Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62664
Automatic Translation
1
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

Enkelt molekyle fluorescens energioverførsel er en metode, der sporer tRNA dynamik under ribosomal protein syntese. Ved at spore individuelle ribosomer identificeres inhomogene populationer, som kaster lys over mekanismer. Denne metode kan bruges til at spore biologiske kropsbygningsændringer generelt for at afsløre dynamiske funktionsforhold i mange andre komplekse biosystemer. Enkeltmolekylemetoder kan observere ikke-hastighedsbegrænsende trin og lavt befolkede nøgleprodukter, som ikke er tilgængelige med konventionelle ensemblemetoder på grund af den gennemsnitlige effekt.

Abstract

Ribosom er et stort ribonucleoprotein kompleks, der samler proteiner processivt langs mRNA skabeloner. Diameteren af ribosom er ca 20 nm til at rumme store tRNA substrater på A-, P- og E-steder. Derfor er ribosomdynamikken naturligvis affaset hurtigt. Enkeltmolekylemetode kan detektere hvert ribosom separat og skelne inhomogene populationer, hvilket er vigtigt for at afsløre de komplicerede mekanismer i flerkomponentsystemer. Vi rapporterer detaljerne i en smFRET metode baseret på Nikon Ti2 omvendt mikroskop til sonde ribosom dynamik mellem ribosomale protein L27 og tRNAs. L27 er mærket på sin unikke Cys 53 position og rekonstitueret til en ribosom, der er konstrueret til at mangle L27. TRNA er mærket på sin albue region. Efterhånden som tRNA bevæger sig til forskellige steder inde i ribosomet under forlængelsescyklussen, såsom præ- og eftertranslokation, udviser FRET-effektivitetsgevinster og dynamikforskelle, som har foreslået flere delpopulationer. Disse delpopulationer kan ikke påvises ved ensemble metoder. Det TIRF-baserede smFRET-mikroskop er bygget på et manuelt eller motoriseret omvendt mikroskop med hjemmebygget laserbelysning. Ribosomprøverne renses af ultracentrifugering, indlæses i en hjemmebygget multikanalprøvecelle og belyses derefter via et evanescent laserfelt. Refleksion laser stedet kan bruges til at opnå feedback kontrol af perfekt fokus. Fluorescenssignalerne adskilles af et motoriseret filtertårn og indsamles af to digitale CMOS-kameraer. Intensiteterne hentes via NIS-Elements software.

Introduction

Ribosomet er et ø 20 nm stort ribonucleoproteinkompleks af et stort (50S) og en lille (30S) underenhed. Det samler lange peptider langs mRNA-skabelonen processivt og samarbejdsvilligt. Ribosomet 30S binder sig til fMet-tRNAfMet og mRNA for at starte proteinsyntese, og 50S slutter sig derefter til 70S-indvielseskomplekset. TRNAs bringer aminosyrer til ribosom på A-stedet (aminoacyl- tRNA bindingssted), mens den aflange peptidylkæde holdes på P-stedet (peptidyl- tRNA bindingssted). I prætranslokationskomplekset overføres peptidylkæden til tRNA på A-stedet med en aminosyre tilsat. I mellemtiden er P-site tRNA deacylated. Derefter flytter A-, P- tRNAs til P-, E- sites for at danne post-translocation komplekset, hvor E-webstedet repræsenterer tRNA-udgangsstedet. I denne tilstand flytter peptidyl-tRNA tilbage til P-stedet. Forlængelsescyklussen fortsætter mellem præ- og postkonformationerne, mens ribosomet translocerer på mRNA, en codon ad gangen1. Ribosom er meget koordinerende for forskellige funktionelle steder for at gøre denne proces effektiv og præcis, såsom inter-subunit ratcheting2,tRNA hybridisering udsving3,GTPase aktiveringer4,L1 stilk åbning-lukning5, osv. Derfor ribosomer hurtigt de-fase, fordi hvert molekyle bevæger sig i sit eget tempo. De konventionelle metoder kan kun udlede tilsyneladende gennemsnitlige parametre, men lavtbefolkede eller kortvarige arter vil blive maskeret i den gennemsnitlige effekt6. Enkelt molekyle metode kan bryde denne begrænsning ved at opdage hver ribosom individuelt, derefter identificere forskellige arter via statistisk rekonstruktion7. Forskellige mærkningssteder er blevet implementeret for at sonde ribosom dynamik, såsom samspillet mellem tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10,osv. Derudover observeres der ved mærkning af de store og små underenheder henholdsvis inter-subunit ratcheting kinetics og koordinering med faktorer11,12. I mellemtiden har smFRET-metoden brede anvendelser i andre centrale biologiske processer, og fret-metoder med flere farver dukkerop 13.

Tidligere en ny ribosom FRET par blev udviklet14,15. Den rekombinante ribosomale protein L27 er blevet udtrykt, renset, og mærket, og indarbejdet tilbage i ribosom. Dette protein interagerede med tRNAs på tæt afstand og hjalp med at stabilisere P-site tRNA i post-translokationskomplekset. Når tRNA flyttes fra A- til P-stedet, forkortet afstanden mellem dette protein og tRNA, hvilket kan skelnes af smFRET-signalet. Der er identificeret flere ribosomunderpopulationer ved hjælp af statistiske metoder og mutagenese, og spontan udveksling af disse populationer i prætranslokationskomplekset tyder på, at ribosomet er mere fleksibelt, før det bevæger sig på mRNA og mere stiv under afkodning16,17,18. Disse variationer er afgørende for ribosomfunktionen. Her beskriver protokollen detaljerne i ribosom /tRNA-mærkning, deres inkorporering i ribosom, smFRET prøveforberedelse og dataindsamling / analyse19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af mærket ribosom og tRNA til FRET-detektion

  1. Isoler ribosom uden L27 fra E. coli stamme IW312 i henhold til standardprotokol20,21. Udtræk den almindelige ribosom fra E. coli stamme MRE600.
  2. Klon L27's rpmA-gen med C-terminal His-tag til pET-21b (+) plasmid, som omdannes og udtrykkes i BL21(DE3)pLysS-celler15. Rense proteinet via en færdigpakket sepharose kolonne.
  3. Mærkning af L27
    1. Inkuber 20-100 μM renset L27 i 100 μL med 2-10 gange overskydende TCEP (Tris-2-carboxyethyl-fosphin) ved stuetemperatur (RT) i 30 min. Bufferen ombytter løsningen til PBS-buffer (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl) ved hjælp af en nap-5 kolonne. Tilsæt 10 gange overskydende Cy5-maleimid monoreaktivt farvestof i DMSO i opløsningen og inkuber ved RT i mørke i 2 timer.
    2. Læg ovennævnte mærkede proteinopløsning (500 μL) på en Nap-5-kolonne for at fjerne det overskydende farvestof. Sørg for, at proteinet elutes i den første farvede bånd, efterfulgt af den frie farvestof elute i det andet bånd, henholdsvis. Det eluterede protein opsamles i 1 mL TAM10-buffer (20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA og 7 mM BME (2-mercaptoethanol)).
  4. Rekonstruer ribosomet med L27. Bland det mærkede L27-protein med en tilsvarende mængde IW312 ribosom i TAM10-buffer og inkuber ved 37 °C i 1 time. Fjern det frie protein ved saccharosepude ultracentrifugering (100.000 x g, natten over) for at gøre det muligt for ribosomet at danne en blåfarvet pellet i bunden af røret.
  5. Mærk tRNAPhe i henhold til den tidligere offentliggjorte rapport22. Inkuberes først tRNA (10 A260 i 1 mL vand) med 100 μL NaBH4 (100 mM lager, tilsætning dropwise) ved 0 °C i 1 time. Frigør tRNA'erne fra upræsenteret NaBH4 via tre gange ethanoludfældning ved at tilsætte 1/10 volumen på 3 M KAc (pH 5,0) og 2,5x mængde ethanol. Inkuberes den reducerede tRNA med 1 μL Cy3-NHS-farveopløsning (1 mg i 10 μL DMSO) i et minimumvolumen (~20 μL) på 0,1 M natriumformat (pH 3,7). Efter 2 timers inkubation ved 37 °C adskilles tRNA'et fra det ikke-reakterede farvestof via en lille G25 Sephadex-kolonne, og det frie farvestof fjernes derefter via to gange ethanoludfældning.

2. Forberedelse af ribosomkomplekserne

  1. Udtrykke og rense de hist mærkede proteiner i IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts og tRNA synthetaser ved hjælp af standardmetoder15.
  2. Indledningsblandingen tilsættes ved tilsætning af følgende ingredienser i TAM10-bufferen ved 37 °C i 15 min. 1,5 μM hver af IF1, IF2 og IF3 2 μM biotinyleret mRNA (kodende MF for de to første aminosyrer); 4 μM opladet fMet-tRNAfMet; og 1 mM GTP.
  3. EF-Tu_G blandes ved at blande følgende ingredienser i TAM10 buffer ved 37 °C i 15 min: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP og 0,02 mg/mL Pyruvat Kinase.
  4. Forbered EF-Tu_NoG mix svarende til trin 2.3 uden EF-G.
  5. Phe-blandingen tilberedes ved at blande følgende ingredienser i nucleasefrit vand ved 37 °C i 15 min. 100 mM Tris (pH 7,5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM Phenylalaninspecifik synthetase, 2 A260/mL mærket tRNAPheog 50 μM phenylalanin.
  6. Pretranslokationskomplekset (PRE) forberedes ved at blande indledningen, EF-Tu_NoG og Phe blandes i forholdet 1:2:2 ved 37 °C i 2 min. Efter inkubation rense pre med 1,1 M saccharose pude ultracentrifugering natten over ved 100.000 x g.
  7. Forbered post-translokationskomplekset (POST) ved at blande indledningen, EF-Tu_WG og Phe blander sig i forholdet 1:2:2 ved 37 °C i 10 min. Efter inkubation renses POST med 1,1 M saccharosepude ultracentrifugering natten over ved 100.000 x g.

3. Udarbejdelse af prøverutschebaner

  1. Rengør mikroskopglasrutschebanerne (75 mm x 25 mm), der indeholder seks par huller (1 mm i diameter). Hvert par danner en indløbsudtag af prøvekammeret. Sørg for, at afstanden mellem hvert indløbshul er 13 mm, og midt-til-center afstanden mellem to kanaler er 6 mm. Placer seks dias i en glasdigel.
  2. Fyld diglen med acetone og soniker dem i 5 min. Dekant acetone og skyl dias tre gange med ultrapure vand. Fyld diglen igen med vand og 1 mL på 10 M KOH. Sonikere i 20 min.
  3. Skyl rutsjebanerne tre gange med ultrapurt vand. Fyld diglen igen med ethanol og soniker i 5 min. Opløsningsmidlet dekanterer fuldstændigt. Lad rutsjebanerne tørre i røghætten.
  4. Rengør mikroskopglasdækslerne (#1,5 tykkelse, 24 x 40 mm). Udfør rengøringstrinnene som beskrevet i trin 3.1-3.3.
  5. Bag de rensede rutsjebaner og coverlips ved 300 °C i 3 timer. Hold dem i ovnen natten over for at køle af.
  6. Coat coverlip med aminosilane. Hæld i methanolblanding (100 mL methanol, 5 mL vand, 0,5 mL HAc og 1 mL aminosilane) i diglen indeholdende dæksler. Varm diglen i et vandbad i 10 min, soniker den i 10 min, og varm derefter diglen i vandbadet i yderligere 10 minutter. Dekanter methanolblandingen, skyl dækslet godt i tre digler af rent vand. Rens overfladerne med en tør nitrogenstrøm gennem en nål.
  7. Coat coverlips med biotin-PEG i en laminar ren hætte.
    1. For at fremstille PEG-løsningen skal du bruge 98 mg PEG og 2-3 mg biotin-PEG i 200 μL på 100 mM NaHCO3-opløsning.
    2. Læg en coverlip fladt på en overflade. Smid forsigtigt 60 μL PEG-opløsning på den øverste kant. Læg derefter en anden coverlip oven på den, så kapillæreffekten spredes opløsningen mellem de to coverlips. Sørg for, at der ikke dannes bobler.
    3. Gentag trin 3.7.2 for yderligere to par coverslips. Coat seks stykker coverlips med biotin. Hvis der er behov for flere coverlips, skal du justere mængden af PEG og Biotin PEG i overensstemmelse hermed for at lave mere PEG-løsning.
    4. Opbevar disse coverlips i en tom tipboks fyldt med vand og inkuber i 3 timer i mørket.
    5. Efter 3 timer adskilles dækslerne, skylles med vand i tre på hinanden følgende digler og renses med en tør nitrogenstrøm. Placer de coatede coverlips på et keramisk stativ. Markér overfladen med belægning.
  8. Prøvekamrenesamles 19.
    1. Træk skarpe pipettespidser gennem hullerne på glasrutschebanerne, indtil de passer stramt. Skrab de skarpe ender af, indtil den er helt flad til glasoverfladen. Skær den anden ende af spidsen til at være ca. 5 mm til prøvebelastning.
    2. Klip et dobbeltsidet bånd med kanalmønsteret på (25 x 40 mm).
    3. Sæt det dobbeltsidede bånd på glasrutschebanerne på den flade side.
    4. Stik den coatede coverlip på det dobbeltsidede bånd. Tryk på den for at lave en tæt forsegling af prøvekammeret. Sørg for, at den coatede side vender indad.

4. Enkeltmolekyle FRET billeddannelse

  1. Tænd computeren.
  2. Tænd for mikroskopkontakten.
  3. Start laserstyringsgrænsefladen, og tænd for laseren. Tryk på aktiveringsknappen på laserkontrolboksen for at opvarme laseren.
  4. Tænd for kameraerne.
  5. Start det mikroskop-tilknyttede softwareprogram. Klik på den øverste lukker fra og klik på lampen På.
  6. Tam10_WT bufferen forberedes ved at tilsætte 10 μL på 5% Tween-20 i 1 mL TAM10 buffer.
  7. Deoxyopløsningen forberedes ved at veje 3 mg glukoseoxidase i et lille mikrocentrifugerør. Der tilsættes 45 μL katalase. Vortex forsigtigt at opløse den faste. Spin ved 20.000 x g i et mikrocentrifuge i 1 min. Tag supernatanten.
  8. Klargør 30% glukoseopløsning i vand og 200 mM Trolox opløsning i DMSO.
  9. Der fremstilles 0,5 mg/mL streptavidinopløsning i nukleasefrit vand.
  10. Tilføj en dråbe billedolie til TIRF-målet.
  11. Sæt prøvekamrene på målet.
  12. Fyld kammeret med 10 μL streptavidinopløsning. Vent i 1 minut.
  13. Vask kammeret med 30 mL TAM10_WT buffer og opsamle gennemløbsopløsningen med et foldet filterpapir. Vent i 1 minut.
  14. Fortynd ribosomkomplekserne (PRE eller POST) til 10-50 nM koncentration med TAM10_WT buffer.
  15. Læg 20 μL af ribosomprøven i kanalen. Vent i 2 minutter.
  16. Der fremstilles billedbuffer (50 μL TAM10-buffer plus 0,5 μL hver af deoxy-, glukose- og Trolox-opløsninger). Bland bufferen godt.
  17. Skyl kammeret med 30 μL af billedbufferen.
  18. Indstil kameraet til at anskaffe 100 ms/frame, 16 bit, 4 x 4 binning.
  19. Klik på den øverste lukker til og lampen Slukket.
  20. Start kamera erhvervelse. Spred billederne i tre vinduer, der repræsenterer to individuelle kameraer og overlejringen.
  21. Klik på Autofokus. Finjustere for at finde det bedste fokus.
  22. Klik på en metode. Angiv feltpunkter, fillagring og løkkenummer.
  23. Klik på Kør.
    BEMÆRK: Der vises et nyt vindue med billedbehandling i realtid. Status for tidsserien og visningsserierne vises øverst i vinduet.
  24. Når billedopsamlingen er fuldført, skal du lukke pop op-vinduet.
  25. Åbn ND-filen (den købte fil).
  26. Klik på ROI / simpel ROI editor. Vælg indstillingen Cirkel.
  27. Vælg investeringsafkast på billedet. Klik på Udfør, når den er færdig.
  28. Klik på Måling/ Tidsmåling for at få vist dataene enten som et plot eller som et regneark.
  29. Åbn fanen Eksporter. Angiv eksportparametrene.
  30. Klik på Eksporter for at gemme intensiteterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SmFRET havde ribosom mærket i midten position af tRNA trafik, at skelne tRNA translokation fra A- til P-site (Figur 1)15. Afstanden fra L27-mærkningsresterne til TRNA på A- eller P-stedet er henholdsvis 52 eller 61 Å, svarende til FRET-effektivitet på 0,47 og 0,65. Efter billedsamlingen blev fluorescensintensiteter fra donor- og acceptorkanaler hentet og plottet, efterhånden som tiden udløber (figur 1). FRET effektivitet blev beregnet af formlen jegacceptor/(Jegacceptor+Idonor). Et hjemmelavet program opdagede entrins blegning af donoren / acceptoren og monterede dataene før blegningsstederne for at undgå beregning af FRET fra lyde. Efter donorblegning nærmede begge spor sig basislinjen, fordi der ikke kan forekomme excitation direkte på acceptoren (Figur 2A). Efter acceptor blegning steg donorintensiteten, fordi færre reaktionsveje spreder excitationsenergien (Figur 2B,C).

Det blev konstateret, at de enkelte ribosomer udviser forskellige udsving, som i de eksempler, der er vist i figur 2. Disse udsving skyldes tRNAs' vaklende bevægelse, hvilket forårsager afstandsudsving til L2717,18. I figur 2er de stiplede linjer de oprindelige data, og faste linjer er de monterede data fra programmet. De monterede spor ændrer ikke den rå dataaflæsning, men afkorter time-lapse-sporene efter blegning. De blå spor er de beregnede FRET-effektivitetsgevinster. Ved at spore nøjagtig de samme ribosomer efter 5 minutters inkubation på RT blev det konstateret, at en type dynamik kan skifte til en anden23. Fordi disse signaler rapport om tRNA beslutningsforslag dikteret af de omkringliggende ribosom, lignende FRET effektivitetsgevinster blev grupperet i forskellige ribosom delpopulationer.

Figur 3 viser meget forskellige delpopulationer i PRE-komplekset. Der er ca. 70% (640/951) af svingende arter og 30% (311/951) af ikke-svingende arter. Disse to kategorier kan yderligere grupperes i finere delpopulationer. På den anden side viser figur 4 den modsatte dynamikfordeling. I POST er 65% af delpopulationerne ikke svingende, og de fleste af dem udviste høj FRET-effektivitet. Disse resultater tyder på, at ribosom er mere fleksibel i PRE tilstand end POST tilstand, som bekræfter en cryo-EM undersøgelse, der konkluderede, at peptidyl kæde på P-site låser ribosom dynamik i POST tilstand. Men i PRE-tilstanden overføres peptidylkæden til A-webstedet, låser ribosomet op og promoverer5. Resultaterne understøttede strukturundersøgelsens konklusion under mere fysiologiske forhold. Den ulåste tilstand er korreleret med ratcheting bevægelse mellem 30S og 50S, og den låste tilstand er korreleret med den ikke-skralde kropsbygning.

Delpopulationssorteringsmetoden afslører ribosomkonformationen ved hæmning af antibiotika viomycin, som vist i figur 514. Den samlede FRET effektivitet histogramme viser en stor top på 0,47, den klassiske tilstand, uden sortering. I denne tilstand er ribosomet låst og ikke-skraldet. Sorteringen af delpopulationerne har imidlertid vist, at 60% af befolkningen svinger som det ulåste PRE-kompleks. Derfor har viomycin fanget ribosomet i den skraldede tilstand. Resultaterne af denne undersøgelse modsagde et røntgenstrukturresultat på udgivelsestidspunktet (2010), men blev for nylig understøttet af en anden strukturundersøgelse (2020).

Figure 1
Figur 1: Cy3/Cy5's mærkningsposition på ribosomet og tRNA' et. Afstandene mellem mærkningsresterne af L27 til TRNA på A- og P-stedet vises (de røde og blå stjerner viser henholdsvis cy5- og cy3-mærkernes omtrentlige mærkningssteder). Der vises et repræsentativt spor af fluorescensintensiteter fra CY3/Cy5 FRET-parret. Et program registrerer blegning punkter på donor / acceptor spor og afkorter sporet før dette punkt. Dette tal er blevet ændret fra Altuntop, M.E. et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: De typiske ribosomspor blev klassificeret efter deres forskellige dynamikker. (A) Et ikke-svingende ribosomspor. (B) Et svingende ribosomspor, der kun prøver FRET-værdier, der er lavere end 0,6. (C) Et svingende ribosomspor, der prøver FRET-værdien, der er højere end 0,6. Legenderne vises i plottet. Fluorescensintensiteterne for donor og acceptor er henholdsvis grønne og magenta. FRET-værdier beregnes somjeg accepterer/(Iacceptor+Idonor)og afbildes separat i blåt. De oprindelige data vises på stiplede linjer, og data afkortes, før blegepunkterne vises i faste linjer. Dette tal er blevet ændret fra Altuntop, M.E. et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: FRET-effektivitets histogrammer fra prækomplekset. De øverste parceller viser FRET histogrammet af de samlede ribosomer. De andet niveau plots viser FRET histogrammer af ribosomer adskilt i svingende (F) og ikke-svingende (NF) grupper. De tredje-tier plots viser FRET histogrammer af ribosomer yderligere opdelt i grupper af udsving, der var over eller under en FRET værdi på 0,6. Lignende kriterier blev anvendt på NF ribosomer for at opdele dem i stabile FRET-tilstande under eller over 0,6 (NF-lav, NF-høj). De fjerde niveau plots vise de repræsentative spor for hver delpopulation. Dette tal er blevet ændret fra Altuntop, M.E. et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: FRET effektivitet histogrammer af POST-Complex. Arrangementet og gruppering svarer til figur 3. I modsætning til figur 3er NF-Høj befolkning flertallet. Dette tal er blevet ændret fra Altuntop, M.E. et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Histogrammer af PRE-komplekset i nærværelse af 100 μM viomycin. Arrangementet og gruppering svarer til figur 3. Dette tal er blevet ændret fra Ly, C.T. et al.14. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SmFRET er følsom over for baggrundssignaler. For det første er det nødvendigt at belægge prøvekammeret med 0,05% mellem og derefter tilsættes samtidig med ribosomopløsningen for at blokere ikke-specifik binding af ribosomet til overfladen. For at se fluorescens fra acceptor Cy5 emission, ilt scavenger cocktail (deoxy, glukose, og Trolox løsninger) er afgørende. Uden denne løsning er blegningen for hurtig i acceptorkanalen til at få nyttige oplysninger. Et andet kritisk skridt for ribosomforsøg er specifikt PEG-belægningen på glasoverfladen. Ribosomaktiviteten er følsom over for overflademiljøet; derfor er lange børstningspolymer afgørende for at beskytte ugunstige overfladeeffekter.

Hvis prøvestadiet er for langt fra fokus, fungerer det automatiske fokuseringssystem ikke. Hvis dette sker, skal du slukke for autofokus og manuelt justere målpositionen, mens du observerer den reflekterede laserplet. Dette er en fordel ved en hjemmebygget total intern refleksion belysning, fordi laser stedet er synlig. Når målet er tæt på fokus, skal hændelsen og reflekterede laserpletter være side om side, og det reflekterende sted bevæger sig med justeringen af målpositionen. Når disse to steder er tæt på, vil autofokus fungere igen.

En begrænsning af smFRET er det meget lave koncentrationsområde. Kun op til 50 nM fluorescerende mærkede substrater kan lastes uden at forårsage hæmmende baggrundsstøj. Selvom overfladebundne prøver kan kræve langvarig erhvervelse på det samme molekyle, er tidsopløsningen begrænset til ms-området, mens diffusionsbaseret konfokal smFRET kan nå dynamikken i μs-området24. En anden begrænsning af FRET-metoden er den præcise beregning af afstanden fra FRET-effektivitet. På grund af forskellige farvestoffer linkere og miljøer, Forster afstand varierer fra lab til lab. Derfor kan sammenligning af absolut afstand være problematisk25. Selvom FRET-effektivitetsændringer afslører translokationsmekanismen, blev der udviklet en mere direkte strategi for at måle den nøjagtige dækning af ribosom på mRNA26,27.

Ikke desto mindre er det en kraftfuld metode til at afsløre mekanisme og dynamik et molekyle ad gangen, som ikke er tilgængelig med konventionelle metoder, ved at bruge FRET-værdier som relative referencer til at skelne inhomogene populationer inden for en eksperimentel indstilling. Desuden vil multi-farve FRET og kombinationen af FRET med en optisk fælde afsløre mere orkestreret ribosom dynamik i fremtiden28. Denne udvikling giver hidtil uset følsomhed (forskydning af Å afstand) og nye parametre (såsom kræfter pico-Newton størrelsesorden), der ikke kan opnås med eksisterende metoder28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Y. Wang erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af US National Institutes of Health (R01GM111452) og Welch Foundation (E-1721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminosilane Laysanbio MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG Laysanbio Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells Novagen 71403
Catalase millipore sigma C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge nuaire
Cy3/C5-maleimide ApexBio A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood Baker
Glucose oxidase millipore sigma G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column) Cytiva 17524701
Microscope cover slip VWR 48393-230
Microscope glass slides VWR 470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera Hamamatsu
PEG (5,000) Laysanbio MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid Novagen 69741
Sonicator VWR CPX-952-518R
TCEP Apexbio B6055
Trolox millipore sigma 238813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
  2. Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
  3. Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
  4. Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
  5. Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
  6. Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
  7. Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  8. Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
  9. Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
  10. Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
  11. Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
  12. Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
  13. Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
  14. Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
  15. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
  16. Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
  17. Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
  18. Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
  19. Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
  20. Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
  21. Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
  22. Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
  23. Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
  24. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
  25. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  26. Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
  27. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
  28. Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).

Tags

Biokemi udgave 173
Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. Single Molecule… More

Wang, Y. Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis. J. Vis. Exp. (173), e62664, doi:10.3791/62664 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter