Summary
Bu makalede, birincil ve ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattında UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır.
Abstract
Bu makalede, primer (pHCEC) ve ölümsüzleştirilmiş (iHCEC) insan kornea epitel hücre kültürleri üzerinde ultraviyole (UV) radyasyon ve oküler toksinlerin toksisitesini ölçme yöntemleri açıklanmaktadır. Hücreler UV radyasyonuna ve toksik dozlarda benzalkonyum klorür (BAK), hidrojen peroksit (H2O2) ve sodyum dodesil sülfat (SDS) dozlarına maruz bırakıldı. Metabolik aktivite metabolik bir tahlil kullanılarak ölçüldü. İnflamatuar sitokinlerin salınımı multipleks interlökin (IL)-1β, IL-6, IL-8 ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) testi kullanılarak ölçüldü ve hücreler floresan boyalar kullanılarak canlılık açısından değerlendirildi.
UV'nin hücre metabolik aktivitesi ve sitokin salınımı üzerindeki zararlı etkileri, iHCEC için 5 dakika UV maruziyetinde ve pHCEC için 20 dakika UV maruziyetinde meydana gelmiştir. İHCEC ve pHCEC'in metabolik aktivitesindeki benzer yüzde düşüşleri, BAK, H2O2veya SDS'ye maruz kaldıktan sonra meydana geldi ve sitokin salınımındaki en önemli değişiklikler IL-6 ve IL-8 için meydana geldi. Floresan olarak boyanmış iHCEC ve pHCEC BAK'a maruz kalan hücrelerin mikroskopisi,% 0.005 BAK maruziyetinde hücre ölümü gösterdi, ancak iHCEC'lerde etidyum boyama derecesi pHCEC'lerden daha büyüktü. Mikroskopi kullanarak toksik etkileri değerlendirmek, metabolik aktivitenin değerlendirilmesi ve sitokin üretimi için birçok yöntem kullanılarak, UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesi hem birincil hem de ölümsüzleştirilmiş hücre hatları için belirlenebilir.
Introduction
Hücrelere zarar verebilecek kimyasalların ve diğer ajanların toksik etkilerini tahmin etmek için in vitro toksikoloji çalışmaları yapılmaktadır. Korneaya toksisitenin değerlendirilmesinde, insan kornea epitel hücreleri (HCEC'ler) bu etkilerin değerlendirilmesi için modellerde kullanılmıştır 1,2,3,4. Bu modeller tipik olarak hücrenin metabolik aktivitesindeki değişiklikler, hücre proliferasyonu ve enflamatuar sitokinlerin üretimi ve salınımı gibi diğer hücre fonksiyonları gibi fizyolojik etkileri değerlendirir. Bu toksikoloji çalışmaları için, kimyasalların ve UV radyasyonunun HCEC'ler üzerindeki zararlı etkilerini değerlendirmek için çeşitli kaynaklardan hücreler seçilmiştir 2,3. pHCEC hatları, bu hücreleri yetişkinlerin donör dokularından sağlayan şirketlerden temin edilebilir. Birincil hücreler dispaz ile tedavi edilebilir ve kültür5 için korneadan nazikçe kazınabilir. Hücreler daha sonra virüsler ve kontaminasyon açısından test edilir ve daha sonra% 10 dimetil sülfoksit içinde kriyokorunmuş olarak gönderilir.
Birincil hücre hatlarının avantajı, hücrelerin genetik olarak donörün hücreleriyle aynı olmasıdır. Bu idealdir, çünkü in vitro bir model in vivo dokuyu mümkün olduğunca taklit etmelidir. Birincil hücre hatlarının dezavantajı, sınırlı sayıda hücre bölünmesine veya pasajına sahip olmalarıdır6. Mevcut sınırlı sayıda hücre, tek bir birincil kültürle yapılabilecek deney sayısını kısıtlar ve deneylerin maliyetini artırır.
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre kültürü toksisite modellerinde de kullanılmıştır. Bununla birlikte, in vivo dokudan elde edilen birincil hücre hattının aksine, ölümsüzleştirilmiş hücre hattı genetik olarak değiştirilmiştir. Ölümsüzleştirilmiş hücreler, bir virüsün genlerinin birincil hücrelerin DNA'sına dahil edilmesiyle oluşturulur 6,7,8. Başarılı viral gen katılımına sahip hücreler, ölümsüzleştirilmiş hücre hattı için seçilir. Ölümsüzleştirmenin avantajı, sınırsız sayıda hücrenin aynı hücre hattını kullanarak birden fazla deney yapmasını sağlayarak sınırsız hızlı çoğalmaya izin vermesidir. Bu, deneyler arasında tutarlılık sağlar ve maliyeti azaltır.
Hücre proliferasyonunu sınırlayan genlerdeki değişikliklere ek olarak, kritik işlevselliğe sahip genlerin ekspresyonunda da değişiklikler meydana gelebilir9. Bu nedenle, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin kullanılmasının dezavantajı, çeşitli dış uyaranlara tepkileri açısından orijinal in vivo hücreleri artık temsil edememeleridir10. Karşılaştırmalar, kimyasalların primer ve ölümsüzleştirilmiş insan kornea keratositleri11, ayrıca ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler ve tavşan kornea epitelyal primer hücreleri12 üzerindeki toksik etkilerini gözlemlemeyi içermektedir. Toksinlerin primer insan keratositleri ile ölümsüzleştirilmiş keratositler üzerindeki etkileri arasındaki karşılaştırmada anlamlı bir fark görülmemiştir11. Bu makalede detaylandırılan yöntemler kullanılarak, UV radyasyonunun ve oküler toksinlerin pHCEC'ler ve iHCEC'ler üzerindeki toksisitesini değerlendirmek için bu testlerin etkinliği belirlenecektir.
İn vitro testlerde yaygın olarak kullanılan üç oküler toksin seçildi: BAK, H2,O2ve SDS. BAK, oftalmik çözeltilerde yaygın olarak kullanılan katyonik bir koruyucudur13,14, H2O2, kontakt lensleri dezenfekte etmek için yaygın olarak kullanılır15 ve SDS, deterjanlarda ve şampuanlarda bulunan anyonik bir yüzey aktif maddedir 14. Oküler toksinlere benzer şekilde, UV radyasyonu da HCEC'lerde önemli hasara neden olabilir3. Ek olarak, UV'ye aşırı maruz kalmak, yırtılma, ışık hassasiyeti ve kumluluk hissi belirtileri ile karakterize fotokeratit olarak bilinen bir oküler duruma neden olabilir16.
Kullanılabilecek sınırsız sayıda birincil hücre kültürü ve geliştirilmiş çeşitli ölümsüzleştirilmiş hücre hatları vardır. Bu nedenle, bu tip hücreleri içeren modeller arasındaki benzerlikleri ve farklılıkları belirlemek için birincil HCEC'leri ölümsüzleştirilmiş bir HCEC çizgisiyle karşılaştırmak için bir araştırma yapılmıştır.
Bu çalışmada, pHCEC'ler ve iHCEC'ler arasındaki UV ve toksinlere hücre fizyolojik yanıtı üzerindeki olası farklılıkları değerlendirmek için mikroskopi kullanılmıştır. UV radyasyonu ve kimyasallarının hücre metabolik aktivitesi ve iki hücre hattı için inflamatuar sitokin salınımı üzerindeki etkileri de değerlendirildi. İki hücre hattı arasındaki farklılıkları belirlemenin önemi, bu hücre hatlarının değerlendirmek için en uygun kullanımını anlamaktır: 1) UV radyasyonunun hücreler üzerindeki etkisi, 2) toksinlerin hücreler üzerindeki etkileri ve 3) gelecekteki çalışmalar için metabolizma, hücre canlılığı ve hücre sitokin salınımında ortaya çıkan değişiklikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. pHCEC'lerin ve iHCEC'lerin kültürü
- İnsan oküler epitel besiyerinde (HOEM) pHCEC'leri ve iHCEC'leri aşağıdaki takviyelerle büyütün: 6 mM L-glutamin,% 0.002 hücre ortamı takviyesi O (Malzeme Tablosu), 1.0 μM epinefrin,% 0.4 hücre ortamı takviyesi P (Malzeme Tablosu), 5 μg / mL rh insülin, 5 μg / mL apo-transferrin ve kollajen-1 kaplı kültür şişelerinde 100 ng / mL hidrokortizon hemisuksinat (75cm2 kültür şişesinde 18 mL).
- Şişelerdeki ortamı her 2-3 günde bir, hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra ortamı çıkararak değiştirin. Fenol kırmızısı olmadan ayrışma çözeltisi ekleyin ve hücreler tamamen ayrılana kadar şişeyi 37 ° C'de inkübe edin. DMEM / F12 ile ayrışma solüsyonunu serum ile nötralize edin ve ardından hücreleri 500 × g'da santrifüj edin. Süpernatant ortamı çıkarın ve hücreleri HOEM ortamında yeniden askıya alın.
2. Konfokal mikroskopi kullanarak hücre büyüklüğünün belirlenmesi
- Hem pHCEC'leri hem de iHCEC'leri, 1 mL HOEM ile 1 × 105 konsantrasyonunda cam tabanlı kapaklarla kollajen kaplı Petri kaplarına tohumlayın. pHCEC'leri ve iHCEC'leri, 24 saat boyunca bir kültür seti ve 48 saat boyunca başka bir kültür kümesini,% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatörde büyütün.
- Kuluçka döneminden sonra, hücreleri kalsein (4 μM), ethidyum homodimer-1 (8 μM) ve anneksin V (500 μL tampon-Alexa Fluor 647 konjugatında 5 μL) içeren 500 μL anneksin boyama tampon çözeltisi ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca boyayın. Hücreleri boyadıktan sonra, mikroskobu kalsein-için 488/515 nm, ethidyum homodimer-1 için 543/600 nm ve ek V için 633/665 nm uyarma / emisyon dalga boylarını yakalamak için konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak ayarlayın.
- Görüntüleri elde edin ve hücre boyutunu üç boyutlu olarak değerlendirmek için Z yığınlarını alın.
- İki boyutlu (2B) ve üç boyutlu (3B) görüntüleri elde etmek için, bir apochromat 40x / 1.2 su hedefi ile görüntülenecek alanı bulun. Argon (488) (ilk tarama), HeNe1 (543) (ikinci tarama ve HeNe2 (633) (üçüncü tarama) lazerleriyle, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis ve NFT 545 LP560, LP505 ışın ayırıcılarını kullanarak üç ayrı kanalda tarayın.
- Karışmayı azaltmak için çok kanallı sıralı taramayı kullanın.
NOT: LP505, kalsein boyasının emisyonunu yakalamak için 488 lazer ile kanal 2 için kullanılır. LP560, ethidyum homodimer 1'in emisyonunu yakalamak için 543 lazer ile kanal 3'te kullanılır. NFT 635, ek V'nin emisyonunu yakalamak için 633 lazerle birlikte kullanılır. HFT'nin amacı, uyarma ve emisyon ışığını ayırmaktır. NFT, belirtilen dalga boyundaki ışığı ayrı bir kanala yansıtarak ışığı böler < ışığın belirtilen dalga boyunu ikinci bir kanala > izin verir. LP filtreleri, belirtilen dalga boyundan daha kısa dalga boylarını bloke eder ve daha uzun dalga boylarının geçmesine izin verir. - 3B görüntü görüntülemek için, konfokali değeri Z-yığını olarak ayarlayın ve en az 20 kare tarayın.
3. Hücrelerin UV radyasyonuna maruz kalması
- Hücreleri 24 delikli kollajen-1 kaplı bir kültür plakasının her bir kuyucuğuna 5 ×10 4 / mL HOEM tohumlayın ve 3 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, kuyucuklardaki ortamın hacmini 300 μL'ye düşürün. Daha sonra, hücreleri ayrı deneylerde 5 ve 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde UV radyasyonuna (hem 6.48 W / m2'de UVA hem de UVB tüpleri inkübatörde aynı anda açıldığından, hem 6.48 W /m2'de UVA hem de 1.82 W /m2'de UVB) maruz bırakın.
- UV radyasyonundan sonra, her bir oyuğa 200 μL taze HOEM ekleyin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de 20 saat inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, hücre süpernatantını her bir kuyucukta toplayın ve steril 2 mL polipropilen tüplere aktarın. -80 °C'de dondurun. UV maruziyetinden sonra pHCEC'ler ve iHCEC'ler tarafından salınan sitokin seviyelerini belirlemek için, multipleks bir sitokin testi kullanın ve aşağıdaki dört sitokini ölçmek için kitin talimatlarını izleyin: IL-6, IL-8, IL-1β ve TNF-α.
- Kuyucuklardaki hücrelere metabolik tahlil reaktifi ekleyin.
- DMEM / F12'de% 10 metabolik tahlil reaktifi hazırlayın. Her bir kuyucuktaki kültür ortamını 1 mL% 10 metabolik tahlil çözeltisi ile değiştirin ve 37 ° C'de 4 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Her çözeltinin floresansını 530/590 nm uyarma/emisyon dalga boylarında bir floresan plaka okuyucu kullanarak ölçün.
4. Hücrelerin kimyasal toksinlere maruz kalması
- 24 delikli kollajen-1 kaplı bir kültür plakasının her bir kuyucuğunda 5 × 104/mL HOEM tohum hücreleri ve 3 saat boyunca %5 CO2 ile 37 °C'de inkübe edilir. Kuluçka döneminden sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 5 ve 15 dakika boyunca 1 mL kimyasal toksine (BAK% 0.001, H2O2% 0.01 ve SDS% 0.0025) maruz bırakın.
- Kimyasal toksinlere maruz kaldıktan sonra, toksinleri kuyucuklardan çıkarın, 1 mL PBS ile durulayın ve her bir oyuğa 1 mL HOEM ekleyin. 20 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı% 10'luk bir metabolik tahlil çözeltisinin 1 mL'si ile değiştirerek ve 37 ° C'de 4 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe ederek metabolik bir tahlil gerçekleştirin. 530/590 nm uyarma/emisyon dalga boylarında floresan çok kuyucuklu plakalı bir okuyucu kullanarak floresanı ölçün.
- 20 saatlik inkübasyonu takiben hücre süpernatantlarını kuyucuklardan ayrı steril 2 mL polipropilen tüplere aktarın ve -80 ° C'de dondurun. Kimyasallara maruz kaldıktan sonra pHCEC'ler ve iHCEC'ler tarafından salınan sitokinleri sayısallaştırın. UV ile muamele edilmiş hücrelerden sitokinleri değerlendirmek için kullanılan aynı multipleks platformu kullanın. Aşağıdaki dört sitokini ölçmek için kitin talimatlarını izleyerek bir multipleks sitokin testi kullanın: IL-6, IL-8, IL-1β ve TNF-α.
5. Çeşitli BAK konsantrasyonlarına maruz kalan hücrelerin incelenmesi
- 24 delikli kollajen-1 kaplı bir kültür plakasının her bir kuyucuğunda 1 × 10 5 / mL HOEM tohum hücreleri ve 24 saat boyunca%5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir. Kuluçka döneminden sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 1 mL kimyasal toksine (PBS'de BAK% 0.001, BAK% 0.005 ve BAK% 0.01) maruz bırakın.
- Maruz kaldıktan sonra, kimyasal toksinleri çıkarın, kuyucukları 1 mL PBS ile durulayın ve her bir oyuğa 1 mL HOEM ekleyin. 20 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri kalsein (4 μM), ethidyum homodimer-1 (8 μM) ve eksin V (500 μL tampon-Alexa Fluor 647 konjugatında 5 μL) içeren 500 μL ekin boyama tamponu çözeltisi ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca boyayın. Mikroskobu, sırasıyla 630/675 nm, 495/515 nm ve 528/617 nm uyarma/emisyon dalga boylarında ek V, kalsein ve etidyum-1 boyama yoğunluklarını ölçmek için ayarlayın. Floresan mikroskobu kullanarak hücreleri görüntüleyin
6. Veri analizi
- Varyans analizi (ANOVA), Welch ANOVA veya Kruskal-Wallis testi yapmadan önce bir normallik testi ve eşit varyans testi yapın. Test edilen her grubu karşılaştırmak için uygun post-hoc testi kullanın. p
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre boyutu
Birincil ve ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler, hücre canlılığının üç farklı aşamasını yansıtan üç floresan boya ile görselleştirildi. Canlı hücreler yeşildir (kalsein-), ölü hücreler kırmızıdır (ethidium homodimer-1) ve apoptotik hücreler sarıdır (floresan sinyalinin daha iyi görselleştirilmesi için ek V-bilgisayar ayarlı renk). Canlı hücreler, hücre sitoplazmasında esterazlar içerir ve kalsein-'yi kalseine dönüştürür. Ölü hücreler, ethidium homodimer-1'e geçirgen hücre zarlarına sahiptir. Apoptotik hücreler, fosfatidilserin dış zara translokasyon yaptığı için hücre zarında boyanmaya sahiptir.
24 ve 48 saatlik büyümeden sonra iki tip HCEC için hücre büyüklüğünün karşılaştırılması, Şekil 1'de gösterildiği gibi konfokal mikroskopi kullanılarak yapılmıştır. İHCEC'ler (Şekil 1A), 10 μm ila 20 μm arasında değişen daha küçük hücrelerdir ve pHCEC'ler (Şekil 1B), 24 saatlik büyümeden sonra 20 μm ila 50 μm arasında değişmektedir. 48 saatlik büyümeden sonra iHCEC'ler (Şekil 1C) ve pHCEC'ler (Şekil 1D) için boyut aralığında benzer farklılıklar gözlenmiştir. İki tip HCEC'nin 3D görüntüleri konfokal mikroskopi kullanılarak yapılmıştır (Şekil 2A , pHCEC'leri göstermektedir; Şekil 2B , iHCEC'leri göstermektedir).
Şekil 1: Konfokal mikroskopi kullanılarak hücre boyutunun karşılaştırılması . 24 (A) ve 48 (C) h büyümeden sonra iHCEC'ler, 10 ila 20 μm arasında değişen hücrelerle birlikte. 24 (B) ve 48 (D) h büyümeden sonra pHCEC'ler, 20 ila 50 μm arasında değişen hücrelerle büyüme. 40x su hedefi. Ölçek çubukları = 10 ve 20 μm (A); 25 ve 50 μm (B); 10 ve 20 μm (C); 50 μm (D). Kısaltmalar: iHCEC'ler = ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri; pHCEC'ler = birincil insan kornea epitel hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: 3D konfokal görüntüler. 48 saatlik büyümeden (A) sonra pHCEC'lerin ve 24 saat (B) sonra iHCEC'lerin 3D konfokal görüntüleri. 40x su hedefi. Kısaltmalar: iHCEC'ler = ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri; pHCEC'ler = birincil insan kornea epitel hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
UV'nin primer ve ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler üzerine etkisi
UV'ye maruz kaldıktan sonra hem primer hem de ölümsüzleştirilmiş HCEC'lerin metabolik aktivitesi Şekil 3'te gösterilmiştir. Şekil, test kuyularından normalleştirilmiş araçları göstermektedir (dörtlü kuyular, iki ayrı deney). UV'ye maruz kalmayan hücrelerle karşılaştırıldığında, ışınlanmış pHCEC'lerin metabolik aktivitesi 20 dakikalık maruziyette önemli ölçüde azalmıştır. İHCEC'ler için, hem 5 hem de 20 dakikada ışınlanan hücreler için metabolik aktivite azalmıştır. Bu nedenle, pHCEC'lerin metabolik aktivitesini azaltmak iHCEC'lerden daha uzun bir maruz kalma süresi aldı.
Şekil 3: pHCEC'lerin ve iHCEC'lerin 5 ve 20 dakikalık UV radyasyonuna maruz kaldıktan sonraki metabolik aktivitesi. *p < UV'ye maruz kalmayan kontrolün 0.05'i. UV'ye maruz kalmayan kontrol, test numuneleriyle inkübe edilen ancak UV'ye maruz kalmayan kuyucuklardaki hücrelerdir. Y ekseni, UV'ye maruz kalmayan hücrelerin metabolik aktivitesine göre yüzdedir. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: iHCEC'ler = ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri; pHCEC'ler = birincil insan kornea epitel hücreleri; UV = ultraviyole. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
UV maruziyetinin HCEC'lerden inflamatuar sitokinlerin salınımı üzerindeki etkisi Şekil 4'te gösterilmiştir. Maksimum sitokin salınımı, birincil ve ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler için UV maruziyetinin farklı zamanlarında meydana geldi. İHCEC'ler tarafından maksimum sitokin salınımı 5 dakikalık UV maruziyetinde idi. Hücreler, UV'ye maruz kalmayan hücrelere kıyasla IL-1β, IL-6 ve IL-8'in önemli seviyelerini (p < 0.05) serbest bıraktı. Ayrıca, iHCEC'ler için 20 dakikalık UV maruziyetinde önemli bir sitokin salınımı meydana gelmemiştir. Bununla birlikte, pHCEC'ler için maksimum sitokin salınımı 20 dakikalık UV maruziyetinde meydana geldi. Dört sitokinin tümü (IL-1β, IL-6, IL-8 ve TNF-α), UV'ye maruz kalmayan hücrelere kıyasla önemli seviyelerde salındı. Salınan toplam enflamatuar sitokin miktarları (pg / mL) açısından, pHCEC'ler iHCEC'lerden önemli ölçüde daha fazla IL-1β, IL-8 ve TNF-α salgılarken, iHCEC'ler daha fazla IL-6 salgıladı.
Şekil 4: pg/mL cinsinden UV radyasyonuna maruz kaldıktan sonra pHCEC'ler ve iHCEC'ler tarafından sitokin salınımı. Ölçülen dört proinflamatuar sitokin IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) ve TNF-α (D)'dir. *p< UV'ye maruz kalmayan kontrolün 0,05'idir. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: iHCEC'ler = ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri; pHCEC'ler = birincil insan kornea epitel hücreleri; UV = ultraviyole; IL = interlökin; TNF-α = tümör nekroz faktörü alfa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Kimyasal toksinlerin birincil ve ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler üzerindeki etkileri
Üç oküler toksine maruz kaldıktan sonra metabolik aktivitedeki yüzde azalma, Şekil 5'te gösterildiği gibi, pHCEC'ler ve iHCEC'ler arasında benzerdi. Şekil, test kuyularından normalleştirilmiş araçları göstermektedir (dörtlü kuyular, iki ayrı deney).
Şekil 5: pHCEC'lerin ve iHCEC'lerin 5 ve 15 dakika boyunca üç oküler toksine maruz kaldıktan sonra metabolik aktivitesi. * p < kontrolün 0.05'i. Toksine maruz kalmayan kontrol, test numuneleriyle inkübe edilen ancak kimyasal toksinlere maruz kalmayan kuyucuklardaki hücrelerdir. Y ekseni, kimyasal toksinlere maruz kalmayan hücrelerin metabolik aktivitesine göre yüzdedir. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: iHCEC'ler = ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri; pHCEC'ler = birincil insan kornea epitel hücreleri; BAK = benzalkonyum klorür; H2O2= hidrojen peroksit; SDS = sodyum dodesil sülfat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
pHCEC'ler tarafından salınan sitokinlerin miktarları, iHCEC'ler tarafından salınan miktarlardan daha büyüktü. Sitokin IL-6 salınımı en çok üç kimyasala maruz kalmaktan etkilenmiştir (BAK %0.001, H2O2 %0.01, SDS%0.0025, Şekil 6). Şekil, test kuyularından (dörtlü kuyular, iki ayrı deney) ortalamaları (pg / mL) göstermektedir. Hem pHCEC'ler hem de iHCEC'ler, her üç kimyasala maruz kaldıktan sonra IL-6 salınımında bir değişiklik gösterdi. BAK, hem primer hem de ölümsüzleştirilmiş HCEC'lerin kontrolüne kıyasla IL-6 salınımında bir azalmaya neden olurken,H2O2, IL-6'nın iHCEC'lerden salınımında bir artışa ve pHCEC'lerden salınımda bir azalmaya neden olmuştur.
Şekil 6: Sitokin salınımı. pg / mL'de 5 ve 15 dakika boyunca üç oküler toksine maruz kaldıktan sonra pHCEC'ler ve iHCEC'ler tarafından sitokin salınımı. Ölçülen dört proinflamatuar sitokin IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) ve TNF-α (D)'dir. *p < kontrolün 0,05'i. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: iHCEC'ler = ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri; pHCEC'ler = birincil insan kornea epitel hücreleri; BAK = benzalkonyum klorür; H2O2= hidrojen peroksit; SDS = sodyum dodesil sülfat; IL = interlökin; TNF-α = tümör nekroz faktörü alfa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Çeşitli BAK konsantrasyonlarının hücre canlılığı üzerine etkileri
BAK konsantrasyonlarının 5 dakika boyunca %0.001, %0.005 ve %0.01 iHCEC canlılığı üzerindeki etkileri Şekil 7'de gösterilmiştir. BAK, hem pHCEC'ler hem de iHCEC'ler için% 0.001'de çok az etki göstermiştir. Hem pHCEC'ler hem de iHCEC'ler BAK'ın% 0.005'inde ve% 0.01'inde önemli ölçüde hasar gördü. BAK'ın% 0.005 ve% 0.01'inde, iHCEC'lerde ethidyum boyama derecesi pHCEC'lerden daha fazlaydı. Kalsein yeşil, etiltyum kırmızı ve ek V mavi (floresan sinyalinin daha iyi görselleştirilmesi için ek V renkli bilgisayar ayarlı renk)
Şekil 7: 5 dakika boyunca farklı BAK konsantrasyonlarına maruz kalan pHCEC'lerin ve iHCEC'lerin floresan mikroskobik görüntüleri. Ölçek çubukları = 200 μm; 10x hedef. Kısaltmalar: iHCEC'ler = ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri; pHCEC'ler = birincil insan kornea epitel hücreleri; BAK = benzalkonyum klorür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İki tip HCEC'in kullanımındaki potansiyel farklılıklar değerlendirildi. Hücreler aynı ortama (HOEM) aynı hücre konsantrasyonlarında yerleştirildi ve daha sonra kısa ve uzun süreli UV radyasyonuna ve üç oküler toksine maruz bırakıldı. UV radyasyonu ve kimyasalların dozları, karşılaştırılabilecek ara tepkiler üretmek için hücrelere yeterince zarar veren fizyolojik etkilerine dayanarak seçildi. UV radyasyonu için 5 ve 20 dakika ve seçilen BAK (% 0.001), SDS (% 0.0025) ve H2O2(% 0.01) dozları için 5 ve 15 dakikalık maruz kalma süreleri, hücreler ve tedavi edilmemiş kontroller arasında önemli ölçüde farklı tepkiler gösteren ideal maruz kalma süreleri ve konsantrasyonlarıydı.
HOEM, HCEC'lerin kültürü için optimize edilmiş serumsuz bir ortamdır. HOEM hem birincil hem de ölümsüzleştirilmiş hücrelerin büyümesini destekler. Bu araştırmada kullanılan ölümsüzleştirilmiş hücre hattı SV408 kullanılarak ölümsüzleştirildi. SV40-ölümsüzleştirilmiş hücreler, Rb, p53 ve pp2a17'ye müdahale ederek hücre döngüsü ilerlemesini destekleyebilen onkogen proteinlerini eksprese eder. Retinoblastom (Rb), inhibe edilmediğinde, bir hücrenin hücre döngüsünde ilerlemesine ve18'i bölmesine izin veren E2F transkripsiyon faktörlerine bağlanır ve inhibe eder. P53 molekülü ayrıca hücre döngüsü19'un ilerlemesini kontrol etmek için transkripsiyon faktörlerine bağlanır. Üçüncü bir molekülün, pp2a 20,21'in inhibisyonu da hücresel proliferasyonu teşvik eder 22. Rb, p53 ve pp2a17'yi inhibe eden SV40 onkogen proteinlerinin ekspresyonu, iHCEC'lerin pHCEC'lere karşı tepkisindeki farklılıklara katkıda bulunabilir. İki tip HCEC'in hücre boyutları da farklıydı, bu da bu onkogen inhibe edici proteinlerden kaynaklanıyor olabilir, çünkü ölümsüzleştirilmiş hücreler, hücreler birincil hücrelerin büyüklüğüne ulaşmadan önce bu moleküller tarafından bölünmeye zorlanır.
Kornea UV radyasyonuna maruz kalmak, kornea epitel hücrelerinde ciddi hasara neden olabilir. UV radyasyonu hücrede reaktif oksijen türleri üretebilir, DNA ve hücre moleküllerine zarar verebilir ve enzim süreçlerini bozabilir23,24. UVB, DNA'ya doğrudan zarar verir ve UVA, hücre içinde daha sonra diğer biyomoleküllerle reaksiyona girebilen reaktif oksijen türlerinin üretimi yoluyla DNA'ya ve diğer hücresel moleküllere zarar verir25,26. Bu UV hasarı, maruz kalan hücrelerden inflamatuar sitokinlerin salınımına bağlı olarak sitotoksisiteye ve inflamasyona neden olabilir 3,27. Bu çalışmada, ölümsüzleştirilmiş hücreler, UV radyasyonunun hücre metabolik aktivitesi üzerindeki etkilerine karşı daha hassastı, çünkü ölümsüzleştirilmiş hücrelerin metabolik aktivitesinde bir düşüş vardı, ancak 5 dakika sonra birincil hücre hattında değildi. İnflamatuar sitokinlerin salınımındaki farklılıklar da pHCEC'ler ve iHCEC'ler arasında meydana geldi. pHCEC'ler, 20 dakikalık UV radyasyonundan sonra iHCEC'lerden daha fazla IL-1β, IL-8 ve TNF-α salgıladı. Sitokin salınımındaki bu farklılıklar, birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücre kültürlerinin hücre büyüklüğü arasındaki farklarla ilişkili olabilir. Birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücreler arasındaki sitokin salınımındaki diferansiyel etkiler, sigara dumanının birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatları üzerindeki etkilerini inceleyen başka bir çalışmada belirtilmiştir28.
Kimyasal toksinlerin oküler tahrişe neden olma potansiyelini modellemek için, bu kimyasalların sitotoksisitesini değerlendirmek için çeşitli hücre kültürü modelleri geliştirilmiştir. Bu çalışma, HCEC'ler üzerinde ara etkileri olan oküler toksinlerin, hem primer hem de ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler için metabolik aktivitede yaklaşık olarak aynı yüzde azalmaya sahip olduğunu göstermiştir. Üç oküler toksin, tedavi edilmeyen kontrole kıyasla inflamatuar sitokinlerin çoğunun önemli bir salınımına neden olmamıştır. Bununla birlikte, bu makale bu yöntemin bazal sitokin seviyelerini saptamadaki duyarlılığını göstermektedir. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarından sitokinleri tespit etmek için başka bir yöntem değerlendirilmiş ve bazal sitokin seviyeleri29'u tespit edemediği bulunmuştur. BAK'a maruz kalan kültürlerin mikroskobik görüntüleri, hem pHCEC'lerde hem de iHCEC'lerde, 5 dakika maruz kaldıktan ve 20 saat iyileşmeden sonra% 0.005 ve% 0.01 konsantrasyonlarında toksisite göstermiştir.
Bu protokoldeki kritik adımlar, hücreler için ara toksisiteye neden olan UV dozlarını ve oküler toksin dozlarını seçmek ve her HCEC tipinin aynı ortamda büyümesini sağlamaktı. Bu, her tedavinin pHCEC'ler ve iHCEC'ler üzerindeki etkileri arasında karşılaştırmalar yapılmasına izin verdi. Bu yöntemin modifikasyonları, toksik ajanlara maruz kalma zamanında yapılabilir. Bununla birlikte, maruz kalma süresinin bu protokolde test edilen sürelere yakın tutulması önerilir, çünkü daha kısa zaman noktaları hücreler üzerinde toksisite göstermeyebilir. Buna karşılık, çok uzun süre maruz kalmak çok fazla hasara neden olabilir, böylece oküler toksinlerin toksisitesindeki küçük farklılıklar bu protokolde açıklanan test ajanlarının zararlı etkileriyle karşılaştırılamaz.
Ölümsüzleştirilmiş HCEC'lerin primer HCEC'lere göre avantajlarından biri, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin oküler toksinlere maruz kaldıktan sonra metabolik aktivite ve sitokin salınımı için primer hücrelerden daha düşük standart sapmalara sahip olmasıdır. Bu nedenle, maruz kaldıktan sonra metabolik aktiviteyi ve sitokin salınımını değerlendirmek için, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin fizyolojik toksisiteyi birincil hücrelerden daha fazla tespit etme olasılığı daha yüksektir. Hem birincil hücreler hem de ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, UV ışınlarına maruz kaldıktan sonra metabolik aktivite ve sitokin salınımı üzerinde önemli etkiler tespit etti ve her ikisi de hücreleri floresan boyalarla boyadıktan sonra BAK'ın toksisitesini tespit etti.
Bu araştırmada bahsedilen toksisite sonlanım noktalarına ek olarak, sıkı kavşaklar, hücre proliferasyonu, hücre göçü ve ek sitokinlerin salınımı üzerindeki etkiler de dahil olmak üzere diğer uç noktalar test edilebilir. Bu protokol, toksik ajanların dört inflamatuar sitokinin salınımı üzerindeki etkilerini, metabolik aktiviteyi ve hücre canlılığını hücre geçirgenliği, esteraz aktivitesi ve apoptoz ölçümlerini kullanarak değerlendirdi. Ek olarak, tavşan oküler irritasyon testi gibi in vivtestler, toksisitenin HCEC'lere etki mekanizmasını değerlendirmek için uygun olduğundan, bir toksisite test bataryasına dahil edilmelidir. İn vitro olarak modellenemeyen diğer bağışıklık ve toksisite mekanizmalarının olup olmadığını belirlemek için hayvanlarda in vivo testlere ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar Lyndon W. Jones, son 3 yılda, CORE aracılığıyla, aşağıdaki şirketlerden araştırma desteği veya öğretim üyeliği onursal olarak almıştır: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage ve Visioneering. Lyndon Jones ayrıca Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis ve Ophtecs için bir danışman ve/veya danışma kurulunda görev yapmaktadır. Diğer yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar bu çalışma için herhangi bir fon almadılar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H.
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
