Summary
单分子荧光能量转移是一种跟踪核糖体蛋白合成过程中tRNA动力学的方法。通过跟踪单个核糖体，确定不生菌种群，从而揭示机制。该方法可用于跟踪生物构象变化，以揭示许多其他复杂生物系统中的动态函数关系。单分子方法可以观察到非速率限制步骤和人口较少的关键中间体，由于平均效果，传统组合方法无法访问这些中间体。
Abstract
核糖体是一种大型核糖核蛋白复合物，沿着mRNA模板加工组装蛋白质。核糖体的直径约为 20 nm，可容纳 A、P 和 E 位点的大型 tRNA 基板。因此，核糖体动力学自然会迅速去相。单分子法可以分别检测每个核糖体并区分不生菌种群，这对于揭示多成分系统的复杂机制至关重要。我们报告了基于尼康Ti2倒置显微镜的smFRET方法的细节，以探测核糖体蛋白L27和tRNA之间的核糖体动力学。L27 被标记在其独特的 Cys 53 位置，并重组为核糖体，设计为缺乏 L27。tRNA 在其肘部区域标记。当 tRNA 在拉长周期内移动到核糖体内的不同位置（如转位前和转位后）时，FRET 效率和动力学表现出差异，这暗示了多个子聚合。这些子群无法通过合奏方法检测到。基于 TIRF 的 smFRET 显微镜基于手动或电动倒置显微镜，配备自制激光照明。核糖体样品通过超浓缩净化，装入自建的多通道样品细胞，然后通过消逝的激光场照明。反射激光点可用于实现完美对焦的反馈控制。荧光信号由电动滤塔分离，由两台数字 CMOS 摄像机收集。强度通过 NIS 元素软件检索。
Introduction
核糖体是一个 20 纳米大的核糖核蛋白复合物，由大型 （50S） 和小型 （30S） 子组组合而成。它沿着 mRNA 模板以过程和合作性地组装长肽。核糖体 30S 与 fMet-tRNAfMet和 mRNA 结合以启动蛋白质合成，然后 50S 连接以形成 70S 启动复合体。tRNA 将氨基酸带到 A 站点（氨基酸 - tRNA 结合部位）的核糖体，而拉长的肽链则保存在 P 站点（肽-tRNA 结合部位）。在迁移前复合物中，肽链通过添加一种氨基酸被转移到 A 站点的 tRNA。同时，P 站点 tRNA 已脱乙酰。然后，A-，P-tRNA 移动到 P-，E-站点，形成迁移后复合体，其中电子站点表示 tRNA 退出站点。在此状态下，肽-tRNA 会移回 P 位点。拉长周期继续在前和后构象之间，而核糖体在mRNA上转移，一次1个科顿。核糖体是高度协调的不同功能位点，使这个过程高效和准确，如子单元间棘轮2，tRNA杂交波动3，GTPase激活4，L1茎开闭5等。因此，核糖体会迅速去相，因为每个分子都按照自己的速度移动。传统方法只能推断出明显的平均参数，但低人口或短寿命物种将掩盖在平均效果6。单分子方法可以通过单独检测每个核糖体来打破这一限制，然后通过统计重建7识别不同的物种。已实施不同的标记站点来检测核糖体动力学，例如 tRNA-tRNA 8、EF-G-L119、L1-tRNA10等之间的相互作用。此外，通过分别标记大和小子单位，观察到子单元间棘轮动能学和与因子的协调。同时，smFRET方法在其他中央生物过程中具有广泛的应用，多色FRET方法正在兴起。
以前，一个新的核糖体FRET对被开发14，15。重组核糖蛋白L27已被表达，纯化，并标记，并重新纳入核糖体。这种蛋白质与tRNA在近距离相互作用，有助于稳定转移后复合物中的P位tRNA。当tRNA从A-移动到P位点时，这种蛋白质和tRNA之间的距离被缩短，这可以通过smFRET信号来区分。使用统计方法和突变体已经识别出多个核糖体亚群，在迁移前但不是迁移后复合物中自发交换这些种群表明，核糖体在移动mRNA之前更灵活，在解码16、17、18时更刚性。这些变化对核糖体功能至关重要。在这里，协议描述了核糖体/tRNA标签的细节，它们被纳入核糖体，smFRET样品制备，和数据采集/分析19。
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Protocol
1. 为FRET检测准备标记的核糖体和tRNA
- 根据标准协议20，21，将没有L27的核糖体与大肠杆菌株IW312分离。从大肠杆菌菌株MRI600中提取常规核糖体。
- 克隆L27的rpmA基因与C终端他的标签到pET-21b（+）质粒，这是转换和表达在BL21（DE3）pLysS细胞15。通过预包装的柱净化蛋白质。
- L27 的标签
- 在室温 （RT） 下，在 100 μL 中孵育 20-100 μM 纯化 L27，在室温下多育 2-10 倍的 TCEP （Tris-2-carboxye-乙基磷化物） 30 分钟。缓冲器将溶液交换到 PBS 缓冲器 （10 mM Na2HPO4， 1.8 mMKH 2PO4， 2.7 mM KCl： 0.137 M NaCl）， 使用午睡 5 列。在 DMSO 中加入 10 倍多余的 Cy5-maleimide 单反应染料到溶液中，并在黑暗中在 RT 孵育 2 小时。
- 将上述标记的蛋白质溶液 （500 μL） 加载到 Nap-5 列上以去除多余的染料。确保蛋白质在第一个彩色带中精脱，然后是在第二个带中自由染料精脱。收集在 TAM10 缓冲器 （20 mM tris-HCl （pH 7.5）， 10 mM Mg （OAc）2，30 mM NH4Cl， 70 mM KCl， 0.5 m EDTA 和 7 m M BME （2-甲醇） 的 1 mL 中分离的蛋白质。
- 用 L27 重组核糖体。将标记的 L27 蛋白质与同等数量的 IW312 核糖体混合在 TAM10 缓冲中，并在 37 °C 下孵育 1 小时。通过蔗糖垫超浓缩（100，000 xg，过夜）去除释放的蛋白质，使核糖体在管子底部形成蓝色颗粒。
- 根据先前发表的报告22，标记tRNAPhe。首先，在 0 °C 1 小时的 100 μL NaBH 4（100 mM 库存，向下添加）孵育 tRNA（10 A260在 1 mL 水中）。通过三次乙醇降水将 tRNA 从未反应的 NaBH4中释放，添加 1/10 的 3 M KAc （pH 5.0） 和 2.5 倍的乙醇体积。用 1 μL 的 Cy3-NHS 染料溶液（1 毫克（10 微升 DMSO 中 1 毫克）在 0.1 M 钠的最低体积（+20 μL）中孵育减少的 tRNA（pH 3.7）。在 37 °C 的 2 小时孵化后，通过一个小 G25 Sephadex 柱将 tRNA 与未激活的染料分离，然后通过两次乙醇沉淀去除自由染料。
2. 核糖体复合物的准备
- 使用标准方法15快速和净化 IF1、IF2、IF3、EF-G、EF-Tu、EF-Ts 和 tRNA 合成器的标记蛋白。
- 在 TAM10 缓冲器中添加以下成分，在 37 °C 下添加以下成分，15 分钟：标签核糖体的 1 μM;1.5 μM IF1、IF2 和 IF3;2 μM 生物酸化 mRNA（前两种氨基酸编码 MF）;4 μM 的充电 fMet-tRNAfMet;和 1 mm Gtp 。
- 准备 EF-Tu_G 混合，在 37 °C 的 TAM10 缓冲中混合以下成分，15 分钟：4 μM EF-Tu、0.4 μM EF-Ts、2 μM EF-G、4 mM GTP、4 mM PEP 和 0.02 毫克/毫升的皮鲁瓦特激酶。
- 准备类似于步骤 2.3 的 EF-Tu_NoG组合，而没有 EF-G。
- 在 37 °C 的无核酸酶水中混合以下成分，15 分钟：100 mM Tris （pH 7.5），20 mM MgAc2， 1 mM EDTA， 4 m ATP， 7 m M BME， 2 m Min 苯丙氨酸特异性合成酶， 2 A260/mL 标签 tRNAPhe， 和 50 μM 苯丙氨酸。
- 将启动、EF-Tu_NoG和 Phe 混合在 1：2：2 的比例中，在 37 °C 下混合 2 分钟，从而准备预移复合物 （PRE）。孵化后，以10万 克的隔夜将PRE净化1.1M蔗糖垫超浓缩。
- 将启动、EF-Tu_WG和 Phe 混合在 1：2：2 的比例中，在 37 °C 下混合 10 分钟，从而准备转位后复合物 （POST）。孵化后，以10万 克的隔夜净苏糖垫超浓缩。
3. 准备示例幻灯片
- 清洁包含六对孔（直径为 1 毫米）的显微镜玻璃滑梯（75 毫米 x 25 毫米）。每对形成样品室的入口出口。确保每个入口出口孔之间的距离为 13 mm，两个通道之间的中心到中心距离为 6 毫米。将六张幻灯片放在玻璃熔炉中。
- 用丙酮填充熔炉，并将其调音5分钟。将丙酮脱色，用超纯水冲洗滑梯三次。再次用水和 1 mL 的 10 M KOH 填充熔炉。声波为20分钟。
- 用超纯水冲洗滑梯三次。再次用乙醇和声波填充熔炉 5 分钟。完全倒除溶剂。让幻灯片在烟气罩中干燥。
- 清洁显微镜玻璃盖片（#1.5 厚度，24 x 40 mm）。执行步骤 3.1-3.3 中描述的清洁步骤。
- 在 300 °C 下烘烤清洁的幻灯片和盖片，3 小时。把它们放在炉子里过夜冷却。
- 用氨基烷涂上盖唇。在含有盖片的熔炉中，倒入甲醇混合物（100 mL甲醇、5 mL 水、0.5 mL 的 HAc 和 1 mL 氨基烷）。在水浴中加热熔炉10分钟，将其声波调谐10分钟，然后在水浴中加热熔炉10分钟。将甲醇混合物脱脂，将盖唇井冲洗成三块干净的水。用干氮流通过针头清除表面。
- 将盖片涂上生物素-PEG，盖在层压清洁罩中。
- 要制造 PEG 溶液，请使用 98 毫克 PEG 和 2-3 毫克生物素-PEG 在 200 μL 的 100 mM NaHCO3 溶液中。
- 将一个盖片平放在表面上。小心地将 60 μL 的 PEG 解决方案放在顶部边缘。然后，在上面再铺一个盖片，让毛细子效应将溶液分散到两个盖片之间。确保不会形成气泡。
- 重复步骤 3.7.2 为另外两对盖唇。用生物素涂上六片盖片。如果需要更多的覆盖唇，相应地调整PEG和Biotin PEG的数量，以使更多的PEG解决方案。
- 将这些盖片存放在装满水的空尖盒中，在黑暗中孵育3小时。
- 3小时后，将盖片分开，连续用三个熔炉用水冲洗，用干氮流清洗。将涂层的盖片放在陶瓷架上。用涂层标记表面。
- 组装样品室19。
- 将锋利的移液器尖穿过玻璃滑梯上的孔，直到它们紧贴。刮掉锋利的末端，直到它完全平坦到玻璃表面。将尖端的另一端切割为大约 5 mm，用于样品加载。
- 切割带有通道图案的双面胶带（25 x 40 mm）。
- 将双面胶带粘在平侧的玻璃滑梯上。
- 将涂层的盖唇粘在双面胶带上。按压它，对样品室进行严密密封。确保涂层侧朝内。
4. 单分子FRET成像
- 打开计算机。
- 打开显微镜开关。
- 启动激光控制界面并打开激光。按下激光控制盒上的启用按钮，为激光预热。
- 打开摄像机。
- 启动显微镜相关软件程序。单击上部快门关闭并单击灯。
- 通过在 TAM10缓冲器的 1 mL 中加入 10 μL 的 5% Tween-20，准备 TAM10 _WT缓冲。
- 在一个小微中心管中称重 3 毫克葡萄糖氧化酶，准备脱氧溶液。加入 45 μL 的卡塔拉酶。漩涡轻轻溶解固体。在微中心以 20，000 x g 旋转 1 分钟。拿超纳特
- 在水中准备 30% 葡萄糖溶液，在 DMSO 中准备 200 mM 特罗洛克斯溶液。
- 在无核酸水中准备 0.5 毫克/毫升的链球菌溶液。
- 向 TIRF 目标添加一滴成像油。
- 将样品室放在目标上。
- 在房间中填充 10 μL 的链球菌素溶液。等待 1 分钟。
- 用 30 mL 的TAM10_WT缓冲器清洗房间，然后用折叠的滤纸收集直通式溶液。等待 1 分钟。
- 用 TAM 10 _WT缓冲器将核糖体复合物 （PRE 或 POST） 稀释至10-50nM 浓度。
- 将 20 μL 的核糖体样品加载到通道中。等待 2 分钟。
- 制作成像缓冲器（TAM10 缓冲器的 50 μL 加上 0.5 μL 的脱氧、葡萄糖和特罗洛克斯解决方案）。将缓冲器混合好。
- 用 30 微升的成像缓冲器冲洗腔室。
- 设置相机以获取 100 毫 x 帧、16 位、4 x 4 宾套。
- 单击上百叶窗 打开 并 关闭灯。
- 开始相机采集。将图像分成三个窗口，表示两个单独的摄像机和覆盖物。
- 点击 自动对焦。微调，找到最佳焦点。
- 单击方法。设置字段点、文件存储和循环号。
- 点击 运行。
注：通过实时成像显示新窗口。时间系列和视场系列的进度显示在窗口顶部。 - 图像采集完成后，关闭弹出窗口。
- 打开 ND 文件（已获取文件）。
- 点击 ROI/简单的ROI编辑器。选择选项 圈。
- 选择图像上的投资回报率。完成后单击 "完成 "。
- 单击 "测量/时间测量 "以图或电子表格显示数据。
- 打开 "导出 "选项卡。设置出口参数。
- 单击 "导出 "以节省强度。
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Representative Results
smFRET 的核糖体标记在 tRNA 流量的中间位置，以区分 tRNA 从 A 到 P 站点的迁移（图 1）15。从 L27 标记残留物到 A-或 P 站点 tRNA 的距离分别为 52 或 61+，对应于 0.47 和 0.65 的 FRET 效率。图像收集后，从捐赠者和接受者通道中检索和绘制荧光强度（图1）。FRET 效率由我接受的公式计算 /（我接受者=我捐赠者）。自制程序检测到供体/接受者的单步漂白，并在漂白点前安装数据，以避免从噪音中计算 FRET。供体漂白后，两个痕迹接近基线，因为不能直接在接受者身上发生兴奋（图2A）。接受者漂白后，供体强度增加，因为较少的反应通路消散激发能量（图2B，C）。
研究发现，单个核糖体表现出不同的波动，例如图 2中示例。这些波动是由于 tRNA 的摆动运动，这导致距离波动到 L2717，18。在 图 2中，虚线是原始数据，实线是程序中安装的数据。安装的痕迹不会改变原始数据读数，但会在漂白后截断延时痕迹。蓝色痕迹是计算出的 FRET 效率。通过跟踪完全相同的核糖体后，5分钟孵化在RT，它被发现，一种类型的动力学可以切换到另一种23。由于这些信号报告由周围核糖体决定的 tRNA 运动，因此类似的 FRET 效率被分组成各种核糖体亚群。
图 3显示了 PRE 复合体中非常多样化的子群。波动物种约占70%（640/951），非波动物种约占30%（311/951）。这两个类别可以进一步归为更精细的子群体。另一方面， 图4 显示了相反的动态分布。在 POST 中，65% 的子人口是无波动的，并且大多数子人口表现出较高的 FRET 效率。这些结果表明，核糖体在PRE状态中比POST状态更灵活，这证实了一项低温-EM研究，该研究得出结论，P-site的肽链将核糖体动力学锁定在POST状态。然而，在PRE状态下，肽链被转移到A站点，解锁核糖体并促进5。研究结果支持了在更生理条件下的结构研究结论。解锁状态与 30S 和 50S 之间的棘轮运动相关，锁定状态与未棘轮构象相关。
亚人口分拣方法揭示了由抗生素维他素抑制后的核糖体构象，如图 514所示。整体 FRET 效率直方图显示主要峰值为 0.47，这是经典状态，无需排序。在这种状态下，核糖体被锁定和解开。然而，对子人口进行排序后发现，60% 的人口是作为未解锁的 PRE 复合体波动的。因此，维霉素已经将核糖体困在棘轮状态。这项研究的结果与出版时的X射线结构结果相矛盾（2010年），但最近得到了另一项结构研究（2020年）的支持。
图1：环核糖体和tRNA上的Cy3/Cy5标签位置。 显示 L27 标签残留物与 A 和 P 站点 tRNA 之间的距离（红色和蓝色星分别显示 Cy5 和 Cy3 的大致标记位置）。显示了 CY3/Cy5 FRET 对荧光强度的一个具有代表性的延时痕迹。程序检测供体/接受者痕迹上的漂白点，并在该点之前截断该痕迹。这个数字已经从阿尔通托普，M.E.等人修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：典型的核糖体痕迹按其不同的动力学分类。 （A） 非波动核糖体痕迹。（B） 波动的核糖体痕迹，只样本 FRET 值低于 0.6。（C） 波动的核糖体痕迹，样本FRET值高于0.6。传说在情节中显示。捐赠者和接受者的荧光强度分别为绿色和洋红色。FRET 值按我接受者/（我接受者+I捐赠者）计算，并单独绘制成蓝色。原始数据以虚线显示，数据在漂白点以实线显示之前被截断。这个数字已经从阿尔通托普，M.E.等人修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3： 前复合体的FRET效率直方图。 顶级图显示了总核糖体的 FRET 直方图。第二层图显示了核糖体的 FRET 直方图，这些核糖体分为波动 （F） 和非波动 （NF） 组。第三层图显示核糖体的 FRET 直方图进一步分为高于或低于 0.6 的 FRET 值的波动组。类似的标准也适用于 NF 核糖体，将其分离到低于或高于 0.6（NF-low，NF-高）的稳定 FRET 状态。第四层图显示了每个子聚居区的代表痕迹。这个数字已经从阿尔通托普，M.E.等人修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4： FRET效率直方图后复杂。 排列和分组与 图3相似。与 图3相反，NF高人口占多数。这个数字已经从阿尔通托普，M.E.等人修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：在100μM维他命的情况下，PRE复合体的直方图。排列和分组与图3相似。这个数字已经从Ly，C.T.等人修改了。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
斯姆弗雷特对背景信号很敏感。首先，有必要给样品室涂上0.05%的补间，然后与核糖体溶液同时添加，以阻止核糖体与表面的非特定结合。要从接受者 Cy5 排放中看到荧光，氧气清除剂鸡尾酒（脱氧、葡萄糖和特罗洛克斯溶液）至关重要。如果没有此解决方案，接受器通道中的漂白速度太快，无法获取有用的信息。核糖体实验的另一个关键步骤，具体来说，是玻璃表面的PEG涂层。核糖体活动对表面环境敏感：因此，长刷涤聚合物对于屏蔽不利的表面效应至关重要。
如果样品阶段离焦点太远，自动对焦系统将不起作用。如果发生这种情况，关闭自动对焦并手动调整目标位置，同时观察反射的激光点。这是自建总内部反射照明的一个优点，因为激光点是可见的。当目标接近焦点时，事件和反射激光点应并排移动，反射点应随着客观位置的调整而移动。当这两个点接近时，自动对焦将再次工作。
smFRET 的一个限制是浓度范围非常低。只有高达 50 nM 的荧光标记基板才能加载，而不会引起抑制背景噪音。虽然表面的样品可能需要在同一分子上长期采集，但时间分辨率仅限于 ms 范围，而基于扩散的共聚焦 smFRET 可以达到 μs 范围24的动态。FRET 方法的另一个局限性是精确计算与 FRET 效率的距离。由于不同的染料连接器和环境，福斯特的距离因实验室而异。因此，比较绝对距离可能是有问题的25。虽然FRET效率的变化揭示了迁移机制，但制定了更直接的策略来测量核糖体在mRNA26、27上的确切覆盖范围。
然而，使用FRET值作为相对参考来区分一个实验环境中的不生物质种群是一种强有力的方法，可以一次揭示一个分子的机制和动力学，这是传统方法所无法利用的。此外，多色FRET和FRET与光学陷阱的结合将揭示更多的精心策划的核糖体动力学在未来28。这些发展提供了前所未有的灵敏度（距离位移）和新的参数（如皮科-牛顿量级的力量），这是无法实现与现有方法28。
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Disclosures
王先生声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家卫生研究院（R01GM111452）和韦尔奇基金会（E-1721）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
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