C. elegans Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Motor Bozukluğun Değerlendirilmesi

Summary

Bu protokol, C. elegans amyotrofik lateral skleroz modellerinde hafif, orta ve şiddetli motor bozukluk arasında ayrım yapmak için iki hassas tahlil, C. elegans suşları için genel yarar ile değiştirilmiş hareketlilik ile açıklanmaktadır.

Abstract

Nörodejeneratif hastalık amyotrofik lateral skleroz (ALS), zamanla kötüleşen kas zayıflığı ve motor bozukluk eşliğinde motor nöronların ilerleyici kaybına sahiptir. Hastaların bir alt kümesi için ALS'nin genetik sürücülerinin belirlenmesinde önemli ilerlemeler elde edilmiş olsa da, vakaların çoğunda bilinmeyen bir etiyoloji vardır. Ayrıca, motor nöron disfonksiyonu ve dejenerasyonun altında kalan mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır; bu nedenle, bu süreçleri incelemek için temsili modeller geliştirmek ve karakterize etmek için devam eden bir ihtiyaç vardır. Caenorhabditis elegans , laboratuvar ortamında incelenen iki birincil hareket paradigması ile hareketlerini çevrelerinin fiziksel kısıtlamalarına uyarlayabilir - katı bir yüzeyde sürünür ve sıvı içinde yüzer. Bunlar duyum, motor nöronlar ve kaslar arasında karmaşık bir etkileşimi temsil eder. C. ELEGANS ALS modelleri bu hareket paradigmalarından birinde veya her ikisinde de bozulma oluşturabilir. Bu protokol, C. elegans'taki hareketliliği değerlendirmek için iki hassas tahlil açıklar: katı bir yüzeyde gezinmeyi ölçen optimize edilmiş bir radyal hareketlilik testi ve sıvıda yüzmeyi izlemek ve analiz etmek için otomatik bir yöntem (kırbaçlama). ALS modellerinin taban çizgisi motor bozukluğunun karakterizasyonuna ek olarak, bu tahliller fenotiplerin genetik veya küçük molekül müdahalelerinden baskılanmasını veya arttırılmasını tespit edebilir. Bu nedenle, bu yöntemler ALS modellerini ve değiştirilmiş hareketlilik gösteren herhangi bir C. elegans suşunu incelemek için yardımcı programlara sahiptir.

Introduction

Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), motor nöronlar üzerinde özel bir etkisi olan zayıflatıcı, yaşlanmaya bağlı bir nörodejeneratif hastalıktır. Hastalık, beyin ve omurilikte motor nöron kaybı ve ilerleyici motor bozukluk içerir. Bu, tipik olarak tanıdan sonraki 3-5 yıl içinde majör fonksiyonel sakatlık ve erken ölümle ^{sonuçlanır1}. En az 38 gendeki mutasyonlar ALS'ye neden olabilir; Bununla birlikte, ALS'li hastaların çoğu nöronlarda ve glial hücrelerde birincil patoloji olarak TDP-43 proteininin her yerde bulunan inklüzyonlarını biriktirir2,3,4. ALS in vivo'ya neden olan veya katkıda bulunan temel mekanizmaları incelemek için bir dizi hayvan modeli geliştirilmiştir (^in5'te gözden geçirilmiştir). C. elegans'ta bu modeller ALS'ye neden olan genlerin homologlarında genetik fonksiyon kaybı mutasyonlarını veya insan ALS genlerinin transgenik ekspresyonunu içerir. C. elegans'ta ALS modellemenin sayısız avantajı vardır. C. elegans, farklılaşmış bir sinir sistemine, iyi karakterize edilmiş davranış paradigmalarına ve insanlara önemli genetik homolojiye sahip çekilebilir basit bir ^{hayvandır6,7}. Güçlü genom düzenleme yetenekleri, nörodejenerasyon in vivo floresan muhabirleri, RNAi tarama paradigmaları, çekişli genetik ve yerleşik davranışsal ve fenotipik tahliller de dahil olmak üzere C. elegans ile çalışmak için birçok araç mevcuttur. C. ELEGANS ALS modelleri, çözünmeyen protein birikimi, nörodejenerasyon ve erken ölüm de dahil olmak üzere insan hastalığının yönlerini yeniden ^özetler8,9. Ayrıca, hem emekleme hem de yüzme davranışlarında rahatsızlık içeren motor disfonksiyon birçok C. elegans ALS modelinde mevcuttur.

Bu protokol , C. elegans motor fenotiplerini karakterize etmek için iki yöntemi açıklar: katı bir yüzeyde gezinmeyi değerlendirmek için radyal hareketlilik testi ve WormLab otomatik izleme ve analizini kullanarak sıvıda yüzmenin (kırbaçlama) değerlendirilmesi. Motor açıklarını karakterize etmek için bu hassas yöntemler, şiddetin karşılaştırılmasına izin verir ve motor fenotiplerin baskılanması ve geliştirilmesini ölçmek için araçlar sunar. Radyal hareketlilik testi, solucan popülasyonları arasında sürünen hareketlilikteki (katı bir yüzeydeki sinüzoidal hareket) farklılıkları ölçen testtir. Bu tahlil, solucanları bir tabağa tek bir yere yerleştirerek ve belirli bir süre sonra son konumlarını işaretleyerek C. elegans doğal uyarılmamış keşif davranışından ^{yararlanır10}. Alternatif olarak, sıvı (kırbaçlama) testlerinde yüzmek, belirli bir süre boyunca bireysel solucanların vücut bükülmelerini sayar. Vücut virajlarının insan gözüyle manuel olarak sayılması zaman yoğundur ve tipik olarak deneyciler arasında önemli bir değişkenlik gösterir. Bilgisayar destekli otomatik izleme ve analizin kullanılması, bu değişkenliğin çoğunu ortadan kaldırabilir. ALS modellerinin taban çizgisi motor bozukluğunun karakterizasyonuna ek olarak, hem radyal hareketlilik hem de yüzme tahlilleri, genetik veya küçük molekül müdahalelerinden farklı lokomotor fenotiplerinin modülasyonunu tespit edebilir. Bu yöntemler, ALS modellerini ve değiştirilmiş hareketlilik gösteren herhangi bir C. elegans suşunu incelemek için yardımcı programlara sahiptir.

Protocol

1. Radyal locomotion tahlil

1. 100 mm veya 150 mm çapında Petri kapları yaklaşık yarısı nematod büyüme ortamı (NGM) ile dolu ve agarın tüm yüzeyini kaplayacak şekilde tek tip op50 bakteri çimi ile tohumlayın.
2. NGM test plakalarını ters çevirin ve altını C. elegans suşlarının tahlil edilmesi için bir tanımlayıcı ile etiketlenin, gerinim başına 2 plaka (Şekil 1A).
3. Baş aşağı plakanın ortasındaki işaretleyici ile küçük bir nokta yapın (Şekil 1A).
4. Bir diseksiyon mikroskobu ile çalışırken, platin tel çekme (Şekil 1B) kullanarak 15-20 aşamalı eşleştirilen ¹¹ solucanı doğrudan orta noktanın üzerine (NGM aracılığıyla görülebilir) test plakasının ortasına aktarın.
   NOT: Tüm solucanları aynı anda veya mümkün olduğunca çabuk aktarmaya çalışın.
   1. Solucanlar plakanın ortasına yerleştirildikten sonra 30 dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın. Kapağı tekrar tabağa koyun ve bir kenara koyun (Şekil 1C).
5. Tüm suşlar belirlenen test plakalarına gelene kadar solucanları aktarmaya devam edin, plakalar arasında yaklaşık olarak ne kadar süre aktarılacağını not edin (plakalar arasında ~ 1 dakika hedefleyin). Tüm plakaları kuruldukları sırada tutun.
6. 30 dakika sonra, ilk plakayı puanlamaya başlayın.
   1. Kapağı çıkarın ve plakayı, plakanın etiketli arkası yukarı bakacak şekilde, kesme mikroskobu altında aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve NGM agar görüş hattı ile solucanlar arasındadır. Plaka normal kullanımdan baş aşağı olacaktır.
   2. Solucanlar agardan görünene kadar mikroskop odağını ayarlayın.
   3. Merkez noktadan farklı bir renkli keçeli uç kalem kullanarak, her solucanın yerine küçük bir nokta koyun - en distal hayvanları bulmak için solucan izlerini bakteri çimlerinden takip edin.
   4. Bazı solucanlar oraya varabileceğinden plakanın kenarını kontrol edin. Ayrıca, orta nokta noktasındaki solucan sayısını sayın ve kaydedin (Şekil 1D).
7. Tüm plakaların 30 dakikalık etkinlik süresine sahip olacak şekilde tüm test plakalarını sırayla işaretlemeye devam edin, plakayı kurmak için geçen süreyi hesaba katmaya dikkat edin. Ardından, 1.8 veya 1.9 adımlarında açıklandığı gibi manuel veya dijital ölçümler gerçekleştirin.
8. Cetvel kullanarak el ile ölçümler gerçekleştirin.
   1. Mm, merkezden her solucan için son konum işaretlerine olan mesafeyi ölçmek ve mesafeyi kaydetmek için bir cetvel kullanın. Puanlama sırasında ilerlemeyi izlemeye yardımcı olmak için, ilk puanlanan noktayı küçük bir işaretleme çizgisiyle etiketleyin.
   2. Plakayı saat yönünde döndürerek her nokta için ardışık olarak uzunluk verilerini kaydedin (Şekil 1E).
9. Tarayıcı ve ImageJ kullanarak dijital ölçüm gerçekleştirin.
   1. Düz yataklı tarayıcı kullanarak, bir cetvelin yanındaki test plakalarının arkasını tarayın (tarama yüzeyine bakan sayılar) (Şekil 2A).
   2. Taranan plaka görüntüsünü ImageJ veya benzer bir programda açın.
      NOT: ImageJ, NIH tarafından barındırılan ücretsiz bir Java tabanlı görüntü işleme yazılımıdır.
   3. Düz Çizgi Aracı'na tıklayın ve ardından cetvelin taranan görüntüsündeki 1 cm ve 2 cm'lik noktaları birbirine bağlayan bir çizgi çizin (Şekil 2B).
      NOT: Shift bilgisayar anahtarını basılı tutmak, hattı en yakın 45° açıya zorlar.
   4. Çözümle menüsüne gidin ve ölçeği ayarlamak için kullanın (Analiz | Ölçeği Ayarla) (Şekil 2C).
   5. Bilinen Mesafeyi (10) ve Uzunluk Birimlerini (mm) uygun kutulara girin, mesafeyi piksel sayısı olarak ayarlamayın. Her ImageJ oturumunda analiz edilen tüm görüntülere aynı ölçeği uygulamak için Genel'i kontrol edin; aksi takdirde, açıldıktan sonra her görüntünün ölçeğini ayarlayın (Şekil 2D). Tamam'ı tıklatın.
      NOT: Ölçüm ölçeğini ayarlamak için 1.9.2-1.9.5 adımları gerçekleştirilir. Bu görüntünün ölçümleri artık çizgilerin uzunluğunu tanımlanan pikselle otomatik olarak ilişkilendirecek: uzunluk ilişkisi. 300 dpi'de taranan görüntüler mm başına yaklaşık 11,8 piksel ilişkisine sahip olacaktır.
   6. Puanlanacak ilk noktanın hemen üstünde işaretlemek için Paintbrush Aracı'nı kullanın.
      NOT: Bu, puanlanan ilk solucan için görsel bir göstergedir.
   7. Orta noktadan ilk solucan veri noktasına bir çizgi çizmek için Düz Çizgi Aracı'nı kullanın.
   8. Mesafeyi ölçmek için klavyedeki M tuşunu tıklatın. Alternatif olarak, Çözümle menüsüne gidin ve Ölçü'nün (Analiz | Ölçü). Her iki durumda da, ölçüm yeni bir pencerede görünecektir; bu pencere görüntü başına tüm ölçümleri toplar.
   9. Orta noktayı sabit tutarak, ilk solucan noktasına dokunan çizginin ucunun bir sonraki solucan noktasına doğru hareket etmesini, saat yönünde hareket etmesini ve ölçülecek M tuşunu tıklatmasını sağla.
   10. Tüm puanlar alınana kadar her noktayı saat yönünde ölçmeye devam edin.
   11. Uzunluk ölçüm verilerini kopyalama ve yapıştırarak kaydetmek için bir elektronik tabloya yapıştırın. Ardından, taranan her plaka görüntüsü için işlemi tekrarlayın.
       NOT: Adım 1.9.6 - 1.9.11 solucan yer değiştirme değerlerini ölçer (Şekil 2E-F).
10. İstatistiksel analiz yapın.
    1. Toplam sayının 30-40 solucan arasında olması için çoğaltmaları tek bir denemede birleştirin.
    2. Farklı günlerde ve bağımsız solucan popülasyonları ile bağımsız deneysel çoğaltmalar gerçekleştirerek 3 bağımsız deneysel kopya ile sonuçlanır.
    3. 2 suş için Öğrenci t testi veya üç veya daha fazla suş için 1 yönlü ANOVA gibi uygun istatistiksel analizleri kullanarak verileri analiz edin.

2. Bilgisayar analizli yüzme tahlili

NOT: Bu protokol, piyasada bulunan WormLab donanım ve yazılım sistemi için ayrıntılı talimatlar içerir (bkz. Malzeme Tablosu). Ancak, iş akışı diğer bilgisayar analizli yüzme tahlil sistemlerine uygulanabilir.

1. Video ayarlama ve kaydetme.
2. Görüntüleme donanımındaki kalkanı yükseltin (Şekil 3) ve kamera yüksekliğinin beklenen konuma ayarlı olduğunu doğrulayın.
   NOT: Solucanları 35 mm plaka üzerinde yakalamak için en uygun yükseklik, alt dişli vida deliğinden üçüncünün ayarlanabilir kamera montaj braketinin altında görülebilecek şekildedir, ancak vida deliğinin üzerinde (sahnenin yaklaşık 30,5 cm üzerinde) ek bir montaj deliği görülmez (Şekil 3C). Bu, 11,43 μm / piksel yakalama oranına neden olur. Teste başlamadan önce bunu onaylamanın daha kolay olması için bir "doğru yükseklik" göstergesi eklemeyi düşünün. Yükseklik ayarlamalarını hesaba katmak için protokol adımı 2.18'e bakın.
3. İlişkili yazılımı açın (Tamamlayıcı Şekil 1A).
4. Yeni bir Video Yakalama penceresi açmak için Video Yakalama simgesini (ortasında sağa işaret üçgeni olan film) tıklatın. Kamera Canlı Görüntü'de olacak, ancak ekran siyah olacak (Tamamlayıcı Şekil 1B).
5. Dimmer düğmesine bastırın ve ışığı ayarlamak için saat yönünde çevirin.
   NOT: Dimmer düğmesi, parlak alan ışık kaynağının yakınındaki görüntüleme sisteminin sahnesindedir. Video Yakalama canlı görüntü ekranı siyahtan aydınlatmaya dönüşecektir.
6. Video Yakalama penceresinde, Ayarlar sekmesine tıklayın, aşağıdaki gibi ayarlayın: Video modu: 2456 x 2052_Mono8, Kare hızı: 14, Çıkış: tek renkli, Pozlama: 0.00300 s, Kazanç: 1 dB , Gama: 1, Döndür 180 (kontrol).
7. Yakalama sekmesine geri dönün. Kayıt klasörünü seçin (Tamamlayıcı Şekil 1B).
   NOT: Tüm kayıtların ve proje dosyalarının depolanacağı yer burasıdır. Verileri düzenli tutmak için tek tek denemeler için benzersiz klasörler oluşturun.
8. Dosya öneki metin kutusuna girerek bir dosya adı atayın.
   NOT: Yazılım, önekin sonuna otomatik olarak "0001" biçiminde aşamalı bir sayı ekler. "YYYYMMDD_treatmentName_rep#_" gibi dosyalar için tutarlı bir adlandırma düzenine sahip olması önerilir.
9. Diğer Yakalama ayarlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: Arabellek: 128 kare (varsayılan), Süre (iade): 00 h:01dk:00 s. Bu sekmedeki diğer ayarları yoksay veya kapat.
10. Test plakasını, kapağı cihaz sahnesine yerleştirin ve Video Yakalama ekranında ortalayın; kapağı çıkarın.
    NOT: Test plakalarını önceden hazırlayın. Her plaka, yaklaşık yarısı unseeded (bakteriyel çimsiz) NGM dolu 35 mm Petri kabından oluşur.
11. Sahne ^senkronize11 solucanlarını 1 mL M9'da test plakasına yıkamak için bir mikropipette kullanın - yaklaşık 50 solucan hedefleyin (Şekil 3D). Hayvanları merkeze getirmek için plakayı hafifçe döndürün veya hayvanları ayırmak için birkaç damla M9 eklemek için bir mikropipette kullanın (Şekil 3E). Solucanların yüzmeye alışmasına izin vermek için 60 s'lik bir zamanlayıcı ayarlayın.
    NOT: Plaka ekranda %100 görünmez. Hayvanlar üst üste binerken doğru bir şekilde izlenmez.
12. Zamanlayıcı geri sayarken, ekranı izlerken odaklama halkasını kameranın lens gövdesine çevirerek kamera odağını manuel olarak ayarlayın (Şekil 3F). Daha hassas odaklama sağlayan bir kaydırma tekerleği faresi kullanarak solucanları yakınlaştırmak mümkündür.
13. Odağı ayarladıktan sonra, ışık düğmesini ekranın aşırı pozlama olmadan mümkün olduğunca parlak olacak şekilde ayarlayın (ekranda kırmızı pikseller olarak gösterilir).
14. 60 sn'den sonra Kaydet düğmesine basın.
    NOT: Video Canlı Görüntü'den Kayda geçer ve bir zamanlayıcı görünür. Yakalama tamamlandığında, Video Yakalama ekranı Canlı Görüntü'ye geri döner (Tamamlayıcı Şekil 1B).
15. Kayıt yaptıktan sonra plakayı çıkarın ve bir sonraki plakayı ayarlayın. Öneki gerektiği gibi yeniden adlandırın. Solucanları test plakasına yıkayın, 60 s boyunca kuluçkaya yatırın ve her tedaviyi kaydedin.
16. Bir deneme için tüm kayıtları tamamladıktan sonra, açık video sekmelerini kapatın ve dimmer düğmesini bastırarak ışık kaynağını kapatın.
17. Pencerenin sağ üst köşesindeki kırmızı x düğmesini tıklatarak Video Yakalama penceresini kapatın; alternatif olarak, tüm yazılım paketini kapatın ve yeniden açın.
18. Videoları izlemek için hazırlayın.
19. İş Akışı kenar çubuğu menüsünden, bu menüdeki ilk düğme olan Görüntü Sırasını İçeri Aktar'ı seçin ve bir videoyu bulup çift tıklatın. Video orta pencerede açılacaktır (Ek Şekil 2A).
    NOT: Yazılım için varsayılan ekran İş Akışı kenar çubuğu menüsüdür; Bu menüye Görünüm [Görünüm | altındaki görünüm üst açılır menüsünden de erişilebilir İş Akışı]. İş Akışı menüsünün birkaç görünüm seçeneği vardır; İzleme görünümü protokolün bu noktasında uygundur. Sıra Bilgilerini Ayarla düğmesi menüde görünmüyorsa, bu doğru görünüm değildir. İlk olarak, Menünün altına bakın ve İş Akışı sekmesinin etkin olup olmadığını kontrol edin, ardından İzle simgesine tıklayarak İzle görünümünün etkin olup olmadığını kontrol edin. Menülerin pencerede göründüğü yer, monitör boyutuna ve diğer açılan menülerin konumuna bağlıdır. Menüler sürükle ve bırak, yeniden boyutlandırılarak ve kapatılarak hareket ettirilebilir. Menülerin çoğu Görünüm açılır menüsünden de açılabilir.
20. İş Akışı menüsünde Sıra Bilgilerini Ayarla'yı seçin (Tamamlayıcı Şekil 2B). Yeni menü penceresinde adlandırma düzenini denetleyin, notlar ekleyin ve meta verileri doğrulayın.
21. Ölçeklemenin doğru ayarlanın; Ölçek: 11,43 μm/piksel ve 1000 μm 87 piksel olduğu için Ölçü otomatik olarak doldurulur. Kamera yüksekliği burada öngörülenden farklı ayarlanmışsa, ölçeği güncellemek için bu menüdeki yönergeleri izleyin. Kaydet düğmesini tıklatın.
22. İş Akışı menüsünde Görüntüyü Ayarla'yı seçin ve Görüntü Ayarlamaları adlı yeni bir açılır menü açılır (Tamamlayıcı Şekil 2C). Açık arka planda (parlak alan) Koyu solucanlar'ı seçin.
23. Ek ayarları yapın. Önerilen Görüntü İşleme Ayarları aşağıdaki gibidir: Arka plan yumuşatma: 10, Gauss yumuşatma: 5, Delikleri doldur: 2, Küçük nesne filtresi: 0 ve İntegral Türev Segmentasyonunu atlayın.
24. Eşik seviyesini, hayvanların tamamen yeşille doldurulması, ancak yine de arka plandan farklı olması için ayarlayın. Uygula'yı tıklatın.
    NOT: Solucan olmayan bazı nesneleri almak caizdir.
25. İş Akışı menüsünde Algıla ve İzle'yi seçin (Tamamlayıcı Şekil 2D).
    NOT: Videonun yan tarafında 3 sekmeli bir menü görünecektir: Algılama, İzleme ve Onarma. İmleç, video ekranının üzerindeyken işaret parmağı gibi görünecektir. Alternatif olarak, yazılımın sol üst simgesi menüsündeki Seç simgesini (imleç oku) tıklatın.
    1. 3-7 solucan seçmek için parmak seçici aracını kullanın ve Algılama sekmesinde solucanları algıla düğmesini tıklatın.
       NOT: Bu seçim, yazılımın belirli koşullar için solucanları doğru bir şekilde tanımlamasına yardımcı olur ve her video için yapılmalıdır. Birkaç saniye sonra, solucanların çoğu yeşil renkte vurgulanır ve sarı bir sayıya sahip olur. Dokunan veya kıvrılan solucanlar büyük olasılıkla vurgulanmayacak; ancak, program büyük olasılıkla izleme sırasında onları bulacaktır. Algılama parametrelerini ayarlama seçeneği vardır; ancak, varsayılanlar çoğu koşulda iyi çalışır. Algılama parametrelerinde ayarlamalar yapılırsa, örnekler ve yinelemeler arasında tutarlı olduğundan emin olun.
26. Yine de Algıla ve İzle penceresinde , İzleme sekmesine gidin (Tamamlayıcı Şekil 2E). İzleme Parametreleri'nde Geri izlemeyi kullan seçeneğini işaretleyin, görüntünün kenarındaki solucanları izleme seçeneğinin işaretini kaldırın.
27. Max izlenen hipotezini 5 olarak ayarlayın. İzleme modunu Yüzme olarak ayarlayın.
    NOT: Max izlenen hipotez ayarı, tek bir izlenen solucanın kaç tane potansiyel solucan izin verildiğini ayarlar ve programa tek bir solucanın izini kaybetmeden ne kadar doğru bir şekilde iz süreceğini biraz rahatlatır. 5 yüzmek için iyi bir ortamdır.
28. Gelişmiş Ayarlar bölümüne gidin ve aşağıdakileri ayarlayın: Çerçeve solucanları sınıra dokunabilir: 50, Çerçeve solucanları üst üste binebilir: 500, Konum toleransı: 0.50, Şekil toleransı: 0.50. Bu ayarları kaydedin ve yapılandırma olarak kaydederek bir denemedeki (ve ötesindeki) tüm videolar için dağıtın.
    NOT: Parça filtreleme önerilmez ve işlem sonrası kolayca yapılabilir, bırakın.
29. Sol üst simge menüsündeki Yapılandırma Yöneticisi'ne (dişli simgesi) gidin. Tıklatıldığında, Yapılandırma Yöneticisi kenar çubuğu menüsü açılır. Ardından, Kaydet (dişli +) simgesine tıklayın, bu yapılandırmaya bir ad ve açıklama verin ve ardından Tamam düğmesini tıklatın.
    1. Gelecekte bu yapılandırmaya erişmek için Yapılandırma menüsünü açın, istediğiniz yapılandırmayı seçin ve Yükle (vites yukarı ok) simgesini tıklatın. Ardından sıra bilgileri ekleyin, muhtemelen eşik düzeyinde ince ayar yapın ve algılama için solucanları seçin. Diğer tüm ayarlar aynı olacaktır.
30. İş Akışı menüsünde Projeyi Kaydet'i tıklatın, kaydetme konumunu doğrulayın ve bir proje dosyası adı ekleyin (proje dosyası adını video adıyla eşleştirmek süreklilik sağlar). Videoyu kapatın.
    NOT: Bu projeler .wpr dosya türüyle kaydedilir.
31. Tüm videolar için tekrarlayın: Görüntü Sırasını İçeri Aktar (2.18), Kaydedilen yapılandırmayı yükle (2.28.1), eşiği ayarla (2.23), sıra bilgilerini ayarla (2.19), solucanları algıla (2.24.1), projeyi kaydet (2.29), videoyu kapat.
32. Videoları izleme
    1. Proje dosyalarını izlemek için İş Akışı menüsüne gidin ve Toplu İş (solucan sayfaları içeren klasör) simgesini (Tamamlayıcı Şekil 2F) tıklatın.
       NOT: Toplu İşleme paneli görüntülenecektir (Tamamlayıcı Şekil 2G). Bazen gizlenir, ancak Toplu İş Akışı menüsünün en altından erişilebilir; pencerenin görülmesi için genişletilmesi gerekebilir.
    2. Bu Toplu İşlem menüsünün Dosya Seçimi bölümünün altındaki Ekle düğmesini tıklatın. İşlenecek tüm proje dosyalarına (.wpr) gidin ve seçin, Aç'ı tıklatın.
       NOT: Toplu İşlem menüsü seçilen dosya yolu, bir durum göstergesi ve her dosya için gri ilerleme çubuğu ile doldurulur.
    3. Başlat 'ı tıklatın (yürüt düğmesi simgesi). İlk dosyadaki yeşil ilerleme göstergesine dikkat edin. Tüm dosyaların işlenmesine izin verin. Tüm dosyalar tamamlandı olarak okunduğunda (yeşil), yazılım kapatılabilir (Tamamlayıcı Şekil 2G).
    4. Bir proje dosyası sıkışırsa, askıda kalan dosyayı kendi başına çalıştırmayı düşünün, bu genellikle sorunu giderir. Bu sorunu çözmezse, proje dosyasını açın, seçili solucanları silin (Algıla ve İzle menüsü) ve yeni bir eğitim kümesinden yeniden seçim. Ardından proje dosyasını yeniden işle.
33. Parçaları onarma (önerilen)
    NOT: Parçaların onarılması rayların doğruluğunu artırabilir. Yaygın düzeltmeler, insan gözüyle görüntülenenle aynı solucana ait olan parçaları birleştirmek, doğru olmayan veya gerçek solucan verilerini yakalamayan izleri silmek ve solucanlar dokunduğu için yanlış tanıtılan parçaları bölmektir (kötü bölümü çıkarın ve pratikse kötü bölümden önce ve sonra parçaları birleştirin).
    1. Yazılımı açın ve bir proje dosyası açın [Dosya | Açık Proje] ilgi çekici. Aç'ı tıklatın ve bu dosyayı kullanmak için Evet'i tıklatın. Zamansal filtrenin yüklenmesini bekleyin. İşlenen video ekranda olacak; solucanlar yeşil renkte vurgulanacak ve sarı ile özetlenecektir. Videoyu temizlemek veya oynatmak için video oynatıcıyı kullanın.
    2. İş Akışı menüsünde Algıla ve İzle'yi seçin (Tamamlayıcı Şekil 2D). Onar sekmesine geçin. Seçici aracı simgesine (imleç oku) tıklayarak Seçici imleci etkinleştirin. Bir solucan izi bulup seçerek videoyu ovalayın ve ardından istediğiniz değişikliği oluşturmak için onarım menüsünü kullanın.
       NOT: Çoğu sorunu stratejik olarak hızlı bir şekilde düzeltmek için, plakanın yaklaşık 1/^6'sının görülebilecek şekilde yakınlaştırın, #1 parçasını çevreleyen alandan başlayın. Gizemli bir şekilde aniden ortaya çıkan solucanlar, sayıların değiştiği yerler veya solucanların birbirine çarptığı, sorunlar ortaya çıktıkça düzenleme yapan solucanlar için video denetimini hızla temizleyin. Solucanları başlangıç konumundan sayısal sırada izleyin. Tüm plaka onarılana kadar her solucanı gerektiği gibi takip etmek için ileri geri ovalayın. Plakanın kenarlarına dikkat edin; genellikle, plaka kenarlarının gölgelerinde sahte solucanlar görülür.
34. Veri analizi
    1. İş Akışı menüsünde Verileri Çözümle'yi seçin (Tamamlayıcı Şekil 3A).
       NOT: Veri Analizi ve Çizim adlı yeni bir pencere görünecektir (Tamamlayıcı Şekil 3B). Bu pencere, belirli bir proje dosyasının solucan popülasyonunun taşıma verilerini değerlendirmenin ve görüntülemenin birçok yoluna sahiptir. Bu analizlerin çoğu, belirli bir videodan belirli, birden çok veya tüm solucanların seçilmesine izin vererek izleme bilgilerinin farklı şekillerde çizilmesini sağlar.
    2. Dönüş sayısını analiz etmek için Parça Özeti'ne gidin [Konum ve Hız | Parça Özeti] (Tamamlayıcı Şekil 3C). Verileri elektronik tablo okunabilir biçimde dışa aktarmak için sağ alttaki Dışa Aktar düğmesini kullanın (.csv), elektronik tablonun unutulmaz bir şeyle yeniden adlandırılması da dahil olmak üzere istenen konumuna giden bir yol seçin. Varsayılan ayarlar iyi bir seçimdir (Tamamlayıcı Şekil 3D).
    3. Bu verilerin yanı sıra diğer ilgili proje veri kümelerini birleştirilmiş bir elektronik tablo çalışma kitabına yapıştırın (Tamamlayıcı Şekil 3E).
    4. Elektronik tablo işlevlerini (=dönüşler/izleme süresi * 60) kullanarak her parça için dakika başına dönüşleri hesaplamak veya istediğiniz gibi farklı bir ölçüm kullanmak için Turn Count ve Track Duration'ı kullanın (Tamamlayıcı Şekil 3F).
       NOT: Dakikadaki dönüşler, sıvıda yaygın olarak kullanılan bir aktivite ölçüsü olan manuel bir kırbaçlama tahlili ile çok benzer bilgiler yakalar, ancak birçok seçenek vardır ve farklı bir ölçümün belirli bir tedavi veya karşılaştırma için diğer ilginç verileri tanımlaması oldukça olasıdır.
    5. İsterseniz, solucan boyutu, izleme süresi ve/veya başka bir seçili ölçüm için ekran, olası bir kafa karıştırıcıysa parçaların kaldırılması için vurgulamak üzere koşullu biçimlendirme araçlarını kullanarak. Tedaviler ve çoğaltmalar arasında tutarlı veri işlemeyi sürdürin.
    6. 2 suş için Öğrenci t testi veya 3 veya daha fazla suş için 1 yönlü ANOVA gibi uygun istatistiksel analizleri kullanarak verileri analiz edin. Farklı günlerde ve en az 3 bağımsız deneysel kopya için bağımsız solucan popülasyonları ile bağımsız deneysel çoğaltmalar gerçekleştirin.

Representative Results

Hem radyal hareketlilik hem de yüzme tahlilleri hareketlilik bozukluğunun hassas bir şekilde tespitini sağlar (Şekil 4 ve Şekil 5). ALS'de patolojik TDP-43'ün altında kalan mekanizmaları araştırmak için, vahşi tip veya ALS-mutant insan TDP-43 pan-nöronally'yi ifade eden C. elegans modelleri geliştirilmiştir. Bu hayvanlar, motor disfonksiyon9 da dahil olmak üzere ALS'yi anımsatan moleküler ve hücresel özellikler gösterir. Daha da önemlisi, hem radyal hareketlilik hem de yüzme tahlilleri kullanarak ALS-mutant TDP-43'ü ifade eden hayvanlarda vahşi tip insan TDP-43 ekspresyasyonu ve daha şiddetli hareketlilik bozukluğu ile orta derecede hareketlilik bozukluğu gösterirler. Bazı mutant veya transgenik hayvanlar, emeklemede yüzmekten daha fazla bozulmaya sahip olacaktır veya bunun tersi de olabilir. İki farklı hareketlilik tahlilleri kullanılarak, suşlar arasındaki fenotipik farklılıkların daha net bir resmi elde edilir.

Radyal hareketlilik
Tohumlu bir ağar tabağına yerleştirildiğinde, C. eleganlar besin kaynaklarının sınırlarını aramak da dahil olmak üzere çevrelerini keşfederler. Radyal hareketlilik tahlilleri, fiziksel uygunluk için bir metrik olarak bu davranışlardan yararlanmanın bir yoludur. Radyal lokomotor testi, lokomotor davranışını (katı bir yüzeyde sürünerek) kontrollü ve ölçülebilir bir şekilde analiz ederek, motor açıklarının ve motorla ilgili diğer fenotiplerin şiddetini değerlendirmek için basit ve etkili bir araç sunar. Radyal hareketlilik tahlilleri, orta veya ağır derecede bozulmuş ALS model solucanlarında hareketlilik farklılıklarını yakalar ve hareketlilik fenotiplerinin modülasyonunu veya hareketlilikteki değişiklikleri yaşla karşılaştırmak için bir taban çizgisi sunar (Şekil 6). Bu strateji, hareketi vahşi tipten (N2) veya kontrol solucanlarından değiştiren herhangi bir türün gezinme davranışını ölçmek için uygulanabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, silindir mutantlar veya felçli hayvanlar gibi normal şekilde sürünemeyen hayvanları değerlendirmek için iyi bir seçim olmayabilir. Tipik olarak, vahşi tip solucanlar 20 °C'de yükseltildiğinde ve test edildiğinde ortalama 200-300 μm / dk arasında bir yer değiştirme sunacaktır. Şekil 4'te sunulan örnek veriler, vahşi tip insan TDP-43'ü hafif bir fenotip [TDP-43(WT-hafif), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] veya daha güçlü fenotip [TDP-43(WT-orta), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]], mutant insan TDP-43'ü şiddetli fenotip [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]) ve başka bir nörodejeneratif hastalık ilişkili proteini ifade eden transgenik bir suş, vahşi tip insan tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. Vahşi tip TDP-43'i ifade eden iki suş, radyal locomotion tarafından tespit edildiği gibi farklı derecelerde bozulmaya sahiptir. TDP-43(WT-low) N2'den önemli ölçüde farklı değildir, TDP-43 (WT-yüksek) ise hareketlilikte net farklılıklar sergiler. TDP-43(M337V) ve tau (WT) suşları hareketlilikte daha ciddi bozukluklara sahiptir.

Yüzme tahlilleri
C. eleganlar sıvıya daldırıldığında basmakalıp yüzme (kırbaçlama) hareketine girerler. Dalgıçlık anında, solucanlar karakteristik olarak baş ve kuyruğu yaklaşık 45 ° büküm açısıyla birbirlerine doğru bükmeye başlar ve açı köşesi solucanın orta noktasıdır. Solucanlar ventral ve dorsal yönlerde bükme dönüşümlü. Yazılım tarafından ölçülen bir dayak, yönlülükten bağımsız olarak doğrudan 20° veya daha büyük bir gövde büküm açısına gitme hareketini temsil eder (açı eşiği , Analiz ve Çizim penceresinde işlem sonrası ayarlanabilir [İş Akışı | Veri | Çözümleme Vücut Şekli | Bükme Açısı | Orta Nokta | Genlik Eşiği: # derece]. Burada açıklanan yüzme tahlili, yüzme aktivitesinin tarafsız puanlamasını sağlamak için otomatik bilgisayar tabanlı izleme ve analiz kullanır. Vahşi tip (N2) solucanların 20 °C'de yükseltildiğinde ve kaydedildiğinde dakikada ortalama 150-200 kırbaç olması beklenir. Şekil 5'te sunulan örnek veriler, vahşi tip insan TDP-43'ü hafif bir fenotip [TDP-43(WT-hafif), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43) ile ifade eden iki farklı transgenik suş olan N2'yi karşılaştıran beklenen sonuçları gösterir; Pmyo-3::GFP])] veya daha güçlü fenotip [TDP-43(WT-orta), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])] ve başka bir nörodejeneratif hastalık ilişkili proteini ifade eden transgenik bir suş, vahşi tip insan tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. ALS-mutant TDP-43 [TDP-43(M337V)] ifade eden transgenik suş sıvıda çırpınmaz ve bu nedenle grafikte ND (veri yok) olarak gösterilir. Bu test, Şekil 4'te gösterilen radyal locomotion testinden farklı fenotipleri ayırt edebilir. Örneğin radyal locomotion testinde (Şekil 4), TDP-43(WT-low) N2'den önemli ölçüde farklı değildi. Bununla birlikte, yüzme testinde (Şekil 5), hem TDP-43 (WT-low) hem de TDP-43 (WT-high) N2'den önemli ölçüde farklı olduğu gibi, bir birinden de önemli ölçüde farklıdır. Ayrıca, hem TDP-43 (M337V) hem de tau (WT) radyal hareketlilik nedeniyle ciddi emekleme bozukluklarına sahip olmasına rağmen (Şekil 4), sadece tau (WT) yazılım tarafından izlenecek kadar kırbaçlanabilir (Şekil 5). TDP-43(M337V) hayvanlar kırbaçlayamaz ve yazılım tabanlı analiz bu solucanları doğru bir şekilde algılamaz veya izlemez. Böylece, bu solucanlarla ilgili veriler toplanmadı (ND, veri yok).

Şekil 1: Radyal locomotion test iş akışı. Paneller A-E radyal locomotion testinin genelleştirilmiş adımlarını gösterir. Adımlar şu şekildedir: (A) KENARLARINA OP50 tohumlu NGM Plakaları, merkezi nokta ile işaretlenerek ve işaretlenerek hazırlanır, (B) solucanlar orta nokta ile işaretlenmiş olarak agarın ortasına yerleştirilir, (C) solucanların belirli bir süre serbestçe hareket etmesine izin verilir, (D) plakası aşağıdan yukarıya çevrilir ve her solucanın son konumu orta noktadan farklı bir renkte işaretlenir, (E) Elle veya dijital olarak ölçülen orta noktadan her son solucan konumuna olan mesafe. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ImageJ kullanılarak nihai konumun dijital ölçümü.  Plakanın ImageJ (A) tarama arka tarafını çerçevede bir cetvelle dijital olarak ölçmek için merkez ölçümlerinden uzaklık elle veya dijital olarak ölçülebilir. (B) Çizgi aracını kullanarak bilinen bir uzunluk çizin. (C) Ölçeği ayarlamak için (B) içinde çizilen bilinen uzunluğu kullanın [Analiz | Ölçeği Ayarla...]. (D) Orta noktadan son konum işaretine bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın, her işaret için yineleyin. (E) Puanlamada ölçülen ilk işareti işaretleyen bir boya fırçası çizgisi (1 işaretin yanındaki dalgalı siyah çizgi). Son konum işaretleri, puanlamanın yönünü göstermek için sarı olarak numaralandırilir. (F) Ölçümler Sonuçlar penceresine kaydedilir. İstatistiksel analiz için sonuçları başka bir yere kaydedin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Yazılımın kullanılmasına yönelik malzeme ve donanım ayarlamaları. (A) Yazılım destekli yüzme tahlilleri için kullanılan malzemeler. (B) Yazılımın ve gerekli malzemelerin genel kurulumu, muhafazanın yükseltilmiş konumda olduğunu unutmayın. (C) Lens montaj braketi yüksekliği ayarlanabilir. Bu görüntüde, ayarlanabilir pist ve yüzme testlerini gerçekleştirmek için tercih edilen yüksekliği işaretleyen bir bant göstergesi gösterilebilir. Kayıt yapmadan önce parlak alan ışığını ve kamera odağını ayarlamak gerekir. (D) Sahneye 35 mm'lik bir test plakası yerleştirilir, plakaya M9'daki hayvanlar eklenir ve 1 dakikalık bir zamanlayıcı başlatılır. (E) Solucanları merkeze yaklaştırmak için plakayı hafifçe döndürmek bazen avantajlıdır - canlı yakalama ekranında konumu gözlemleyin; alternatif olarak, solucanları ayırmak için bir pipettörden birkaç damla M9 kullanılabilir. (F) Kamera lensinin netleme halkasını ayarlayın, en iyi odağı belirlemek için ekrandaki solucanları gözlemleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Radyal hareketlilik tahlilleri tarama hızındaki farklılıkları tespit eder. Gelişimsel olarak sahnelenen L4 larvalarının uyarılmamış dağılımı, yukarıda açıklanan radyal locomotion testi kullanılarak ölçüldü ve μm/dk seyahat (A-B) olarak grafiklendi. (A) ve (B) öğelerinde çizilen aynı veriler iki farklı olası grafik sunuyu gösterir. (A) içinde, veriler bir çubuk grafik olarak görüntülenir ve gerinimler arasındaki göreli farkları daha net hale getirir. (B) içinde, her solucanın son yer değiştirmesi grafik içinde yer alır ve popülasyon içindeki varyasyonun daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Test edilen suşlar arasındaki önemi değerlendirmek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile varyansın (ANOVA) tek yönlü analizi kullanılmıştır. **p=0.0022, ****p<0.0001, ns=önemli değil. TDP-43(M337V) ve tau(WT) da N2, p<0.0001'den önemli ölçüde farklıdır. (A) hata çubukları ortalamanın standart hatasıdır (SEM) ve (B) standart sapmadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yüzme tahlilleri sıvıdaki dayaktan farklılıkları tespit eder. Yüzme oranları (sıvıda kırbaçlama veya dalgalanma sıklığı) yukarıda açıklanan tarafsız bilgisayar destekli puanlama ve analiz kullanılarak ölçüldü ve thrashes/dk (A-B) olarak grafiklendi. (A) ve (B) içinde çizilen verilerle aynıdır. (A) içinde veriler, suşlar arasındaki göreli farklılıkların görülmesini kolaylaştıran bir çubuk grafik olarak grafiklendirilir. (B) içinde, puanlanan her bir solucandan elde edilen veriler grafik içinde çizilir ve popülasyon içindeki varyasyonun daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Test edilen suşlar arasındaki önemi değerlendirmek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile varyansın (ANOVA) tek yönlü analizi kullanılmıştır. s<0.0001, ns=anlamlı değildir. TDP-43(WT-orta) ve tau(WT) da N2'den önemli ölçüde farklıdır, p<0.0001.A) hata çubukları ortalamanın standart hatasıdır (SEM) ve (B) standart sapmadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Mutant TDP-43 solucanları vahşi tip solucanlardan daha az seyahat eder. Sahnelenmiş L4 N2 (vahşi tip) ve TDP-43(M337V) (CK423(bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), oda sıcaklığında 1 saat boyunca uyarılmadan süründükten sonra ciddi şekilde bozulmuş motor fonksiyonu olan mutant insan TDP-43'ü ifade eden bir suş. Plakalar orta nokta için kırmızı bir nokta ve hayvanların son konumu için mavi noktalar ile işaretlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Görüntüleme ve izleme yazılımı kullanılarak yüzme davranışının kaydedilme şekli. (A) İzleme iş akışı ve video yakalama simgesinin konumu. (B) Video Yakalama penceresi Canlı Görüntü'de gösterilir ve en önemli hususlar vurgulanır. Kayıt düğmesi etkinleştirildiğinde yeşil "Canlı görüntü" sözcükleri kırmızı bir "Kayıt" olarak değişir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Yüzme davranışının hazırlanması ve izlenmesi. Bu şekilde, izleme için bir video görüntü dizisi ayarlamaya yardımcı olacak bir dizi ekran görüntüsü gösterilir. Video dizisi hazırlamanın genel protokolü, her iş akışı menüsünü şu sırada açmaktır: Görüntü Sırası | Sıra Bilgisi | Ayarlama Görüntü | Ayarla | Algılama ve İzleme Projeyi Kaydet. Verileri Çözümle penceresi yalnızca bir proje dosyası izlendikten sonra kullanılabilir. (A) Diziyi İzleme iş akışı içinden yazılıma aldıktan sonra açılmış bir .avi (video) dosyası gösterir. (B) Sıra Bilgilerini Ayarla penceresi notlar için bir yer sağlar, ölçeği ayarlar/değiştirir ve bir video dizisi için meta verileri denetler. Ölçeği değiştirme yönergeleri bu pencerede bulunur ve fotoğraf makinesi alçaltılırken veya yükseltildiğinde (B) takip edilmelidir. Resim (C), Görüntüyü Ayarla penceresi ayarlarını gösterir. (D) Algıla ve İzle penceresinin algılama sekmesini gösteren ekran görüntüsü. Solucanları algılamak yazılımı eğitmek için kullanılır ve her video dizisi için ayarlanmalıdır. İsterseniz ek algılama parametreleri burada ayarlanabilir. (E) Yüzme davranışını izlemek için önerilen ayarları içeren Algıla ve İzle penceresinin İzleme sekmesinin ekran görüntüsü. Bu, bir video dizisi ayarlamanın son adımıdır. Projeyi Kaydet penceresini kullanarak sırayı proje olarak kaydedin . Her video dizisi için bu adımları yineleyin. Ayarlar, iş yükünü azaltmak ve tüm dizilerin aynı şekilde ele alınmasından (gösterilmemesini) sağlamak için bir yapılandırma olarak kaydedilebilir. Proje dosyalarını analiz için izlemek için Toplu İş Akışı'na gidin. (F) Toplu İş akışına gitmek için kullanılan simgeyi gösterir ve (G) toplu işlem penceresini gösterir, ekle ve başlat düğmelerini vurgular ve izlenen bir proje dosyasının beklenen görünümünü gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Yüzme davranış analizi. Bir proje dosyası izlendikten sonra [Dosya | kullanılarak açılabilir Projeyi Aç]. Solucanlar (A) içinde gösterildiği gibi yeşil renkte görünecektir. Videoyu ovalamak, videonun beklediği gibi işlendiğini hızlı bir şekilde kontrol etmeyi teklif ediyor, yeşil vurgulama ovma yaparken kaybolacak. Veri Çözümleme ve Çizim penceresi Verileri Çözümle iş akışı öğesinden açılır. (B) Konum görünümü açıkken (varsayılan) Veri Analizi ve Çizim penceresini gösterir, tüm izler vurgulanır. Veri noktalarının altında, vurgulanan her solucan için kaydedilen parçayı gösteren bir çizim vardır. Parça özeti analizi, dakika başına hesaplanan dönüşler için kullanılır. (C-D) parça özeti raporunu ve dışa aktarma ayrıntılarını gösterir. (E-F) bir elektronik tabloda parça özetini ve dakika başına dönüşlerin nasıl hesaplanacağını, bu testte ölçülen çıktıyı gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Radyal hareketlilik:
Bu tahlilin çözünürlüğü zaman değişkeni değiştirilerek kolayca kontrol edilir. Sürenin artırılması, şiddetli fenotiplere sahip hayvanlar arasındaki farklılıkları gözlemlemeyi kolaylaştırır, böylece ince farklılıkları tanımlar. Bununla birlikte, bu test yer değiştirmeyi ölçtüğünden, tahlil süresi çok uzun uzatılırsa, N2 gibi normal hareketliliği olan hayvanlar plakanın kenarlarına seyahat eder ve yiyecek arama davranışı geriye doğru iz sürmeye yol açar. Bu, kat edilen mesafenin ölçümünü yapay olarak azaltacaktır. Çok uzun olan zaman aralıkları, özellikle daha az şiddetli motor fenotipleri olan hayvanlar arasındaki suşlar arasındaki farklılıkların kaybolmasına neden olabilir, çünkü hayvanlar plaka boyunca eşit olarak dağılır. Zaman değişkeninin kısaltılması, daha aktif solucanların plakanın kenarlarını bulmasını önleyecektir. Bu yöntem, her solucan için kat edilen toplam mesafeyi izlemez, ancak her solucan için kat edilen mesafeyi plakanın merkezinden doğrusal bir mesafeye sıkıştırır. Bu nedenle, doğası gereği tek tek solucanların toplam iz uzunluğunu kaydeden bir yöntemden daha az sağlamdır. Bununla birlikte, radyal locomotion testi çok az araştırmacı eğitimi gerektirir, çoğu solucan laboratuvarında yaygın olarak bulunan nispeten uygun fiyatlı reaktifleri kullanır ve önemli ve tekrarlanabilir sonuçlar üretecek kadar hassastır. Otomatik video izlemeyi tercih eden laboratuvarlar için, gezinme hareketlerini izlemek ve analiz etmek için daha önce çeşitli yöntemler ^{oluşturulmuştur12} veya bu makaledeki yüzme tahlilleri için kullanılan yazılım parametreleri tarama algılama ve analizine izin vermek için değiştirilebilir.

Bu deney genellikle üç taraflı bağımsız çoğaltmalarda yapılır ve çoğaltma başına 30-40 solucan kümesi vardır. Her çoğaltma, plaka başına 15-20 solucan ile iki farklı 100 mm veya 150 mm plakaya bölünür. Plaka başına önerilenden daha fazla solucan kullanmak, verimli bir şekilde puan almanın zor olmasını sağlayabilir. 90+ puan alan toplam sayı, hafif, orta veya şiddetli hareketlilik bozukluğu için önem oluşturmak için yeterince güçlendirilmiştir. Puanlanan suşlar arasındaki zamanlama ile tutarlı olmak doğruluk ve tekrarlanabilirlik için gereklidir. 30 dakika genellikle insan mutant TDP-43'ü ifade eden transgenik suşlar gibi orta ila şiddetli fenotipler arasında vahşi tip solucanlara kıyasla farklar oluşturacak kadar uzundur (Şekil 4). Zaman değişkeni uzatılacaksa, plakanın boyutunun 100 mm'den 150 mm'ye çıkarılması da önerilir. Sıcaklık ve nem gibi çevresel faktörler, tipik olarak ortam odası sıcaklığında gerçekleştirilen bu tahlilleri etkileyebilir, bu nedenle çoğaltmalar arasında karşılaştırma yaparken her zaman vahşi tip (N2) kontrolü kullanmak önemlidir. Ek olarak, bu test, sıvıda normal yüzme davranışı sergilemeyen bazı suşların hareketliliğini ölçebilir (kırbaçlama), yüzme testine yararlı bir tamamlayıcıdır.

Yüzme tahlil:
Solucan yüzmesinin izlenmesini ve analizini otomatikleştirmek için görüntüleme ve edinme sisteminin kullanılması, titiz ve tarafsız verilere izin verir. Bununla birlikte, denemenin ilk kurulumu sırasında örnekler arasında kontrol edilmesi gereken birkaç faktör vardır. Bunlar, kayda başlamadan önce sıvıya alışma süresini, ortam koşullarını (örneğin sıcaklık, nem) ve tutarlı ışık ve kayıt ayarlarını içerir. Kayıt aşamasında, plakalar arasındaki değişkenliği azaltmaya yardımcı olan çeşitli özellikler vardır. Bunlar arasında, video kaydına plakalar arasında tutarlı hale getiren entegre bir parçaya monte kamera ve parlak alan aşaması, kayıt sırasında yansımaları, parlamayı ve hava hareketlerini önleyen sahne alanının etrafında koruma ve solucanları güvenilir bir şekilde algılayan ve video sonrası işlemdeki parçaların manuel olarak düzeltilmesini sağlayan sağlam bir yazılım paketi bulunur. Bu protokolde, solucanlı 35 mm'lik bir plakanın videoları 1 dakika boyunca kaydedilir ve daha sonra yazılım paketi kullanılarak işlenir. İşlemden sonra, izlerin manuel olarak düzeltilmesi, solucan davranışlarının şaşırtıcı izleme hataları olmadan doğru bir şekilde kaydedilmesini sağlar. Dönüş sayısı ve izleme süresi verileri, son okuma olarak dakika başına dönüşleri belirlemek için kullanılır. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, her biri 40-50 hayvan puanlanmış en az 3 bağımsız çoğaltma deneyi üzerinden veri toplanır ve toplam son hayvan sayısı 120-150'ye ulaşır. Bu sayı, yüzme davranışındaki küçük farklılıkları kontrol solucanlarından ayırt etmek için yeterlidir. Bazı solucanların yüzerek test edilemeyecek kadar ciddi motor açıkları vardır. Örneğin, beklenen dayak tepkisini yerine sıvı bir orta kıvrılmaya yerleştirilen hayvanlar, bu tahlil bu hareketleri doğru bir şekilde kaydetmez ve radyal hareketlilik gibi başka bir hareket testi bu hareketlilik kusurlarını daha iyi yakalayabilir. Sağlanan protokol ticari olarak kullanılabilen bir görüntüleme sistemi kullanır (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosu'na bakın), ancak diğer solucan izleme sistemleri benzer bir yardımcı program sağlayabilir ve bazıları açık ^kaynak12'dir. Daha önce yayınlanan yöntemler solucan kırbaçlamanın manuel puanlamasını ^açıklar13. Otomatik analiz her bir solucan için bir dizi ölçüm üretirken, dakikada thrashes ile ölçülen vücut bükümlerinin tespiti, deneyler ve izler arasında, solucan kırbaçlarının gözle geleneksel puanlamasıyla tutarlı sonuçlar sağlar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	-	Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass	VWR	14673-010	Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.
Disposable petri dishes, 35x10mm	VWR	10799-192	Assay plates for WormLab Imaging System
Disposable petri dishes, 60x15mm	VWR	25384-090	Stock plates for worms
Disposable petri dishes, 100x15mm	VWR	25384-302	Standard radial locomotion assay plate
Disposable petri dishes, 150x15mm	VWR	25384-326	Longer time frame radial locomotion assay plate
Dissecting microscope	Leica	M80	Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays
Fine-tipped markers	VWR	52877-810	Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.
Flatbed Scanner	Amazon	Epson Perfection V850	Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine
ImageJ	NIH	-	Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
M9 buffer	VWR	IC113037012	Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
NGM (Nematode Growth Medium)	VWR	76347-412	Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
OP50  bacteria	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Primary food source for C. elegans
p1000 pipettor	VWR	76207-552	Pipettor, used in swimming assay
p1000 tips	VWR	83007-384	Tips for pipettor, used in swimming assay
Platinum wire, 0.2032mm diameter	VWR	BT136585-5M	Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.
Ruler	VWR	56510-001	Need to score radial locomotion assays
WormLab Imaging System	MBF Bioscience	WormLab	The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system