stato impostato per ridurre la probabilità di contaminazione del serbatoio con la crescita microbica per la durata della coltura dell'organo. - Avviare la raccolta dei dati IOP assicurandosi innanzitutto che sia presente una scheda microSD per il salvataggio dei file di dati. Quindi, attivare la configurazione del trasduttore di pressione per iniziare la raccolta dei dati.
NOTA: i dettagli per la configurazione del dispositivo di raccolta dati del trasduttore di pressione sono forniti nel protocollo supplementare 2.
5. Manutenzione giornaliera di ASOC
- Dopo che l'ASOC ha avuto 24 ore per equilibrare, rimuovere le stoviglie dall'incubatore a 37 °C, 5% CO2 e metterle nell'armadio BSC II.
NOTA: durante l'acquisizione dei dati di pressione, questi periodi di tempo sembrano picchi poiché gli ASOC vengono rimossi dall'incubatore (variazione di altezza) e regolati nell'armadio. - Verificare la disponibilità di perdite sotto ogni piatto sulla piastra di Petri. Se presente, verificare la disponibilità di connessioni fluidiche strette sotto la parabola e, se necessario, stringere di riconseciere. Verificare la disponibilità di perdite nella parte superiore del piatto utilizzando una chiave a L sterile per serrare le viti nell'anello di serraggio.
NOTA: il tessuto asclerale AS si comprimerà e ridurrà lo spessore di 24 ore e l'anello di serraggio dovrà essere stretto. - Aspirare bene il supporto dal piatto.
NOTA: la rete trabecolare sta filtrando il fluido dal fluido che viene pompato nell'ASOC. Pertanto, i media saranno presenti nella parabola ASOC lungo i bordi. - Ripetere i passaggi 3.7 e 3.8 per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate.
- Ricaricare le siringhe sulle pompe a siringa, assicurarsi che le pompe a siringa siano in funzione e confermare l'allineamento delle valvole per la perfusione nell'ASOC. Riportare la parabola ASOC all'incubatore a CO2 a 37 °C, 5%.
NOTA: in modo ottimale, questi passaggi devono essere eseguiti quotidianamente. Tuttavia, l'uso di un volume iniziale di 20 mL di supporti, il volume del pozzo della parabola ASOC e una velocità della pompa di 2,5 μL / min dovrebbe essere sufficiente per lasciare il sistema in funzione per diversi giorni indisturbato.
6. Induzione di lesioni OG con dispositivo di foratura pneumatico
NOTA: La costruzione del dispositivo di foratura pneumatica è dettagliata nel protocollo supplementare 3. Le lesioni OG sono indotte dopo che la IOP si è stabilizzata, che normalmente si verifica dopo 3 giorni in coltura. I valori IOP accettabili sono 5-20 mmHg in base alla IOP fisiologica, che può essere determinata valutando i file di dati IOP o impostando indicatori LED nel sistema di misurazione della pressione come descritto nel Protocollo supplementare 2.
- Preparare il cabinet BSC II per l'induzione delle lesioni OG come dettagliato nel passaggio 1.10. Collegare la piattaforma di foratura a una linea di aria compressa. Attaccare l'oggetto di foratura sterile al mandrino.
NOTA: un compressore d'aria può essere utilizzato per alimentare il dispositivo, ma l'aria compressa del serbatoio o le linee di laboratorio integrate possono essere sufficienti se la pressione è superiore a 50 psi. - Impostare il regolatore di pressione sulla piattaforma di foratura a 50 psi per un'adeguata forza di foratura su oggetti fino a 4,5 mm di diametro. Posizionare la morsa cross-tracking sul jack da laboratorio di fronte alla piattaforma di foratura per tenere la parabola ASOC durante l'induzione dell'infortunio.
- Rimuovere la configurazione ASOC da 37 °C, incubatore a CO2 al 5% e posizionare nella morsa a tracciamento incrociato perpendicolare alla piattaforma di perforazione (Figura 2) dopo aver rimosso il coperchio e averlo messo da parte. Mantenere il segmento anteriore perfusore ma chiudere la porta della valvola a 3 vie al trasduttore di pressione per evitare danni da sovrapressurizzazione al trasduttore.
- Estendere il braccio del pistone alla sua distanza massima e posizionare l'apice corneale entro 1 mm dall'oggetto di puntura. Ritrarre il braccio del pistone e avvicinare il segmento anteriore di 1 cm all'oggetto della foratura.
NOTA: questa distanza è stata ottimizzata per l'induzione di lesioni ad alta efficienza senza colpire la parabola ASOC. - Accendere il dispositivo di foratura accendendolo e aprendo l'elettrovalvola con il secondo interruttore sul dispositivo. Per ritrarre il dispositivo, premere nuovamente il secondo interruttore per rimuovere il dispositivo di puntura dall'occhio. Verificare la corretta induzione delle lesioni mediante ispezione visiva e perdite di supporti dal sito della lesione.
- Rimuovere la parabola ASOC dalla morsa; rimettere il coperchio sul gruppo piatto e aprire la linea fluidica al trasduttore di pressione. Riportare l'ASOC nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: A questo punto, la terapia può essere applicata all'AS per valutarne l'efficacia per sigillare le lesioni OG.
7. Rimozione di ASOC dalla cultura
NOTA: a seconda dell'analisi degli endpoint (vedere Risultati rappresentativi per i possibili metodi di endpoint), l'AS deve rimanere nel piatto ASOC gonfiato mentre altri metodi richiedono tessuto AS isolato dalla camera di coltura. La metodologia seguente descrive come togliere AS dai piatti di coltura dell'organo e rimuovere il resto della configurazione.
- Rimuovere le stoviglie ASOC dall'incubatore a CO2 a 37 °C, 5%. Chiudere la valvola a 3 vie alla siringa e al serbatoio e scollegare il tubo dal sistema. Scartare la siringa, il serbatoio e il filtro. Posizionare le valvole a 3 vie, i tubi e i mozzi ad ago in un contenitore separato per il lavaggio e la sterilizzazione.
- Scollegare i mozzi dell'ago dalle connessioni fluidiche sul fondo del piatto. Sfilare i connettori fluidici e gli o-ring. Metti tutti gli oggetti in un contenitore per il lavaggio e la sterilizzazione.
- Rimuovere le quattro viti dall'anello di serraggio utilizzando la chiave a L. Rimuovere con attenzione l'anello di serraggio.
- Usando la pinza, rimuovere l'AS dal piatto e, a seconda dell'analisi dell'endpoint e dell'immagine, inserire rifiuti fissativi o appropriati a rischio biologico.
8. Analisi dei dati IOP
- Collegare la scheda microSD a un computer per rimuovere il file .txt contenente i dati dell'esecuzione sperimentale più recente.
NOTA: il file è denominato nel codice che controlla il microcontrollore e deve essere aggiornato per ogni esperimento (vedere Protocollo supplementare 2). - Importare i dati in un foglio di calcolo.
- Organizza i dati in 12 colonne: Tempo (in min) e segnale mV per ciascuno degli 11 canali del trasduttore di pressione. I primi dieci canali corrispondono a dieci configurazioni sperimentali ASOC. Il segnale finale del trasduttore è per un sensore aperto all'aria come canale di controllo per confermare che il segnale mV non si è alterato a causa di cambiamenti nel segnale di ingresso. Traccia il canale di controllo rispetto al tempo per confermare che il segnale mV era coerente in tutto.
- Convertire i segnali mV per dieci canali in mmHg utilizzando equazioni di pendenza-intercetta generate dalla calibrazione iniziale di ciascun sensore (vedere Protocollo supplementare 4).
- Traccia il tempo (converti in giorni per semplificare l'interpretazione dei dati) rispetto a ciascuno dei dieci canali per determinare come la IOP fluttuava nel corso del tempo sperimentale.
- Determinare i valori medi di IOP nei punti chiave dei dati per confrontare più facilmente i valori tra ciascuno e il modo in cui vengono alterati prima e dopo l'induzione della lesione OG. Media di 2-3 ore di dati per ogni intervallo di 24 ore per determinare la IOP in ogni giorno di ASOC.
NOTA: i risultati IOP rappresentativi sono mostrati nella Figura 4.
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Representative Results
Le immagini acquisite tramite tomografia a coerenza ottica (OCT) vengono mostrate per gli occhi feriti OG per illustrare come appare un'induzione di lesioni di successo. La Figura 3 mostra le immagini per il controllo e il tessuto AS danneggiato da OG immediatamente dopo l'infortunio e 72 ore dopo. Vengono mostrate due viste: immagini in sezione trasversale attraverso il sito della lesione e proiezione di intensità massima (MIP) dall'alto verso il basso per visualizzare l'area della superficie dell'immagine. Gli occhi di controllo non mostrano interruzioni evidenti nella cornea, mentre possono essere localizzate lesioni chiare che attraversano l'intera cornea dopo la lesione OG. Dai MIP, è evidente che le lesioni sono irregolari nella forma e nelle dimensioni, ma la dimensione della lesione diminuisce oltre le 72 ore. In precedenza, questo effetto ha dimostrato di essere significativo per un certo numero di dimensioni di lesionitestate 13.
L'output di dati primari per il modello di lesione OG descritto in questo protocollo è la pressione intraoculare nel corso della configurazione sperimentale. I dati sono registrati in unità di millivolt come uscita da ciascun trasduttore di pressione che può essere convertito in mmHg tramite calibrazione (Protocollo supplementare 4). Esempio di dati IOP rispetto al corso di tempo sperimentale è fornito per gli occhi che sono considerati accettabili e altri che non sarebbero considerati utilizzabili (Figura 4A). Dai dati della traccia di pressione, gli occhi sono stati collegati ai sensori dopo 24 ore in coltura, ma la IOP continua a fluttuare nelle prime 72 ore in coltura. La IOP fisiologica per il tessuto AS in coltura d'organo è di circa 8-10 mmHg, quindi è stato deciso un intervallo 2x e 1/2x come gate per i valori IOP utilizzabili dopo che i valori si sono stabilizzati (5-20 mmHg). Solo gli occhi che si trovavano in quell'intervallo sarebbero stati consentiti per l'uso con il resto del protocollo. Da esperimenti precedenti, abbiamo avuto un tasso di successo del 90% che è stato raggiunto nella configurazione ASOC per la stabilizzazione degli occhi nell'intervallo richiesto (Figura 4B).
Vengono inoltre forniti i risultati su come la IOP cambia a causa della lesione OG e dell'intervento terapeutico (Figura 4C, D). Dopo l'induzione della lesione OG, la pressione dovrebbe diminuire significativamente e rimanere tale fino a quando il tessuto non viene rimosso dall'ASOC (Figura 4C). Se l'induzione di un occhio dopo una lesione non diminuisce di pressione, ciò indica che una lesione di successo non è stata indotta in quanto la IOP dovrebbe essere ridotta se la tenuta stagna dell'occhio è compromessa. Tuttavia, le dimensioni più piccole delle lesioni possono auto-guarire, il che potrebbe comportare il ripristino della IOP. Se la terapia viene applicata all'occhio dopo l'induzione della lesione OG, il ripristino della IOP può essere monitorato durante l'ASOC. Questo concetto è dimostrato con i dati che mostrano un adesivo Dermabond applicato a lesioni OG da 2,4 mm (Figura 4D). Vengono mostrati risultati medi per cinque esperimenti ASOC separati con e senza terapia ed è evidente che la terapia sta aumentando la IOP. Questo metodo può misurare l'efficacia della terapia per il ripristino della IOP e monitorare se tale pressione viene ripristinata attraverso la lesione chiave post-OG di 72 ore.
Inoltre, il protocollo ASOC è adattabile per l'uso con una vasta gamma di endpoint di caratterizzazione per soddisfare i requisiti sperimentali dell'utente finale. Durante la coltura, i mezzi di deflusso che lasciano l'occhio possono essere raccolti su base giornaliera o addirittura oraria che può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti del livello proteico che si verificano durante l'ASOC, dopo l'induzione della lesione OG o dopo l'applicazione della terapia. Ad esempio, la zimografia della gelatina è stata precedentemente eseguita per rilevare i livelli di metalloproteinasi della matrice per monitorare la guarigione delle ferite e il rimodellamento dei tessuti20. Ulteriori endpoint biologici sono possibili dopo aver rimosso il tessuto dalla coltura tramite metodi immunoistochimici tradizionali per valutare la vitalità tissutale21,22,tracciare i cambiamenti fisiopatologici della cornea23,24,o colorazione a base di anticorpi per qualsiasi proteina di interesse25,26.
Le metriche corneali funzionali possono anche essere ottenute da occhi mantenuti in ASOC. L'integrità dell'epitelio corneale può essere valutata tramite una macchia oculare di fluoresceina e l'acquisizione di immagini utilizzando una sorgente di luce blu27,28. Dopo la rimozione dalla coltura, il tessuto corneale può essere valutato per la trasparenza attraverso la semplice acquisizione diimmagini 13. L'imaging oculare tradizionale può anche essere eseguito per valutare la struttura del tessuto con o senza intervento terapeutico. Le immagini OCT, come mostrato nella Figura 3,possono creare immagini in sezione trasversale attraverso la cornea e possono essere acquisite in modo non invasivo, consentendo potenzialmente la raccolta di immagini mantenendo il tessuto in coltura. Altre modalità di imaging come la microscopia a lampada a fessura, l'ecografia o la microscopia confocale in vivo possono anche essere adattate per acquisire ulteriori informazioni anatomiche.
Infine, la valutazione delle proprietà meccaniche del segmento anteriore può essere catturata per comprendere l'effetto della lesione OG o la successiva terapia sul tessuto sottostante. Mentre la raccolta dei dati IOP da sola evidenzia come l'integrità del sigillo a tenuta stagna dell'occhio sia stata compromessa, abbiamo precedentemente dimostrato che è possibile misurare ulteriori metriche di test per stuzzicare ulteriori caratteristiche meccaniche10,11. La compliance oculare, una proprietà meccanica raggruppata che descrive come la pressione intraoculare cambia a causa del gonfiaggio (variazione di volume / variazione di pressione), può essere misurata con una pompa a siringa per iniettare improvvisi piccoli volumi di liquido nell'occhio e registrare l'aumento di pressione risultante con un trasduttore di pressione. Una maggiore conformità indica che il tessuto è meno rigido e può essere utilizzato per monitorare come le proprietà terapeutiche del materiale differiscono dal tessuto corneale sottostante. La velocità di perdita dall'occhio o da un impianto di deflusso tradizionale può essere misurata e calcolata per determinare la portata fluidica precisa che esce dall'occhio per unità dipressione 20,29. Infine, per quanto riguarda i test terapeutici, la pressione di scoppio può essere misurata per determinare la pressione massima che l'occhio può trattenere prima del fallimento terapeutico. Questo può essere utilizzato per confrontare le prestazioni con occhi illesi o per tenere traccia dei cambiamenti nelle prestazioni con il tempo12,13.
Figura 1: Diagramma della configurazione ASOC. Gli occhi sono tenuti in piatti di cultura d'organo costruiti su misura e tenuti in posizione con un anello di serraggio. Il mezzo ASOC viene infuso tramite pompa a siringa attraverso la valvola A e collegato a un trasduttore di pressione e successiva acquisizione dei dati con la valvola B. Le porte aperte in ciascuna valvola sono evidenziate in blu mentre il giallo indica i canali chiusi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica della configurazione delle lesioni OG. ( A )Configurazionedel dispositivo per lesioni pneumatico. Da sinistra a destra, l'aria compressa viene introdotta nel dispositivo tramite una linea di aria compressa, che passa attraverso un regolatore per impostare la pressione a 50 psi misurata dal manometro. Due elettrovalvole sono collegate a un attuatore lineare per dirigere l'espansione/retrazione del mandrino del trapano che trattiene l'oggetto di foratura. La morsa è posizionata davanti al dispositivo di puntura per tenere l'occhio al posizionamento x, y, z appropriato. (B) Il rappresentante ASOC è posto davanti al dispositivo di induzione della lesione. Ulteriori dettagli sul dispositivo e sulla sua costruzione sono dettagliati nel Protocollo supplementare 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Tomografia a coerenza ottica Immagini di esperimenti di lesione ASOC OG. Le immagini sono mostrate per gli occhi di controllo (illesi) e gli occhi feriti OG immediatamente dopo l'infortunio e 72 ore dopo l'infortunio. Le viste sono mostrate come sezioni trasversali attraverso la cornea(lato sinistro)e viste di proiezione di massima intensità dall'alto verso il basso della superficie corneale(lato destro). La figura è stata adattata con il permesso di Snider et al.13. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati IOP rappresentativi per esperimenti ASOC. (A) Dati IOP grezzi per le prime 72 ore di configurazione ASOC. Gli occhi vengono perforati a 72 ore, quindi i primi 3 giorni di dati vengono valutati per determinare se la IOP si stabilizza nell'intervallo IOP accettabile (5-20 mmHg). Dai risultati rappresentativi, tre dei cinque occhi rientrano nell'intervallo IOP accettabile, mentre uno ha IOP troppo alto e uno ha IOP troppo basso (che cade al di fuori della regione gialla evidenziata sul grafico). (B) IOP stabilizzato per n = 50 configurazioni ASOC da esperimenti precedenti per dimostrare il tasso di successo tipico con il metodo ASOC. (C) IOP per gli occhi non lesi rispetto a tre diverse dimensioni di lesioni OG dopo l'induzione della lesione per 72 ore. La perdita di IOP è evidente, senza segni di ripresa. (D) Risultati IOP feriti rispetto alle lesioni trattate con un adesivo Dermabond. Mentre il tasso di errore è elevato a causa di alcuni occhi sigillati e altri no, il metodo può tenere traccia delle modifiche alla IOP nel periodo di 72 ore post-infortunio. La figura è stata adattata con il permesso di Snider et al.13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono passaggi critici con la piattaforma di lesioni ASOC OG che dovrebbero essere evidenziati per migliorare la probabilità di successo quando si utilizza la metodologia. In primo luogo, durante la dissezione del segmento anteriore, preservare la rete trabecolare è essenziale ma difficile da fare correttamente. Se la Meditazione Trascendentale viene interrotta, l'occhio non manterrà la pressione fisiologica e non soddisferà i criteri di ammissibilità per l'uso sperimentale. Si raccomanda di praticare prima il processo di dissezione in condizioni normali piuttosto che introdurre le ulteriori sfide tecniche asettiche fino a quando non si ottengono dissezioni adeguate. In secondo luogo, quando si impostano gli occhi nei piatti ASOC, è imperativo che siano abbastanza stretti da impedire la fuoriuscita di liquidi, ma abbastanza sciolti da evitare di danneggiare i piatti ASOC. Se l'occhio non è fissato saldamente, il fluido fuoriuscirà dall'occhio attraverso mezzi non fisiologici con conseguente poca o nessuna IOP. Tuttavia, l'anello di serraggio che tiene l'occhio verso il basso è di plastica e può essere facilmente rotto se troppo stretto. È essenziale stringere gli occhi per 2 giorni poiché il tessuto sclerale sotto l'anello comprimerà e allenterà il tessuto durante le prime 24 ore. Si consiglia di stringere gli anelli fino a quando la resistenza al serraggio non si avverte il giorno 1 e seguire questo con un nuovo serraggio a livelli simili dopo 24 ore in coltura per ottenere i migliori risultati.
In terzo luogo, è fondamentale comprendere appieno dove è diretto il flusso del fluido in ogni momento quando si utilizza questo modello. Ogni parabola ASOC è collegata a più valvole a tre vie per dirigere il flusso del fluido dalla pompa della siringa o dal serbatoio della siringa da 10 mL e collegarsi ai trasduttori di pressione. Diverse istanze del processo di configurazione richiedono che le valvole siano posizionate in modo tale da lavare le bolle d'aria dall'occhio o proteggere i trasduttori di pressione dalla sovrapressurizzazione. Bisogna comunque fare attenzione a capire cosa è aperto / chiuso in ogni momento prima dei passaggi critici del protocollo. Infine, il mantenimento della sterilità in tutto il protocollo di lesioni ASOC OG è fondamentale ma facile da perdere attraverso il processo in più fasi e più giorni. I mezzi di perfusione contengono alti livelli di antibiotici e antimicotici per prevenire questo, e gli occhi sono immersi in betadine prima di essere impostati per prevenire le contaminazioni, ma ci sono ancora passaggi critici in cui gli errori sono più probabili. Durante la configurazione iniziale nel piatto, evitare il contatto con gli occhi mentre si stringono gli anelli di serraggio in posizione e tenere le palpebre sui piatti in ogni momento quando non in uso. Una fase di esposizione più probabile è durante la manutenzione quotidiana dell'ASOC. È importante eseguire questi passaggi di routine in un armadio di biosicurezza, anche se sembra che possano essere eseguiti rapidamente senza rimuovere gli occhi dall'incubatrice. Seguire attentamente il protocollo e mantenere una buona tecnica asettica dovrebbe ridurre al minimo i rischi di contaminazione durante gli esperimenti ASOC di 6 giorni.
Nel complesso, la piattaforma di lesioni ASOC OG è unica rispetto ad altre metodologie che esaminano le lesioni open globe a causa di due criteri chiave. Il primo è il metodo di induzione delle lesioni. Il dispositivo pneumatico ad alta velocità utilizzato induce lesioni con un'elevata quantità di forza. Ciò consente di indurre lesioni con oggetti che non sono particolarmente affilati né con un diametro ridotto. Questo imita più da vicino le lesioni che sono di forma irregolare; schegge ad alta velocità ferite derivanti da ordigni esplosivi30,31. Il dispositivo pneumatico può essere facilmente dotato di schegge di forma irregolare che imitano gli oggetti per creare lesioni più difficili da guarire rispetto ai metodi precedenti che utilizzano laser, aghi o lame di bisturi per creare geometrie di lesioni pulite e precise32,33,34. In secondo luogo, la metodologia ASOC consente di monitorare i progressi delle lesioni e le prestazioni terapeutiche oltre l'induzione iniziale della lesione. Essere in grado di tracciare fino a 72 ore non era possibile nella piattaforma di lesioni OG da banco precedentemente sviluppata10,11,12 ed era la motivazione alla base dello sviluppo di questo protocollo. Infatti, la vitalità cellulare è rimasta elevata nell'endotelio corneale per almeno 1 settimana in ASOC13. ASOC è l'unico mezzo per realizzare questa caratterizzazione a lungo termine senza passare a costosi esperimenti in vivo.
Le principali applicazioni per la piattaforma ASOC sono duplici. In primo luogo, il modello può essere utilizzato per caratterizzare ulteriormente le lesioni open globe, soprattutto considerando come cambiano nel tempo. Nello studio precedente, le lesioni OG sono state caratterizzate in questo modo e la guarigione delle ferite è stata osservata per oltre 72 ore dopo lalesione 13. L'ulteriore monitoraggio di diverse dimensioni, forme, posizioni delle lesioni per 72 ore o anche più a lungo per quanto riguarda i cambiamenti biologici che si verificano informerà le decisioni mediche critiche che devono essere prese a seguito di lesioni OG. Alcuni parametri di lesione possono consentire l'auto-guarigione da parte della cornea, o altri parametri possono essere più gravi se l'intervento non viene applicato entro le prime 24 ore. Queste informazioni saranno preziose per il triaging dei pazienti quando sono disponibili forniture mediche limitate o risorse di evacuazione.
In secondo luogo, la piattaforma ASOC OG può essere utilizzata per lo sviluppo e il test dello sviluppo del prodotto. Per questa applicazione, la piattaforma di coltura degli organi può ricoprire una serie di ruoli. Durante lo sviluppo iniziale del prodotto, è possibile testare intervalli di tempo più brevi con una gamma di formulazioni di prodotti per determinare ciò che è più efficace. Il sistema di coltura degli organi può essere configurato per una produttività ancora maggiore per questa applicazione con pompe a siringa aggiuntive per andare oltre i dieci esperimenti simultanei possibili con il sistema dettagliato qui. Per i prodotti più raffinati, è possibile valutare punti temporali più lunghi per valutare le prestazioni per 72 ore o potenzialmente anche di più. Infine, la valutazione della guarigione delle ferite può essere possibile quando si valutano prodotti biologicamente attivi che possono trattare in modo permanente le lesioni OG piuttosto che la stabilizzazione temporanea.
Tuttavia, ci sono limitazioni con la piattaforma ASOC OG che dovrebbero essere prese in considerazione. In primo luogo, mentre il modello consente una valutazione a lungo termine delle terapie, manca tutto il tessuto dell'occhio al di fuori del guscio corneosclerale, come l'iride e la lente. È probabile che questi tessuti aggiuntivi siano influenzati dalla lesione OG e possano svolgere un ruolo nella progressione della lesione. Allo stesso modo, in un segmento anteriore isolato mancano elementi di risposta immunitaria che sarebbero inclusi durante la transizione dal modello ASOC alla successiva sperimentazione animale. Successivamente, il modello è adatto solo per la creazione di lesioni OG corneali e potenzialmente lesioni OG limbali. Le lesioni da OG sclerale o posteriore non possono essere indotte con questo metodo. Tuttavia, molti di questi tipi di lesioni provocano danni alla retina, rendendo improbabile qualsiasi stabilizzazione temporanea terapeutica per prevenire la perdita della vista35,36. Infine, gli infortuni con il modello fino a 72 ore dopo l'infortunio sono stati solo monitorati. ASOC è stato utilizzato in altre applicazioni fino a 2 settimane, quindi il modello può probabilmente essere utilizzato per queste applicazioni, ma non è stato testato in questo momento37,38,39.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti. Le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono la politica o la posizione ufficiale del Dipartimento medico dell'esercito degli Stati Uniti, del Dipartimento dell'esercito, del Dipartimento della Difesa o del governo degli Stati Uniti.
Acknowledgments
Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti attraverso un accordo interagenzia (# 19-1006-IM) con il programma di acquisizione temporary corneal repair (United States Army Medical Materiel Development Agency).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
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