Summary
Lesões oculares de globo aberta podem ficar sem tratamento por vários dias em cenários rurais ou militares relevantes, resultando em cegueira. Terapêuticas são necessárias para minimizar a perda de visão. Aqui, detalhamos um modelo de lesão de globo aberto da cultura de órgãos. Com este modelo, a terapêutica potencial para estabilização dessas lesões pode ser devidamente avaliada.
Abstract
Lesões em globos abertos têm resultados visuais ruins, muitas vezes resultando em perda permanente de visão. Isso se deve, em parte, a um prolongado atraso entre lesão e intervenção médica em ambientes rurais e aplicações de medicamentos militares onde o atendimento oftalmológico não está prontamente disponível. Lesões não tratadas são suscetíveis à infecção depois que o olho perdeu sua vedação impermeável, bem como a perda de viabilidade tecidual devido à hipotensão intraocular. A terapêutica para selar temporariamente lesões de globo aberta, se devidamente desenvolvidas, pode ser capaz de restaurar a pressão intraocular e prevenir a infecção até que o cuidado oftalmológico adequado seja possível. Para facilitar o desenvolvimento do produto, detalhado aqui está o uso de uma plataforma de lesão aberta de órgãos do segmento anterior para rastrear o desempenho terapêutico por pelo menos 72 h após a lesão. O tecido do segmento anterior suíno pode ser mantido em pratos de cultura de órgãos personalizados e mantido sob pressão intraocular fisiológica. Lesões por punção podem ser criadas com um sistema pneumático capaz de gerar tamanhos de lesões de até 4,5 mm de diâmetro, semelhante ao tamanho de lesões relevantes para os militares. A perda de pressão intraocular pode ser observada por 72 h após a lesão, confirmando a indução adequada da lesão e a perda do selo impermeável do olho. O desempenho terapêutico pode ser rastreado por aplicação ao olho após a indução da lesão e, em seguida, rastreamento da pressão intraocular por vários dias. Além disso, o modelo de lesão do segmento anterior é aplicável a métodos amplamente utilizados para o rastreamento funcional e biologicamente da fisiologia do segmento anterior, como avaliação da transparência, mecânica ocular, saúde do epitélio córnea e viabilidade tecidual. No geral, o método descrito aqui é um próximo passo necessário para o desenvolvimento de terapêuticas biomateriais para selar temporariamente lesões de globo aberta quando o cuidado oftálmico não estiver prontamente disponível.
Introduction
Lesões de globo aberta (OG) podem resultar em perda permanente de visão quando não tratadas ou pelo menos estabilizadas após lesão1. Os atrasos, no entanto, são prevalentes em áreas remotas onde o acesso à intervenção oftalmómica não está prontamente disponível, como em áreas rurais ou no campo de batalha em cenários militares. Quando o tratamento não está prontamente disponível, o padrão atual de cuidado é proteger o olho com um escudo rígido até que a intervenção médica seja possível. Na medicina militar, esse atraso atualmente é de até 24 horas, mas a previsão é de aumento de até 72 horas em futuras operações de combate em ambientes urbanos onde a evacuação aérea não é possível2,3,4. Esses atrasos podem ser ainda maiores em aplicações civis rurais e remotas, onde o acesso à intervenção oftálmica é limitado5,6. Uma lesão OG não tratada é altamente suscetível à infecção e perda de pressão intraocular (IOP) devido à vedação impermeável do olho estar comprometida7,8. A perda de IOP pode impactar a viabilidade tecidual, tornando improvável qualquer intervenção médica para restaurar a visão se o atraso entre lesão e terapêutica for muito longo9.
Para permitir o desenvolvimento de terapêuticas fáceis de aplicar para vedação de lesões OG até que um especialista oftálmico possa ser alcançado, um modelo de lesão de OG no topo do banco foi previamente desenvolvido10,11. Com este modelo, lesões de alta velocidade foram criadas em olhos suínos inteiros, enquanto o IOP foi capturado por transdutores de pressão. A terapêutica pode então ser aplicada para avaliar sua capacidade de selar o local da lesão de OG12. No entanto, como este modelo utiliza olhos suínos inteiros, ele só pode avaliar o desempenho terapêutico imediato sem nenhuma maneira de acompanhar o desempenho a longo prazo através da possível janela de 72h em que o terapêutico deve estabilizar o local da lesão até que o paciente atinja o atendimento especializado. Como resultado, um modelo de lesão OG de cultura de órgãos do segmento anterior (ASOC) foi desenvolvido e detalhado neste protocolo como uma plataforma para acompanhamento do desempenho terapêutico de longo prazo13.
O ASOC é uma técnica amplamente utilizada para a manutenção do tecido avascular do segmento anterior, como a córnea, para várias semanas pós-enucleação14,15,16,17. O segmento anterior é mantido sob IOP fisiológico por perfusar o fluido nas taxas de fluxo fisiológico e preservar a região de saída da malha trabecular, o tecido responsável pela regulação do IOP, durante a configuração ASOC18,19. A plataforma ASOC pode manter o tecido fisiologicamente, induzir uma lesão OG usando um dispositivo pneumático, aplicar uma estabilização terapêutica e de lesão de pista por pelo menos 72 h pós-lesão13.
Aqui, o protocolo fornece uma metodologia passo a passo para o uso da plataforma ASOC. Primeiro, detalha como configurar e fabricar a plataforma ASOC. Em seguida, o protocolo detalha como dissecar asepticamente o segmento anterior e manter o trabalho de malha trabecular, seguido pela criação de tecido de segmento anterior em pratos de cultura de órgãos personalizados. Em seguida, detalha como criar lesões de globo aberto e aplicar terapêutica imediatamente após a lesão. Por fim, o protocolo fornece uma visão geral sobre parâmetros de caracterização que são possíveis de usar com este método que avalia as propriedades funcionais, mecânicas e biológicas do olho e quão bem a lesão foi estabilizada. No geral, este modelo fornece uma plataforma muito necessária para acelerar o desenvolvimento de produtos para estabilizar e tratar lesões de globo aberta e melhorar o prognóstico de visão ruim após a lesão.
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Protocol
Antes de realizar este protocolo, esteja ciente de que existem requisitos legais e éticos para o uso de animais em pesquisa e treinamento. Se animais vivos forem usados para a fonte de tecido ocular, procure aprovação da autoridade ética ou legal local (IACUC ou Comitê de Ética, etc.) antes de começar. Se houver alguma dúvida na obtenção de aprovação para o uso de animais, não prossiga. Determinamos e relatamos anteriormente que os olhos suínos frescos obtiveram e foram usados dentro de 24 horas após a morte em comparação com a fisiologia in vivo e se saíram bem para esses estudos (Tecnologias Animais, Tyler, TX, EUA)10,13. Nenhum animal vivo foi utilizado ao longo deste protocolo, utilizando um fornecedor de tecidos para obter tecido dentro de 24 horas.
NOTA: Antes da chegada dos tecidos, forja os pratos de cultura de órgãos(Protocolo Suplementar 1),anéis de fixação(Protocolo Suplementar 1),estandes de pratos(Protocolo Suplementar 1),configuração de coleta de dados transdutores de pressão(Protocolo Suplementar 2)e plataforma de punção pneumática(Protocolo Suplementar 3). Esterilize os pratos, ferramentas e suprimentos e prepare as áreas de trabalho. É útil ter uma área não estéril para realizar dissecção grosseira nos olhos, pois eles geralmente vêm com tecido orbital extra conectado. Execute estes primeiros passos em uma superfície de trabalho aberta e limpa e, em seguida, transfira os olhos aseptamente para um gabinete BSC II para micro-dissecção (gabinete #1). Idealmente, o gabinete BSC II utilizado para microdiscção é separado do gabinete BSC II (gabinete nº 2) para minimizar o fluxo de ar e maximizar o espaço de trabalho. Configure o armário de micro dissecção com um microscópio dissecando e uma maneira de visualizar a superfície de trabalho (câmera ou oculares salientes do armário).
1. Etapas de esterilização, suprimentos (ver Tabela de Materiais para obter mais detalhes) e configuração
- Preparar e esterilizar a gás os seguintes itens (1 kit para cada olho): prato ASOC, anel de fixação, dois conectores fluidos com anéis O, dois cubos de agulha de 18 G, quatro parafusos, dois comprimentos de tubo PE-100 (comprimento de distância deve ser longo o suficiente para estender do prato dentro da incubadora até a bomba de seringa e configuração de coleta de dados transdutores de pressão), dois hubs de agulha dobradas de 18 G 90°, duas válvulas de 3 vias.
- Prepare e autoclave os seguintes kits.
- Prepare e autoclave o kit de instrumentos de microdiscção, contendo um par de fórceps finos, um par de tesouras Vannas, um par de fórceps dentuças médias, um par de tesouras grandes, cotonetes de algodão, e uma lâmina de barbear ou bisturi.
- Prepare e autoclave o kit de instrumentos de montagem, contendo um par de fórceps dentados médios, um par de tesouras cirúrgicas e uma chave L.
- Prepare e autoclave o kit diário (quantidade: um por dia de cultura), contendo uma chave L para apertar anéis de fixação em pratos todos os dias, conforme necessário.
- Autoclave quatro béquers de 100 mL para desinfetar e armazenar olhos e segmentos anteriores.
- Autoclave os objetos de punção.
- Reúna os seguintes itens estéreis: placa de Petri (1 prato/olho), gaze (1-2/olho), suporte para pratos, seringas de 20 mL (1/olho), seringas de 10 mL (1/olho), filtros de seringa de nylon (1/olho).
- Prepare a mídia estéril: DMEM com 4% de FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicina, 1x Antibiótico-Antimycotico (AA; aproximadamente 30-40 mL mídia completa/olho).
- Prepare AA-PBS: PBS com 1x AA (~500 mL).
- Prepare o pacote de ferramentas de dissecção grosseira: tesoura cirúrgica grande e limpa e seca.
- Configure o espaço de trabalho de dissecção não estéril: Reúna suprimentos da embalagem bruta da ferramenta de dissecção, olhos suínos enucleados submersos na PBS e no gelo, cortina cirúrgica, 100 mL de béquer com PBS. Coloque a cortina cirúrgica e os itens necessários para dissecção grosseira.
- Configure o espaço de trabalho de dissecção estéril: Reúna suprimentos do kit de instrumentos de microdiscção, gaze estéril, microscópio dissecando, solução betadina, PBS estéril, mídia estéril, quatro béquers esterilizados de 100 mL, placa de Petri estéril. Transferência asepticamente para o gabinete BSC II #1. Configure o armário para visualizar os olhos no microscópio de dissecação.
- Configure o espaço de trabalho de montagem ASOC: Reúna kits esterilizados a gás (kit de prato e kit de tampa), kit de instrumentos de montagem, mídia estéril, estandes de pratos de pratos, placas de Petri estéreis, seringas estéreis e filtros de seringa. Transferência asepticamente para o gabinete BSC II #2. Configure o armário para montagem de pratos.
- Quando os olhos estiverem estabilizados e prontos para perfuração (72 h após a configuração), transfiticamente transferi-los para um gabinete BSC II. Configure o espaço de trabalho de indução de lesão OG: dispositivo de indução de lesão pneumática (conjunto detalhado em Supplemental 3) e Lab Jack e vise de rastreamento cruzado para segurar o prato ASOC.
2. Dissecção do tecido
- Prepare o tecido suíno usando espaço de trabalho de dissecção não estéril.
- Procure olhos suínos enucleados de um matadouro local, estudos em animais ou fornecedor. Mantenha os olhos no gelo submerso em PBS durante a entrega e use imediatamente após o recebimento.
- Corte o tecido extraorbital e corte a conjuntiva deixando apenas a concha córnea e o nervo óptico. Realize a dissecção em condições não estéreis com grandes tesouras cirúrgicas e fórceps em um pacote de ferramentas de dissecção bruta.
- Coloque os olhos de volta em PBS fresco no gelo até que todos os olhos necessários para a configuração experimental tenham sido dissecados preliminares/brutos.
- Submergir os olhos em solução betadina de 10% por 2 minutos em recipientes fechados e transferir asepticamente para o gabinete BSC II #1. Realize todos os trabalhos subsequentes em condições estéreis para minimizar as contaminações durante a instalação.
- Dissecar estérilmente segmentos anteriores.
- Após 2 min em solução betadina, transfira os olhos para três lavagens seriais de AA-PBS estéreis para remover o excesso de solução betadina da superfície ocular, mantendo a esterilidade do tecido ocular. Depois de três lavagens, mantenha o tecido em AA-PBS até uso posterior.
- Hemisect o olho usando uma lâmina de barbear/bisturi e tesoura curvada. Coloque o olho em uma gaze encharcada de AA-PBS e crie uma incisão com uma lâmina de barbear estéril ou bisturi perto do equador do olho (60/40 dividido com 40 no lado anterior). Utilizando tesoura cirúrgica curva, hemisect o olho para isolar o olho anterior (metade córnea).
NOTA: O corte ao redor do segmento anterior precisa ser contínuo para evitar bordas irregulares e ásperas na esclera que criarão vazamentos de fluidos após a instalação na cultura do órgão. - Use microscisores como pá para colher humor vítreo do segmento anterior. Remova a lente do segmento anterior usando microscissores. Deixe os segmentos anteriores no AA-PBS até novas etapas de dissecção.
NOTA: Todos os olhos que serão dissecados podem ser mantidos nesta etapa e um por um levado pelo restante do processo de dissecção. - Com um microscópio dissecando, corte a íris para a raiz da íris gradualmente, radialmente até que a malha trabecular (TM) seja visível. O TM é um tecido pigmentado que compreende fibras circunferencialmente orientadas ao redor da casca corneoscleral. Cortes cuidadosos na íris em direção à raiz da íris exporão a profundidade do TM sob o tecido.
- Corte 360° ao redor da íris na mesma profundidade do corte inicial no tecido para expor toda a região TM. Limpe qualquer íris residual restante cobrindo TM, conforme necessário.
- Corte os remanescentes do corpo ciliar posteriormente ao TM, deixando apenas uma fina faixa de tecido posterior à região TM (aproximadamente 1 mm).
- Coloque o segmento anterior dissecado (AS) em mídia até nova configuração no ASOC no gabinete BSC II #2.
NOTA: Todos os olhos podem ser mantidos neste momento antes da configuração do ASOC se um único usuário estiver realizando dissecção e montagem de pratos de cultura de órgãos.
3. Criação de segmentos anteriores em pratos de cultura de órgãos
- Coloque um único AS em uma placa de Petri com AS invertida (copo para cima). Usando um cotonete, molhado na mídia e suavemente dab no centro da córnea para remover qualquer pigmento. Usando fórceps para segurar o olho e o mesmo cotonete, limpe o cotonete ao redor da esclera para remover pigmento extra.
- Inverta o AS e coloque em cima da parte inferior do prato sobre a região elevada, centralizando a córnea sobre a região elevada no prato. Coloque o anel de fixação em cima do AS recém-colocado.
- Coloque quatro parafusos nos orifícios correspondentes para manter o anel no lugar com o SO sob o anel. Aperte suavemente os parafusos com a tecla L.
NOTA: A etapa de aperto acontecerá diariamente durante todo o experimento, de modo que o objetivo do aperto inicial aqui é garantir que a mídia não vaze, evitando quebrar o anel de fixação. - Com um conjunto de placas de Petri estéreis, coloque a parte superior sobre a placa e inverta a configuração. Anexe o suporte do prato. Conecte os conectores fluidos com anéis O em portas roscadas na parte inferior do prato.
- A um conector fluido, conecte um cubo de agulha dobrada de 18 G 90°, um comprimento de tubulação, um hub de agulha de 18 G, um filtro de seringa de nylon, uma válvula de três vias e uma seringa de 20 mL cheia de mídia.
- Ao segundo conector fluido, conecte um cubo de agulha dobrada de 18 G 90° grau, comprimento de tubulação, um cubo de agulha de 18 G, uma válvula de três vias e a porção do barril de uma seringa estéril de 10 mL (isso funcionará como um reservatório para capturar líquidos e bolhas do ASOC).
- Com válvulas de três vias abertas adequadamente para as seringas, empurre suavemente a mídia através do sistema usando a porta do conector fluidics identificada na etapa 3.5 para inflar o AS, encher a mídia no tubo e, eventualmente, o reservatório.
NOTA: Se a mídia vazar no prato ASOC, o AS não está bem fixado o suficiente com o anel de fixação. - Remova bolhas empurrando suavemente a mídia para dentro do prato e invertendo o prato para empurrar as bolhas para dentro do reservatório.
- Coloque o prato e fique de pé. Coloque a parte inferior de uma placa de Petri sob os pés do suporte, cuidado para não engravar a tubulação.
4. Iniciar a cultura de órgãos do segmento anterior
- A ASOC está pronta para incubação. Coloque o prato ASOC na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2). Certifique-se de que a altura do prato ASOC na incubadora acima dos transdutores de pressão é conhecida e contabilizada para calcular o IOP com precisão(Protocolo Suplementar 4).
- Direcione as linhas de tubulação pela parte inferior da porta da incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 para que não interfiram na abertura e fechamento da porta. Conecte a seringa de 20 mL à bomba de seringa fixada em 2,5 μL/min.
- Posicione a linha de tubulação com o reservatório no instrumento transdutor de pressão. Conecte a válvula lateral de 3 vias à configuração do transdutor de pressão enquanto flui PBS através da linha para evitar que bolhas de ar entrem nas linhas de tubulação.
NOTA: Esvazie o PBS dos reservatórios após a instalação do sistema para reduzir a probabilidade de contaminação do reservatório com crescimento microbiano durante a duração da cultura dos órgãos. - Inicie a coleta de dados IOP, primeiro garantindo que um cartão microSD esteja presente para salvar arquivos de dados. Em seguida, ligue a configuração do transdutor de pressão para iniciar a coleta de dados.
NOTA: Os detalhes para a configuração do dispositivo de coleta de dados do transdutor de pressão são fornecidos no Protocolo Suplementar 2.
5. Manutenção diária do ASOC
- Depois que o ASOC tiver 24 h para equilibrar, remova os pratos da incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e coloque-os no gabinete BSC II.
NOTA: Na aquisição de dados de pressão, esses períodos de tempo parecem picos à medida que os ASOCs são removidos da incubadora (mudança de altura) e ajustados no gabinete. - Verifique se há vazamentos em cada prato na placa de Petri. Se estiver presente, verifique se há conexões fluidas apertadas sob o prato e aperte novamente se necessário. Verifique se há vazamentos na parte superior do prato usando uma tecla L estéril para apertar os parafusos no anel de fixação.
NOTA: O tecido esclera AS comprimirá e reduzirá a espessura em 24 horas, e o anel de fixação precisará ser apertado. - Aspire a mídia do prato bem.
NOTA: O trabalho de malha trabecular está filtrando o fluido da mídia que está sendo bombeada para o ASOC. Portanto, a mídia estará presente no prato ASOC ao longo das bordas. - Repita as etapas 3.7 e 3.8 para remover quaisquer bolhas de ar presas.
- Recheie as seringas nas bombas de seringa, certifique-se de que as bombas de seringa estejam em funcionamento e confirme o alinhamento das válvulas para perfusão no ASOC. Devolva o prato ASOC para a incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
NOTA: O ideal é que essas etapas sejam executadas diariamente. No entanto, o uso de um volume inicial de 20 mL de mídia, o volume do prato ASOC e uma taxa de bomba de 2,5 μL/min devem ser suficientes para deixar o sistema funcionar por vários dias sem ser perturbado.
6. Indução de lesão por OG com dispositivo de punção pneumática
NOTA: A construção do dispositivo de punção pneumática está detalhada no Protocolo Suplementar 3. As lesões de OG são induzidas após a estabilização do IOP, que normalmente ocorre após 3 dias na cultura. Os valores aceitáveis de IOP são de 5 a 20 mmHg com base no IOP fisiológico, o que pode ser determinado avaliando os arquivos de dados IOP ou definindo indicadores LED no sistema de medição de pressão conforme descrito no Protocolo Suplementar 2.
- Prepare o gabinete BSC II para indução de lesão OG conforme detalhado na etapa 1.10. Conecte a plataforma de perfuração a uma linha de ar comprimido. Coloque o objeto de punção estéril no mandril.
NOTA: Um compressor de ar pode ser usado para alimentar o dispositivo, mas o ar comprimido do tanque ou linhas de laboratório embutidas podem ser suficientes se a pressão for superior a 50 psi. - Coloque o regulador de pressão na plataforma de punção a 50 psi para uma força de punção adequada em objetos de até 4,5 mm de diâmetro. Posicione a víse de rastreamento cruzado na tomada de laboratório em frente à plataforma de punção para segurar o prato ASOC durante a indução de lesão.
- Remova a configuração ASOC de 37 °C, incubadora de CO2 de 5% e coloque no vise perpendicular de rastreamento cruzado à plataforma de punção(Figura 2) depois de remover a tampa e colocá-la de lado. Mantenha o segmento anterior perfusando, mas feche a porta da válvula de 3 vias para o transdutor de pressão para evitar danos de pressão excessiva ao transdutor.
- Estenda o braço do pistão até a distância máxima e posicione o ápice da córnea dentro de 1 mm do objeto de punção. Retraia o braço do pistão e aproxime o segmento anterior 1 cm do objeto de punção.
NOTA: Esta distância foi otimizada para indução de lesão de alta eficiência sem atingir o prato ASOC. - Dispare o dispositivo de punção ligando-o e abrindo a válvula solenoide com o segundo interruptor no dispositivo. Para retrair o dispositivo, pressione novamente o segundo interruptor para remover o dispositivo de punção do olho. Verifique a indução adequada da lesão por inspeção visual e vazamento de mídia do local da lesão.
- Remover o prato ASOC do torno; coloque a tampa de volta no conjunto do prato e abra a linha fluida para o transdutor de pressão. Coloque o ASOC de volta na incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
NOTA: Neste ponto, o terapêutico pode ser aplicado ao AS para avaliar sua eficácia para vedação de lesões OG.
7. Removendo o ASOC da cultura
NOTA: Dependendo da análise do ponto final (ver Resultados Representativos para possíveis métodos de ponto final), o AS precisa permanecer no prato ASOC inflado enquanto outros métodos requerem tecido AS isolado da câmara de cultura. A metodologia abaixo descreve como tirar o AS dos pratos da cultura do órgão e remover o resto da configuração.
- Remova os pratos ASOC da incubadora de 37 °C, 5% de CO2. Feche a válvula de 3 vias para a seringa e o reservatório e desconecte o tubo do sistema. Descarte a seringa, o reservatório e o filtro. Coloque as válvulas de 3 vias, tubos e cubos de agulha em um recipiente separado para lavar e esterilizar.
- Desconecte os cubos de agulha das conexões fluidas na parte inferior do prato. Desconecte os conectores fluidos e os anéis o. Coloque todos os itens em um recipiente para lavar e esterilizar.
- Remova os quatro parafusos do anel de fixação usando a tecla L. Remova cuidadosamente o anel de fixação.
- Utilizando fórceps, remova o AS do prato e, dependendo da análise e imagem do ponto final, coloque em resíduos de risco biológico fixador ou apropriado.
8. Análise de dados do IOP
- Conecte o cartão microSD a um computador para remover o arquivo .txt contendo dados da execução experimental mais recente.
NOTA: O arquivo é nomeado no código que controla o microcontrolador e deve ser atualizado para cada experimento (ver Protocolo Suplementar 2). - Importe os dados em uma planilha.
- Organize os dados em 12 colunas: Tempo (em minuto) e sinal mV para cada um dos 11 canais transdutores de pressão. Os primeiros dez canais correspondem a dez configurações experimentais ASOC. O sinal final do transdutor é para um sensor aberto ao ar como um canal de controle para confirmar que o sinal mV não alterou devido a alterações no sinal de entrada. Canal de controle de parcela versus tempo para confirmar que o sinal mV foi consistente durante todo o tempo.
- Converta os sinais mV para dez canais em mmHg usando equações de interceptação de inclinação geradas a partir da calibração inicial de cada sensor (ver Protocolo Suplementar 4).
- Tempo de parcela (converter-se em dias para simplificar a interpretação de dados) versus cada um dos dez canais para determinar como o IOP flutuava ao longo do curso de tempo experimental.
- Determine os valores médios de IOP em pontos-chave dos dados para comparar mais facilmente os valores entre cada um e como eles são alterados antes e depois da indução de lesão de OG. Média de 2-3 horas de dados para cada intervalo de 24 horas para determinar iOP em cada dia de ASOC.
NOTA: Os resultados do IOP representativo são mostrados na Figura 4.
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Representative Results
Imagens capturadas via Tomografia de Coerência Óptica (OCT) são mostradas para olhos lesionados de OG para ilustrar como uma indução de lesão bem sucedida parece. A Figura 3 mostra imagens para controle e tecido AS ferido OG imediatamente após a lesão e 72 h depois. Duas visualizações são mostradas: imagens transversais através do local da lesão e projeção de intensidade máxima (MIPs) de cima para baixo para visualizar a área da superfície da imagem. Os olhos de controle não mostram nenhuma interrupção perceptível na córnea, enquanto podem ser localizados ferimentos claros que atravessam toda a córnea após a lesão de OG. A partir de MIPs, é evidente que as lesões são irregulares em forma e tamanho, mas o tamanho da lesão diminui mais de 72 h. Anteriormente, esse efeito mostrou-se significativo para uma série de tamanhos de lesões testados13.
A produção primária de dados para o modelo de lesão OG descrito neste protocolo é a pressão intraocular ao longo da configuração experimental. Os dados são registrados em unidades de milvolts como uma saída de cada transdutor de pressão que pode ser convertido em mmHg via calibração (Protocolo Suplementar 4). Exemplos de dados IOP versus o curso de tempo experimental são fornecidos para olhos considerados aceitáveis e outros que não seriam considerados utilizáveis(Figura 4A). A partir dos dados de traço de pressão, os olhos foram anexados aos sensores após 24 horas na cultura, mas o IOP continua a flutuar ao longo das primeiras 72 horas na cultura. O IOP fisiológico para tecido AS na cultura de órgãos é de aproximadamente 8-10 mmHg, por isso a faixa de 2x e 1/2x foi decidida como um portão para valores IOP utilizáveis após os valores terem estabilizado (5-20 mmHg). Somente os olhos que estavam nessa faixa seriam permitidos para uso com o restante do protocolo. A partir de experimentos anteriores, tivemos uma taxa de sucesso de 90% que foi alcançada na configuração ASOC para olhos estabilizando na faixa necessária (Figura 4B).
Os resultados de como o IOP muda devido à lesão de OG e intervenção terapêutica também são fornecidos (Figura 4C,D). Após a indução da lesão de OG, a pressão deve cair significativamente e permanecer assim até que o tecido seja removido do ASOC (Figura 4C). Se um olho após a indução da lesão não diminuir a pressão, isso indica que uma lesão bem sucedida não foi induzida, pois o IOP deve ser reduzido se a vedação impermeável do olho estiver comprometida. No entanto, tamanhos menores de lesões podem se auto-curar, o que pode resultar na restauração do IOP. Se a terapêutica for aplicada ao olho após a indução da lesão de OG, a restauração do IOP pode ser rastreada durante o ASOC. Este conceito é demonstrado com dados mostrando um adesivo Dermabond aplicado a lesões OG de 2,4 mm(Figura 4D). Os resultados médios de cinco experimentos asoc separados com e sem terapêutica são mostrados e é evidente que a terapêutica está aumentando o IOP. Este método pode medir a eficácia do terapêutico para restaurar o IOP e rastrear se essa pressão é restaurada através da lesão de 72 h pós-OG.
Além disso, o protocolo ASOC é adaptável para uso com uma ampla gama de pontos finais de caracterização para atender aos requisitos experimentais do usuário final. Durante a cultura, os meios de saída do olho podem ser coletados diariamente ou até mesmo por hora, que podem ser utilizados para rastrear mudanças no nível da proteína que ocorrem durante o ASOC, após a indução de lesão OG ou após a aplicação terapêutica. Por exemplo, a zimografia de gelatina foi realizada anteriormente para detectar níveis de metaloproteinase matricial para rastrear a cicatrização da ferida e a remodelação do tecido20. Outros pontos finais biológicos são possíveis após a remoção do tecido da cultura através de métodos tradicionais de imunohistoquímica para avaliação da viabilidade tecidual21,22, rastreamento de alterações fisiodicosiológicas na córnea23,24, ou mancha à base de anticorpos para qualquer proteína de interesse25,26.
Métricas córneas funcionais também podem ser obtidas a partir de olhos mantidos no ASOC. A integridade do epitélio da córnea pode ser avaliada através de uma mancha de olho fluoresceína e aquisição de imagem usando uma fonte de luz azul27,28. Após a remoção da cultura, o tecido córnea pode ser avaliado para transparência através da simples aquisição de imagem13. Imagens oculares tradicionais também podem ser realizadas para avaliar a estrutura tecidual com ou sem intervenção terapêutica. As imagens OCT, como mostrado na Figura 3,podem criar imagens transversais através da córnea e podem ser capturadas de forma não invasiva, potencialmente permitindo a coleta de imagens enquanto mantêm o tecido na cultura. Outras modalidades de imagem, como microscopia de lâmpadas de fenda, ultrassom ou microscopia confocal in vivo também podem ser adaptadas para a aquisição de mais informações anatômicas.
Por fim, a avaliação das propriedades mecânicas do segmento anterior pode ser capturada para entender o efeito da lesão de OG ou terapêutica subsequente no tecido subjacente. Embora a coleta de dados do IOP por si só destaque como a integridade do selo impermeável do olho foi comprometida, já mostramos anteriormente que métricas adicionais de teste podem ser medidas para provocar recursos mecânicos adicionais10,11. A conformidade ocular, uma propriedade mecânica agrupada descrevendo como a pressão intraocular muda devido à inflação (alteração de volume/mudança de pressão), pode ser medida com uma bomba de seringa para injetar pequenos volumes repentinos de fluido no olho e registrando o aumento de pressão resultante com um transdutor de pressão. A maior conformidade indica que o tecido é menos rígido e pode ser usado para rastrear como as propriedades do material terapêutico diferem do tecido córnea subjacente. A taxa de vazamento do olho ou de uma instalação tradicional de saída pode ser medida e calculada para determinar a taxa de fluxo fluido preciso deixando o olho por unidade de pressão20,29. Por fim, no que diz respeito aos testes terapêuticos, a pressão de explosão pode ser medida para determinar a pressão máxima que o olho pode manter antes da falha terapêutica. Isso pode ser usado para comparar o desempenho com olhos não feridos ou para rastrear mudanças de desempenho com o tempo12,13.
Figura 1: Diagrama da configuração ASOC. Os olhos são mantidos em pratos personalizados de cultura de órgãos e mantidos no lugar com um anel de fixação. A mídia ASOC é infundida através da bomba de seringa através da válvula A e conectada a um transdutor de pressão, e a subsequente aquisição de dados com a Válvula B. As portas abertas em cada válvula são destacadas em azul, enquanto o amarelo indica canais fechados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral da configuração da lesão OG. (A) Configuração do dispositivo de lesão pneumática. Da esquerda para a direita, o ar comprimido é introduzido no dispositivo através de uma linha de ar comprimido, que passa por um regulador para definir a pressão em 50 psi medida pelo medidor de pressão. Duas válvulas solenoides estão conectadas a um atuador linear para expansão direta/retração do mandril de perfuração que segura o objeto de punção. O vise está posicionado na frente do dispositivo de punção para segurar o olho no posicionamento x, y, z apropriado. (B) O ASOC representativo é colocado em frente ao dispositivo de indução de lesões. Mais detalhes sobre o dispositivo e sua construção estão detalhados no Protocolo Suplementar 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens de Tomografia de Coerência Óptica de experimentos de lesão asoc og. Imagens são mostradas para olhos de controle (ilesos) e olhos feridos OG imediatamente após a lesão e 72 h pós-lesão. As visualizações são mostradas como seções transversais através da córnea(lado esquerdo)e vistas de projeção de intensidade máxima de cima para baixo da superfície córnea(lado direito). A figura foi adaptada com permissão de Snider et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados do IOP representativo para experimentos ASOC. (A) Dados de IOP brutos para as primeiras 72 h de configuração ASOC. Os olhos são perfurados a 72 h, então os primeiros 3 dias de dados são avaliados para determinar se o IOP se estabiliza na faixa IOP aceitável (5-20 mmHg). Pelos resultados representativos, três dos cinco olhos estão dentro da faixa IOP aceitável, enquanto um tem IOP muito alto e um tem IOP muito baixo (caindo fora da região amarela destacada na trama). (B) IOP estabilizado para n = 50 configurações ASOC de experimentos anteriores para demonstrar a taxa de sucesso típica com o método ASOC. (C) IOP para olhos não feridos em comparação com três diferentes tamanhos de lesão OG após indução de lesão por 72 h. A perda do IOP é evidente, sem sinais de recuperação. (D) Resultados de IOP lesionados em comparação com lesões tratadas com um adesivo Dermabond. Embora a taxa de erro seja alta devido a alguns olhos estarem selados e outros não, o método pode rastrear alterações no IOP durante o período de 72 horas após a lesão. A figura foi adaptada com permissão de Snider et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem etapas críticas com a plataforma de lesão ASOC OG que devem ser destacadas para melhorar a probabilidade de sucesso ao usar a metodologia. Primeiro, durante a dissecção do segmento anterior, preservar o trabalho de malha trabecular é essencial, mas desafiador de fazer corretamente. Se o TM for interrompido, o olho não manterá a pressão fisiológica e não atenderá aos critérios de elegibilidade para uso experimental. Recomenda-se praticar o processo de dissecção em condições normais primeiro, em vez de introduzir os desafios adicionais da técnica asséptica até que sejam obtidas dissecções adequadas. Em segundo lugar, ao colocar os olhos nos pratos ASOC, é imperativo que eles estejam apertados o suficiente para evitar que o fluido vaze, mas solto o suficiente para evitar danificar os pratos ASOC. Se o olho não estiver bem fixado, o fluido vazará do olho através de meios não fisiológicos, resultando em pouco ou nenhum IOP. No entanto, o anel de fixação que prende o olho para baixo é de plástico e pode ser facilmente quebrado se for pressionado. É essencial fixar os olhos para baixo ao longo de 2 dias, pois o tecido escleral sob o anel irá comprimir e afrouxar o tecido durante as primeiras 24 horas. Recomenda-se apertar os anéis apenas até que a resistência ao aperto seja sentida no primeiro dia e segui-lo ressuornando-se a níveis semelhantes após 24 h em cultura para melhores resultados.
Em terceiro lugar, é fundamental entender completamente onde o fluxo de fluidos é direcionado a todos os momentos ao usar este modelo. Cada prato ASOC é conectado a múltiplas válvulas de três vias para direcionar o fluxo de fluidos da bomba de seringa ou do reservatório de seringa de 10 mL e conectar-se a transdutores de pressão. Diferentes instâncias do processo de configuração exigem que as válvulas sejam posicionadas de forma a retirar bolhas de ar do olho ou proteger transdutores de pressão contra a pressão excessiva. Ainda deve ser tomado cuidado para entender o que está aberto/fechado o tempo todo antes das etapas críticas do protocolo. Por último, manter a esterilidade em todo o protocolo de lesão ASOC OG é crítico, mas fácil de perder em todo o processo de vários passos e vários dias. A mídia de perfusão contém altos níveis de antibióticos e antimícticos para evitar isso, e os olhos estão submersos em betadina antes de serem configurados para evitar contaminações, mas ainda há passos críticos onde os erros são mais prováveis. Durante a configuração inicial no prato, evite o contato com os olhos enquanto aperta os anéis de fixação no lugar e mantenha as tampas nos pratos o tempo todo quando não estiver em uso. Um passo de exposição mais provável é durante a manutenção do ASOC diário. É importante fazer essas etapas rotineiras em um armário de biossegurança, mesmo que pareça que eles podem ser rapidamente realizados sem remover os olhos da incubadora. Seguir cuidadosamente o protocolo e manter uma boa técnica asséptica deve minimizar os riscos de contaminação nos experimentos de 6 dias do ASOC.
No geral, a plataforma de lesão ASOC OG é única de outras metodologias que analisam lesões de globo aberto devido a dois critérios-chave. O primeiro é o método de indução de lesões. O dispositivo de lesão pneumática de alta velocidade utilizado induz lesões com uma alta quantidade de força. Isso permite induzir lesões com objetos que não são especialmente afiados nem com um diâmetro pequeno. Isso imita mais de perto lesões irregulares na forma; Estilhaços de alta velocidade feridos resultantes de dispositivos explosivos30,31. O dispositivo pneumático pode ser facilmente equipado com estilhaços de forma irregular imitando objetos para criar lesões mais desafiadoras para curar em comparação com métodos anteriores usando lasers, agulhas ou lâminas de bisturi para criar geometrias limpas e precisas de lesões32,33,34. Em segundo lugar, a metodologia ASOC permite acompanhar o progresso das lesões e o desempenho terapêutico além da indução inicial de lesões. Ser capaz de rastrear até 72 h não foi possível na plataforma de lesão OG anteriormente desenvolvida10,11,12 e foi a motivação por trás do desenvolvimento deste protocolo. Na verdade, a viabilidade celular permaneceu elevada no endotélio córnea por pelo menos 1 semana no ASOC13. O ASOC é o único meio que essa caracterização de longo prazo pode ser realizada sem fazer a transição para experimentos in vivo caros.
As principais aplicações para a plataforma ASOC são duplamente. Primeiro, o modelo pode ser utilizado para caracterizar ainda mais lesões de globo aberto, especialmente considerando como elas mudam com o tempo. No estudo anterior, as lesões de OG foram caracterizadas dessa forma e a cicatrização da ferida foi observada ao longo de 72 h após a lesão13. O rastreamento de diferentes tamanhos, formas, locais por 72 h ou até mais com relação às mudanças biológicas que ocorrem informará decisões médicas críticas que devem ser tomadas após lesões de OG. Certos parâmetros de lesão podem permitir a auto-cura pela córnea, ou outros parâmetros podem ser mais graves se a intervenção não for aplicada nas primeiras 24 horas. Essas informações serão inestimáveis para triagem de pacientes quando suprimentos médicos limitados ou recursos de evacuação estiverem disponíveis.
Em segundo lugar, a plataforma ASOC OG pode ser usada para desenvolver e testar o desenvolvimento de produtos. Para esta aplicação, a plataforma de cultura de órgãos pode preencher uma série de funções. Durante o desenvolvimento inicial do produto, períodos de tempo mais curtos podem ser testados com uma gama de formulações de produtos para determinar o que é mais eficaz. O sistema de cultura de órgãos pode ser configurado para um rendimento ainda maior para esta aplicação com bombas de seringa adicionais para ir além dos dez experimentos simultâneos possíveis com o sistema detalhado aqui. Para produtos mais refinados, podem ser avaliados pontos de tempo mais longos para avaliar o desempenho por 72 h ou potencialmente até mais. Por fim, a avaliação da cicatrização de feridas pode ser possível ao avaliar produtos biologicamente ativos que podem tratar permanentemente lesões OG em vez de estabilização temporária.
No entanto, existem limitações com a plataforma ASOC OG que devem ser levadas em consideração. Primeiro, enquanto o modelo permite uma avaliação a longo prazo da terapêutica, está faltando todo o tecido do olho fora da casca corneoscleral, como a íris e a lente. Esses tecidos adicionais provavelmente serão influenciados pela lesão de OG e podem desempenhar um papel na progressão da lesão. Da mesma forma, um segmento anterior isolado está faltando elementos de resposta imune que seriam incluídos na transição do modelo ASOC para testes subsequentes em animais. Em seguida, o modelo só é adequado para criar lesões OG córneas e lesões og potencialmente limbais. Lesões esclerais ou posteriores de OG não podem ser induzidas com este método. No entanto, muitos desses tipos de lesões resultam em danos à retina, tornando improvável qualquer estabilização terapêutica temporária para evitar a perda da visão35,36. Por fim, as lesões com o modelo fora de 72h após a lesão foram apenas rastreadas. O ASOC foi utilizado em outras aplicações por 2 semanas, de modo que o modelo provavelmente pode ser utilizado para essas aplicações, mas não foi testado até o momento37,38,39.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes. As opiniões expressas neste artigo são as dos autores e não refletem a política oficial ou a posição do Departamento Médico do Exército dos EUA, departamento do Exército, Departamento de Defesa ou governo dos EUA.
Acknowledgments
Este material é baseado em trabalho apoiado pelo Departamento de Defesa dos Estados Unidos através de um acordo interagências (#19-1006-IM) com o programa temporário de aquisição de reparos corneais (Agência de Desenvolvimento de Materiel Médicos do Exército dos Estados Unidos).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
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