Summary
Las lesiones oculares de globo abierto pueden no tratarse durante varios días en escenarios rurales o militares relevantes, lo que resulta en ceguera. Se necesitan terapias para minimizar la pérdida de visión. Aquí, detallamos un modelo de lesión de globo abierto de cultivo de órganos. Con este modelo, las posibles terapias para estabilizar estas lesiones pueden evaluarse adecuadamente.
Abstract
Las lesiones de globo abierto tienen malos resultados visuales, lo que a menudo resulta en una pérdida permanente de la visión. Esto se debe en parte a un retraso prolongado entre las lesiones y la intervención médica en entornos rurales y aplicaciones de medicina militar donde la atención oftálmica no está fácilmente disponible. Las lesiones no tratadas son susceptibles a la infección después de que el ojo ha perdido su sello estanco, así como a la pérdida de viabilidad del tejido debido a la hipotensión intraocular. Las terapias para sellar temporalmente las lesiones del globo abierto, si se desarrollan adecuadamente, pueden restaurar la presión intraocular y prevenir la infección hasta que sea posible la atención oftálmica adecuada. Para facilitar el desarrollo del producto, aquí se detalla el uso de una plataforma de lesión de globo abierto de cultivo de órganos del segmento anterior para rastrear el rendimiento terapéutico durante al menos 72 h después de la lesión. El tejido del segmento anterior porcino se puede mantener en platos de cultivo de órganos diseñados a medida y mantenerse a presión intraocular fisiológica. Las lesiones por punción se pueden crear con un sistema neumático capaz de generar tamaños de lesión de hasta 4,5 mm de diámetro, similares a los tamaños de lesión relevantes para el ejército. La pérdida de presión intraocular se puede observar durante 72 h después de la lesión, lo que confirma la inducción adecuada de la lesión y la pérdida del sello estanco del ojo. El rendimiento terapéutico se puede rastrear mediante la aplicación al ojo después de la inducción de la lesión y luego el seguimiento de la presión intraocular durante varios días. Además, el modelo de lesión del segmento anterior es aplicable a los métodos ampliamente utilizados para el seguimiento funcional y biológico de la fisiología del segmento anterior, como la evaluación de la transparencia, la mecánica ocular, la salud del epitelio corneal y la viabilidad de los tejidos. En general, el método descrito aquí es un siguiente paso necesario hacia el desarrollo de terapias de biomateriales para sellar temporalmente las lesiones de globo abierto cuando la atención oftálmica no está fácilmente disponible.
Introduction
Las lesiones de globo abierto (OG) pueden resultar en una pérdida permanente de la visión cuando no se tratan o al menos se estabilizan después deuna lesión 1. Sin embargo, los retrasos prevalecen en áreas remotas donde el acceso a la intervención oftálmica no está fácilmente disponible, como en áreas rurales o en el campo de batalla en escenarios militares. Cuando el tratamiento no está fácilmente disponible, el estándar actual de atención es proteger el ojo con un escudo rígido hasta que sea posible la intervención médica. En medicina militar, este retraso es actualmente de hasta 24 h, pero se prevé que aumente hasta 72 h en futuras operaciones de combate en entornos urbanos donde no es posible la evacuación aérea2,3,4. Estos retrasos pueden ser aún más largos en aplicaciones civiles rurales y remotas donde el acceso a la intervención oftálmica es limitado5,6. Una lesión OG no tratada es altamente susceptible a la infección y la pérdida de presión intraocular (PIO) debido a que el sello estanco del ojo se ve comprometido7,8. La pérdida de PIO puede afectar la viabilidad del tejido, por lo que es poco probable que cualquier intervención médica restaure la visión si el retraso entre la lesión y la terapéutica es demasiado largo9.
Para permitir el desarrollo de terapias fáciles de aplicar para sellar lesiones OG hasta que se pueda llegar a un especialista oftálmico, se desarrolló previamente un modelo de lesión OG de sobremesa10,11. Con este modelo, se crearon lesiones de alta velocidad en ojos porcinos enteros, mientras que la PIO fue capturada por transductores de presión. La terapéutica se puede aplicar para evaluar su capacidad para sellar el sitio de la lesión OG12. Sin embargo, como este modelo utiliza ojos porcinos enteros, solo puede evaluar el rendimiento terapéutico inmediato sin forma de rastrear el rendimiento a largo plazo en la posible ventana de 72 horas en la que el terapéutico debe estabilizar el sitio de la lesión hasta que el paciente llegue a la atención especializada. Como resultado, se desarrolló un modelo de lesión OG de cultivo de órganos del segmento anterior (ASOC) y se detalló en este protocolo como plataforma para el seguimiento del rendimiento terapéutico a largo plazo13.
ASOC es una técnica ampliamente utilizada para mantener el tejido avascular del segmento anterior, como la córnea, durante varias semanas después de la enucleación14,15,16,17. El segmento anterior se mantiene bajo PIO fisiológica mediante la perfusión de líquido a caudales fisiológicos y la preservación de la región de salida de malla trabecular, el tejido responsable de regular la PIO, durante la configuración de ASOC18,19. La plataforma ASOC puede mantener el tejido fisiológicamente, inducir una lesión OG utilizando un dispositivo neumático, aplicar una terapéutica y rastrear la estabilización de la lesión durante al menos 72 h después dela lesión 13.
Aquí, el protocolo proporciona una metodología paso a paso para usar la plataforma ASOC. Primero detalla cómo configurar y fabricar la plataforma ASOC. A continuación, el protocolo detalla cómo diseccionar asépticamente el segmento anterior y mantener la malla trabecular, seguido de la configuración del tejido del segmento anterior en platos de cultivo de órganos personalizados. Luego, detalla cómo crear lesiones de globo abierto y aplicar terapias inmediatamente después de la lesión. Por último, el protocolo proporciona una visión general sobre los parámetros de caracterización que son posibles de usar con este método que evalúa las propiedades funcionales, mecánicas y biológicas del ojo y qué tan bien se estabilizó la lesión. En general, este modelo proporciona una plataforma muy necesaria para acelerar el desarrollo de productos para estabilizar y tratar lesiones de globo abierto y mejorar el mal pronóstico de la visión después de una lesión.
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Protocol
Antes de realizar este protocolo, tenga en cuenta que existen requisitos legales y éticos para el uso de animales en la investigación y el entrenamiento. Si se utilizan animales vivos para la fuente de tejido ocular, busque la aprobación de la autoridad ética o legal local (IACUC o Comité de ética, etc.) antes de comenzar. Si hay alguna duda en la obtención de la aprobación para el uso de animales, no proceda. Previamente determinamos e informamos que los ojos porcinos frescos obtenidos y utilizados dentro de las 24 h post mortem se compararon más cerca de la fisiología in vivo y les fue bien para estos estudios (Animal Technologies, Tyler, TX, USA)10,13. No se utilizaron animales vivos a lo largo de este protocolo, utilizando un proveedor de tejidos para obtener tejido dentro de las 24 h.
NOTA: Antes de la llegada del tejido, fabrique los platos de cultivo de órganos (Protocolo Suplementario 1), los anillos de sujeción (Protocolo Suplementario 1), los soportes para platos (Protocolo Suplementario 1), la configuración de recolección de datos del transductor de presión (Protocolo Suplementario 2) y la plataforma de punción neumática (Protocolo Suplementario 3). Esterilizar los platos, herramientas y suministros y preparar las áreas de trabajo. Es útil tener un área no estéril para realizar una disección gruesa en los ojos, ya que generalmente vienen con tejido conectivo y extra orbitario unido. Ejecute estos primeros pasos en una superficie de trabajo abierta y limpia, y luego transfiera los ojos asépticamente a un gabinete BSC II para microdesacción (gabinete # 1). De manera óptima, el gabinete BSC II utilizado para la microsección se separa del gabinete BSC II de ensamblaje de platos (gabinete # 2) para minimizar el flujo de aire y maximizar el espacio de trabajo. Configure el gabinete de microsección con un microscopio de disección y una forma de visualizar la superficie de trabajo (cámara u oculares que sobresalen del gabinete).
1. Pasos de esterilización, suministros (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) y configuración
- Prepare y esterilice con gas los siguientes artículos (1 kit para cada ojo): plato ASOC, anillo de sujeción, dos conectores fluídicos con juntas tóricas, dos cubos de aguja de 18 G, cuatro tornillos, dos longitudes de tubo PE-100 (la longitud de la distancia debe ser lo suficientemente larga como para extenderse desde el plato dentro de la incubadora hasta la bomba de jeringa y la configuración de recolección de datos del transductor de presión), dos bujes de aguja doblados de 18 G 90°, dos válvulas de 3 vías.
- Preparar y autoclave los siguientes kits.
- Prepare y autoclave el kit de instrumentos de microsección, que contiene un par de fórceps finos, un par de tijeras Vannas, un par de fórceps de dientes medianos, un par de tijeras grandes, hisopos de algodón y una hoja de afeitar o bisturí.
- Prepare y autoclave el kit de instrumentos de ensamblaje, que contiene un par de fórceps de dientes medianos, un par de tijeras quirúrgicas y una tecla L.
- Preparar y autoclave el kit diario (cantidad: uno por día de cultivo), que contiene una llave L para apretar los anillos de sujeción a los platos cada día según sea necesario.
- Autoclave cuatro picores de 100 ml para desinfectar y almacenar ojos y segmentos anteriores.
- Autoclave los objetos de punción.
- Reúna los siguientes artículos estériles: placa de Petri (1 plato/ojo), gasa (1-2/ojo), soporte para platos, jeringas de 20 ml (1/ojo), jeringas de 10 ml (1/ojo), filtros de jeringa de nylon (1/ojo).
- Preparar medios estériles: DMEM con 4% fbs, 1x glutamax, 1x gentamicina, 1x antibiótico-antimicótico (AA; aproximadamente 30-40 mL medios completos/ojo).
- Prepare AA-PBS: PBS con 1x AA (~500 mL).
- Prepare el paquete de herramientas de disección gruesa: limpie y seque las tijeras quirúrgicas grandes y las pórceps.
- Configure el espacio de trabajo de disección no estéril: reúna suministros del paquete de herramientas de disección gruesa, ojos porcinos enucleados sumergidos en PBS y en hielo, cortina quirúrgica, beaker de 100 ml con PBS. Coloque la cortina quirúrgica y los elementos necesarios para la disección macróstica.
- Configure el espacio de trabajo de disección estéril: Reúna suministros del kit de instrumentos de microdisección, gasa estéril, microscopio de disección, solución de betadina, PBS estéril, medios estériles, cuatro picores esterilizados de 100 ml, placa de Petri estéril. Transferencia aséptica al gabinete BSC II #1. Configure el gabinete para visualizar los ojos en el microscopio de disección.
- Configure el espacio de trabajo de ensamblaje de ASOC: Reúna kits esterilizados por gas (kit de platos y kit de tapa), kit de instrumentos de ensamblaje, medios estériles, soportes para platos, placas de Petri estériles, jeringas estériles y filtros de jeringa. Transferencia aséptica al gabinete BSC II # 2. Configure el gabinete para el montaje del plato.
- Cuando los ojos estén estabilizados y listos para la punción (72 h después de la configuración), transfiéralos asépticamente a un gabinete BSC II. Configure el espacio de trabajo de inducción de lesiones OG: dispositivo de inducción de lesiones con alimentación neumática (ensamblaje detallado en el Suplemento 3)y Lab Jack y vise de seguimiento cruzado para sostener el plato ASOC.
2. Disección de tejido
- Prepare el tejido porcino utilizando el espacio de trabajo de disección no estéril.
- Procure ojos porcinos enucleados de un matadero local, estudios de animales o vendedor. Mantenga los ojos en hielo sumergido en PBS durante el parto y úselo inmediatamente después de recibir.
- Cortar el tejido extraorbital y recortar la conjuntiva dejando sólo la cáscara corneoescleral y el nervio óptico. Realice la disección en condiciones no estériles con tijeras quirúrgicas grandes y pórceps en un paquete de herramientas de disección gruesa.
- Coloque los ojos de nuevo en PBS fresco sobre hielo hasta que todos los ojos necesarios para la configuración experimental hayan sido diseccionados preliminarmente / gruesos.
- Sumerja los ojos en una solución de betadina al 10% durante 2 min en recipientes cerrados y transfiéralos asépticamente al gabinete BSC II # 1. Realice todos los trabajos posteriores en condiciones estériles para minimizar las contaminaciones durante la configuración.
- Diseccionar estérilmente los segmentos anteriores.
- Después de 2 min en solución de betadina, transfiera los ojos a tres lavados en serie de AA-PBS estéril para eliminar el exceso de solución de betadina de la superficie ocular mientras se mantiene la esterilidad del tejido ocular. Después de tres lavados, mantenga el tejido en AA-PBS hasta su uso posterior.
- Hemisecte el ojo con una cuchilla de afeitar / bisturí y tijeras curvas. Coloque el ojo sobre una gasa empapada en AA-PBS y cree una incisión con una cuchilla de afeitar estéril o un bisturí cerca del ecuador del ojo (60/40 dividido con 40 en el lado anterior). Usando tijeras quirúrgicas curvas, hemisectar el ojo para aislar el ojo anterior (mitad corneal).
NOTA: El corte alrededor del segmento anterior debe ser continuo para evitar bordes irregulares y ásperos en la esclerótica que crearán fugas de líquido después de la configuración en el cultivo de órganos. - Use microscisores como una pala para extraer el humor vítreo del segmento anterior. Retire la lente del segmento anterior con microscisores. Deje los segmentos anteriores en AA-PBS hasta los pasos de disección adicionales.
NOTA: Todos los ojos que se diseccionarán se pueden mantener en este paso y uno por uno a través del resto del proceso de disección. - Con un microscopio de disección, corte el iris a la raíz del iris gradualmente, radialmente hasta que la malla trabecular (TM) sea visible. La MT es un tejido pigmentado que comprende fibras circunferencialmente orientadas alrededor de la cáscara corneoescleral. Los cortes cuidadosos en el iris hacia la raíz del iris expondrán la profundidad de la MT debajo del tejido.
- Corte 360° alrededor del iris a la misma profundidad que el corte inicial en el tejido para exponer toda la región TM. Limpie cualquier iris residual restante que cubra la MT según sea necesario.
- Recorte los restos del cuerpo ciliar posteriores a la MT, dejando solo una banda delgada de tejido posterior a la región de la MT (aproximadamente 1 mm).
- Coloque el segmento anterior diseccionado (AS) en el medio hasta su configuración adicional en ASOC en el gabinete BSC II # 2.
NOTA: Todos los ojos se pueden mantener en este punto antes de la configuración de ASOC si un solo usuario está realizando la disección y el ensamblaje de platos de cultivo de órganos.
3. Configuración de segmentos anteriores en platos de cultivo de órganos
- Coloque un solo AS en una placa de Petri con AS invertido (taza hacia arriba). Usando un hisopo de algodón, humedezca en el medio y aplique suavemente en el centro de la córnea para eliminar cualquier pigmento. Usando forzadores para sostener el ojo y el mismo hisopo, limpie el hisopo de algodón alrededor de la esclerótica para eliminar el pigmento adicional.
- Invierta el AS y colóquese en la parte superior de la parte inferior del plato sobre la región elevada, centrando la córnea sobre la región elevada del plato. Coloque el anillo de sujeción en la parte superior del AS recién colocado.
- Coloque cuatro tornillos en los orificios correspondientes para mantener el anillo en su lugar con el AS debajo del anillo. Apriete suavemente a mano los tornillos con la tecla L.
NOTA: El paso de apriete ocurrirá diariamente durante todo el experimento, por lo que el objetivo del apriete inicial aquí es garantizar que el medio no se filtre mientras se evita romper el anillo de sujeción. - Con un juego de placas de Petri estéril, coloque la parte superior sobre la placa e invierta la configuración. Coloque el soporte para platos. Conecte los conectores fluídicos con tóricas a los puertos roscados en la parte inferior del plato.
- A un conector fluídico, conecte un cubo de aguja doblada de 18 G 90 °, una longitud de tubo, un cubo de aguja de 18 G, un filtro de jeringa de nylon, una válvula de tres vías y una jeringa de 20 ml llena de medios.
- Al segundo conector fluídico, conecte un cubo de aguja doblada de 18 G y 90 ° grados, la longitud del tubo, un cubo de aguja de 18 G, una válvula de tres vías y la parte del barril de una jeringa estéril de 10 ml (esto actuará como un depósito para atrapar líquidos y burbujas del ASOC).
- Con válvulas de tres vías abiertas adecuadamente a las jeringas, empuje suavemente los medios a través del sistema utilizando el puerto del conector fluídico identificado en el paso 3.5 para inflar el AS, llenar los medios en el tubo y, finalmente, el depósito.
NOTA: Si el medio se filtra en el plato ASOC, el AS no está lo suficientemente bien asegurado con el anillo de sujeción. - Retire las burbujas empujando suavemente los medios dentro del plato e invirtiendo el plato para empujar las burbujas hacia afuera y hacia el depósito.
- Coloque el plato y párese erguido. Coloque la parte inferior de una placa de Petri debajo de los pies del soporte, con cuidado de no enredar el tubo.
4. Inicio del cultivo de órganos del segmento anterior
- ASOC ya está listo para la incubación. Coloque el plato ASOC en la incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% CO2). Asegúrese de que la altura del plato ASOC en la incubadora por encima de los transductores de presión sea conocida y contabilizada para calcular la PIO con precisión(Protocolo suplementario 4).
- Dirija las líneas de tubería a través de la parte inferior de la puerta de la incubadora de 37 ° C, 5% DE CO2 para que no interfieran con la apertura y el cierre de la puerta. Conecte la jeringa de 20 ml a la bomba de jeringa a 2,5 μL/min.
- Coloque la línea de tubería con el depósito en el instrumento del transductor de presión. Conecte la válvula lateral de 3 vías a la configuración del transductor de presión mientras fluye PBS a través de la línea para evitar que las burbujas de aire entren en las líneas de tubería.
NOTA: Vacíe el PBS de los reservorios después de configurar el sistema para reducir la probabilidad de contaminación del reservorio con crecimiento microbiano durante la duración del cultivo de órganos. - Inicie la recopilación de datos de IOP asegurándose primero de que una tarjeta microSD esté presente para guardar archivos de datos. A continuación, active la configuración del transductor de presión para comenzar la recopilación de datos.
NOTA: Los detalles para configurar el dispositivo de recolección de datos del transductor de presión se proporcionan en el Protocolo suplementario 2.
5. Mantenimiento diario de ASOC
- Después de que el ASOC haya tenido 24 h para equilibrar, retire los platos de la incubadora de 37 ° C, 5% de CO2 y colóquelos en el gabinete BSC II.
NOTA: En la adquisición de datos de presión, estos períodos de tiempo parecen picos a medida que los ASOC se retiran de la incubadora (cambio de altura) y se ajustan en el gabinete. - Compruebe si hay fugas debajo de cada plato en la placa de Petri. Si está presente, verifique si hay conexiones fluidas apretadas debajo del plato y vuelva a apretar si es necesario. Compruebe si hay fugas en la parte superior del plato con una llave L estéril para apretar los tornillos en el anillo de sujeción.
NOTA: El tejido de la esclerótica AS comprimirá y reducirá el grosor en 24 h, y el anillo de sujeción deberá apretarse. - Aspira bien los medios del plato.
NOTA: La malla trabecular está filtrando el fluido de los medios que se bombean al ASOC. Por lo tanto, los medios estarán presentes en el plato ASOC a lo largo de los bordes. - Repita los pasos 3.7 y 3.8 para eliminar las burbujas de aire atrapadas.
- Rellene las jeringas en las bombas de jeringa, asegúrese de que las bombas de jeringa estén funcionando y confirme la alineación de las válvulas para la perfusión en el ASOC. Devuelva el plato ASOC a la incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
NOTA: De manera óptima, estos pasos deben realizarse diariamente. Sin embargo, el uso de un volumen inicial de medios de 20 ml, el volumen del pozo del plato ASOC y una velocidad de bombeo de 2,5 μL / min debería ser suficiente para permitir que el sistema funcione durante varios días sin ser molestado.
6. Inducción de lesiones OG con dispositivo de punción neumático
NOTA: La construcción del dispositivo de punción neumática se detalla en el Protocolo Suplementario 3. Las lesiones de OG se inducen después de que la PIO se ha estabilizado, lo que normalmente ocurre después de 3 días en cultivo. Los valores aceptables de PIO son de 5-20 mmHg basados en la PIO fisiológica, que se puede determinar evaluando los archivos de datos de PIO o estableciendo indicadores LED en el sistema de medición de presión como se describe en el Protocolo Suplementario 2.
- Prepare el gabinete BSC II para la inducción de lesiones OG como se detalla en el paso 1.10. Conecte la plataforma de punción a una línea de aire comprimido. Coloque el objeto de punción estéril en el mandril.
NOTA: Se puede usar un compresor de aire para alimentar el dispositivo, pero el aire comprimido del tanque o las líneas de laboratorio incorporadas pueden ser suficientes si la presión es superior a 50 psi. - Ajuste el regulador de presión en la plataforma de punción a 50 psi para una fuerza de punción adecuada en objetos de hasta 4,5 mm de diámetro. Coloque la vise de seguimiento cruzado en el conector de laboratorio frente a la plataforma de punción para sostener el plato ASOC durante la inducción de lesiones.
- Retire la configuración ASOC de la incubadora de 37 °C, 5% de CO2, y colóquela en la vise de seguimiento cruzado perpendicular a la plataforma de punción (Figura 2) después de quitar la tapa y dejarla a un lado. Mantenga el segmento anterior perfundiendo, pero cierre el puerto de la válvula de 3 vías al transductor de presión para evitar daños por sobrepresión en el transductor.
- Extienda el brazo del pistón a su distancia máxima y coloque el ápice corneal dentro de 1 mm del objeto de punción. Retraiga el brazo del pistón y acerque el segmento anterior 1 cm al objeto punzante.
NOTA: Esta distancia se ha optimizado para la inducción de lesiones de alta eficiencia sin golpear el plato ASOC. - Encienda el dispositivo de punción encendándolo y abriendo la válvula solenoide con el segundo interruptor del dispositivo. Para retraer el dispositivo, presione el segundo interruptor nuevamente para quitar el dispositivo de punción del ojo. Verifique la inducción adecuada de lesiones mediante inspección visual y fugas de medios del sitio de la lesión.
- Retire el plato ASOC de la visera; vuelva a colocar la tapa en el conjunto del plato y abra la línea fluídica al transductor de presión. Vuelva a colocar el ASOC en la incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
NOTA: En este punto, la terapéutica se puede aplicar a la EA para evaluar su eficacia para sellar las lesiones OG.
7. Eliminación de ASOC de la cultura
NOTA: Dependiendo del análisis de punto final (consulte Resultados representativos para posibles métodos de punto final), el AS debe permanecer en el plato ASOC inflado, mientras que otros métodos requieren tejido AS aislado de la cámara de cultivo. La siguiente metodología describe cómo sacar as de los platos de cultivo de órganos y eliminar el resto de la configuración.
- Retire los platos ASOC de la incubadora de 37 °C, 5% DE CO2. Cierre la válvula de 3 vías a la jeringa y al depósito y desconecte la tubería del sistema. Deseche la jeringa, el depósito y el filtro. Coloque las válvulas de 3 vías, los tubos y los cubos de agujas en un recipiente separado para lavarlos y esterilizarlos.
- Desconecte los cubos de aguja de las conexiones fluídicas en la parte inferior del plato. Desenrosca los conectores fluídicos y las tóricas. Coloque todos los artículos en un recipiente para lavarlos y esterilizarlos.
- Retire los cuatro tornillos del anillo de sujeción con la tecla L. Retire con cuidado el anillo de sujeción.
- Usando forrceps, retire el AS del plato y, dependiendo del análisis final y la imagen, colóquelo en un fijador o en los desechos de riesgo biológico apropiados.
8. Análisis de datos de la PIO
- Conecte la tarjeta microSD a un ordenador para extraer el archivo .txt que contiene datos de la ejecución experimental más reciente.
NOTA: El archivo tiene un nombre en el código que controla el microcontrolador y debe actualizarse para cada experimento (consulte Protocolo suplementario 2). - Importe los datos a una hoja de cálculo.
- Organice los datos en 12 columnas: Tiempo (en min) y señal de mV para cada uno de los 11 canales del transductor de presión. Los primeros diez canales corresponden a diez configuraciones experimentales ASOC. La señal final del transductor es para un sensor abierto al aire como un canal de control para confirmar que la señal mV no se alteró debido a cambios en la señal de entrada. Trazar el canal de control versus el tiempo para confirmar que la señal mV fue consistente en todo momento.
- Convertir las señales mV para diez canales en mmHg utilizando ecuaciones de intersección de pendiente generadas a partir de la calibración inicial de cada sensor (ver Protocolo Suplementario 4).
- Trazar el tiempo (convertir en días para simplificar la interpretación de datos) frente a cada uno de los diez canales para determinar cómo fluctuó la PIO a lo largo del curso de tiempo experimental.
- Determine los valores promedio de la PIO en los puntos clave de los datos para comparar más fácilmente los valores entre cada uno y cómo se alteran antes y después de la inducción de la lesión OG. Promedio de 2-3 h de datos para cada intervalo de 24 h para determinar la PIO en cada día de ASOC.
NOTA: Los resultados representativos de la PIO se muestran en la Figura 4.
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Representative Results
Las imágenes capturadas a través de la tomografía de coherencia óptica (OCT) se muestran para los ojos lesionados OG para ilustrar cómo se ve una inducción de lesión exitosa. La Figura 3 muestra imágenes para el control y el tejido AS lesionado por OG inmediatamente después de la lesión y 72 h después. Se muestran dos vistas: imágenes transversales a través del sitio de la lesión y proyección de intensidad máxima (MIP) de arriba hacia abajo para visualizar el área de superficie de la imagen. Los ojos de control no muestran una interrupción notable en la córnea, mientras que se pueden localizar lesiones claras que atraviesan toda la córnea después de la lesión OG. A partir de los MIP, es evidente que las lesiones son irregulares en forma y tamaño, pero el tamaño de la lesión disminuye en 72 h. Anteriormente, este efecto ha demostrado ser significativo para una serie de tamaños de lesión probados13.
La salida de datos primarios para el modelo de lesión OG descrito en este protocolo es la presión intraocular en el transcurso de la configuración experimental. Los datos se registran en unidades de milivoltios como una salida de cada transductor de presión que se puede convertir en mmHg a través de la calibración(Protocolo suplementario 4). Ejemplo de datos de PIO vs el curso de tiempo experimental se proporciona para los ojos que se consideran aceptables y otros que no se considerarían utilizables(Figura 4A). A partir de los datos de seguimiento de presión, los ojos se unieron a los sensores después de 24 h en cultivo, pero la PIO continúa fluctuando durante las primeras 72 h en cultivo. La PIO fisiológica para el tejido de AS en cultivo de órganos es de aproximadamente 8-10 mmHg, por lo que se decidió el rango de 2x y 1/2x como una puerta para los valores de PIO utilizables después de que los valores se hayan estabilizado (5-20 mmHg). Solo los ojos que estuvieran en ese rango estarían permitidos para su uso con el resto del protocolo. A partir de experimentos anteriores, tuvimos una tasa de éxito del 90% que se logró en la configuración de ASOC para que los ojos se estabilizaran en el rango requerido(Figura 4B).
También se proporcionan los resultados de cómo cambia la PIO debido a la lesión de OG y la intervención terapéutica(Figura 4C,D). Después de la inducción de la lesión OG, la presión debe disminuir significativamente y permanecer de esa manera hasta que el tejido se elimine de ASOC(Figura 4C). Si un ojo después de la inducción de la lesión no disminuye en presión, esto indica que no se indujo una lesión exitosa, ya que la PIO debe reducirse si el sello estanco del ojo está comprometido. Sin embargo, los tamaños de lesión más pequeños pueden autocurarse, lo que podría resultar en la restauración de la PIO. Si se aplica terapia al ojo después de la inducción de la lesión OG, la restauración de la PIO se puede rastrear durante asOC. Este concepto se demuestra con datos que muestran un adhesivo Dermabond aplicado a lesiones OG de 2,4 mm (Figura 4D). Se muestran los resultados promedio de cinco experimentos ASOC separados con y sin terapia y es evidente que la terapéutica está aumentando la PIO. Este método puede medir la eficacia de la terapéutica para restaurar la PIO y rastrear si esa presión se restaura en las 72 h clave posteriores a la lesión OG.
Además, el protocolo ASOC es adaptable para su uso con una amplia gama de puntos finales de caracterización para cumplir con los requisitos experimentales del usuario final. Durante el cultivo, los medios de salida que salen del ojo se pueden recolectar diariamente o incluso cada hora, lo que se puede utilizar para rastrear los cambios en el nivel de proteína que ocurren durante ASOC, después de la inducción de la lesión OG o después de la aplicación terapéutica. Por ejemplo, la cimagrafía de gelatina se ha realizado previamente para detectar los niveles de metaloproteinasa de la matriz para rastrear la cicatrización de heridas y la remodelación de tejidos20. Otros criterios de valoración biológicos son posibles después de extraer el tejido del cultivo a través de métodos tradicionales de inmunohistoquímica para evaluar la viabilidad del tejido21,22, seguimiento de los cambios fisiopatológicos en la córnea23,24, o tinción basada en anticuerpos para cualquier proteína de interés25,26.
Las métricas corneales funcionales también se pueden obtener de los ojos mantenidos en ASOC. La integridad del epitelio corneal se puede evaluar a través de una tinción ocular de fluoresceína y la adquisición de imágenes utilizando una fuente de luz azul27,28. Después de la eliminación del cultivo, el tejido corneal puede evaluarse para determinar su transparencia a través de la adquisición simple deimágenes 13. Las imágenes oculares tradicionales también se pueden realizar para evaluar la estructura del tejido con o sin intervención terapéutica. Las imágenes de OCT, como se muestra en la Figura 3,pueden crear imágenes transversales a través de la córnea y se pueden capturar de forma no invasiva, lo que potencialmente permite la recopilación de imágenes mientras se mantiene el tejido en cultivo. Otras modalidades de imagen como la microscopía con lámpara de hendidura, el ultrasonido o la microscopía confocal in vivo también se pueden adaptar para adquirir información anatómica adicional.
Por último, se puede capturar la evaluación de las propiedades mecánicas del segmento anterior para comprender el efecto de la lesión OG o la terapéutica posterior en el tejido subyacente. Si bien la recopilación de datos de IOP por sí sola destaca cómo la integridad del sello estanco del ojo se ha visto comprometida, hemos demostrado previamente que se pueden medir métricas de prueba adicionales para descubrir características mecánicas adicionales10,11. El cumplimiento ocular, una propiedad mecánica agrupada que describe cómo cambia la presión intraocular debido a la inflación (cambio en el volumen / cambio en la presión), se puede medir con una bomba de jeringa para inyectar pequeños volúmenes repentinos de líquido en el ojo y registrar el aumento de presión resultante con un transductor de presión. Un mayor cumplimiento indica que el tejido es menos rígido y se puede usar para rastrear cómo las propiedades del material terapéutico difieren del tejido corneal subyacente. La tasa de fuga del ojo o de una instalación de salida tradicional se puede medir y calcular para determinar el caudal fluídico preciso que sale del ojo por unidad de presión20,29. Por último, con respecto a las pruebas terapéuticas, la presión de estallido se puede medir para determinar la presión máxima que el ojo puede mantener antes de la falla terapéutica. Esto se puede usar para comparar el rendimiento con los ojos ilesos o para realizar un seguimiento de los cambios en el rendimiento con el tiempo12,13.
Figura 1: Diagrama de la configuración de ASOC. Los ojos se mantienen en platos de cultivo de órganos hechos a medida y se mantienen en su lugar con un anillo de sujeción. El medio ASOC se infunde a través de una bomba de jeringa a través de la válvula A y se conecta a un transductor de presión, y la posterior adquisición de datos con la válvula B. Los puertos abiertos en cada válvula se resaltan en azul, mientras que el amarillo indica canales cerrados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción general de la configuración de lesiones OG. (A) Configuración del dispositivo de lesiones con alimentación neumática. De izquierda a derecha, el aire comprimido se introduce en el dispositivo a través de una línea de aire comprimido, que pasa a través de un regulador para establecer la presión a 50 psi según lo medido por el manómetro. Dos válvulas solenoides están conectadas a un actuador lineal para dirigir la expansión / retracción del mandril de perforación que sostiene el objeto de punción. Vise se coloca frente al dispositivo de punción para mantener el ojo en la posición adecuada x, y, z. (B)El ASOC representativo se coloca delante del dispositivo de inducción de lesiones. Más detalles del dispositivo y su construcción se detallan en el Protocolo Suplementario 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:Imágenes de tomografía de coherencia óptica de experimentos de lesiones ASOC OG. Las imágenes se muestran para los ojos de control (ilesos) y los ojos lesionados OG inmediatamente después de la lesión y 72 h después de la lesión. Las vistas se muestran como secciones transversales a través de la córnea(lado izquierdo)y vistas de proyección de máxima intensidad de arriba hacia abajo de la superficie corneal(lado derecho). La figura ha sido adaptada con permiso de Snider et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de IOP para experimentos ASOC. (A) Datos de IOP sin procesar para las primeras 72 h de configuración de ASOC. Los ojos se perforan a las 72 h, por lo que se evalúan los primeros 3 días de datos para determinar si la PIO se estabiliza en el rango aceptable de PIO (5-20 mmHg). A partir de los resultados representativos, tres de los cinco ojos caen dentro del rango de PIO aceptable, mientras que uno tiene PIO demasiado alta y uno tiene PIO demasiado baja (cayendo fuera de la región amarilla resaltada en la gráfica). (B) PIO estabilizada para n = 50 configuraciones ASOC de experimentos anteriores para demostrar la tasa de éxito típica con el método ASOC. (C) PIO para ojos no lesionados en comparación con tres tamaños diferentes de lesión OG después de la inducción de la lesión durante 72 h. La pérdida de PIO es evidente, sin signos de recuperación. (D) Resultados de PIO lesionada en comparación con lesiones tratadas con un adhesivo Dermabond. Si bien la tasa de error es alta debido a que algunos ojos están sellados y otros no, el método puede rastrear los cambios en la PIO durante el período de 72 h después de la lesión. La figura ha sido adaptada con permiso de Snider et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay pasos críticos con la plataforma de lesiones ASOC OG que deben destacarse para mejorar la probabilidad de éxito al usar la metodología. En primer lugar, durante la disección del segmento anterior, preservar la malla trabecular es esencial pero difícil de hacer correctamente. Si la MT se interrumpe, el ojo no mantendrá la presión fisiológica y no cumplirá con los criterios de elegibilidad para el uso experimental. Se recomienda practicar primero el proceso de disección en condiciones normales en lugar de introducir los desafíos adicionales de la técnica aséptica hasta que se obtengan las disecciones adecuadas. En segundo lugar, al colocar los ojos en los platos ASOC, es imperativo que estén lo suficientemente apretados como para evitar que el líquido se filtre, pero lo suficientemente sueltos como para evitar dañar los platos ASOC. Si el ojo no está bien asegurado, el líquido se filtrará del ojo a través de medios no fisiológicos, lo que resultará en poca o ninguna PIO. Sin embargo, el anillo de sujeción que sujeta el ojo hacia abajo es de plástico y se puede romper fácilmente si se apreta en exceso. Es esencial sujetar los ojos hacia abajo durante 2 días, ya que el tejido escleral debajo del anillo comprimirá y aflojará el tejido durante las primeras 24 h. Se recomienda apretar los anillos justo hasta que se sienta resistencia al apriete el día 1 y seguir esto volviendo a apretar a niveles similares después de 24 h en cultivo para obtener mejores resultados.
En tercer lugar, es fundamental comprender completamente hacia dónde se dirige el flujo de fluidos en todo momento cuando se utiliza este modelo. Cada plato ASOC está conectado a múltiples válvulas de tres vías para dirigir el flujo de fluido desde la bomba de jeringa o el depósito de jeringa de 10 ml y conectarse a los transductores de presión. Las diferentes instancias del proceso de configuración requieren que las válvulas se coloquen de tal manera que eliminen las burbujas de aire del ojo o para proteger los transductores de presión de la sobrepresión. Aún se debe tener cuidado de comprender qué es abrir / cerrar en todo momento antes de los pasos críticos del protocolo. Por último, mantener la esterilidad a lo largo del protocolo de lesiones ASOC OG es crítico, pero fácil de perder en el proceso de varios pasos y varios días. Los medios de perfusión contienen altos niveles de antibióticos y antimicóticos para prevenir esto, y los ojos se sumergen en betadina antes de configurarse para prevenir contaminaciones, pero todavía hay pasos críticos donde es más probable que se cometan errores. Durante la configuración inicial en el plato, evite el contacto con los ojos mientras aprieta los anillos de sujeción en su lugar y mantenga los párpados en los platos en todo momento cuando no esté en uso. Un paso de exposición más probable es durante el mantenimiento diario de ASOC. Es importante hacer estos pasos de rutina en un gabinete de bioseguridad, incluso si parece que se pueden lograr rápidamente sin quitar los ojos de la incubadora. Seguir cuidadosamente el protocolo y mantener una buena técnica aséptica debe minimizar los riesgos de contaminación en los experimentos ASOC de 6 días.
En general, la plataforma de lesiones ASOC OG es única de otras metodologías que analizan las lesiones de globo abierto debido a dos criterios clave. El primero es el método de inducción de lesiones. El dispositivo de lesión neumática de alta velocidad utilizado induce lesiones con una alta cantidad de fuerza. Esto permite inducir lesiones con objetos que no son especialmente afilados ni con un diámetro pequeño. Esto imita más de cerca las lesiones que son de forma irregular; lesiones por metralla de alta velocidad resultantes de artefactos explosivos30,31. El dispositivo neumático puede equiparse fácilmente con objetos que imitan la metralla de forma irregular para crear lesiones más difíciles de curar en comparación con los métodos anteriores que utilizan láseres, agujas o cuchillas de bisturí para crear geometrías de lesiones limpias y precisas32,33,34. En segundo lugar, la metodología ASOC permite rastrear el progreso de la lesión y el rendimiento terapéutico más allá de la inducción inicial de la lesión. Ser capaz de rastrear a 72 h no era posible en la plataforma de lesiones OG de sobremesa desarrollada previamente10,11,12 y fue la motivación detrás del desarrollo de este protocolo. De hecho, la viabilidad celular se mantuvo alta en el endotelio corneal durante al menos 1 semana en ASOC13. ASOC es el único medio que esta caracterización a largo plazo se puede lograr sin pasar a costosos experimentos in vivo.
Las principales aplicaciones para la plataforma ASOC son dobles. En primer lugar, el modelo se puede utilizar para caracterizar aún más las lesiones de globo abierto, especialmente teniendo en cuenta cómo cambian con el tiempo. En el estudio anterior, las lesiones OG se caracterizaron de esta manera y la cicatrización de heridas se observó más de 72 h después dela lesión 13. Un seguimiento adicional de los diferentes tamaños de lesiones, formas, ubicaciones durante 72 h o incluso más con respecto a los cambios biológicos que ocurren informará las decisiones médicas críticas que deben tomarse después de las lesiones de OG. Ciertos parámetros de lesión pueden permitir la autocuración por la córnea, u otros parámetros pueden ser más graves si la intervención no se aplica dentro de las primeras 24 h. Esta información será invaluable para clasificar a los pacientes cuando haya suministros médicos limitados o recursos de evacuación disponibles.
En segundo lugar, la plataforma ASOC OG se puede utilizar para desarrollar y probar el desarrollo de productos. Para esta aplicación, la plataforma de cultivo de órganos puede desempeñar una serie de funciones. Durante el desarrollo inicial del producto, se pueden probar marcos de tiempo más cortos con una gama de formulaciones de productos para determinar qué es lo más efectivo. El sistema de cultivo de órganos se puede configurar para un alto rendimiento aún mayor para esta aplicación con bombas de jeringa adicionales para ir más allá de los diez experimentos simultáneos posibles con el sistema detallado aquí. Para productos más refinados, se pueden evaluar puntos de tiempo más largos para evaluar el rendimiento durante 72 h o potencialmente incluso más. Por último, la evaluación de la cicatrización de heridas puede ser posible cuando se evalúan productos biológicamente activos que pueden tratar permanentemente las lesiones OG en lugar de la estabilización temporal.
Sin embargo, existen limitaciones con la plataforma ASOC OG que deben tenerse en cuenta. En primer lugar, si bien el modelo permite una evaluación a más largo plazo de la terapéutica, falta todo el tejido del ojo fuera de la cáscara corneoescleral, como el iris y el cristalino. Es probable que estos tejidos adicionales estén influenciados por la lesión OG y pueden desempeñar un papel en la progresión de la lesión. Del mismo modo, a un segmento anterior aislado le faltan elementos de respuesta inmune que se incluirían al pasar del modelo ASOC a las pruebas posteriores en animales. A continuación, el modelo solo es adecuado para crear lesiones OG corneales y lesiones OG potencialmente limbales. Las lesiones esclerales o posteriores de OG no se pueden inducir con este método. Sin embargo, muchos de estos tipos de lesiones resultan en daño a la retina, por lo que cualquier estabilización terapéutica temporal es poco probable que prevenga la pérdida de visión35,36. Por último, las lesiones con el modelo a 72 h después de la lesión solo se rastrearon. ASOC se ha utilizado en otras aplicaciones hasta 2 semanas, por lo que el modelo probablemente se puede utilizar para estas aplicaciones, pero no se ha probado en este momento37,38,39.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos. Las opiniones expresadas en este artículo son las del autor (s) y no reflejan la política o posición oficial del Departamento Médico del Ejército de los Estados Unidos, el Departamento del Ejército, el Departamento de Defensa o el Gobierno de los Estados Unidos.
Acknowledgments
Este material se basa en el trabajo apoyado por el Departamento de Defensa de los Estados Unidos a través de un acuerdo interinstitucional (# 19-1006-IM) con el programa de adquisición de Reparación Corneal Temporal (Agencia de Desarrollo de Material Médico del Ejército de los Estados Unidos).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
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