Summary
En molekyl fluorescens energiöverföring är en metod som spårar tRNA dynamiken under ribosomal proteinsyntes. Genom att spåra enskilda ribosomer identifieras inhomogena populationer, vilket belyser mekanismer. Denna metod kan användas för att spåra biologiska konformationsförändringar i allmänhet för att avslöja dynamiska funktionsrelationer i många andra komplexa biosystem. Metoder med en molekyl kan observera icke-hastighetsbegränsande steg och lågbefolkade nyckelmediärer, som inte är tillgängliga med konventionella ensemblemetoder på grund av den genomsnittliga effekten.
Abstract
Ribosomen är ett stort ribonukleoproteinkomplex som monterar proteiner processivt längs mRNA-mallar. Ribosomens diameter är cirka 20 nm för att rymma stora tRNA-substrat vid A-, P- och E-platserna. Följaktligen är ribosomdynamiken naturligt avfasad snabbt. Enmolekylsmetod kan detektera varje ribosom separat och skilja inhomogena populationer, vilket är viktigt för att avslöja de komplicerade mekanismerna i flerkomponentsystem. Vi rapporterar detaljerna i en smFRET metod baserat på Nikon Ti2 inverterade mikroskop för att undersöka ribosom dynamiken mellan ribosomal protein L27 och tRNAs. L27 är märkt på sin unika Cys 53-position och rekonstitueras till en ribosom som är konstruerad för att sakna L27. TRNA är märkt vid armbågsregionen. Som tRNAenflyttningar till olikt lägen insida ribosomen under förlängningen cyklar, liksom pre- och post-translocation, FRET-effektivitetsvinsterna och dynamiken ställer ut skillnader, som har föreslagit multipel subpopulations. Dessa delpopulationer kan inte upptäckas med ensemblemetoder. Det TIRF-baserade smFRET-mikroskopet är byggt på ett manuellt eller motoriserat inverterat mikroskop med hembyggd laserbelysning. Ribosomproverna renas genom ultracentrifugation, laddas i en hembyggd flerkanalig provcell och belyses sedan via ett evanescent laserfält. Reflektionslaserpunkten kan användas för att uppnå feedbackkontroll av perfekt fokus. Fluorescenssignalerna separeras av ett motoriserat filtertorn och samlas in av två digitala CMOS-kameror. Intensiteterna hämtas via NIS-Elements programvara.
Introduction
Ribosomen är ett ø 20 nm stort ribonukleoproteinkomplex med en stor (50S) och en liten (30S) underenhet. Den monterar långa peptider längs mRNA-mallen processivt och samarbetsvilligt. Ribosomen 30S binder till fMet-tRNAfMet och mRNA för att starta proteinsyntesen, och 50S förenar sig sedan för att bilda 70S-initieringskomplexet. TRNAs ger aminosyror till ribosomen vid A-platsen (aminoacyl-tRNA-bindningsställe), medan den långsträckta peptidylkedjan hålls på P-site (peptidyl-tRNA-bindningsställe). I pre-translocation komplexet överförs peptidyl kedjan till tRNA på A-platsen med en aminosyra tillsatt. Under tiden är P-site tRNA deacylated. Sedan flyttar A-, P-tRNAs till P-, E-platserna för att bilda post-translocation-komplexet, där E-platsen representerar tRNA-utgångsplatsen. I detta tillstånd flyttar peptidyl-tRNA tillbaka till P-platsen. Förlängningscykeln fortsätter mellan pre- och postkonformationerna medan ribosomen flyttar på mRNA, en kodon i taget1. Ribosomen är mycket koordinativ av olika funktionella platser för att göra denna process effektiv och exakt, såsom inter-subunit ratcheting2, tRNA hybridiseringsfluktuationer3, GTPaseaktiveringar 4, L1 stjälk öppning-stängning5,etc. Följaktligen avfasar ribosomer snabbt eftersom varje molekyl rör sig i sin egen takt. De konventionella metoderna kan bara härleda uppenbara genomsnittliga parametrar, men lågbefolkade eller kortlivade arter kommer att maskeras igenomsnittseffekten 6. Enmolekylmetod kan bryta denna begränsning genom att upptäcka varje ribosom individuellt och sedan identifiera olika arter via statistisk rekonstruktion7. Olika märkningsplatser har implementerats för att undersöka ribosomdynamik, såsom interaktioner mellan tRNA-tRNA8,EF-G-L119,L1-tRNA10,etc. Genom att märka de stora respektive små underenheterna observeras dessutom11,12. Samtidigt har smFRET-metoden breda tillämpningar i andra centrala biologiska processer, och flerfärgade FRET-metoder växer fram13.
Tidigare utvecklades ett nytt ribosom FRET-par14,15. Det rekombinanta ribosomala proteinet L27 har uttryckts, renats och märkts och införlivats tillbaka i ribosomen. Detta protein interagerade med tRNAs på nära avstånd och hjälpte till att stabilisera P-site tRNA i post-translocation komplexet. När tRNA flyttades från A- till P-platsen förkortas avståndet mellan detta protein och tRNA, vilket kan särskiljas av smFRET-signalen. Flera ribosom subpopulationer har identifierats med hjälp av statistiska metoder och mutagenes, och spontant utbyte av dessa populationer i pre- men inte post-translocation komplexet tyder ribosomen är mer flexibel innan man flyttar på mRNA, och mer stel under avkodning16,17,18. Dessa variationer är väsentliga för ribosomfunktionen. Här beskriver protokollet detaljerna i ribosom/tRNA-märkning, deras införlivande i ribosomen, smFRET-provberedningen och datainsamling/analys19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av märkt ribosom och tRNA för FRET-detektion
- Isolera ribosom utan L27 från E. coli-stammen IW312 enligt standardprotokollen20,21. Extrahera den vanliga ribosomen från E. coli-stammen MRE600.
- Klona L27:s rpmA-gen med C-terminal His-tag till pET-21b (+) plasmid, som omvandlas och uttrycks i BL21(DE3)pLysS-celler15. Rena proteinet via en färdigförpackad sepharose-kolonn.
- Märkning av L27
- Inkubera 20-100 μM renad L27 i 100 μL med 2-10-faldigt överskott av TCEP (Tris-2-carboxyetyl-fosfin) vid rumstemperatur (RT) i 30 min. Buffertväxlar lösningen till PBS-buffert (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), med en nap-5-kolumn. Tillsätt 10-faldigt överskott cy5-maleimid monoreaktivt färgämne i DMSO i lösningen och inkubera vid RT i mörkret i 2 timmar.
- Ladda den märkta proteinlösningen (500 μL) som nämns ovan på en Nap-5-kolumn för att ta bort överskottsfärgämnet. Se till att proteinet eluerar i det första färgade bandet, följt av det fria färgämnet som eluerar i det andra bandet. Samla det eluterade proteinet i 1 ml TAM10-buffert (20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2,30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA och 7 mM BME (2-mercaptoethanol)).
- Rekonstruera ribosomen med L27. Blanda det märkta L27-proteinet med lika mycket IW312 ribosom i TAM10-buffert och inkubera vid 37 °C i 1 timme. Ta bort det fria proteinet genom sackaroskudde ultracentrifugering (100 000 x g , övernatten) så att ribosomen kan bilda en blåfärgad pellet längst ner i röret.
- Märk tRNAPhe enligt den tidigare publicerade rapporten22. Inkubera först tRNA (10 A260 i 1 ml vatten) med 100 μL NaBH4 (100 mM lager, tillsätt på droppe) vid 0 °C i 1 timme. Befria tRNAs från oredovisade NaBH4 via trefaldig etanolutfällning genom att tillsätta 1/10 volym 3 M KAc (pH 5.0) och 2,5x volym etanol. Inkubera det reducerade tRNA med 1 μL Cy3-NHS färglösning (1 mg i 10 μL DMSO) i en minsta volym (~ 20 μL) på 0, 1 M natriumformat (pH 3,7). Efter 2 h inkubation vid 37 °C, separera tRNA från det oredovisade färgämnet via en liten G25 Sephadex-kolumn och ta sedan bort det fria färgämnet via tvåfaldig etanolutfällning.
2. Förberedelse av ribosomkomplexen
- Uttryck och rena de hans märkta proteinerna i IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts och tRNA synthetases medstandardmetoderna 15.
- Förbered initieringsblandningen genom att tillsätta följande ingredienser i TAM10-bufferten vid 37 °C i 15 min: 1 μM av den märkta ribosomen; 1,5 μM vardera av IF1, IF2 och IF3, 2 μM biotinylerat mRNA (kodning av MF för de två första aminosyrorna); 4 μM laddad fMet-tRNAfMet; och 1 mM GTP.
- Förbered EF-Tu_G-blandningen genom att blanda följande ingredienser i TAM10-bufferten vid 37 °C i 15 min: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP och 0,02 mg/ml pyruvatkinas.
- Förbered EF-Tu_NoG blandning som liknar steg 2.3 utan EF-G.
- Förbered Phe-blandningen genom att blanda följande ingredienser i nukleasfritt vatten vid 37 °C i 15 min: 100 mM Tris (pH 7,5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM Fenylalaninspecifik syntas, 2 A260/ml märkt tRNAPheoch 50 μM fenylalanin.
- Förbered förflyttningskomplexet (PRE) genom att blanda initierings-, EF-Tu_NoG- och Phe-blandningarna i förhållandet 1:2:2 vid 37 °C i 2 minuter. Efter inkubation, rena PRE med 1,1 M sackaroskudde ultracentrifugering över natten vid 100 000 x g.
- Förbered postflyttningskomplexet (POST) genom att blanda initierings-, EF-Tu_WG- och Phe-blandningarna i förhållandet 1:2:2 vid 37 °C i 10 min. Efter inkubation, rena POST med 1,1 M sackaroskudde ultracentrifugering över natten vid 100 000 x g.
3. Förberedelse av provbilder
- Rengör mikroskopglasets diabilder (75 mm x 25 mm) som innehåller sex par hål (1 mm i diameter). Varje par bildar ett inloppsuttag på provkammaren. Se till att avståndet mellan varje inloppshål är 13 mm och avståndet mellan mitten och mitten mellan två kanaler är 6 mm. Placera sex diabilder i en glasdegel.
- Fyll degeln med aceton och soniska dem i 5 minuter. Dekantera acetonen och skölj rutschkanorna tre gånger med ultrapurevatten. Fyll degeln igen med vatten och 1 ml 10 M KOH. Ultraljudsbehandling i 20 min.
- Skölj rutschkanorna tre gånger med ultrapurevatten. Fyll degeln igen med etanol och ultraljudsbehandling i 5 min. Dekanta lösningsmedlet helt. Låt rutschkanorna torka i rökhuven.
- Rengör mikroskopglasets täcken (#1,5 tjocklek, 24 x 40 mm). Utför rengöringsstegen enligt beskrivningen i steg 3.1-3.3.
- Grädda de rengjorda rutschkanorna och täckena vid 300 °C i 3 timmar. Håll dem i ugnen över natten för att svalna.
- Täck täcket med aminosilan. Häll i metanolblandning (100 ml metanol, 5 ml vatten, 0,5 ml HAc och 1 ml aminosilan i degeln som innehåller täcken). Värm degeln i ett vattenbad i 10 min, soniska den i 10 minuter och värm sedan degeln i vattenbadet i ytterligare 10 minuter. Dekanta metanolblandningen, skölj täcket väl i tre degel av rent vatten. Rensa ytorna med en torr kväveström genom en nål.
- Täck täckena med biotin-PEG i en laminär ren huva.
- För att göra PEG-lösningen, använd 98 mg PEG och 2-3 mg biotin-PEG i 200 μL 100 mM NaHCO3-lösning.
- Lägg ett locklip platt på en yta. Släpp försiktigt 60 μL PEG-lösning på överkanten. Lägg sedan ett annat täckskydd ovanpå det, låt kapilläreffekten sprida lösningen mellan de två täckena. Se till att inga bubblor bildas.
- Upprepa steg 3.7.2 för ytterligare två par täcken. Täck sex stycken täcklips med biotin. Om fler täcken behövs, justera mängden PEG och Biotin PEG i enlighet därmed för att göra mer PEG-lösning.
- Förvara dessa täcken i en tom tipplåda fylld med vatten och inkubera i 3 timmar i mörker.
- Efter 3 timmar separera täckena, skölj med vatten i tre på varandra följande degel och rensa med en torr kväveström. Placera de belagda täckena på ett keramiskt rack. Markera ytan med beläggning.
- Montera provkamrarna19.
- Dra vassa pipettspetsar genom hålen på glasrutschbanorna tills de passar tätt. Skrapa av de vassa ändarna tills den är helt platt mot glasytan. Kapa den andra änden av spetsen så att den är ca 5 mm för provbelastning.
- Klipp ett dubbelband med kanalmönstret på (25 x 40 mm).
- Fäst den dubbelsidiga tejpen på glasrutschbanorna på den plana sidan.
- Fäst det belagda täcket på dubbelbandsbandet. Tryck på den för att göra en tät tätning av provkammaren. Se till att den belagda sidan är vänd inåt.
4. Fret-avbildning med en molekyl
- Slå på datorn.
- Slå på mikroskopbrytaren.
- Starta laserkontrollgränssnittet och slå på lasern. Tryck på strömbrytaren på laserkontrollboxen för att värma upp lasern.
- Sätt på kamerorna.
- Starta det mikroskoprelaterade programmet. Klicka på den övre slutaren Av och klicka på lampan På.
- Förbered TAM10_WT genom att tillsätta 10 μL 5% interpolering-20 i 1 ml TAM10-buffert.
- Förbered deoxylösningen genom att väga 3 mg glukosoxidas i ett litet mikrocentrifugrör. Tillsätt 45 μL katalas. Virvel försiktigt för att lösa upp det fasta. Snurra på 20 000 x g i en mikrocentrifug i 1 min. Ta supernaten.
- Förbered 30% glukoslösning i vatten och 200 mM Trolox lösning i DMSO.
- Bered 0,5 mg/ml streptavidinlösning i nukleasfritt vatten.
- Tillsätt en droppe bildolja till TIRF-målet.
- Sätt provkamrarna på målet.
- Fyll kammaren med 10 μL streptavidinlösning. Vänta i 1 minut.
- Tvätta kammaren med 30 ml TAM10_WT och samla in genomkörningslösningen med ett vikt filterpapper. Vänta i 1 minut.
- Späd ribosomkomplexen (PRE eller POST) till 10-50 nM koncentration med TAM10_WT buffert.
- Ladda 20 μL ribosomprovet i kanalen. Vänta i 2 minuter.
- Gör bildbufferten (50 μL TAM10-buffert plus 0,5 μL vardera av deoxy-, glukos- och Trolox-lösningar). Blanda bufferten väl.
- Spola kammaren med 30 μL av bildbufferten.
- Ställ in kameran så att den får 100 ms/ram, 16 bitar, 4 x 4 binning.
- Klicka på den övre slutaren På och lampan Av.
- Starta kameraförvärv. Sprid bilderna i tre fönster som representerar två enskilda kameror och överlägget.
- Klicka på Autofokus. Finjustera för att hitta det bästa fokuset.
- Klicka på en metod. Ange fältpunkter, fillagring och loopnumret.
- Klicka på Kör.
OBS: Ett nytt fönster visas med avbildning i realtid. Tidsseriens och synfältsseriens förlopp visas högst upp i fönstret. - När bildförvärvet är klart stänger du popup-fönstret.
- Öppna ND-filen (den förvärvade filen).
- Klicka på ROI / enkel ROI-redigerare. Välj alternativet Cirkel.
- Välj ROI på bilden. Klicka på Slutför när det är klart.
- Klicka på Mått/ Tidsmätning för att visa data antingen som ett diagram eller som ett kalkylblad.
- Öppna fliken Exportera. Ange exportparametrarna.
- Klicka på Exportera för att spara intensiteterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SmFRET hade ribosomen märkt i mitten av tRNA-trafiken, för att skilja tRNA-flyttning från A- till P-platsen (Figur 1)15. Avståndet från L27-märkningsresterna till A- eller P-site tRNA är 52 respektive 61 Å, vilket motsvarar FRET-effektivitet på 0,47 respektive 0,65. Efter bildsamlingen hämtades fluorescensintensiteter från donator- och acceptorkanalerna och ritades upp när tiden förfaller (figur 1). FRET effektivitet beräknades av formeln jagacceptor/(jagacceptor+ jaggivare). Ett hemmagjort program upptäckte givarens/acceptorns enstegsblekning och monterade data före blekningspunkterna för att undvika beräkning av FRET från ljud. Efter donatorblekning närmade sig båda spåren baslinjen eftersom ingen excitation kan uppstå direkt på acceptorn (figur 2A). Efter acceptorblekning ökade donatorintensiteten eftersom färre reaktionsvägar avleder excitationsenergin (figurerna 2B,C).
Det konstaterades att de enskilda ribosomerna uppvisar olika fluktuationer, till exempel i exemplen i figur 2. Dessa fluktuationer beror på tRNAs vinglande rörelse, vilket orsakar avståndsfluktuationer till L2717,18. I figur 2är de prickade raderna de ursprungliga data, och heldragna linjer är de monterade data från programmet. De monterade spåren ändrar inte rådataavläsningen utan trunkerar tidsfördröjningsspåren efter blekning. De blå spåren är de beräknade FRET-effektivitetsvinsterna. Genom att spåra exakt samma ribosomer efter 5 minuters inkubation på RT, konstaterades det att en typ av dynamik kan byta till en annan23. Eftersom dessa signaler rapporterar om tRNA-rörelser dikteras av den omgivande ribosomen, grupperades liknande FRET effektivitet i olika ribosom subpopulationer.
Figur 3 visar mycket olika delpopulationer i PRE-komplexet. Det finns cirka 70% (640/951) fluktuerande arter och 30% (311/951) av icke-fluktuerande arter. Dessa två kategorier kan grupperas ytterligare i finare delpopulationer. Å andra sidan visar figur 4 den motsatta dynamikfördelningen. I POST är 65% av subpopulationerna icke-fluktuerande, och majoriteten av dem uppvisade hög FRET-effektivitet. Dessa resultat tyder på att ribosomen är mer flexibel i PRE-tillstånd än POST-tillståndet, vilket bekräftar en cryo-EM-studie som drog slutsatsen att peptidylkedjan vid P-platsen låser ribosomdynamiken i POST-tillståndet. Men i PRE-tillståndet överförs peptidylkedjan till A-webbplatsen, låser upp ribosomen och främjar5. Resultaten stödde strukturstudiens slutsats under mer fysiologiska förhållanden. Det olåsta tillståndet är korrelerat med spärrrörelsen mellan 30S och 50S, och det låsta tillståndet är korrelerat med den ospärrade konformationen.
Subpopulationssorteringsmetoden avslöjar ribosomkonformationen vid hämning av antibiotikumet viomycin, vilket visas i figur 514. Det övergripande FRET-effektivitets histogrammet visar en stor topp på 0,47, det klassiska tillståndet, utan sortering. I detta tillstånd är ribosomen låst och ospärrad. Men att sortera subpopulationerna har avslöjat att 60% av befolkningen fluktuerar som det olåsta PRE-komplexet. Därför har viomycin fångat ribosomen vid spärrtillståndet. Resultaten av denna studie motsade ett röntgenstrukturresultat vid publicerings tidpunkten (2010) men stöddes nyligen av en annan strukturstudie (2020).
Figur 1:Cy3/Cy5:s märkningsposition på ribosomen och tRNA. Avstånden mellan märkningsresterna av L27 till TRNA för A- och P-plats visas (de röda och blå stjärnorna visar de ungefärliga märkningsplatserna för Cy5 respektive Cy3). Ett representativt tidsfördröjningsspår av fluorescensintensiteter från CY3/Cy5 FRET-paret visas. Ett program upptäcker blekningspunkter på donator-/acceptorspår och trunkerar spårningen före den punkten. Denna siffra har ändrats från Altuntop, M. E. et al.15. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:De typiska ribosomspåren klassificeradesefter deras olika dynamik. B)Ett fluktuerande ribosomspår som endast tar prover på FRET-värden som är lägre än 0,6. C)Ett fluktuerande ribosomspår som tar prover på ETT FRET-värde som är högre än 0,6. Legenderna visas i handlingen. Fluorescensintensiteterna hos givare och acceptor är gröna respektive magenta. FRET-värden beräknas som jagacceptor/(jagacceptor+Igivare)och plottas separat i blått. De ursprungliga data visas i prickade linjer och data trunkeras innan blekningspunkterna visas i heldragna linjer. Denna siffra har ändrats från Altuntop, M. E. et al.15. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:FRET-effektivitets histogram av pre-komplexet. Toppklassiga tomter visar FRET histogram av de totala ribosomerna. De andra nivåernas tomter visar FRET-histogrammen i ribosomerna uppdelade i fluktuerande (F) och icke-fluktuerande (NF) grupper. De tredje nivåns tomter visar FRET histogram av ribosomer ytterligare uppdelade i grupper av fluktuationer som var över eller under ett FRET-värde på 0,6. Liknande kriterier tillämpades på NF-ribosomerna för att separera dem i stabila FRET-tillstånd under eller över 0,6 (NF-låg, NF-hög). De fjärde nivåerna visar de representativa spåren för varje delpopulation. Denna siffra har ändrats från Altuntop, M. E. et al.15. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:FRET effektivitet histogram av POST-Complex. Arrangemanget och gruppningen liknar figur 3. I motsats till figur 3är den NF-höga befolkningen majoriteten. Denna siffra har ändrats från Altuntop, M. E. et al.15. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Histogram av PRE-komplexet i närvaro av 100 μM viomycin. Arrangemanget och gruppningen liknar figur 3. Denna siffra har ändrats från Ly, C. T. et al.14. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SmFRET är känsligt för bakgrundssignaler. Först är det nödvändigt att täcka provkammaren med 0,05% interpolering och sedan tillsättas samtidigt med ribosomlösningen för att blockera icke-specifik bindning av ribosomen till ytan. För att se fluorescens från acceptorn Cy5-utsläpp är syrereningscocktailen (deoxy-, glukos- och Trolox-lösningar) viktig. Utan denna lösning är blekningen för snabb i acceptorkanalen för att få användbar information. Ett annat kritiskt steg för ribosomexperiment är specifikt PEG-beläggningen på glasytan. Ribosomaktiviteten är känslig för ytmiljön; Därför är långa borstpolymerer nödvändiga för att skydda ogynnsamma yteffekter.
Om exempelsteget är för långt från fokus fungerar inte systemet för automatisk fokusering. Om detta händer stänger du av autofokus och justerar objektivpositionen manuellt samtidigt som du observerar den reflekterade laserpunkten. Detta är en fördel med en hembyggd total intern reflektionsbelysning eftersom laserfläcken är synlig. När målet är nära fokus bör incidenten och de reflekterade laserfläckarna vara sida vid sida, och den reflekterande punkten rör sig med justeringen av objektivpositionen. När dessa två platser är nära fungerar autofokus igen.
En begränsning av smFRET är det mycket låga koncentrationsområdet. Endast upp till 50 nM fluorescerande märkta substrat kan laddas utan att orsaka hämmande bakgrundsljud. Även om ytbundna prover kan kräva långvarigt förvärv på samma molekyl, är tidsupplösningen begränsad till ms-intervallet, medan diffusionsbaserad konfokal smFRET kan nå dynamiken i μs-intervallet24. En annan begränsning av FRET-metoden är den exakta beräkningen av avståndet från FRET-effektiviteten. På grund av olika färglänkare och miljöer varierar Forster-avståndet från labb till labb. Därför kan det vara problematiskt att jämföra absolutavstånd 25. Även om FRET effektivitetsändring avslöjar flyttningsmekanismen, utvecklades en mer direkt strategi för att mäta den exakta täckningen av ribosom på mRNA26,27.
Att använda FRET-värden som relativa referenser för att skilja inhomogena populationer inom en experimentell inställning är dock en kraftfull metod för att avslöja mekanism och dynamik en molekyl i taget, som inte är tillgänglig med konventionella metoder. Dessutom kommer multi-color FRET och kombinationen av FRET med en optisk fälla att avslöja mer orkestrerad ribosomdynamik i framtiden28. Denna utveckling ger oöverträffad känslighet (förskjutning av Å-avstånd) och nya parametrar (t.ex. krafter av pico-Newton-magnitud) som inte kan uppnås med befintliga metoder28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wang förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av US National Institutes of Health (R01GM111452) och Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
