Summary
Open-Globe-Augenverletzungen können in ländlichen oder militärrelevanten Szenarien mehrere Tage unbehandelt bleiben, was zu Blindheit führt. Therapeutika werden benötigt, um den Verlust des Sehvermögens zu minimieren. Hier beschreiben wir ein Organkultur-Open-Globe-Verletzungsmodell. Mit diesem Modell können mögliche Therapeutika zur Stabilisierung dieser Verletzungen richtig bewertet werden.
Abstract
Open-Globe-Verletzungen haben schlechte visuelle Ergebnisse, was oft zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führt. Dies ist zum Teil auf eine längere Verzögerung zwischen Verletzungen und medizinischen Eingriffen in ländlichen Umgebungen und militärmedizinischen Anwendungen zurückzuführen, bei denen die Augenheilkunde nicht ohne weiteres verfügbar ist. Unbehandelte Verletzungen sind anfällig für Infektionen, nachdem das Auge seine wasserdichte Versiegelung verloren hat, sowie verlust der Gewebelebensfähigkeit aufgrund von intraokularer Hypotonie. Therapeutika zur vorübergehenden Abdichtung von Verletzungen mit offenem Globus können, wenn sie richtig entwickelt wurden, den Augeninnendruck wiederherstellen und Infektionen verhindern, bis eine ordnungsgemäße Augenheilkunde möglich ist. Um die Produktentwicklung zu erleichtern, wird hier die Verwendung einer offenen Globus-Verletzungsplattform für die organkulturelle Anterior-Segment zur Verfolgung der therapeutischen Leistung für mindestens 72 Stunden nach der Verletzung detailliert beschrieben. Porcines vorderes Segmentgewebe kann in speziell angefertigten Organkulturschalen gehalten und bei physiologischem Augeninnendruck gehalten werden. Punktionsverletzungen können mit einem pneumatisch angetriebenen System erzeugt werden, das Verletzungsgrößen von bis zu 4,5 mm Durchmesser erzeugen kann, ähnlich wie militärisch relevante Verletzungsgrößen. Ein Verlust des Augeninnendrucks kann 72 Stunden nach der Verletzung beobachtet werden, was die ordnungsgemäße Verletzungsinduktion und den Verlust der wasserdichten Augendichtung bestätigt. Die therapeutische Leistung kann durch Anwendung auf das Auge nach Verletzungsinduktion und anschließender Verfolgung des Augeninnendrucks für mehrere Tage verfolgt werden. Darüber hinaus ist das Anterior-Segment-Verletzungsmodell auf weit verbreitete Methoden zur funktionellen und biologischen Verfolgung der Physiologie des vorderen Segments anwendbar, wie z. B. die Beurteilung von Transparenz, Augenmechanik, Hornhautepithelgesundheit und Gewebelebensfähigkeit. Insgesamt ist die hier beschriebene Methode ein notwendiger nächster Schritt zur Entwicklung von Biomaterialtherapeutika zur vorübergehenden Versiegelung von Verletzungen am offenen Globus, wenn die Augenheilkunde nicht ohne weiteres verfügbar ist.
Introduction
Open Globe (OG)-Verletzungen können zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führen, wenn sie nach einer Verletzung nicht behandelt oder zumindest stabilisiert werden1. Verzögerungen sind jedoch in abgelegenen Gebieten weit verbreitet, in denen der Zugang zu ophthalmologischen Eingriffen nicht ohne weiteres möglich ist, wie in ländlichen Gebieten oder auf dem Schlachtfeld in militärischen Szenarien. Wenn die Behandlung nicht ohne weiteres verfügbar ist, besteht der derzeitige Behandlungsstandard darin, das Auge mit einem starren Schild zu schützen, bis ein medizinischer Eingriff möglich ist. In der Militärmedizin beträgt diese Verzögerung derzeit bis zu 24 Stunden, aber es wird erwartet, dass sie in zukünftigen Kampfeinsätzen in städtischen Umgebungen, in denen eine Luftevakuierung nicht möglichist,auf bis zu 72 Stunden ansteigen wird2,3,4. Diese Verzögerungen können in ländlichen, abgelegenen zivilen Anwendungen, bei denen der Zugang zu ophthalmologischen Eingriffen begrenztist,noch länger sein5,6. Eine unbehandelte OG-Verletzung ist sehr anfällig für Infektionen und Verlust des Augeninnendrucks (IOP), da die wasserdichte Versiegelung des Auges beeinträchtigt ist7,8. Der Verlust des IOD kann die Lebensfähigkeit des Gewebes beeinträchtigen, so dass es unwahrscheinlich ist, dass ein medizinischer Eingriff das Sehvermögen wiederherstellt, wenn die Verzögerung zwischen Verletzung und Therapie zu lang ist9.
Um die Entwicklung einfach anzuwendender Therapeutika zur Abdichtung von OG-Verletzungen zu ermöglichen, bis ein Augenarzt erreicht werden kann, wurde zuvor ein Benchtop-OG-Verletzungsmodell entwickelt10,11. Bei diesem Modell wurden Hochgeschwindigkeitsverletzungen in ganzen Schweineaugen erzeugt, während IOD von Druckaufnehmern erfasst wurde. Therapeutika können dann angewendet werden, um ihre Fähigkeit zu beurteilen, die OG-Verletzungsstelle zu versiegeln12. Da dieses Modell jedoch ganze Schweineaugen verwendet, kann es nur die sofortige therapeutische Leistung beurteilen, ohne dass die längerfristige Leistung über das mögliche 72-Stunden-Fenster verfolgt werden kann, in dem das Therapeutikum die Verletzungsstelle stabilisieren muss, bis der Patient die Spezialbehandlung erreicht. Infolgedessen wurde ein anteriores Segment Organ Culture (ASOC) OG-Verletzungsmodell entwickelt und in diesem Protokoll als Plattform zur Verfolgung der langfristigen therapeutischen Leistungdetailliert beschrieben 13.
ASOC ist eine weit verbreitete Technik zur Aufrechterhaltung von avaskulärem Gewebe des vorderen Segments, wie der Hornhaut, für mehrere Wochen nach der Enukleation14,15,16,17. Das vordere Segment wird unter physiologischem IOD aufrechterhalten, indem Flüssigkeit mit physiologischen Durchflussraten durchschränkt wird und die trabekuläre Netzabflussregion, das Gewebe, das für die Regulierung des IOD verantwortlich ist, während des ASOC-Setups erhalten bleibt18,19. Die ASOC-Plattform kann Gewebe physiologisch erhalten, eine OG-Verletzung mit einem pneumatisch betriebenen Gerät induzieren, ein Therapeutikum anwenden und die Verletzungsstabilisierung für mindestens 72 Stunden nach der Verletzungverfolgen 13.
Hier bietet das Protokoll eine Schritt-für-Schritt-Methodik für die Verwendung der ASOC-Plattform. Zuerst wird beschrieben, wie die ASOC-Plattform eingerichtet und hergestellt wird. Als nächstes beschreibt das Protokoll, wie das vordere Segment aseptisch seziert und das trabekuläre Geflecht beibehalten wird, gefolgt von der Einrichtung von vorderem Segmentgewebe in speziell angefertigten Organkulturschalen. Dann wird beschrieben, wie man Open-Globe-Verletzungen erzeugt und therapeutisch unmittelbar nach der Verletzung anwendet. Schließlich bietet das Protokoll einen Überblick über Charakterisierungsparameter, die mit dieser Methode möglich sind, die funktionelle, mechanische und biologische Eigenschaften des Auges bewertet und wie gut die Verletzung stabilisiert wurde. Insgesamt bietet dieses Modell eine dringend benötigte Plattform, um die Produktentwicklung zur Stabilisierung und Behandlung von Open-Globe-Verletzungen zu beschleunigen und die Schlechtesichtprognose nach Verletzungen zu verbessern.
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Protocol
Bevor Sie dieses Protokoll durchführen, beachten Sie, dass es rechtliche und ethische Anforderungen für die Verwendung von Tieren in Forschung und Ausbildung gibt. Wenn lebende Tiere als Quelle von Augengewebe verwendet werden, holen Sie vor Beginn die Genehmigung der örtlichen ethischen oder rechtlichen Behörde (IACUC oder Ethikkommission usw.) ein. Wenn es irgendwelche Fragen bei der Erlangung der Genehmigung für die Verwendung von Tieren gibt, fahren Sie nicht fort. Wir haben zuvor festgestellt und berichtet, dass frische Schweineaugen, die innerhalb von 24 Stunden post mortem erhalten und verwendet wurden, im Vergleich zur In-vivo-Physiologie am nächsten kamen und für diese Studien gut abgeschnitten haben (Animal Technologies, Tyler, TX, USA)10,13. Während dieses Protokolls wurden keine lebenden Tiere verwendet, wobei ein Gewebeverkäufer verwendet wurde, um Gewebe innerhalb von 24 Stunden zu erhalten.
HINWEIS: Vor der Ankunft des Gewebes werden die Organkulturschalen(Zusatzprotokoll 1),Klemmringe(Zusatzprotokoll 1),Schalenständer(Zusatzprotokoll 1),Druckaufnehmer-Datenerfassungsaufbau(Zusatzprotokoll 2)und pneumatische Punktionsplattform(Zusatzprotokoll 3)hergestellt. Sterilisieren Sie das Geschirr, die Werkzeuge und das Zubehör und bereiten Sie die Arbeitsbereiche vor. Es ist nützlich, einen nicht sterilen Bereich zu haben, um eine grobe Dissektion an den Augen durchzuführen, da sie normalerweise mit verbindendem, zusätzlichem Orbitalgewebe verbunden sind. Führen Sie diese ersten Schritte auf einer offenen, sauberen Arbeitsfläche aus und übertragen Sie die Augen dann aseptisch in einen BSC II-Schrank zur Mikrodissektion (Schrank Nr. 1). Optimalerweise ist der BSC II-Schrank, der für die Mikrodissektion verwendet wird, vom BSC II-Schrank (Schrank Nr. 2) getrennt, um den Luftstrom zu minimieren und den Arbeitsbereich zu maximieren. Richten Sie den Mikrodissektionsschrank mit einem Seziermikroskop und einer Möglichkeit zur Visualisierung der Arbeitsfläche (Kamera oder Okulare, die aus dem Schrank herausragen) ein.
1. Sterilisationsschritte, Verbrauchsmaterialien (siehe Materialtabelle für weitere Details) und Einrichtung
- Vorbereiten und Gassterilisieren sie die folgenden Elemente (1 Kit für jedes Auge): ASOC-Schüssel, Klemmring, zwei fluidische Anschlüsse mit O-Ringen, zwei 18 G-Nadelnaben, vier Schrauben, zwei Längen PE-100-Schläuche (die Länge des Abstands sollte lang genug sein, um sich von der Schüssel im Inkubator zur Spritzenpumpe und zum Datenerfassungsaufbau des Druckaufnehmers zu erstrecken), zwei 18 G 90° gebogene Nadelnaben, zwei 3-Wege-Ventile.
- Bereiten Sie die folgenden Kits vor und autoklavieren Sie sie.
- Bereiten Sie das Mikrodissektionsinstrumenten-Kit vor und autoklavieren Sie es, das eine feine Zange, eine Vannas-Schere, eine mittlere Zahnzette, eine große Schere, Wattestäbchen und eine Rasierklinge oder ein Skalpell enthält.
- Bereiten Sie das Montageinstrumentenset vor und autoklavieren Sie es, das eine Mittelzahnzette, eine chirurgische Schere und eine L-Taste enthält.
- Bereiten Sie das tägliche Kit (Menge: eines pro Kulturtag) vor und autoklavieren Sie es, das einen L-Schlüssel enthält, um die Klemmringe jeden Tag nach Bedarf an Geschirr festzuziehen.
- Autoklav vier 100 ml Becher zur Desinfektion und Lagerung von Augen und vorderen Segmenten.
- Autoklavieren Sie die Punktionsobjekte.
- Sammeln Sie die folgenden sterilen Gegenstände: Petrischale (1 Schüssel / Auge), Gaze (1-2 / Auge), Geschirrständer, 20 ml Spritzen (1 / Auge), 10 ml Spritzen (1 / Auge), Nylonspritzenfilter (1 / Auge).
- Sterile Medien vorbereiten: DMEM mit 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicin, 1x Antibiotika-Antimykotikum (AA; ca. 30-40 ml komplettes Medium/Auge).
- Bereiten Sie AA-PBS vor: PBS mit 1x AA (~ 500 ml).
- Bereiten Sie das Grobdissektionswerkzeugpaket vor: Reinigen und trocknen Sie große chirurgische Scheren und Einezette.
- Richten Sie den nicht sterilen Sezierarbeitsplatz ein: Sammeln Sie Vorräte aus groben Dissektionswerkzeugpackungen, enukleierten Schweineaugen, die in PBS und auf Eis getaunken sind, chirurgischen Vorhängen, 100-ml-Becherglas mit PBS. Legen Sie den chirurgischen Vorhang und die für die grobe Dissektion erforderlichen Gegenstände aus.
- Richten Sie den sterilen Sezierarbeitsplatz ein: Sammeln Sie Vorräte aus mikrodissektioniertem Instrumentenset, steriler Gaze, Seziermikroskop, Betadinlösung, sterilem PBS, sterilen Medien, vier sterilisierten 100-ml-Bechern, steriler Petrischale. Aseptische Übergabe an BSC II Schrank #1. Stellen Sie den Schrank für die Visualisierung der Augen auf dem Seziermikroskop auf.
- Richten Sie den ASOC-Montagearbeitsplatz ein: Sammeln Sie gassterilisierte Kits (Geschirr-Kit und Deckel-Kit), Montageinstrumenten-Kit, sterile Medien, Geschirrständer, sterile Petrischalen, sterile Spritzen und Spritzenfilter. Aseptische Übergabe an BSC II Schrank #2. Richten Sie den Schrank für die Tellermontage ein.
- Wenn die Augen stabilisiert und für die Punktion bereit sind (72 h nach dem Setup), übertragen Sie sie aseptisch in einen BSC II-Schrank. Richten Sie den OG-Verletzungsinduktionsarbeitsbereich ein: Pneumatisch betriebenes Verletzungsinduktionsgerät (Montage in Ergänzung 3beschrieben) und Lab Jack und Cross-Tracking-Schraubstock zum Halten der ASOC-Schüssel.
2. Dissektion von Gewebe
- Bereiten Sie das Schweinegewebe mit einem nicht sterilen Sezierarbeitsplatz vor.
- Beschaffen Sie enukleierte Schweineaugen von einem lokalen Schlachthof, Tierstudien oder Verkäufer. Halten Sie die Augen während der Lieferung auf Eis, das in PBS getaunken ist, und verwenden Sie es sofort nach dem Empfang.
- Schneiden Sie das extraorbitale Gewebe weg und trimmen Sie die Bindehaut, so dass nur die Hornhautschale und der Sehnerv übrig bleiben. Führen Sie die Dissektion unter nicht sterilen Bedingungen mit einer großen chirurgischen Schere und Einer zette in einem groben Dissektionswerkzeug durch.
- Legen Sie die Augen wieder in frisches PBS auf Eis, bis alle für den Versuchsaufbau erforderlichen Augen vorläufig / grob seziert wurden.
- Tauchen Sie die Augen für 2 min in geschlossene Behälter in 10% Betadinlösung und übertragen Sie sie aseptisch in den BSC II-Schrank Nr. 1. Führen Sie alle nachfolgenden Arbeiten unter sterilen Bedingungen durch, um Verunreinigungen während des Aufbaus zu minimieren.
- Sezieren Sie steril vordere Segmente.
- Nach 2 Minuten Betadinlösung die Augen in drei serielle Waschungen von sterilem AA-PBS überführen, um überschüssige Betadinlösung von der Augenoberfläche zu entfernen und gleichzeitig die Sterilität des Augengewebes zu erhalten. Nach drei Wäschen das Gewebe bis zur weiteren Verwendung in AA-PBS halten.
- Hemisektieren Sie das Auge mit einer Rasierklinge / Skalpell und einer gekrümmten Schere. Legen Sie das Auge auf eine AA-PBS-getränkte Gaze und erzeugen Sie einen Schnitt mit einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell in der Nähe des Augenäquators (60/40 geteilt mit 40 auf der vorderen Seite). Mit einer gekrümmten chirurgischen Schere das Auge hemisektieren, um das vordere Auge (Hornhauthälfte) zu isolieren.
HINWEIS: Der Schnitt um das vordere Segment muss kontinuierlich sein, um gezackte, raue Kanten in der Sklera zu verhindern, die nach dem Aufbau in der Organkultur Flüssigkeitslecks erzeugen. - Verwenden Sie Mikroscheren als Schaufel, um Glaskörper aus dem vorderen Segment zu schaufeln. Entfernen Sie die Linse mit einer Mikroschere aus dem vorderen Segment. Lassen Sie die vorderen Segmente in AA-PBS bis zu weiteren Sezierschritten.
HINWEIS: Alle Augen, die seziert werden, können in diesem Schritt gehalten und nacheinander durch den Rest des Dissektionsprozesses geführt werden. - Schneiden Sie mit einem Seziermikroskop die Iris allmählich radial zur Iriswurzel zurück, bis das trabekuläre Geflecht (TM) sichtbar ist. Das TM ist ein pigmentiertes Gewebe, das Fasern umfasst, die umlaufend um die hornhautklerale Schale herum ausgerichtet sind. Sorgfältige Schnitte in die Iris in Richtung iriswurzel legen die Tiefe des TM unter dem Gewebe frei.
- Schneiden Sie 360 ° um die Iris in der gleichen Tiefe wie der erste Schnitt in das Gewebe, um die gesamte TM-Region freizulegen. Reinigen Sie alle verbleibenden Irisreste, die TM abdecken, nach Bedarf.
- Schneiden Sie die Ziliarkörperreste hinter dem TM ab und lassen Sie nur ein dünnes Gewebeband nach dem TM-Bereich (ca. 1 mm).
- Platzieren Sie das sezierte vordere Segment (AS) in Medien, bis es in ASOC im BSC II-Schrank Nr. 2 weiter eingerichtet ist.
HINWEIS: Alle Augen können an dieser Stelle vor der ASOC-Einrichtung gehalten werden, wenn ein einzelner Benutzer Dissektion und Organkulturschalenmontage durchführt.
3. Anstellen von vorderen Segmenten in Organkulturschalen
- Legen Sie ein einzelnes AS in eine Petrischale mit AS invertiert (Tasse hoch). Mit einem Wattestäbchen in den Medien benetzen und vorsichtig in die Mitte der Hornhaut tupfen, um Pigmente zu entfernen. Wischen Sie mit einer Zette, um das Auge und den gleichen Tupfer zu halten, den Wattestäbchen um die Sklera ab, um zusätzliches Pigment zu entfernen.
- Kehren Sie den AS um und legen Sie den unteren Teil des Gerichts über den erhöhten Bereich, wobei die Hornhaut über den erhöhten Bereich in der Schüssel zentriert wird. Legen Sie den Klemmring auf den neu platzierten AS.
- Setzen Sie vier Schrauben in die entsprechenden Löcher ein, um den Ring mit dem AS unter dem Ring zu halten. Ziehen Sie die Schrauben vorsichtig von Hand mit dem L-Key an.
HINWEIS: Der Schraubschritt erfolgt täglich während des gesamten Experiments, daher besteht das Ziel des ersten Anziehens darin, sicherzustellen, dass das Medium nicht ausläuft und gleichzeitig das Brechen des Klemmrings vermieden wird. - Legen Sie mit einem sterilen Petrischalenset die Oberseite über die Schüssel und kehren Sie das Setup um. Befestigen Sie den Geschirrständer. Befestigen Sie die fluidischen Anschlüsse mit O-Ringen an den Gewindeanschlüssen an der Unterseite der Schüssel.
- Befestigen Sie an einem fluidischen Stecker eine 18 G 90 ° gebogene Nadelnabe, eine Schlauchlänge, eine 18 G Nadelnabe, einen Nylonspritzenfilter, ein Dreiwegventil und eine 20 ml Spritze, die mit Medien gefüllt ist.
- Befestigen Sie am zweiten fluidischen Stecker eine um 18 G 90 ° Grad gebogene Nadelnabe, eine Länge des Schlauchs, eine 18 G Nadelnabe, ein Drei-Wege-Ventil und den Fassteil einer sterilen 10-ml-Spritze (dies fungiert als Reservoir zum Auffangen von Flüssigkeit und Blasen aus dem ASOC).
- Wenn sich drei Wegeventile entsprechend zu den Spritzen öffnen, drücken Sie das Medium vorsichtig durch das System, indem Sie den in Schritt 3.5 identifizierten Fluidik-Anschlussanschluss verwenden, um den AS aufzublasen, Medien in den Schlauch und schließlich in den Behälter zu füllen.
HINWEIS: Wenn Medien in die ASOC-Schüssel eindringen, wird der AS mit dem Klemmring nicht fest genug gesichert. - Entfernen Sie Blasen, indem Sie die Medien vorsichtig in die Schüssel drücken und die Schüssel umkehren, um die Blasen in das Reservoir zu drücken.
- Stellen Sie die Schüssel und stehen Sie aufrecht. Legen Sie den unteren Teil einer Petrischale unter die Füße des Ständers und achten Sie darauf, den Schlauch nicht zu verarsten.
4. Beginn der Organkultur des vorderen Segments
- ASOC ist nun bereit für die Inkubation. Legen Sie die ASOC-Schale in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2). Stellen Sie sicher, dass die Höhe der ASOC-Schüssel im Inkubator über den Druckaufnehmern bekannt ist und berücksichtigt wird, um den IOP genau zu berechnen (Zusatzprotokoll 4).
- Richten Sie die Schlauchleitungen durch den Boden der 37 °C, 5% CO2 Inkubatortür aus, damit sie das Öffnen und Schließen der Tür nicht stören. Befestigen Sie die 20-ml-Spritze an der Spritzenpumpe mit 2,5 μL/min.
- Positionieren Sie die Schlauchleitung mit dem Behälter am Druckaufnehmerinstrument. Schließen Sie das seitliche 3-Wege-Ventil an den Druckaufnehmer an, während PBS durch die Leitung fließt, um zu vermeiden, dass Luftblasen in die Schlauchleitungen eindringen.
HINWEIS: Entleeren Sie das PBS aus den Reservoirs, nachdem das System eingerichtet wurde, um die Wahrscheinlichkeit einer Reservoirkontamination mit mikrobiellem Wachstum für die Dauer der Organkultur zu verringern. - Initiieren Sie die IOP-Datenerfassung, indem Sie zunächst sicherstellen, dass eine microSD-Karte zum Speichern von Datendateien vorhanden ist. Schalten Sie dann die Einrichtung des Druckaufnehmers ein, um mit der Datenerfassung zu beginnen.
HINWEIS: Details zur Einrichtung des Druckaufnehmer-Datenerfassungsgeräts finden Sie im Zusatzprotokoll 2.
5. Tägliche Wartung von ASOC
- Nachdem das ASOC 24 Stunden Zeit hatte, um auszugleichen, nehmen Sie das Geschirr aus dem 37 °C, 5% CO2 Inkubator und legen Sie es in den BSC II Schrank.
HINWEIS: Bei der Druckdatenerfassung sehen diese Zeiträume wie Spitzen aus, da die ASOCs aus dem Inkubator entfernt (Höhenänderung) und im Schrank angepasst werden. - Überprüfen Sie auf Lecks unter jeder Schüssel auf der Petriplatte. Falls vorhanden, überprüfen Sie die flüssigkeitsdichten Verbindungen unter der Schüssel und ziehen Sie sie bei Bedarf wieder fest. Überprüfen Sie die Schrauben im Klemmring mit einem sterilen L-Schlüssel auf Lecks in der Oberseite.
HINWEIS: Das AS-Sklera-Gewebe komprimiert und reduziert die Dicke um 24 h, und der Klemmring muss angezogen werden. - Saugen Sie die Medien gut aus dem Gericht ab.
HINWEIS: Das Trabekelgeflecht filtert Flüssigkeit aus dem Medium, das in das ASOC gepumpt wird. Daher werden Medien in der ASOC-Schüssel entlang der Ränder vorhanden sein. - Wiederholen Sie die Schritte 3.7 und 3.8, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
- Füllen Sie die Spritzen an den Spritzenpumpen nach, stellen Sie sicher, dass die Spritzenpumpen funktionieren, und bestätigen Sie die Ausrichtung der Ventile für die Perfusion in das ASOC. Die ASOC-Schale in den 37 °C, 5% CO2 Inkubator zurückgeben.
HINWEIS: Optimalerweise sollten diese Schritte täglich durchgeführt werden. Die Verwendung eines 20-ml-Startvolumens, des ASOC-Spülbrunnenvolumens und einer Pumpleistung von 2,5 μL/min sollte jedoch ausreichen, um das System mehrere Tage ungestört laufen zu lassen.
6. OG-Verletzungsinduktion mit pneumatisch betriebener Pannenvorrichtung
HINWEIS: Der Aufbau der pneumatischen Einstichvorrichtung ist im Zusatzprotokoll 3 beschrieben. OG-Verletzungen werden induziert, nachdem sich der IOD stabilisiert hat, was normalerweise nach 3 Tagen in Kultur auftritt. Akzeptable IOP-Werte sind 5-20 mmHg basierend auf physiologischen IOD, die durch Auswertung der IOP-Datendateien oder Einstellung von LED-Anzeigen im Druckmesssystem wie in Zusatzprotokoll 2beschrieben bestimmt werden können.
- Bereiten Sie den BSC II-Schrank für die OG-Verletzungsinduktion vor, wie in Schritt 1.10 beschrieben. Verbinden Sie die Punktionsplattform mit einer Druckluftleitung. Befestigen Sie das sterile Punktionsobjekt am Futter.
HINWEIS: Ein Luftkompressor kann verwendet werden, um das Gerät mit Strom zu versorgen, aber Tankdruckluft oder eingebaute Laborleitungen können ausreichen, wenn der Druck größer als 50 psi ist. - Stellen Sie den Druckregler auf der Einstichplattform auf 50 psi ein, um eine ausreichende Durchstoßkraft auf Objekte mit einem Durchmesser von bis zu 4,5 mm zu haben. Positionieren Sie den Cross-Tracking-Schraubstock auf der Laborbuchse vor der Einstichplattform, um die ASOC-Schüssel während der Verletzungsinduktion zu halten.
- Entfernen Sie das ASOC-Setup vom 37 °C, 5% CO 2-Inkubator, und legen Sie es senkrecht zur Punktionsplattform(Abbildung 2)in den Cross-Tracking-Schraubstock, nachdem Sie den Deckel entfernt und beiseite gelegt haben. Halten Sie das vordere Segment perfundiert, aber schließen Sie den 3-Wege-Ventilanschluss zum Druckaufnehmer, um eine Überdruckbeaufschlagung des Wandlers zu vermeiden.
- Verlängern Sie den Kolbenarm auf seinen maximalen Abstand und positionieren Sie die Hornhautspitze innerhalb von 1 mm vom Punktionsobjekt. Ziehen Sie den Kolbenarm ein und bringen Sie das vordere Segment 1 cm näher an das Punktionsobjekt heran.
HINWEIS: Dieser Abstand wurde für eine hocheffiziente Verletzungsinduktion optimiert, ohne die ASOC-Schüssel zu treffen. - Feuern Sie die Einstichvorrichtung, indem Sie sie einschalten und das Magnetventil mit dem zweiten Schalter am Gerät öffnen. Um das Gerät einzuziehen, drücken Sie den zweiten Schalter erneut, um das Punktionsgerät aus dem Auge zu entfernen. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Verletzungsinduktion durch visuelle Inspektion und Medienlecks von der Verletzungsstelle.
- AsOC-Schale vom Schraubstock entfernen; Setzen Sie den Deckel wieder auf die Schüsselmontage und öffnen Sie die fluidische Leitung zum Druckaufnehmer. Legen Sie das ASOC wieder in den 37 °C, 5% CO2 Inkubator.
HINWEIS: An dieser Stelle kann das Therapeutikum auf den AS angewendet werden, um seine Wirksamkeit bei der Versiegelung von OG-Verletzungen zu beurteilen.
7. ASOC aus der Kultur entfernen
HINWEIS: Abhängig von der Endpunktanalyse (siehe Repräsentative Ergebnisse für mögliche Endpunktmethoden) muss der AS in der ASOC-Schüssel aufgeblasen bleiben, während andere Methoden AS-Gewebe erfordern, das aus der Kulturkammer isoliert wird. Die folgende Methodik beschreibt, wie AS aus den Organkulturschalen entfernt und der Rest des Setups entfernt wird.
- Entfernen Sie das ASOC-Geschirr aus dem 37 °C, 5% CO2 Inkubator. Schließen Sie das 3-Wege-Ventil an die Spritze und den Behälter und trennen Sie den Schlauch vom System. Entsorgen Sie die Spritze, das Reservoir und den Filter. Legen Sie die 3-Wege-Ventile, Schläuche und Nadelnaben zum Waschen und Sterilisieren in einen separaten Behälter.
- Trennen Sie die Nadelnaben von den fluidischen Verbindungen auf dem Boden der Schüssel. Entfläsern Sie die fluidischen Anschlüsse und O-Ringe. Legen Sie alle Gegenstände zum Waschen und Sterilisieren in einen Behälter.
- Entfernen Sie die vier Schrauben mit der L-Taste vom Klemmring. Entfernen Sie vorsichtig den Klemmring.
- Entfernen Sie den AS mit einer Sparzette aus der Schüssel und legen Sie ihn je nach Endpunktanalyse und Bild in fixative oder geeignete biogefährdische Abfälle.
8. IOP-Datenanalyse
- Schließen Sie die microSD-Karte an einen Computer an, um die .txt Datei mit den Daten aus dem letzten Versuchslauf zu entfernen.
HINWEIS: Die Datei wird im Code genannt, der den Mikrocontroller steuert, und sollte für jedes Experiment aktualisiert werden (siehe Zusatzprotokoll 2). - Importieren Sie die Daten in eine Tabelle.
- Organisieren Sie die Daten in 12 Spalten: Zeit (in min) und mV-Signal für jeden der 11 Druckmessumformerkanäle. Die ersten zehn Kanäle entsprechen zehn ASOC-Versuchsaufbauten. Das endgültige Wandlersignal ist für einen Sensor, der als Steuerkanal für Luft geöffnet ist, um zu bestätigen, dass sich das mV-Signal aufgrund von Änderungen des Eingangssignals nicht geändert hat. Plotten Sie den Steuerkanal im Vergleich zur Zeit, um zu bestätigen, dass das mV-Signal durchgehend konsistent war.
- Wandeln Sie die mV-Signale für zehn Kanäle mithilfe von Steigungs-Schnitt-Gleichungen, die aus der Erstkalibrierung jedes Sensors generiert werden, in mmHg um (siehe Zusatzprotokoll 4).
- Plotten Sie die Zeit (in Tage umrechnen, um die Dateninterpretation zu vereinfachen) im Vergleich zu jedem der zehn Kanäle, um zu bestimmen, wie der IOP im experimentellen Zeitverlauf schwankte.
- Bestimmen Sie die durchschnittlichen IOP-Werte an wichtigen Punkten in den Daten, um die Werte zwischen den einzelnen Werten und deren Veränderung vor und nach der OG-Verletzungsinduktion leichter vergleichen zu können. Durchschnittlich 2-3 h Daten für jedes 24-Stunden-Intervall, um den IOP an jedem Tag des ASOC zu bestimmen.
HINWEIS: Repräsentative IOP-Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt.
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Representative Results
Bilder, die mittels optischer Kohärenztomographie (OCT) aufgenommen wurden, werden für OG-verletzte Augen gezeigt, um zu veranschaulichen, wie eine erfolgreiche Verletzungsinduktion aussieht. Abbildung 3 zeigt Bilder für Kontroll- und OG-verletztes AS-Gewebe unmittelbar nach der Verletzung und 72 h später. Es werden zwei Ansichten gezeigt: Querschnittsbilder durch die Verletzungsstelle und Top-Down-Projektion mit maximaler Intensität (MIPs), um die Oberfläche des Bildes zu visualisieren. Kontrollaugen zeigen keine merkliche Störung in der Hornhaut, während klare Verletzungen lokalisiert werden können, die nach einer OG-Verletzung die gesamte Hornhaut durchqueren. Aus MIPs ist es offensichtlich, dass Verletzungen in Form und Größe unregelmäßig sind, aber die Verletzungsgröße nimmt über 72 h ab. Zuvor hat sich dieser Effekt für eine Reihe von getesteten Verletzungsgrößen als signifikanterwiesen 13.
Die primäre Datenausgabe für das in diesem Protokoll beschriebene OG-Verletzungsmodell ist der Augeninnendruck im Verlauf des Versuchsaufbaus. Die Daten werden in Einheiten von Millivolt als Ausgang von jedem Druckaufnehmer aufgezeichnet, der durch Kalibrierung in mmHg umgewandelt werden kann (Zusatzprotokoll 4). Beispiel-IOP-Daten im Vergleich zum experimentellen Zeitverlauf werden für Augen bereitgestellt, die als akzeptabel angesehen werden, und für andere, die nicht als verwendbar angesehen werden(Abbildung 4A). Aus den Druckspurendaten wurden die Augen nach 24 Stunden in Kultur an Sensoren befestigt, aber der IOD schwankt weiterhin über die ersten 72 Stunden in Kultur. Der physiologische IOD für AS-Gewebe in Organkultur beträgt ca. 8-10 mmHg, daher wurde ein 2x- und 1/2x-Bereich als Tor für nutzbare IOD-Werte nach Stabilisierung der Werte (5-20 mmHg) festgelegt. Nur Augen, die sich in diesem Bereich befanden, wären für die Verwendung mit dem Rest des Protokolls zulässig. Aus früheren Experimenten hatten wir eine Erfolgsquote von 90%, die im ASOC-Setup für Augen erreicht wurde, die sich im erforderlichen Bereich stabilisieren (Abbildung 4B).
Die Ergebnisse für die Veränderungen des IOD aufgrund von OG-Verletzungen und therapeutischen Interventionen werden ebenfalls geliefert (Abbildung 4C, D). Nach der OG-Verletzungsinduktion sollte der Druck signifikant sinken und so bleiben, bis das Gewebe aus dem ASOC entfernt wird (Abbildung 4C). Wenn ein Auge nach der Verletzungsinduktion nicht an Druck abnimmt, deutet dies darauf hin, dass eine erfolgreiche Verletzung nicht induziert wurde, da der IOD reduziert werden sollte, wenn die wasserdichte Versiegelung des Auges beeinträchtigt ist. Kleinere Verletzungsgrößen können sich jedoch selbst heilen, was dazu führen kann, dass der IOP wiederhergestellt wird. Wenn das Therapeutikum nach der Og-Verletzungsinduktion auf das Auge aufgetragen wird, kann die Wiederherstellung des IOD während des ASOC verfolgt werden. Dieses Konzept wird 2 mit Daten demonstriert, die einen Dermabond-Klebstoff zeigen, der auf 2,4 mm OG-Verletzungen aufgetragen wird (Abbildung 4D). Durchschnittliche Ergebnisse für fünf separate ASOC-Experimente mit und ohne Therapeutikum werden gezeigt und es ist offensichtlich, dass das Therapeutikum den IOD erhöht. Diese Methode kann die Wirksamkeit des Therapeutikums zur Wiederherstellung des IOD messen und verfolgen, ob dieser Druck über die wichtigsten 72 Stunden nach der OG-Verletzung wiederhergestellt wird.
Darüber hinaus ist das ASOC-Protokoll für die Verwendung mit einer Vielzahl von Charakterisierungsendpunkten anpassbar, um die experimentellen Anforderungen des Endbenutzers zu erfüllen. Während der Kultur können Abflussmedien, die das Auge verlassen, täglich oder sogar stündlich gesammelt werden, um Proteinspiegeländerungen zu verfolgen, die während ASOC, nach OG-Verletzungsinduktion oder nach therapeutischer Anwendung auftreten. Zum Beispiel wurde zuvor eine Gelatinezymographie durchgeführt, um Matrix-Metalloproteinase-Spiegel zu erkennen, um die Wundheilung und den Gewebeumbau zu verfolgen20. Weitere biologische Endpunkte sind nach der Entnahme von Gewebe aus der Kultur mittels traditioneller immunhistochemischer Methoden zur Beurteilung der Gewebelebensfähigkeit21,22, Verfolgung pathophysiologischer Veränderungen der Hornhaut23,24oder Antikörper-basierter Färbung für jedes Protein von Interesse25,26möglich.
Funktionelle Hornhautmetriken können auch aus Augen gewonnen werden, die in ASOC gepflegt werden. Die Integrität des Hornhautepithels kann über einen Fluoreszein-Augenfleck und bildliche Erfassung mit einer blauen Lichtquelle beurteilt werden27,28. Nach der Entfernung aus der Kultur kann Hornhautgewebe durch einfache Bildaufnahme auf Transparenz untersucht werden13. Traditionelle Augenbildgebung kann auch durchgeführt werden, um die Gewebestruktur mit oder ohne therapeutische Intervention zu beurteilen. OCT-Bilder, wie in Abbildung 3gezeigt, können Querschnittsbilder durch die Hornhaut erzeugen und können nicht-invasiv erfasst werden, was möglicherweise eine Bilderfassung ermöglicht, während das Gewebe in Kultur bleibt. Andere bildgebende Modalitäten wie Spaltlampenmikroskopie, Ultraschall oder konfokale In-vivo-Mikroskopie können ebenfalls angepasst werden, um weitere anatomische Informationen zu erhalten.
Schließlich kann die Beurteilung der mechanischen Eigenschaften des vorderen Segments erfasst werden, um die Auswirkungen der OG-Verletzung oder der anschließenden Therapie auf das darunter liegende Gewebe zu verstehen. Während die IOP-Datenerfassung allein zeigt, wie die Integrität der wasserdichten Dichtung des Auges beeinträchtigt wurde, haben wir zuvor gezeigt, dass zusätzliche Testmetriken gemessen werden können, um zusätzliche mechanische Merkmale herauszuzeigen10,11. Die Augenkonformität, eine zusammengefasste mechanische Eigenschaft, die beschreibt, wie sich der Augeninnendruck aufgrund von Inflation ändert (Volumenänderung/ Druckänderung), kann mit einer Spritzenpumpe gemessen werden, um plötzlich kleine Flüssigkeitsmengen in das Auge zu injizieren und den resultierenden Druckanstieg mit einem Druckaufnehmer aufzuzeichnen. Eine höhere Compliance zeigt an, dass das Gewebe weniger steif ist und verwendet werden kann, um zu verfolgen, wie sich die therapeutischen Materialeigenschaften vom darunter liegenden Hornhautgewebe unterscheiden. Die Leckrate vom Auge oder einer herkömmlichen Ausflussanlage kann gemessen und berechnet werden, um die genaue fluidische Durchflussrate zu bestimmen, die das Auge pro Druckeinheit20,29verlässt. Schließlich kann in Bezug auf therapeutische Tests der Berstdruck gemessen werden, um den maximalen Druck zu bestimmen, den das Auge vor dem therapeutischen Versagen halten kann. Dies kann verwendet werden, um die Leistung mit unverletzten Augen zu vergleichen oder leistungsänderungen mit der Zeit12,13zu verfolgen.
Abbildung 1: Diagramm des ASOC-Setups. Die Augen werden in speziell angefertigten Orgelkulturschalen gehalten und mit einem Klemmring an Ort und Stelle gehalten. ASOC-Medien werden über eine Spritzenpumpe durch Ventil A infundiert und mit einem Druckaufnehmer verbunden, und anschließende Datenerfassung mit Ventil B. Offene Ports in jedem Ventil sind blau hervorgehoben, während Gelb geschlossene Kanäle anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Übersicht über das OG-Verletzungs-Setup. (A) Pneumatisch angetriebenes Verletzungsgerät-Setup. Von links nach rechts wird Druckluft über eine Druckluftleitung in das Gerät eingebracht, die durch einen Regler geleitet wird, um den Druck auf 50 psi einzustellen, wie vom Manometer gemessen. Zwei Magnetventile sind mit einem Linearantrieb verbunden, um das Aus- und Aus- und Ausziehen des Bohrfutters, das das Punktionsobjekt hält, direkt zu ziehen. Der Schraubstock wird vor der Einstichvorrichtung positioniert, um das Auge an der entsprechenden x-, y-, z-Positionierung zu halten. (B) Repräsentatives ASOC wird vor der Verletzungsinduktionsvorrichtung platziert. Weitere Einzelheiten des Geräts und seines Aufbaus sind im Zusatzprotokoll 3 aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Optische Kohärenztomographie Bilder von ASOC OG-Verletzungsexperimenten. Bilder werden für Kontrollaugen (unverletzt) und OG verletzte Augen unmittelbar nach der Verletzung und 72 Stunden nach der Verletzung gezeigt. Ansichten werden als Querschnitte durch die Hornhaut (linke Seite) und Top-Down-Projektionsansichten der Hornhautoberfläche ( rechte Seite) angezeigt. Die Abbildung wurde mit Genehmigung von Snider et al.13angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative IOP-Ergebnisse für ASOC-Experimente. (A) IOP-Rohdaten für die ersten 72 h des ASOC-Aufbaus. Die Augen werden nach 72 h punktiert, so dass die ersten 3 Tage der Daten ausgewertet werden, um festzustellen, ob sich der IOD im akzeptablen IOD-Bereich (5-20 mmHg) stabilisiert. Aus den repräsentativen Ergebnissen gehen hervor, dass drei der fünf Augen innerhalb des akzeptablen IOD-Bereichs liegen, während eines den IOD zu hoch und eines den IOP zu niedrig hat (außerhalb des hervorgehobenen gelben Bereichs auf dem Diagramm). (B) Stabilisierter IOP für n = 50 ASOC-Setups aus früheren Experimenten, um die typische Erfolgsrate mit der ASOC-Methode zu demonstrieren. (C) IOP für unverletzte Augen im Vergleich zu drei verschiedenen OG-Verletzungsgrößen nach Verletzungsinduktion für 72 h. Der Verlust des IOP ist offensichtlich, ohne Anzeichen einer Erholung. (D) Ergebnisse des verletzten IOD im Vergleich zu Verletzungen, die mit einem Dermabond-Klebstoff behandelt wurden. Während die Fehlerrate hoch ist, da einige Augen versiegelt sind und andere nicht, kann die Methode Änderungen des IOD über den Zeitraum von 72 Stunden nach der Verletzung verfolgen. Die Figur wurde mit Genehmigung von Snider et al.13angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Es gibt kritische Schritte mit der ASOC OG-Verletzungsplattform, die hervorgehoben werden sollten, um die Erfolgswahrscheinlichkeit bei der Verwendung der Methodik zu verbessern. Erstens ist es während der Dissektion des vorderen Segments wichtig, das trabekuläre Geflecht zu erhalten, aber es ist schwierig, es richtig zu machen. Wenn das TM gestört ist, hält das Auge den physiologischen Druck nicht aufrecht und erfüllt nicht die Zulassungskriterien für die experimentelle Verwendung. Es wird empfohlen, den Dissektionsprozess zuerst unter normalen Bedingungen zu üben, anstatt die zusätzlichen Herausforderungen der aseptischen Technik einzuführen, bis die richtigen Dissektionen erreicht sind. Zweitens, wenn Sie die Augen in die ASOC-Schalen setzen, ist es unerlässlich, dass sie fest genug sind, um zu verhindern, dass Flüssigkeit austritt, aber locker genug, um eine Beschädigung des ASOC-Geschirrs zu verhindern. Wenn das Auge nicht fest gesichert ist, tritt Flüssigkeit durch nicht-physiologische Mittel aus dem Auge aus, was zu wenig oder keinem IOD führt. Der Klemmring, der das Auge nach unten hält, ist jedoch aus Kunststoff und kann bei zugezogenem Festen leicht gebrochen werden. Es ist wichtig, die Augen über 2 Tage festzuklemmen, da das Skleralgewebe unter dem Ring das Gewebe während der ersten 24 Stunden komprimiert und lockert. Es wird empfohlen, die Ringe so lange anzuziehen, bis an Tag 1 widerstand gegen das Anziehen zu spüren ist, und anschließend nach 24 Stunden in Kultur wieder auf ähnliche Werte zu ziehen, um beste Ergebnisse zu erzielen.
Drittens ist es wichtig, bei der Verwendung dieses Modells jederzeit vollständig zu verstehen, wohin der Flüssigkeitsfluss gerichtet ist. Jede ASOC-Schüssel ist mit mehreren Drei-Wege-Ventilen verbunden, um den Flüssigkeitsfluss aus der Spritzenpumpe oder dem 10-ml-Spritzenbehälter zu leiten und an Druckmessumformer anzuschließen. In verschiedenen Fällen des Setup-Prozesses müssen die Ventile so positioniert werden, dass luftblasen aus dem Auge gespült werden oder Druckaufnehmer vor Überdruck geschützt werden. Es sollte immer noch darauf geachtet werden, zu verstehen, was vor kritischen Protokollschritten jederzeit geöffnet / geschlossen ist. Schließlich ist die Aufrechterhaltung der Sterilität während des gesamten ASOC OG-Verletzungsprotokolls kritisch, aber leicht über den mehrstufigen, mehrtägigen Prozess zu verlieren. Perfusionsmedien enthalten hohe Mengen an Antibiotika und Antimykotika, um dies zu verhindern, und die Augen werden vor dem Einrichten in Betadin getaunken, um Kontaminationen zu verhindern, aber es gibt immer noch kritische Schritte, bei denen Fehler am wahrscheinlichsten sind. Vermeiden Sie während der Ersteinrichtung in der Schüssel den Kontakt mit den Augen, während Sie die Klemmringe festziehen, und halten Sie die Deckel bei Nichtgebrauch jederzeit auf dem Geschirr. Ein wahrscheinlicherer Expositionsschritt ist während der täglichen ASOC-Wartung. Es ist wichtig, diese Routineschritte in einer Biosicherheitswerkbank durchzuführen, auch wenn es scheint, dass sie schnell durchgeführt werden können, ohne die Augen aus dem Inkubator zu entfernen. Die sorgfältige Einhaltung des Protokolls und die Aufrechterhaltung einer guten aseptischen Technik sollten das Kontaminationsrisiko während der 6-tägigen ASOC-Experimente minimieren.
Insgesamt unterscheidet sich die ASOC OG-Verletzungsplattform aufgrund von zwei Schlüsselkriterien von anderen Methoden, die sich mit Open-Globe-Verletzungen befassen. Erstens ist die Verletzungsinduktionsmethode. Die verwendete pneumatische Hochgeschwindigkeitsverletzungsvorrichtung induziert Verletzungen mit einer hohen Kraftmenge. Dies ermöglicht es, Verletzungen bei Gegenständen zu verursachen, die weder besonders scharf noch mit einem kleinen Durchmesser sind. Dies ahmt Verletzungen, die unregelmäßig in der Form sind, genauer nach; Hochgeschwindigkeitssplitterverletzungen durch Sprengkörper30,31. Das pneumatische Gerät kann leicht mit unregelmäßig geformten Granatsplittern ausgestattet werden, die Objekte nachahmen, um Verletzungen zu erzeugen, die im Vergleich zu früheren Methoden mit Lasern, Nadeln oder Skalpellklingen schwieriger zu heilen sind, um saubere, präzise Verletzungsgeometrien zu erstellen32,33,34. Zweitens ermöglicht die ASOC-Methodik die Verfolgung des Verletzungsfortschritts und der therapeutischen Leistung über die anfängliche Verletzungsinduktion hinaus. In der zuvor entwickelten OG-Verletzungsplattform 10 ,11,12und war die Motivation für die Entwicklung dieses Protokolls, bis 72 h zu verfolgen, nicht möglich. Tatsächlich blieb die Zelllebensfähigkeit im Hornhautendothel für mindestens 1 Woche in ASOC13hoch. ASOC ist das einzige Mittel, um diese Langzeitcharakterisierung zu erreichen, ohne in kostspielige In-vivo-Experimente überzugehen.
Die Hauptanwendungen für die ASOC-Plattform sind zweifach. Erstens kann das Modell zur weiteren Charakterisierung von Verletzungen mit offenem Globus verwendet werden, insbesondere wenn man bedenkt, wie sie sich mit der Zeit ändern. In der vorherigen Studie wurden OG-Verletzungen auf diese Weise charakterisiert und die Wundheilung wurde über 72 h nach Verletzungbeobachtet 13. Die weitere Verfolgung verschiedener Verletzungsgrößen, -formen und -orte für 72 Stunden oder sogar länger in Bezug auf auftretende biologische Veränderungen wird kritische medizinische Entscheidungen beeinflussen, die nach OG-Verletzungen getroffen werden müssen. Bestimmte Verletzungsparameter können eine Selbstheilung durch die Hornhaut ermöglichen, oder andere Parameter können schwerwiegender sein, wenn der Eingriff nicht innerhalb der ersten 24 Stunden durchgeführt wird. Diese Informationen sind von unschätzbarem Wert für die Selektion von Patienten, wenn nur begrenzte medizinische Vorräte oder Evakuierungsressourcen verfügbar sind.
Zweitens kann die ASOC OG-Plattform für die Entwicklung und das Testen der Produktentwicklung verwendet werden. Für diese Anwendung kann die Organkulturplattform eine Reihe von Rollen ausfüllen. Während der anfänglichen Produktentwicklung können kürzere Zeitrahmen mit einer Reihe von Produktformulierungen getestet werden, um festzustellen, was am effektivsten ist. Das Organkultursystem kann mit zusätzlichen Spritzenpumpen für einen noch höheren Durchsatz für diese Anwendung konfiguriert werden, um über die zehn gleichzeitigen Experimente hinauszugehen, die mit dem hier beschriebenen System möglich sind. Für verfeinerte Produkte können längere Zeiträume ausgewertet werden, um die Leistung für 72 Stunden oder möglicherweise sogar länger zu bewerten. Schließlich kann eine Wundheilungsbewertung möglich sein, wenn biologisch aktive Produkte bewertet werden, die OG-Verletzungen dauerhaft behandeln können, anstatt eine vorübergehende Stabilisierung durchzuführen.
Es gibt jedoch Einschränkungen bei der ASOC OG-Plattform, die berücksichtigt werden sollten. Erstens, während das Modell eine längerfristige Beurteilung von Therapeutika ermöglicht, fehlt ihm das gesamte Gewebe des Auges außerhalb der hornhautkleralen Schale, wie die Iris und die Linse. Diese zusätzlichen Gewebe werden wahrscheinlich durch die OG-Verletzung beeinflusst und können eine Rolle beim Fortschreiten der Verletzung spielen. In ähnlicher Weise fehlen in einem isolierten vorderen Segment Immunantwortelemente, die beim Übergang vom ASOC-Modell zu nachfolgenden Tierversuchen einbezogen würden. Als nächstes ist das Modell nur geeignet, um Hornhaut-OG-Verletzungen und möglicherweise limbale OG-Verletzungen zu erzeugen. Sklerale oder hintere OG-Verletzungen können mit dieser Methode nicht induziert werden. Viele dieser Verletzungsarten führen jedoch zu einer Schädigung der Netzhaut, so dass ein vorübergehendes Stabilisierungstherapeutikum den Verlust des Sehvermögens wahrscheinlich nicht verhindert35,36. Schließlich wurden Verletzungen mit dem Modell bis zu 72 Stunden nach der Verletzung nur verfolgt. ASOC wurde in anderen Anwendungen innerhalb von 2 Wochen verwendet, so dass das Modell wahrscheinlich für diese Anwendungen verwendet werden kann, aber es wurde zu diesem Zeitpunkt nicht getestet37,38,39.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte. Die in diesem Artikel geäußerten Ansichten sind die des Autors /der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position des MEDIZINISCHEN Ministeriums der US-Armee, des Armeeministeriums, des Verteidigungsministeriums oder der US-Regierung wider.
Acknowledgments
Dieses Material basiert auf Arbeiten, die vom Verteidigungsministerium der Vereinigten Staaten durch eine behördenübergreifende Vereinbarung (#19-1006-IM) mit dem Temporary Corneal Repair Acquisition Program (United States Army Medical Materiel Development Agency) unterstützt werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
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