Summary
Dit protocol beschrijft twee gevoelige testen voor het onderscheid tussen milde, matige en ernstige motorische stoornissen in C. elegans-modellen van amyotrofische laterale sclerose, met algemeen nut voor C. elegans-stammen , met veranderde beweeglijkheid.
Abstract
De neurodegeneratieve ziekte amyotrofische laterale sclerose (ALS) kenmerkt progressief verlies van motorneuronen vergezeld van spierzwakte en motorische stoornissen die met de tijd verergeren. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij het bepalen van genetische drivers van ALS voor een subgroep van patiënten, hebben de meeste gevallen een onbekende etiologie. Verder zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan motorneurondisfunctie en degeneratie niet goed begrepen; daarom is er een voortdurende behoefte om representatieve modellen te ontwikkelen en te karakteriseren om deze processen te bestuderen. Caenorhabditis elegans kunnen hun beweging aanpassen aan de fysieke beperkingen van hun omgeving, met twee primaire bewegingsparadigma's bestudeerd in een laboratoriumomgeving: kruipen op een vast oppervlak en zwemmen in vloeistof. Deze vertegenwoordigen een complex samenspel tussen sensatie, motorneuronen en spieren. C. elegans modellen van ALS kunnen een beperking vertonen in een of beide van deze bewegingsparadigma's. Dit protocol beschrijft twee gevoelige assays voor het evalueren van de beweeglijkheid in C. elegans: een geoptimaliseerde radiale voortbewegingstest die het kruipen op een vast oppervlak meet en een geautomatiseerde methode voor het volgen en analyseren van zwemmen in vloeistof (thrashing). Naast de karakterisering van baseline motorische stoornissen van ALS-modellen, kunnen deze testen onderdrukking of verbetering van de fenotypes detecteren door genetische of kleine molecuulinterventies. Deze methoden hebben dus nut voor het bestuderen van ALS-modellen en elke C. elegans-stam die veranderde beweeglijkheid vertoont.
Introduction
Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een slopende, verouderingsgerelateerde neurodegeneratieve ziekte met een bijzondere impact op motorneuronen. De ziekte kenmerkt verlies van motorneuronen in de hersenen en het ruggenmerg en progressieve motorische stoornissen. Dit resulteert in ernstige functionele invaliditeit en vroegtijdig overlijden, meestal binnen 3-5 jaar na diagnose1. Mutaties in minstens 38 genen kunnen ALS veroorzaken; de meeste patiënten met ALS accumuleren echter ubiquitinated inclusies van het eiwit TDP-43 als hun primaire pathologie in neuronen en gliacellen2,3,4. Er zijn een aantal diermodellen ontwikkeld om de onderliggende mechanismen te bestuderen die in vivo ALS veroorzaken of eraan bijdragen (beoordeeld in5). Bij C. elegans omvatten deze modellen genetische functieverliesmutaties in homologen van ALS-veroorzakende genen of transgene expressie van menselijke ALS-genen. Er zijn tal van voordelen aan het modelleren van ALS in C. elegans. C. elegans zijn een handelbaar eenvoudig dier met een gedifferentieerd zenuwstelsel, goed gekarakteriseerde gedragsparadigma's en een aanzienlijke genetische homologie aan de mens6,7. Er bestaan veel hulpmiddelen voor het werken met C. elegans, waaronder robuuste genoombewerkingsmogelijkheden, in vivo fluorescerende verslaggevers van neurodegeneratie, RNAi-screeningsparadigma's, handelbare genetica en gevestigde gedrags- en fenotypische assays. C. elegans-modellen van ALS recapituleren aspecten van menselijke ziekten, waaronder accumulatie van onoplosbaar eiwit, neurodegeneratie en vroege dood8,9. Verder is motorische disfunctie met verstoring van zowel kruip- als zwemgedrag aanwezig in veel C. elegans ALS-modellen.
Dit protocol beschrijft twee methoden om C. elegans motorfenotypes te karakteriseren: de radiale voortbewegingstest voor het evalueren van kruipen op een vast oppervlak en de beoordeling van zwemmen in vloeistof (thrashing) met behulp van de WormLab geautomatiseerde tracking en analyse. Deze gevoelige methoden voor het karakteriseren van motorische tekorten maken vergelijkingen van de ernst mogelijk en bieden hulpmiddelen voor het meten van onderdrukking en verbeteringen van motorische fenotypen. De radiale voortbewegingstest kwantificeert verschillen in kruipmotiliteit (sinusoïdale beweging op een vast oppervlak) tussen populaties van wormen. Deze test maakt gebruik van C. elegans natuurlijke ongestimuleerde exploratiegedrag door wormen op een enkele locatie op een plaat te plaatsen en hun uiteindelijke locatie na een bepaalde periode te markeren10. Als alternatief, zwemmen in vloeibare (thrashing) assays tellen lichaamsbuigingen van individuele wormen over een bepaalde periode van tijd. Het handmatig tellen van lichaamsbuigingen door het menselijk oog is tijdsintensief en vertoont doorgaans een aanzienlijke variabiliteit tussen experimentatoren. Het gebruik van computerondersteunde geautomatiseerde tracking en analyse kan veel van die variabiliteit elimineren. Naast de karakterisering van baseline motorische stoornissen van ALS-modellen, kunnen zowel radiale voortbewegings- als zwemtests modulatie van verschillende locomotorische fenotypen detecteren uit genetische of kleine molecuulinterventies. Deze methoden hebben nut voor het bestuderen van ALS-modellen en elke C. elegans-stam die een veranderde beweeglijkheid vertoont.
Protocol
1. Radiale locomotietest
- Bereid petrischalen met een diameter van 100 mm of 150 mm ongeveer halfvol met nematodengroeimedia (NGM) en gezaaid met een uniform gazon van OP50-bacteriën om het hele oppervlak van de agar te bedekken.
- Draai de NGM-testplaten ondersteboven en label de bodem met een identificatie voor de te testen C. elegans-stammen , 2 platen per stam (figuur 1A).
- Maak een kleine stip met de stift in het midden van de ondersteboven geplaatste plaat (figuur 1A).
- Breng tijdens het werken met een ontleedmicroscoop 15-20 geënsceneerde matched11-wormen over naar het midden van de testplaat direct over de middelste stip (zichtbaar door de NGM) met behulp van een platinadraadplectrum (figuur 1B).
OPMERKING: Probeer alle wormen tegelijkertijd of zo snel mogelijk over te brengen.- Stel een timer in voor 30 minuten nadat wormen in het midden van de plaat zijn geplaatst. Leg het deksel terug op het bord en zet het apart (figuur 1C).
- Ga door met het overbrengen van wormen totdat alle stammen op de aangewezen testplaten staan, waarbij u ongeveer noteert hoe lang het duurt om tussen platen over te brengen (streef naar ~ 1 min tussen platen). Bewaar alle borden in dezelfde volgorde als waarin ze zijn opgesteld.
- Na 30 minuten begin je met het scoren van de eerste plaat.
- Verwijder het deksel en plaats de plaat met de voorkant naar beneden onder de ontleedmicroscoop, zodat de gelabelde achterkant van de plaat naar boven is gericht en de NGM-agar zich tussen de zichtlijn en de wormen bevindt. De plaat zal ondersteboven zijn van het normale gebruik.
- Pas de microscoopfocus aan totdat wormen zichtbaar zijn door de agar.
- Gebruik een andere gekleurde viltstift vanaf het middelpunt en plaats een kleine stip op de locatie van elke worm - volg de wormsporen door het bacteriële gazon om de meest distale dieren te vinden.
- Controleer de rand van de plaat, want daar kunnen sommige wormen terechtkomen. Tel en noteer ook het aantal wormen in de middelste puntpuntpunt (figuur 1D).
- Blijf alle testplaten in volgorde markeren, zodat alle platen 30 minuten activiteitstijd hebben, waarbij u voorzichtig rekening houdt met de tijd die het kostte om de plaat in te stellen. Voer vervolgens handmatige of digitale metingen uit zoals beschreven in stap 1.8 of 1.9.
- Voer handmatige metingen uit met behulp van een liniaal.
- Gebruik een liniaal om in mm te meten, de afstand van het middelpunt tot de uiteindelijke locatiemarkeringen voor elke worm en noteer de afstand. Om de voortgang tijdens het scoren bij te houden, labelt u het eerste gescoorde punt met een kleine markeringslijn.
- Noteer lengtegegevens voor elke punt achtereenvolgens door de plaat met de klok mee te draaien (figuur 1E).
- Voer digitale metingen uit met behulp van een scanner en ImageJ.
- Scan met behulp van een flatbedscanner de achterkant van de testplaat(en) naast een liniaal (nummers naar het scanoppervlak gericht) (figuur 2A).
- Open de gescande plaatafbeelding in ImageJ of een vergelijkbaar programma.
OPMERKING: ImageJ is een gratis Java-gebaseerde beeldverwerkingssoftware die wordt gehost door de NIH. - Klik op het gereedschap Rechte lijn en teken vervolgens een lijn die de punten van 1 cm en 2 cm verbindt met de gescande afbeelding van de liniaal (afbeelding 2B).
OPMERKING: Als u de Shift-computertoets ingedrukt houdt, wordt de lijn naar de dichtstbijzijnde hoek van 45° geforceerd. - Navigeer naar het menu Analyseren en gebruik het om de schaal in te stellen (| Schaal instellen) (Figuur 2C).
- Voer de bekende afstand (10) en lengte-eenheden (mm) in de juiste vakken in, pas de afstand niet aan in pixelsaantal. Controleer Globaal om dezelfde schaal toe te passen op alle afbeeldingen die in elke ImageJ-sessie worden geanalyseerd; Anders stelt u de schaal voor elke afbeelding in bij het openen (afbeelding 2D). Klik op OK.
OPMERKING: Stappen 1.9.2-1.9.5 worden uitgevoerd om de meetschaal in te stellen. Metingen voor deze afbeelding relateren nu automatisch de lengte van lijnen aan de gedefinieerde pixel: lengterelatie. Afbeeldingen die met 300 dpi worden gescand, hebben een geschatte relatie van 11,8 pixels per mm. - Gebruik het gereedschap Penseel om net boven het eerste punt te markeren dat moet worden gescoord.
OPMERKING: Dit is een visuele indicator voor de eerste worm die wordt gescoord. - Gebruik het gereedschap Rechte lijn om een lijn te tekenen van het middelpunt naar het eerste wormgegevenspunt.
- Klik op de M-toets op het toetsenbord om de afstand te meten. U kunt ook naar het menu Analyseren gaan en Meten (analyseren | Maatregel). In beide gevallen verschijnt de meting in een nieuw venster; dit venster verzamelt alle metingen per afbeelding.
- Houd het middelpunt constant, verplaats het uiteinde van de lijn die het eerste wormpunt raakt naar het volgende wormpunt, beweeg met de klok mee en klik op de M-toets om te meten.
- Blijf elk punt met de klok mee meten totdat alle punten zijn gescoord.
-
Kopieer en plak lengtemetingsgegevens in een spreadsheet om deze op te slaan. Herhaal vervolgens het proces voor elke gescande plaatafbeelding.
OPMERKING: Stap 1.9.6 - 1.9.11 meet de wormverplaatsingswaarden (figuur 2E-F).
- Voer statistische analyses uit.
- Combineer replicaties binnen een enkel experiment, zodat een totaal aantal gescoorde tussen de 30-40 wormen ligt.
- Voer onafhankelijke experimentele replicaties uit op verschillende dagen en met onafhankelijke populaties van wormen om te eindigen met 3 onafhankelijke experimentele replicaties.
- Analyseer gegevens met behulp van geschikte statistische analyses zoals student's t-test voor 2 stammen of 1-weg ANOVA voor drie of meer stammen.
2. Computer-geanalyseerde zwemtest
OPMERKING: Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor het in de handel verkrijgbare WormLab hardware- en softwaresysteem (zie Materiaaltabel). De workflow kan echter worden toegepast op andere computer-geanalyseerde zwemtestsystemen.
- Video's instellen en opnemen.
- Verhoog de afscherming op de beeldverwerkingshardware (figuur 3) en controleer of de camerahoogte is ingesteld op de verwachte locatie.
OPMERKING: De optimale hoogte voor het vangen van wormen op een plaat van 35 mm is zodanig dat de derde van de onderste schroefdraadboring zichtbaar is onder de verstelbare montagebeugel van de camera, maar er is geen extra montagegat te zien boven de schroefboring (ongeveer 30,5 cm boven het podium) (figuur 3C). Dit resulteert in een capture ratio van 11,43 μm/pixel. Overweeg een indicator voor de "juiste hoogte" toe te voegen, zodat dit gemakkelijker te bevestigen is voordat u met de test begint. Zie protocolstap 2.18 om rekening te houden met hoogteaanpassingen. - Open de bijbehorende software (aanvullende afbeelding 1A).
- Klik op het pictogram Video-opname (film met een naar rechts wijzend driehoekje in het midden) om een nieuw venster Video-opname te openen. De camera bevindt zich in de Live View, maar het scherm is zwart (aanvullende figuur 1B).
- Druk op de dimmerknop en draai deze met de klok mee om het licht aan te passen.
OPMERKING: De dimmerknop bevindt zich op het podium van het beeldvormingssysteem in de buurt van de heldere veldlichtbron. Het liveweergavescherm van Video Capture verandert van zwart naar verlicht. - Terug in het venster Video-opname klikt u op het tabblad Instellingen , past u het volgende aan: Videomodus: 2456 x 2052_Mono8, Framesnelheid: 14, Uitvoer: monochroom, Belichting: 0,00300 s, Versterking: 1 dB , Gamma: 1, Roteer 180 (vink aan).
- Ga terug naar het tabblad Vastleggen . Selecteer de opnamemap (aanvullende figuur 1B).
OPMERKING: Hier worden alle opnames en projectbestanden opgeslagen. Maak unieke mappen voor afzonderlijke experimenten om gegevens georganiseerd te houden. - Wijs een bestandsnaam toe door deze in te voeren in het tekstvak Bestandsvoorvoegsel .
OPMERKING: De software voegt automatisch een progressief getal toe aan het einde van het voorvoegsel in het formaat "0001". Het is raadzaam om een consistent naamgevingsschema voor de bestanden te hebben, zoals: "YYYYMMDD_treatmentName_rep#_". - Stel andere opname-instellingen als volgt in: Buffer: 128 frames (standaard), Duur (controleren): 00 h:01min:00 s. Negeer of schakel andere instellingen op dit tabblad uit.
- Plaats de testplaat, deksel omhoog, op het apparaatstadium en centreer deze in het scherm Video-opname ; verwijder het deksel.
OPMERKING: Bereid testplaten van tevoren voor. Elke plaat bestaat uit een petrischaaltje van 35 mm dat ongeveer half vol zit met ongezaaide (geen bacteriële gazon) NGM. - Gebruik een micropipette om de gesynchroniseerde 11 wormen in 1 ml M9 op de testplaat te wassen - streef naar ongeveer 50 wormen (figuur 3D). Draai de plaat voorzichtig om de dieren naar het midden te brengen of gebruik een micropipette om een paar druppels M9 toe te voegen aan afzonderlijke dieren (figuur 3E). Stel een timer in voor 60 s om wormen te laten wennen aan het zwemmen.
OPMERKING: De plaat is niet 100% zichtbaar op het scherm. Dieren worden niet nauwkeurig gevolgd tijdens overlapping. - Terwijl de timer aftelt, past u de camerafocus handmatig aan door de scherpstelring op de lensbehuizing van de camera te draaien terwijl u naar het scherm kijkt (figuur 3F). Het is mogelijk om in te zoomen op de wormen met behulp van een scrollwielmuis, waardoor nauwkeuriger scherpstellen mogelijk is.
- Nadat u de focus hebt ingesteld, stelt u de lichtknop zo in dat het scherm zo helder mogelijk is zonder overbelichting (wordt weergegeven als rode pixels op het display).
- Druk na 60 s op de opnameknop .
OPMERKING: De video gaat van de Live View naar Opname en er is een timer zichtbaar. Wanneer de opname is voltooid, keert het scherm Video-opname terug naar de Live View (aanvullende afbeelding 1B). - Verwijder de plaat na het opnemen en stel de volgende plaat in. Wijzig de naam van het voorvoegsel indien nodig. Was wormen in de testplaat, incubeer gedurende 60 s en noteer elke behandeling.
- Nadat u alle opnamen voor een experiment hebt voltooid, sluit u alle geopende videotabbladen en schakelt u de lichtbron uit door de dimmerknop in te drukken.
- Sluit het venster Video-opname door op de rode x-knop in de rechterbovenhoek van het venster te klikken; U kunt ook het volledige softwarepakket sluiten en opnieuw openen.
- Bereid video's voor op tracking.
- Selecteer in het menu Van werkstroom in de zijbalk de eerste knop in dit menu, Afbeeldingsreeks importeren, en zoek en dubbelklik op een video. De video wordt geopend in het middelste venster (aanvullende figuur 2A).
OPMERKING: De standaardweergave voor de software is het menu Workflow sidebar; dit menu is ook toegankelijk via het bovenste vervolgkeuzemenu weergave onder Beeld [Weergave | Workflow]. Het menu Werkstroom heeft verschillende weergaveopties; de trackweergave is geschikt op dit punt in het protocol. Als de knop Volgorde-informatie instellen niet zichtbaar is in het menu, is dit niet de juiste weergave. Kijk eerst naar de onderkant van het menu en controleer of het tabblad Workflow actief is, controleer vervolgens of de trackweergave actief is door op het trackpictogram te klikken. Waar menu's in het venster worden weergegeven, is afhankelijk van de grootte van de monitor en de locatie van andere geopende menu's. Menu's kunnen worden verplaatst door slepen en neerzetten, het formaat te wijzigen en te sluiten. De meeste menu's kunnen ook worden geopend via het vervolgkeuzemenu Beeld. - Selecteer in het menu Werkstroom de optie Reeksinformatie instellen (aanvullende figuur 2B). Controleer in het nieuwe menuvenster het naamgevingsschema, voeg notities toe en valideer metagegevens.
- Controleer of de schaling correct is ingesteld; Schaal: 11,43 μm /pixel en Meten zal automatisch vullen als 1000 μm is 87 pixels. Als de hoogte van de camera anders is ingesteld dan hier is voorgeschreven, volgt u de instructies in dit menu om de schaal bij te werken. Klik op de knop Opslaan .
- Selecteer in het menu Werkstroom de optie Afbeelding aanpassen en er wordt een nieuw pop-upmenu met de naam Afbeeldingsaanpassingen geopend (Aanvullende afbeelding 2C). Selecteer Donkere wormen op lichte achtergrond (helder veld).
- Pas aanvullende instellingen aan. Aanbevolen instellingen voor beeldverwerking zijn als volgt: Achtergrondafvlakking: 10, Gaussiaanse afvlakking: 5, Gaten vullen: 2, Filter voor kleine objecten: 0 en integrale afgeleide segmentatie overslaan.
- Pas het drempelniveau zo aan dat de dieren volledig gevuld zijn met groen, maar toch duidelijk van de achtergrond. Klik op Toepassen.
OPMERKING: Het is toegestaan om sommige objecten op te pakken die geen wormen zijn. - Selecteer in het menu Werkstroom de optie Detecteren en bijhouden (aanvullende afbeelding 2D).
OPMERKING: Er verschijnt een menu aan de zijkant van de video met 3 tabbladen: Detecteren, Volgen en Herstellen. De cursor ziet eruit als een wijzende vinger boven het videoscherm. U kunt ook op het pictogram Selecteren (cursorpijl) in het pictogrammenu linksboven in de software klikken.- Gebruik de vingerkiezer om 3-7 wormen te selecteren en klik op de knop Wormen detecteren op het tabblad Detectie .
OPMERKING: Deze selectie helpt de software bij het nauwkeurig identificeren van wormen voor bepaalde omstandigheden en moet voor elke video worden uitgevoerd. Na een paar seconden worden de meeste wormen groen gemarkeerd en hebben ze een nummer in geel. Wormen die elkaar raken of opgerold zijn, worden waarschijnlijk niet gemarkeerd; het programma zal ze echter hoogstwaarschijnlijk vinden tijdens het volgen. Er is een optie om de detectieparameters aan te passen; de standaardinstellingen werken echter onder de meeste omstandigheden goed. Als de detectieparameters worden aangepast, zorg er dan voor dat u consistent bent tussen monsters en replicaties.
- Gebruik de vingerkiezer om 3-7 wormen te selecteren en klik op de knop Wormen detecteren op het tabblad Detectie .
- Ga nog steeds in het venster Detecteren en volgen naar het tabblad Traceren (aanvullende afbeelding 2E). Schakel in het selectievakje Traceerparameters Terugtracken gebruiken het selectievakje Wormen bijhouden aan de rand van de afbeelding uit.
- Stel de Max-gevolgde hypothese in op 5. Stel de trackingmodus in op Zwemmen.
OPMERKING: De max-gevolgde hypothese-instelling past aan hoeveel potentiële wormsporen een enkelsporige worm mag hebben en geeft het programma enige speelruimte in hoe nauwkeurig een enkele worm te volgen zonder deze uit het oog te verliezen. 5 is een goede setting om te zwemmen. - Ga naar de sectie Geavanceerde instellingen en stel het volgende in: Frameswormen kunnen grens raken: 50, Frameswormen kunnen overlappen: 500, Positietolerantie: 0,50, Vormtolerantie: 0,50. Sla deze instellingen op en implementeer ze voor alle video's in een experiment (en daarbuiten) door ze op te slaan als een configuratie.
OPMERKING: Trackfiltering wordt niet aanbevolen en kan gemakkelijk nabewerking worden gedaan, weglaten. - Navigeer naar Configuration Manager (tandwielpictogram) in het pictogrammenu linksboven. Wanneer erop wordt geklikt, wordt het menu van de Configuration Manager-zijbalk geopend. Klik vervolgens op het pictogram Opslaan (tandwiel +), geef deze configuratie een naam en beschrijving en klik vervolgens op de knop OK .
- Als u deze configuratie in de toekomst wilt openen, opent u het menu Configuratie , selecteert u de gewenste configuratie en klikt u op het pictogram Laden (pijl omhoog). Voeg vervolgens sequentie-informatie toe, verfijn eventueel het drempelniveau en selecteer wormen voor detectie. Alle andere instellingen zijn hetzelfde.
- Klik in het menu Werkstroom op Project opslaan, controleer de opslaglocatie en voeg een projectbestandsnaam toe (het koppelen van de projectbestandsnaam aan de videonaam helpt bij de continuïteit). Sluit de video.
OPMERKING: Deze projecten worden opgeslagen met het .wpr-bestandstype. - Herhaal voor alle video's: Afbeeldingsreeks importeren (2.18), Opgeslagen configuratie laden (2.28.1), de drempel aanpassen (2.23), volgorde-informatie instellen (2.19), wormen detecteren (2.24.1), het project opslaan (2.29), video sluiten.
- Video's bijhouden
- Als u de projectbestanden wilt bijhouden, gaat u naar het menu Workflow en klikt u op het pictogram Batch (map met wormpagina's) (Aanvullende figuur 2F).
OPMERKING: Het deelvenster Batchverwerking wordt weergegeven (aanvullende figuur 2G). Soms is het verborgen, maar is het helemaal onderaan het menu Batchworkflow toegankelijk; het venster moet mogelijk worden uitgevouwen om het te zien. - Klik op de knop Toevoegen onder het gedeelte Bestandsselectie van dit menu Batchverwerking . Navigeer naar en selecteer alle projectbestanden (.wpr) die moeten worden verwerkt, klik op Openen.
OPMERKING: Het menu Batchverwerking vult zich met het geselecteerde bestandspad, een statusindicator en een grijze voortgangsbalk voor elk bestand. - Klik op het pictogram Start (knop Afspelen). Let op de groene voortgangsindicator op het eerste bestand. Sta toe dat alle bestanden worden verwerkt. Wanneer alle bestanden als voltooid (groen) worden gelezen, kan de software worden gesloten (aanvullende figuur 2G).
- Als een projectbestand vastloopt, overweeg dan om het opgehangen bestand zelf uit te voeren, dit lost het probleem meestal op. Als het probleem hiermee niet is opgelost, opent u het projectbestand, verwijdert u de geselecteerde wormen (menu Detecteren en bijhouden ) en selecteert u opnieuw uit een nieuwe trainingsset. Vervolgens wordt het projectbestand opnieuw verwerkt.
- Als u de projectbestanden wilt bijhouden, gaat u naar het menu Workflow en klikt u op het pictogram Batch (map met wormpagina's) (Aanvullende figuur 2F).
- Reparatie van sporen (aanbevolen)
OPMERKING: Het repareren van tracks kan de nauwkeurigheid van de tracks verhogen. Veelvoorkomende oplossingen zijn het combineren van tracks die duidelijk tot dezelfde worm behoren als door het menselijk oog wordt bekeken, het verwijderen van tracks die niet nauwkeurig zijn of geen echte wormgegevens vastleggen, en het splitsen van tracks die verkeerd worden voorgesteld omdat wormen elkaar raken (verwijder het slechte gedeelte en combineer sporen van voor en na het slechte gedeelte indien praktisch).- Open de software en open een projectbestand [Bestand | Open Project] van belang. Klik op Openen en klik op Ja om dit bestand te gebruiken. Wacht tot het tijdelijke filter is geladen. De verwerkte video wordt op het scherm weergegeven; wormen worden groen gemarkeerd en geel omlijnd. Gebruik de videospeler om de video door te schrobben of af te spelen.
- Selecteer in het menu Werkstroom de optie Detecteren en bijhouden (aanvullende afbeelding 2D). Ga naar het tabblad Herstellen . Activeer de selectorcursor door op het pictogram van het gereedschap Selector (cursorpijl) te klikken. Blader door de video, zoek en selecteer een wormspoor en gebruik vervolgens het reparatiemenu om de gewenste wijziging te maken.
OPMERKING: Om de meeste problemen snel strategisch op te lossen, zoomt u zo in dat ongeveer 1/6e van de plaat zichtbaar is, begin met het gebied rond spoor # 1. Blader snel door de video en controleer op wormen die op mysterieuze wijze uit het niets verschijnen, volgt waar de nummers veranderen of wormen botsen tegen elkaar aan en bewerking als er zich problemen voordoen. Volg wormen in numerieke volgorde vanaf de startpositie. Schrob heen en weer om elke worm zo nodig te volgen totdat de hele plaat is gerepareerd. Let goed op de randen van de plaat; vaak verschijnen nepwormen in de schaduw van plaatranden.
- Data-analyse
- Selecteer in het menu Werkstroom de optie Gegevens analyseren (aanvullende afbeelding 3A).
OPMERKING: Er verschijnt een nieuw venster met de naam Data Analysis and Plotting (aanvullende figuur 3B). Dit venster bevat vele manieren om de verplaatsingsgegevens van de wormpopulatie van een specifiek projectbestand te beoordelen en te bekijken. De meeste van deze analyses maken de selectie van specifieke, meerdere of alle wormen uit een bepaalde video mogelijk, waardoor trackinformatie op verschillende manieren kan worden uitgezet. - Als u het aantal beurten wilt analyseren, navigeert u naar het trackoverzicht [Positie en snelheid | Samenvatting van het spoor] (aanvullende figuur 3C). Gebruik de knop Exporteren rechtsonder om gegevens te exporteren in een leesbare spreadsheetindeling (.csv), kies een pad naar de gewenste locatie van de spreadsheet, inclusief het hernoemen naar iets gedenkwaardigs. De standaardinstellingen zijn een goede keuze (Aanvullende figuur 3D).
- Plak deze gegevens en andere relevante projectgegevenssets in een geconsolideerde spreadsheetwerkmap (aanvullende afbeelding 3E).
- Gebruik het aantal draaien en de duur van de track om de bochten per minuut voor elke track te berekenen met behulp van spreadsheetfuncties (= bochten / trackduur * 60) of gebruik naar wens een andere metriek (aanvullende figuur 3F).
OPMERKING: Turns per minute legt zeer vergelijkbare informatie vast als een handmatige thrashing-test, een veelgebruikte metriek van activiteit in vloeistof, maar er zijn veel opties en het is heel goed mogelijk dat een andere metriek andere interessante gegevens voor een bepaalde behandeling of vergelijking kan identificeren. - Scherm desgewenst op wormgrootte, trackduur en/of andere gekozen statistieken met behulp van voorwaardelijke opmaaktools om tracks te markeren voor verwijdering als ze mogelijk verwarrend zijn. Zorg voor consistente gegevensverwerking tussen behandelingen en replicaties.
- Analyseer gegevens met behulp van geschikte statistische analyses zoals de t-test van Student voor 2 stammen of 1-weg ANOVA voor 3 of meer stammen. Voer onafhankelijke experimentele replicaties uit op verschillende dagen en met onafhankelijke populaties van wormen voor ten minste 3 onafhankelijke experimentele replicaties.
- Selecteer in het menu Werkstroom de optie Gegevens analyseren (aanvullende afbeelding 3A).
Representative Results
Zowel radiale voortbewegings- als zwemtests bieden gevoelige detectie van motiliteitsstoornissen (figuur 4 en figuur 5). Om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan pathologisch TDP-43 bij ALS, zijn C. elegans-modellen ontwikkeld die wild-type of ALS-mutant humaan TDP-43 pan-neuronaal tot expressie brengen. Deze dieren vertonen moleculaire en cellulaire kenmerken die doen denken aan ALS, waaronder motorische disfunctie9. Belangrijk is dat ze matige motiliteitsstoornissen vertonen met de expressie van wild-type humane TDP-43 en meer ernstige motiliteitsstoornissen bij dieren die ALS-mutant TDP-43 tot expressie brengen met behulp van zowel radiale voortbeweging als zwemtests. Sommige gemuteerde of transgene dieren zullen een grotere beperking hebben in kruipen dan zwemmen, of omgekeerd. Door gebruik te maken van twee verschillende motiliteitstesten wordt een duidelijker beeld verkregen van fenotypische verschillen tussen stammen.
Radiale voortbeweging
Wanneer ze op een gezaaide agarplaat worden geplaatst, verkennen C. elegans hun omgeving, inclusief het zoeken naar de grenzen van hun voedselbron. Radiale locomotietests zijn een manier om te profiteren van dat gedrag als een metriek voor fysieke fitheid. Door het locomotorische gedrag (kruipen op een vast oppervlak) op een gecontroleerde en kwantificeerbare manier te analyseren, biedt de radiale locomotorische test een eenvoudig en effectief hulpmiddel voor het beoordelen van de ernst van motorische tekorten en andere motorgerelateerde fenotypen. Radiale voortbewegingstests leggen verschillen in motiliteit vast in matig of ernstig aangetaste ALS-modelwormen en bieden een basislijn om modulatie van motiliteitsfenotypen of veranderingen in motiliteit met de leeftijd te vergelijken (figuur 6). Deze strategie kan worden toegepast om het kruipgedrag te kwantificeren van elke stam die de beweging van wildtype (N2) of controlewormen heeft veranderd. Deze methode is echter mogelijk geen goede keuze om dieren te beoordelen die niet normaal kunnen kruipen, zoals rolmutanten of dieren die verlamd zijn. Typisch, wild-type wormen zullen een gemiddelde verplaatsing tussen 200-300 μm / min vertonen wanneer ze worden verhoogd en getest bij 20 ° C. De voorbeeldgegevens in figuur 4 tonen verwachte resultaten bij het vergelijken van N2, twee verschillende transgene stammen die wild-type humaan TDP-43 tot expressie brengen met een mild fenotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] of sterker fenotype [TDP-43(WT-matig), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], een transgene stam die mutant humaan TDP-43 tot expressie brengt met een ernstig fenotype [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), en een transgene stam die een ander neurodegeneratief-ziekte geassocieerd eiwit tot expressie brengt, wild-type menselijke tau [tau (WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. De twee stammen die wild-type TDP-43 tot expressie brengen, hebben verschillende gradaties van aantasting zoals gedetecteerd door radiale voortbeweging. TDP-43 (WT-laag) verschilt niet significant van N2, terwijl TDP-43 (WT-hoog) duidelijke verschillen in motiliteit vertoont. TDP-43 (M337V) en tau (WT) stammen hebben ernstiger stoornissen in de beweeglijkheid.
Zwemtest
C. elegans houden zich bezig met stereotiepe zwembewegingen (thrashing) wanneer ze worden ondergedompeld in vloeistof. Onmiddellijk na onderdompeling beginnen wormen hoofd en staart karakteristiek naar elkaar toe te buigen met een buighoek van ongeveer 45 °, waarbij de hoekhoek het middelpunt van de worm is. Wormen wisselen buigingen af in de ventrale en dorsale richting. Eén thrash, zoals gemeten door de software, vertegenwoordigt de beweging van het gaan van recht naar een lichaamsbuighoek van 20 ° of meer, ongeacht de directionaliteit (hoekdrempelvorming kan nabewerking worden aangepast in het venster Analyse en Plotting [Workflow | Gegevens | analyseren Lichaamsvorm | Buighoek | Mid-Point | Amplitudedrempel: # graden]. De hier beschreven zwemtest maakt gebruik van geautomatiseerde computergebaseerde tracking en analyse om onbevooroordeelde scores van zwemactiviteit te bieden. Verwacht wordt dat wild-type (N2) wormen gemiddeld tussen de 150-200 thrashes per min zullen hebben wanneer ze worden opgetild en geregistreerd bij 20 °C. De voorbeeldgegevens in figuur 5 tonen de verwachte resultaten van het vergelijken van N2, twee verschillende transgene stammen die wild-type humaan TDP-43 tot expressie brengen met een mild fenotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] of sterker fenotype [TDP-43(WT-matig), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], en een transgene stam die een ander neurodegeneratief-ziekte geassocieerd eiwit tot expressie brengt, wild-type menselijke tau [tau (WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. De transgene stam die ALS-mutant TDP-43 [TDP-43(M337V)] tot expressie brengt, wordt niet in vloeistof gegooid en wordt dus op de grafiek aangeduid als ND (geen gegevens). Deze test kan verschillende fenotypen onderscheiden dan de radiale voortbewegingstest in figuur 4. In de radiale voortbewegingstest (figuur 4) verschilde TDP-43 (WT-laag) bijvoorbeeld niet significant van N2. In de zwemtest (figuur 5) verschillen zowel TDP-43 (WT-laag) als TDP-43 (WT-hoog) echter aanzienlijk van N2 en verschillen ze aanzienlijk van elkaar. Ondanks dat zowel TDP-43 (M337V) als tau (WT) ernstige kruipstoornissen hebben door radiale voortbeweging (figuur 4), is alleen tau (WT) in staat om voldoende te worden gevolgd door de software (figuur 5). TDP-43 (M337V) dieren zijn niet in staat om te slaan, en software-gebaseerde analyse detecteert of volgt deze wormen niet nauwkeurig. Er werden dus geen gegevens over deze wormen verzameld (ND, geen gegevens).
Figuur 1: Radiale locomotietestworkflow. Panelen A-E tonen de gegeneraliseerde stappen van de radiale locomotietest. De stappen zijn als volgt: (A) NGM-platen, met OP50 gezaaid tot aan de randen, worden voorbereid door centrale stip te labelen en te markeren, (B) wormen worden in het midden van de agar geplaatst zoals gemarkeerd door de centrale stip, (C) wormen mogen gedurende een bepaalde tijd vrij bewegen, (D) plaat wordt bottom-up omgedraaid en de uiteindelijke locatie van elke worm is gemarkeerd in een andere kleur dan de centrale stip, (E) De afstand van de middelste stip tot elke uiteindelijke wormlocatie wordt met de hand of digitaal gemeten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Digitale meting van de uiteindelijke locatie met behulp van ImageJ. Afstand tot het midden metingen kunnen met de hand of digitaal worden gemeten, om digitaal te meten met behulp van ImageJ (A) scan achterkant van de plaat met een liniaal in het frame. (B) Teken een bekende lengte met het lijngereedschap. (C) Gebruik de bekende lengte getekend in (B) om schaal in te stellen [Analyseren | Schaal instellen...]. (D) Gebruik het lijngereedschap om een lijn van het middelpunt naar een definitieve locatiemarkering te tekenen, herhaal dit voor elke markering. (E) Een penseellijn die het eerste gemeten merk markeert, helpt bij het scoren (kronkelige zwarte lijn in de buurt van de 1-markering). De uiteindelijke locatiemarkeringen zijn geel genummerd om de richting van het scoren te illustreren. (F) Metingen worden geregistreerd in het venster Resultaten. Sla resultaten elders op voor statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Materiaal- en hardwareaanpassingen voor het gebruik van de software. (A) Materialen die worden gebruikt voor de softwareondersteunde zwemtest. (B) Algemene instelling van de software en benodigde materialen, merk op dat de behuizing zich in de verhoogde positie bevindt. (C) De hoogte van de lensbevestigingsbeugel kan worden aangepast. Deze afbeelding toont de verstelbare track en een tape-indicator die de gewenste hoogte markeert voor het uitvoeren van zwemtests. Het is noodzakelijk om het felle veldlicht en de camerafocus aan te passen voordat u opneemt. (D) Een testplaat van 35 mm wordt op het podium geplaatst, dieren in M9 worden aan de plaat toegevoegd en een timer van 1 minuut wordt gestart. (E) Het is soms voordelig om de plaat voorzichtig te draaien om wormen dichter bij het midden te plaatsen - observeer de locatie op het live opnamescherm; als alternatief kunnen een paar druppels M9 van een pipettor worden gebruikt om wormen te scheiden. (F) Pas de scherpstelring op de cameralens aan, observeer wormen op het scherm om de optimale scherpstelling te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Radiale voortbewegingstests detecteren verschillen in kruipsnelheid. Niet-gestimuleerde dispersie van ontwikkelingsgeënsceneerde L4-larven werd gemeten met behulp van de radiale locomotietest die hierboven is beschreven en in een grafiek weergegeven als μm / min afgelegd (A-B). Dezelfde gegevens uitgezet in (A) en (B) tonen twee verschillende mogelijke grafische presentaties. In (A) worden gegevens weergegeven als een staafdiagram, waardoor relatieve verschillen tussen stammen duidelijker worden. In (B) wordt de uiteindelijke verplaatsing van elke worm in de grafiek weergegeven, waardoor de variatie binnen de populatie beter kan worden gevisualiseerd. Om de significantie tussen geteste stammen te evalueren, werd eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met Tukey's meervoudige vergelijkingstest gebruikt. **p=0,0022, ****p<0,0001, ns=niet significant. TDP-43 (M337V) en tau (WT) verschillen ook aanzienlijk van N2, p<0,0001. Foutbalken in (A) zijn standaardfout van het gemiddelde (SEM) en in (B) zijn standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Zwemtests detecteren verschillen in thrashing in vloeistof. Zwemsnelheden (thrashing of golvingsfrequentie in vloeistof) werden gemeten met behulp van onbevooroordeelde computerondersteunde scores en analyses die hierboven zijn beschreven en in een grafiek zijn weergegeven als thrashes / min (A-B). Dezelfde gegevens uitgezet in (A) en (B). In (A) worden gegevens weergegeven als een staafdiagram, waardoor relatieve verschillen tussen stammen gemakkelijker te zien zijn. In (B) worden gegevens van elke individuele gescoorde worm uitgezet in de grafiek, waardoor de variatie binnen de populatie beter kan worden gevisualiseerd. Om de significantie tussen geteste stammen te evalueren, werd een eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met Tukey's meervoudige vergelijkingstest gebruikt. p<0,0001, ns=niet significant. TDP-43 (WT-matig) en tau (WT) verschillen ook aanzienlijk van N2, p<0.0001.Foutbalken in (A) zijn standaardfout van het gemiddelde (SEM) en in (B) zijn standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Gemuteerde TDP-43 wormen reizen minder dan wild-type wormen. Platen met een representatief verschil in de uiteindelijke locatie van geënsceneerde L4 N2 (wild-type) en TDP-43 (M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), een stam die mutant humaan TDP-43 tot expressie brengt met een ernstig verminderde motorische functie na 1 uur ongestimuleerd kruipen bij kamertemperatuur. Platen zijn gemarkeerd met een rode stip voor het middelpunt en blauwe stippen voor de uiteindelijke locatie van de dieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Het vastleggen van zwemgedrag met behulp van de beeldvormings- en trackingsoftware. (A) De trackingworkflow en de locatie van het pictogram voor video-opname. (B) Het venster Video-opname wordt weergegeven in Live View en de belangrijkste aspecten worden gemarkeerd. De groene woorden "Live view" veranderen in een rode "Recording" wanneer de opnameknop wordt geactiveerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Voorbereiden en volgen van zwemgedrag. Deze afbeelding toont een reeks schermafbeeldingen om te helpen bij het instellen van een videobeeldreeks voor tracking. Het algemene protocol voor het voorbereiden van een videoreeks is om elk workflowmenu in deze volgorde te openen: Afbeeldingsreeks importeren | Set Sequence Info | Afbeelding aanpassen | Detecteer en volg | Project opslaan. Het venster Gegevens analyseren kan alleen worden gebruikt nadat een projectbestand is bijgehouden. (A) toont een geopend .avi (video) bestand na het importeren van de reeks in de software vanuit de Track workflow. (B) Het venster Set Sequence Info biedt een plek voor notities, het instellen/wijzigen van de schaal en het controleren van de metadata voor een videosequentie. Instructies voor het wijzigen van de schaal zijn te vinden in dit venster en moeten worden gevolgd wanneer de camera wordt neergelaten of verhoogd (B). Afbeelding (C) toont de instellingen van het venster Afbeelding aanpassen . (D) Schermafbeelding van het detectietabblad van het venster Detecteren en volgen . Het detecteren van wormen wordt gebruikt om de software te trainen en moet voor elke videosequentie worden ingesteld. Indien gewenst kunnen hier aanvullende detectieparameters worden ingesteld. (E) Screenshot van het tabblad Tracking van het venster Detecteren en volgen met de aanbevolen instellingen voor het volgen van zwemgedrag. Dit is de laatste stap bij het instellen van een videosequentie. Sla de reeks op als een project met behulp van het venster Project opslaan . Herhaal deze stappen voor elke videoreeks. Instellingen kunnen worden opgeslagen als een configuratie om de werklast te verminderen en ervoor te zorgen dat alle sequenties hetzelfde worden behandeld (niet weergegeven). Als u projectbestanden wilt bijhouden voor analyse, navigeert u naar de batchwerkstroom . (F) toont het pictogram dat wordt gebruikt om naar de batchworkflow te navigeren en (G) toont het batchverwerkingsvenster, markeert de knoppen toevoegen en starten en toont het verwachte uiterlijk van een projectbestand dat is bijgehouden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Zwemgedragsanalyse. Nadat een projectbestand is bijgehouden, kan het worden geopend met [Bestand | Open Project]. Wormen verschijnen in het groen zoals weergegeven in (A). Scrubben door de video biedt een snelle controle dat de video is verwerkt zoals verwacht, groene markering zal verdwijnen tijdens het schrobben. Het venster Gegevensanalyse en -plotten wordt geopend vanuit het werkstroomitem Gegevens analyseren . (B) toont het venster Gegevensanalyse en plotten met positieweergave geopend (standaard), alle tracks zijn gemarkeerd. Onder de datapunten bevindt zich een plot met het opgenomen spoor voor elke gemarkeerde worm. De track summary analyse wordt gebruikt om bochten per minuut te berekenen. (C-D) het tracksamenvattingsrapport en exportdetails weergeven. (E-F) toont de tracksamenvatting in een spreadsheet en hoe de beurten per minuut te berekenen, de output gemeten in deze test. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Radiale voortbeweging:
De resolutie van deze test kan eenvoudig worden geregeld door de tijdvariabele te wijzigen. Het verlengen van de tijd maakt het gemakkelijker om verschillen tussen dieren met ernstige fenotypen waar te nemen, waardoor subtiele verschillen worden geïdentificeerd. Omdat deze test echter verplaatsing meet, zullen dieren met normale beweeglijkheid, zoals N2, naar de randen van de plaat reizen als de testtijd te lang wordt verlengd, en foerageergedrag zal leiden tot backtracking. Dit zal de meting van de afgelegde afstand kunstmatig verminderen. Te lange tijdsperioden kunnen leiden tot het verdwijnen van verschillen tussen stammen, met name tussen dieren met minder ernstige motorische fenotypen, omdat dieren gelijkmatig over de plaat worden verspreid. Het verkorten van de tijdvariabele voorkomt dat actievere wormen de randen van de plaat vinden. Deze methode houdt niet de totale afgelegde afstand voor elke worm bij, maar comprimeert de afgelegde afstand voor elke worm in een lineaire afstand van het midden van de plaat. Als zodanig is het inherent minder robuust dan een methode die de totale spoorlengte van individuele wormen registreert. De radiale voortbewegingstest vereist echter zeer weinig training van onderzoekers, gebruikt relatief betaalbare reagentia die algemeen beschikbaar zijn in de meeste wormlaboratoria en is gevoelig genoeg om significante en reproduceerbare resultaten te produceren. Voor laboratoria die de voorkeur geven aan geautomatiseerde videotracking, zijn er eerder verschillende methoden vastgesteld om kruipbewegingen te volgen en te analyseren12, of de softwareparameters die worden gebruikt voor de zwemtest in dit artikel kunnen worden gewijzigd om kruipdetectie en -analyse mogelijk te maken.
Dit experiment wordt meestal uitgevoerd in drievoud onafhankelijke replicaties, met een set van 30-40 wormen per replicatie. Elke replica wordt gesplitst op twee verschillende platen van 100 mm of 150 mm, met 15-20 wormen per plaat. Het gebruik van meer wormen dan aanbevolen per plaat kan het moeilijk maken om efficiënt te scoren. Een totaal aantal gescoorde 90+ is voldoende krachtig om significantie voor milde, matige of ernstige motiliteitsstoornissen vast te stellen. Consistent zijn met de timing tussen de gescoorde stammen is essentieel voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. 30 minuten is over het algemeen lang genoeg om verschillen vast te stellen tussen matige tot ernstige fenotypen zoals transgene stammen die menselijke mutant TDP-43 tot expressie brengen in vergelijking met wildtype wormen (figuur 4). Als de tijdvariabele wordt verlengd, is het raadzaam om ook de grootte van de plaat te vergroten van 100 mm naar 150 mm. Omgevingsfactoren zoals temperatuur en vochtigheid kunnen deze test beïnvloeden, die meestal wordt uitgevoerd bij omgevingstemperatuur, dus het is belangrijk om altijd een wild-type (N2) -controle te gebruiken bij het vergelijken van tussen replicaties. Bovendien kan deze test de beweeglijkheid meten van sommige stammen die geen normaal zwemgedrag vertonen in vloeistof (thrashing), waardoor het een nuttige aanvulling is op de zwemtest.
Zwemtest:
Het gebruik van het beeldvormings- en acquisitiesysteem om het volgen en analyseren van wormzwemmen te automatiseren, zorgt voor rigoureuze en onbevooroordeelde gegevens. Er zijn echter verschillende factoren tijdens de eerste opzet van het experiment die tussen de monsters moeten worden gecontroleerd. Deze omvatten de tijd om te acclimatiseren aan vloeistof voordat u begint met opnemen, omgevingsomstandigheden (d.w.z. temperatuur, vochtigheid) en consistente licht- en opname-instellingen. Op het opnamepodium zijn er verschillende functies die de variabiliteit tussen platen helpen verminderen. Deze omvatten een geïntegreerde op een spoor gemonteerde camera en een helder veld podium dat het opnemen van video consistent maakt tussen platen, afscherming rond het podium die reflecties, verblinding en luchtbewegingen tijdens het opnemen voorkomt, en een robuust softwarepakket dat betrouwbaar wormen detecteert en handmatige correctie van tracks in video-nabewerking mogelijk maakt. In dit protocol worden video's van een 35 mm plaat met wormen gedurende 1 minuut opgenomen en vervolgens verwerkt met behulp van het softwarepakket. Na verwerking zorgt handmatige correctie van tracks ervoor dat wormgedrag nauwkeurig wordt geregistreerd zonder storende trackingfouten. Gegevens over het aantal beurten en de duur van het spoor worden gebruikt om de bochten per minuut te bepalen als een definitieve uitlezing. Om reproduceerbaarheid te garanderen, worden gegevens verzameld over minimaal 3 onafhankelijke replicatie-experimenten, elk met 40-50 dieren gescoord, om een gecombineerd eindaantal dieren 120-150 te bereiken. Dit aantal is voldoende om kleine verschillen in zwemgedrag te onderscheiden van controlewormen. Sommige wormen hebben motorische tekorten die te ernstig zijn om te worden gevangen door zwemtests. Als de dieren bijvoorbeeld in een krul van een vloeibaar medium worden geplaatst in plaats van de verwachte thrashing-respons uit te voeren, zal deze test die bewegingen niet nauwkeurig registreren en kan een andere bewegingstest, zoals radiale voortbeweging, die motiliteitsdefecten beter vastleggen. Het meegeleverde protocol maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar beeldvormingssysteem (zie Tabel met materialen voor meer informatie), maar andere wormvolgsystemen kunnen een vergelijkbaar hulpprogramma bieden, waarvan sommige open source zijn12. Eerder gepubliceerde methoden beschrijven handmatige scoring van wormthrashing13. Hoewel de geautomatiseerde analyse een aantal statistieken voor elke individuele worm produceert, biedt de detectie van lichaamsbuigingen die wordt gemeten in thrashes per minuut, consistente resultaten tussen experimenten en volgt deze goed met conventionele scores van wormen met het oog.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen onthullingen hebben.
Acknowledgments
We bedanken de recensenten voor nuttige opmerkingen en suggesties. We bedanken Aleen Saxton, Brandon Henderson en Jade Stair voor hun uitstekende technische assistentie. We bedanken Brian Kraemer en Rebecca Kow voor hun hulp bij het ontwikkelen van deze testen. Dit materiaal is het resultaat van werk ondersteund met middelen en het gebruik van faciliteiten bij het VA Puget Sound Health Care System. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Verenigde Staten (VS) Department of Veterans Affairs (VA) Biomedical Laboratory Research and Development Service [Merit Review Grant #I01BX004044 aan N.F.L.]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | - | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
| Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
| Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
| Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
| Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
| Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
| Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
| Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
| ImageJ | NIH | - | Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/ |
| M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
| p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
| p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
| Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
| WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |
References
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N.
- Arai, T., et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Mejzini, R., et al. ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now. Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).
- Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. ALS/FTLD: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).
- Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A.
- Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).
- Robatzek, M., Thomas, J. H. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network. Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M. WormBook. Hart, A. C. , 1551 (2006).
