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Neuroscience

C. elegans में मोटर हानि का मूल्यांकन Amyotrophic Lateral Sclerosis के मॉडल

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/62699
Automatic Translation
1, 1,2
1Geriatrics Research Education and Clinical Center, Veterans Affairs Puget Sound Health Care System, 2Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington

Summary

यह प्रोटोकॉल एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के सी एलिगन्स मॉडल में हल्के, मध्यम और गंभीर मोटर हानि के बीच भेदभाव के लिए दो संवेदनशील assays का वर्णन करता है, जिसमें C. elegans उपभेदों के लिए सामान्य उपयोगिता के साथ, परिवर्तित गतिशीलता के साथ।

Abstract

न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) में मांसपेशियों की कमजोरी और मोटर हानि के साथ मोटर न्यूरॉन्स का प्रगतिशील नुकसान होता है जो समय के साथ खराब हो जाता है। जबकि रोगियों के सबसेट के लिए एएलएस के आनुवंशिक ड्राइवरों को निर्धारित करने में काफी प्रगति हुई है, अधिकांश मामलों में एक अज्ञात एटियलजि है। इसके अलावा, मोटर न्यूरॉन शिथिलता और अध: पतन अंतर्निहित तंत्र अच्छी तरह से समझ में नहीं आते हैं; इसलिए, इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रतिनिधि मॉडल को विकसित करने और चिह्नित करने की एक निरंतर आवश्यकता है। Caenorhabditis elegans अपने आंदोलन को अपने परिवेश की भौतिक बाधाओं के लिए अनुकूलित कर सकते हैं, जिसमें दो प्राथमिक आंदोलन प्रतिमानों का अध्ययन प्रयोगशाला वातावरण में किया जाता है- एक ठोस सतह पर रेंगना और तरल में तैरना। ये सनसनी, मोटर न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के बीच एक जटिल इंटरप्ले का प्रतिनिधित्व करते हैं। एएलएस के सी एलिगन्स मॉडल इन आंदोलन प्रतिमानों में से एक या दोनों में हानि प्रदर्शित कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल C. elegans में गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए दो संवेदनशील assays का वर्णन करता है: एक अनुकूलित रेडियल लोकोमोशन परख एक ठोस सतह पर रेंगने को मापने और ट्रैकिंग और तरल (थ्रैशिंग) में तैराकी का विश्लेषण करने के लिए एक स्वचालित विधि। एएलएस मॉडल के बेसलाइन मोटर हानि के लक्षण वर्णन के अलावा, ये assays आनुवंशिक या छोटे अणु हस्तक्षेपों से फेनोटाइप के दमन या वृद्धि का पता लगा सकते हैं। इस प्रकार, इन विधियों में एएलएस मॉडल और किसी भी सी एलिगन्स स्ट्रेन का अध्ययन करने के लिए उपयोगिता है जो परिवर्तित गतिशीलता प्रदर्शित करता है।

Introduction

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) मोटर न्यूरॉन्स पर एक विशेष प्रभाव के साथ एक दुर्बल, उम्र बढ़ने से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है। इस रोग में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स की हानि और प्रगतिशील मोटर हानि होती है। इसके परिणामस्वरूप प्रमुख कार्यात्मक विकलांगता और समय से पहले मृत्यु हो जाती है, आमतौर पर निदान के बाद 3-5 वर्षों के भीतर। कम से कम 38 जीनों में उत्परिवर्तन एएलएस का कारण बन सकता है; हालांकि, एएलएस के साथ अधिकांश रोगियों को न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं 2,3,4 में उनकी प्राथमिक विकृति के रूप में प्रोटीन टीडीपी -43 के ubiquitinated inclusions जमा करते हैं। विवो में एएलएस के कारण या योगदान देने वाले अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने के लिए कई पशु मॉडल विकसित किए गए हैं (5 में समीक्षा की गई)। C. elegans में, इन मॉडलों में ALS-कारण जीन या मानव ALS जीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के होमोलॉग्स में आनुवंशिक हानि-के-फ़ंक्शन उत्परिवर्तन शामिल हैं। C. elegans में ALS मॉडलिंग के कई फायदे हैं। C. elegans एक विभेदित तंत्रिका तंत्र, अच्छी तरह से विशेषता वाले व्यवहार प्रतिमानों, और मनुष्यों के लिए काफी आनुवंशिक होमोलॉजी के साथ एक सभ्य सरल जानवर हैं6,7। सी elegans के साथ काम करने के लिए कई उपकरण मौजूद हैं, जिसमें मजबूत जीनोम संपादन क्षमताएं शामिल हैं, न्यूरोडीजेनेरेशन के विवो फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों में, आरएनएआई स्क्रीनिंग प्रतिमान, असभ्य आनुवांशिकी, और स्थापित व्यवहार और फेनोटाइपिक assays। एएलएस के एलिगन्स मॉडल मानव रोग के पहलुओं को दोहराते हैं, जिसमें अघुलनशील प्रोटीन, न्यूरोडीजेनेरेशन और शुरुआती मृत्यु 8,9 का संचय शामिल है। इसके अलावा, रेंगने और तैराकी दोनों व्यवहारों की गड़बड़ी की विशेषता वाली मोटर शिथिलता कई सी एलिगेंस एएलएस मॉडल में मौजूद है।

यह प्रोटोकॉल C. elegans मोटर फेनोटाइप्स को चिह्नित करने के लिए दो तरीकों का वर्णन करता है: एक ठोस सतह पर रेंगने का मूल्यांकन करने के लिए रेडियल लोकोमोशन परख और वर्मलैब स्वचालित ट्रैकिंग और विश्लेषण का उपयोग करके तरल (थ्रैशिंग) में तैराकी का आकलन। मोटर घाटे की विशेषता के लिए ये संवेदनशील तरीके गंभीरता की तुलना की अनुमति देते हैं और मोटर फेनोटाइप के दमन और संवर्द्धन को मापने के लिए उपकरण प्रदान करते हैं। रेडियल लोकोमोशन परख रेंगने गतिशीलता (एक ठोस सतह पर sinusoidal आंदोलन) कीड़े की आबादी के बीच में अंतर की मात्रा. इस परख सी elegans प्राकृतिक unstimulated अन्वेषण व्यवहार का लाभ उठाता है एक प्लेट पर एक ही स्थान में कीड़े रखने और time10 की एक दी गई अवधि के बाद अपने अंतिम स्थान को चिह्नित करके. वैकल्पिक रूप से, तरल (थ्रैशिंग) assays assays में तैराकी समय की एक निर्धारित अवधि में व्यक्तिगत कीड़े के शरीर के मोड़ की गिनती. मानव आंख द्वारा शरीर के झुकने की मैनुअल गिनती समय-गहन है और आमतौर पर प्रयोगकर्ताओं के बीच काफी परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करती है। कंप्यूटर-सहायता प्राप्त स्वचालित ट्रैकिंग और विश्लेषण का उपयोग उस परिवर्तनशीलता को समाप्त कर सकता है। एएलएस मॉडल के बेसलाइन मोटर हानि के लक्षण वर्णन के अलावा, रेडियल लोकोमोशन और तैराकी एसेस दोनों आनुवंशिक या छोटे अणु हस्तक्षेपों से अलग-अलग लोकोमोटर फेनोटाइप के मॉडुलन का पता लगा सकते हैं। इन विधियों में एएलएस मॉडल और किसी भी सी एलिगेंस स्ट्रेन का अध्ययन करने के लिए उपयोगिता है जो परिवर्तित गतिशीलता प्रदर्शित करता है।

Protocol

1. रेडियल लोकोमोशन परख

  1. 100 मिमी या 150 मिमी व्यास पेट्री व्यंजन तैयार करें जो नेमाटोड विकास मीडिया (एनजीएम) से लगभग आधा भरा हुआ है और आगर की पूरी सतह को कवर करने के लिए OP50 बैक्टीरिया के एक समान लॉन के साथ सीड किया गया है।
  2. NGM परख प्लेटों उल्टा नीचे फ्लिप और सी elegans उपभेदों के लिए एक पहचानकर्ता के साथ नीचे लेबल परख किया जा करने के लिए, तनाव प्रति 2 प्लेटों (चित्रा 1A).
  3. उल्टा-नीचे प्लेट (चित्रा 1 ए) के केंद्र में मार्कर के साथ एक छोटा बिंदु बनाएं।
  4. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ काम करते समय, एक प्लैटिनम-वायर पिक (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके सीधे केंद्र बिंदु (एनजीएम के माध्यम से दिखाई देने वाले) पर सीधे परख प्लेट के केंद्र में 15-20 मंचन मिलान किए गए 11 कीड़े को स्थानांतरित करें।
    नोट: एक ही समय में या जितनी जल्दी हो सके सभी कीड़े स्थानांतरित करने का प्रयास करें।
    1. प्लेट के केंद्र में कीड़े रखने के बाद 30 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें। ढक्कन को प्लेट पर वापस रखें और इसे एक तरफ सेट करें (चित्रा 1 सी)।
  5. जब तक सभी उपभेदों निर्दिष्ट परख प्लेटों पर हैं कीड़े स्थानांतरित जारी रखें, लगभग कितना समय यह प्लेटों के बीच हस्तांतरण करने के लिए लेता है का एक नोट बनाने (प्लेटों के बीच ~ 1 मिनट के लिए लक्ष्य). सभी प्लेटों को उसी क्रम में रखें, जिस क्रम में उन्हें स्थापित किया गया था।
  6. 30 मिनट के बाद, पहली प्लेट को स्कोर करना शुरू करें।
    1. ढक्कन को हटा दें और प्लेट चेहरे को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें, जैसे कि प्लेट के लेबल वाले पीछे का सामना करना पड़ रहा है, और एनजीएम अगर दृष्टि की रेखा और कीड़े के बीच है। प्लेट सामान्य उपयोग से उल्टा हो जाएगा।
    2. माइक्रोस्कोप फोकस को समायोजित करें जब तक कि कीड़े आगर के माध्यम से दिखाई न दें।
    3. केंद्र बिंदु से एक अलग रंगीन महसूस टिप पेन का उपयोग करते हुए, प्रत्येक कीड़े के स्थान पर एक छोटा सा बिंदु रखें - सबसे दूरस्थ जानवरों को खोजने के लिए बैक्टीरिया लॉन के माध्यम से कीड़े पटरियों का पालन करें।
    4. प्लेट के किनारे की जांच करें क्योंकि कुछ कीड़े वहां समाप्त हो सकते हैं। इसके अलावा, केंद्र बिंदु बिंदु बिंदु (चित्रा 1 डी) में कीड़े की संख्या की गणना और रिकॉर्ड करें।
  7. क्रम में सभी परख प्लेटों को चिह्नित करना जारी रखें, जैसे कि सभी प्लेटों में गतिविधि के समय के 30 मिनट होते हैं, प्लेट को स्थापित करने में लगने वाले समय के लिए खाते में सावधान रहना। उसके बाद, चरण 1.8 या 1.9 में वर्णित के रूप में मैन्युअल या डिजिटल माप निष्पादित करें।
  8. किसी मापनी का उपयोग करके मैन्युअल मापन करें.
    1. मिमी में मापने के लिए एक शासक का उपयोग करें, केंद्र से दूरी प्रत्येक कीड़े के लिए अंतिम स्थान चिह्नों को इंगित करती है और दूरी को रिकॉर्ड करती है। स्कोरिंग के दौरान प्रगति का ट्रैक रखने में मदद करने के लिए, पहले स्कोर किए गए बिंदु को एक छोटी मार्किंग लाइन के साथ लेबल करें।
    2. प्लेट को दक्षिणावर्त फैशन में घुमाकर प्रत्येक बिंदु के लिए लगातार लंबाई डेटा रिकॉर्ड करें (चित्रा 1E)।
  9. एक स्कैनर और ImageJ का उपयोग कर डिजिटल माप निष्पादित करें।
    1. एक flatbed स्कैनर का उपयोग कर, परख प्लेट (ओं) के पीछे एक शासक (स्कैनिंग सतह का सामना कर रहे संख्या) (चित्रा 2A) के बगल में स्कैन करें.
    2. ImageJ या इसी तरह के प्रोग्राम में स्कैन की गई प्लेट छवि खोलें.
      नोट: ImageJ एक नि: शुल्क जावा आधारित छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर एनआईएच द्वारा होस्ट किया गया है।
    3. सीधी रेखा उपकरण पर क्लिक करें और फिर शासक (चित्रा 2B) की स्कैन की गई छवि पर 1 सेमी और 2 सेमी बिंदुओं को जोड़ने वाली एक रेखा खींचें।
      नोट:: Shift कंप्यूटर कुंजी धारण निकटतम 45° कोण के लिए लाइन को मजबूर करेगा।
    4. विश्लेषण मेनू पर नेविगेट करें और स्केल सेट करने के लिए इसका उपयोग करें (विश्लेषण | स्केल सेट करें) (चित्रा 2C)।
    5. उपयुक्त बक्से में ज्ञात दूरी (10) और लंबाई की इकाइयाँ (मिमी) दर्ज करें, पिक्सेल संख्या में दूरी को समायोजित न करें। प्रत्येक ImageJ सत्र में विश्लेषण की जा रही सभी छवियों के लिए एक ही पैमाने को लागू करने के लिए वैश्विक की जाँच करें; अन्यथा, खोलने पर प्रत्येक छवि के लिए पैमाने सेट करें (चित्रा 2 डी)। क्लिक करें,OK.
      नोट:: चरण 1.9.2-1.9.5 माप स्केल सेट करने के लिए किए जाते हैं। इस छवि के लिए माप अब स्वचालित रूप से परिभाषित पिक्सेल के लिए लाइनों की लंबाई से संबंधित होगा: लंबाई संबंध। 300 डीपीआई पर स्कैन की गई छवियों में प्रति मिमी 11.8 पिक्सेल का अनुमानित संबंध होगा।
    6. पहले बिंदु स्कोर करने के लिए ठीक ऊपर चिह्नित करने के लिए पेंटब्रश उपकरण का उपयोग करें।
      नोट:: यह पहले वर्म स्कोर के लिए एक दृश्य संकेतक है।
    7. केंद्र बिंदु से पहले वर्म डेटा बिंदु तक कोई रेखा खींचने के लिए सीधी-रेखा उपकरण का उपयोग करें.
    8. दूरी मापने के लिए कुंजीपटल पर M कुंजी पर क्लिक करें। वैकल्पिक रूप से, विश्लेषण मेनू पर नेविगेट करें और माप चुनें (विश्लेषण | उपाय)। दोनों मामलों में, माप एक नई विंडो में दिखाई देगा; इस विंडो छवि प्रति सभी माप एकत्र करेगा.
    9. केंद्र बिंदु को स्थिर रखते हुए, पहले वर्म बिंदु को छूने वाली रेखा के अंत को अगले कृमि बिंदु पर ले जाएं, दक्षिणावर्त में चलते हुए, और मापने के लिए एम कुंजी पर क्लिक करें।
    10. एक दक्षिणावर्त फैशन में प्रत्येक बिंदु को मापना जारी रखें जब तक कि सभी अंक स्कोर नहीं किए जाते हैं।
    11. लंबाई माप डेटा को सहेजने के लिए स्प्रेडशीट में उसकी प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ. फिर, प्रत्येक स्कैन की गई प्लेट छवि के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
      नोट:: चरण 1.9.6 - 1.9.11 वर्म विस्थापन मान (चित्र2E-F) को मापने।
  10. सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
    1. एक ही प्रयोग के भीतर प्रतिकृतियों को संयोजित करें ताकि स्कोर की गई कुल संख्या 30-40 कीड़े के बीच हो।
    2. अलग-अलग दिनों में और 3 स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों के साथ समाप्त होने के लिए कीड़े की स्वतंत्र आबादी के साथ स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां करें।
    3. उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषणों का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें जैसे कि 2 उपभेदों के लिए छात्र का टी-टेस्ट या तीन या अधिक उपभेदों के लिए 1-तरफ़ा एनोवा।

2. कंप्यूटर का विश्लेषण तैराकी परख

नोट:: इस प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध WormLab हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर सिस्टम के लिए विस्तृत निर्देश हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। हालांकि, वर्कफ़्लो अन्य कंप्यूटर-विश्लेषण तैराकी परख सिस्टम के लिए लागू किया जा सकता है।

  1. वीडियो सेट करना और रिकॉर्ड करना.
  2. इमेजिंग हार्डवेयर (चित्रा 3) पर परिरक्षण को उठाएं और सत्यापित करें कि कैमरा ऊंचाई अपेक्षित स्थान पर सेट है।
    नोट: एक 35 मिमी प्लेट पर कीड़े पर कब्जा करने के लिए इष्टतम ऊंचाई ऐसी है कि नीचे थ्रेडेड स्क्रू बोर से तीसरा समायोज्य कैमरा बढ़ते ब्रैकेट के नीचे दिखाई देता है, लेकिन स्क्रू बोर के ऊपर कोई अतिरिक्त बढ़ते छेद नहीं देखा जाता है (मंच के ऊपर लगभग 30.5 सेमी) (चित्रा 3 सी)। इसके परिणामस्वरूप 11.43 μm/pixel का कैप्चर अनुपात होगा। एक "सही ऊंचाई" संकेतक जोड़ने पर विचार करें ताकि यह परख शुरू करने से पहले पुष्टि करना आसान हो। ऊँचाई समायोजन के लिए खाते के लिए प्रोटोकॉल चरण 2.18 देखें।
  3. संबद्ध सॉफ़्टवेयर खोलें (अनुपूरक चित्र 1A).
  4. एक नई वीडियो कैप्चर विंडो खोलने के लिए वीडियो कैप्चर आइकन (बीच में एक दाएँ-इंगित त्रिकोण के साथ फिल्म) पर क्लिक करें। कैमरा लाइव व्यू में होगा, लेकिन डिस्प्ले ब्लैक (सप्लीमेंट्री फिगर 1 बी) होगा।
  5. डिमर घुंडी पर नीचे दबाएं और प्रकाश को समायोजित करने के लिए इसे दक्षिणावर्त घुमाएं।
    नोट: डिमर घुंडी उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश स्रोत के पास इमेजिंग सिस्टम के चरण पर है। वीडियो कैप्चर लाइव दृश्य प्रदर्शन काले से प्रकाशित करने के लिए बदल जाएगा।
  6. वीडियो कैप्चर विंडो में वापस, सेटिंग्स टैब पर क्लिक करें, निम्नानुसार समायोजित करें: वीडियो मोड: 2456 x 2052_Mono8, फ्रेम दर: 14, आउटपुट: मोनोक्रोम, एक्सपोजर: 0.00300 s, लाभ: 1 डीबी, गामा: 1, 180 घुमाएं (पर जाँच करें)।
  7. कैप्चर टैब पर वापस ले जाएँ. रिकॉर्डिंग फ़ोल्डर का चयन करें (अनुपूरक चित्र 1B).
    नोट:: यह वह जगह है जहाँ सभी रिकॉर्डिंग और प्रोजेक्ट फ़ाइलें संग्रहीत की जाएंगी. डेटा को व्यवस्थित रखने के लिए अलग-अलग प्रयोगों के लिए अद्वितीय फ़ोल्डर बनाएँ.
  8. फ़ाइल उपसर्ग पाठ बॉक्स में दर्ज करके कोई फ़ाइल नाम असाइन करें.
    नोट:: सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से "0001" स्वरूप में उपसर्ग के अंत के लिए एक प्रगतिशील संख्या जोड़ देगा। फ़ाइलों के लिए एक सुसंगत नामकरण योजना रखने की सलाह दी जाती है जैसे: "YYYYMMDD_treatmentName_rep #_"।
  9. अन्य कैप्चर सेटिंग्स निम्नानुसार सेट करें: बफ़र: 128 फ़्रेम (डिफ़ॉल्ट), अवधि (पर जाँच करें): 00 h:01min:00 s. इस टैब में अन्य सेटिंग्स पर ध्यान न दें या बंद करें.
  10. परख प्लेट जगह, ढक्कन ऊपर, डिवाइस के मंच पर, और यह वीडियो कैप्चर स्क्रीन में केंद्र; ढक्कन को हटा दें।
    नोट: समय से पहले परख प्लेटों तैयार करें. प्रत्येक प्लेट में एक 35 मिमी पेट्री डिश होती है जो लगभग आधा गैर-वरीयता प्राप्त (कोई जीवाणु लॉन नहीं) एनजीएम से भरा होता है।
  11. परख प्लेट पर M9 के 1 mL में मंच सिंक्रनाइज़ 11 कीड़े धोने के लिए एक micropipette का उपयोग करें - के बारे में 50 कीड़े (चित्रा 3 डी) के लिए लक्ष्य. धीरे से जानवरों को केंद्र में लाने के लिए प्लेट को घुमाएं या जानवरों को अलग करने के लिए एम 9 की कुछ बूंदों को जोड़ने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें (चित्रा 3 ई)। कीड़े को तैराकी के लिए अनुकूलित करने की अनुमति देने के लिए 60 s के लिए एक टाइमर सेट करें।
    नोट: प्लेट स्क्रीन पर 100% दिखाई नहीं देगा। ओवरलैपिंग करते समय जानवरों को सटीक रूप से ट्रैक नहीं किया जाता है।
  12. जबकि टाइमर नीचे गिना जाता है, मैन्युअल रूप से प्रदर्शन (चित्रा 3 एफ) को देखते समय कैमरे के लेंस शरीर पर फोकसिंग रिंग को मोड़कर कैमरे के फोकस को समायोजित करें। स्क्रॉल व्हील माउस का उपयोग करके कीड़े पर ज़ूम करना संभव है जो अधिक सटीक ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है।
  13. फ़ोकस सेट करने के बाद, प्रकाश घुंडी को समायोजित करें जैसे कि डिस्प्ले ओवरएक्सपोजर के बिना जितना संभव हो उतना उज्ज्वल हो (प्रदर्शन पर लाल पिक्सेल के रूप में दिखाता है)।
  14. 60 सेकंड के बाद, रिकॉर्ड बटन दबाएँ ।
    नोट:: वीडियो लाइव दृश्य से रिकॉर्डिंग करने के लिए जाना होगा और एक टाइमर दिखाई देगा। जब कैप्चर पूर्ण हो जाता है, तो वीडियो कैप्चर प्रदर्शन लाइव दृश्य (अनुपूरक चित्र 1B) पर वापस आ जाएगा.
  15. रिकॉर्डिंग के बाद प्लेट को हटा दें और अगली प्लेट सेट करें। आवश्यकतानुसार उपसर्ग का नाम बदलें. परख प्लेट में कीड़े धोएं, 60 s के लिए इनक्यूबेट करें, और प्रत्येक उपचार को रिकॉर्ड करें।
  16. एक प्रयोग के लिए सभी रिकॉर्डिंग को पूरा करने के बाद, किसी भी खुले वीडियो टैब को बंद करें, और डिमर घुंडी को निराशाजनक करके प्रकाश स्रोत को बंद कर दें।
  17. विंडो के ऊपरी दाएँ कोने में लाल x बटन पर क्लिक करके वीडियो कैप्चर विंडो बंद करें; वैकल्पिक रूप से, पूरे सॉफ़्टवेयर पैकेज को बंद करें और फिर से खोलें।
  18. ट्रैकिंग के लिए वीडियो तैयार करें.
  19. वर्कफ़्लो साइडबार मेनू से, इस मेनू पर पहले बटन का चयन करें, छवि अनुक्रम आयात करें, और किसी वीडियो पर ढूँढें और डबल क्लिक करें. वीडियो मध्य विंडो (पूरक चित्रा 2 ए) में खुल जाएगा।
    नोट:: सॉफ़्टवेयर के लिए डिफ़ॉल्ट प्रदर्शन वर्कफ़्लो साइडबार मेनू है; इस मेनू को दृश्य शीर्ष ड्रॉपडाउन मेनू के माध्यम से भी देखा जा सकता है दृश्य के तहत [| देखें] वर्कफ़्लो]। वर्कफ़्लो मेनू में कई दृश्य विकल्प हैं; ट्रैक दृश्य प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर उपयुक्त है। यदि अनुक्रम जानकारी सेट करें बटन मेनू में दिखाई नहीं देता है, तो यह सही दृश्य नहीं है। सबसे पहले, मेनू के निचले भाग को देखें और जाँचें कि वर्कफ़्लो टैब सक्रिय है, अगला चेक करें कि ट्रैक दृश्य ट्रैक आइकन पर क्लिक करके सक्रिय है. जहां मेनू विंडो में दिखाई देते हैं, वह मॉनिटर आकार और अन्य खोले गए मेनू के स्थान पर निर्भर करता है। मेनू को ड्रैग और ड्रॉप, आकार बदलने और बंद करके ले जाया जा सकता है। अधिकांश मेनू को व्यू ड्रॉपडाउन मेनू के माध्यम से भी खोला जा सकता है।
  20. वर्कफ़्लो मेनू से, अनुक्रम जानकारी सेट करें (अनुपूरक चित्र 2B) का चयन करें. नई मेनू विंडो में, नामकरण योजना की जाँच करें, नोट्स जोड़ें, और मेटाडेटा सत्यापित करें.
  21. जाँचें कि स्केलिंग सही ढंग से सेट है; स्केल: 11.43 μm / पिक्सेल और उपाय ऑटो 1000 μm 87 पिक्सेल है के रूप में भर जाएगा. यदि कैमरे की ऊंचाई को यहां निर्धारित से अलग तरीके से समायोजित किया गया है, तो पैमाने को अपडेट करने के लिए इस मेनू में दिए गए निर्देशों का पालन करें। सहेजें बटन क्लिक करें.
  22. वर्कफ़्लो मेनू में, छवि समायोजित करें का चयन करें, और छवि समायोजन नामक एक नया पॉपअप मेनू खुलेगा (अनुपूरक चित्र2C). प्रकाश पृष्ठभूमि (उज्ज्वल क्षेत्र) पर अंधेरे कीड़े का चयन करें।
  23. अतिरिक्त सेटिंग्स समायोजित करें. अनुशंसित छवि प्रसंस्करण सेटिंग्स निम्नानुसार हैं: पृष्ठभूमि चिकनाई: 10, गाऊसी चिकनाई: 5, छेद भरें: 2, छोटी वस्तु फ़िल्टर: 0, और इंटीग्रल व्युत्पन्न विभाजन को छोड़ दें।
  24. दहलीज स्तर को समायोजित करें जैसे कि जानवर पूरी तरह से हरे रंग से भरे हुए हैं लेकिन अभी भी पृष्ठभूमि से अलग हैं। लागू करेंक्लिक करें।
    नोट: यह कुछ वस्तुओं है कि कीड़े नहीं हैं लेने के लिए अनुमति है।
  25. वर्कफ़्लो मेनू से, पता लगाएँ और ट्रैक करें (अनुपूरक चित्र 2D) का चयन करें.
    नोट:: एक मेनू 3 टैब के साथ वीडियो के पक्ष में दिखाई देगा: पता लगाना, ट्रैकिंग, और सुधारें। कर्सर वीडियो प्रदर्शन पर एक इंगित उंगली की तरह दिखेगा। वैकल्पिक रूप से, सॉफ़्टवेयर के ऊपरी बाईं ओर आइकन मेनू में चिह्न का चयन करें (कर्सर तीर) क्लिक करें.
    1. 3-7 कीड़े का चयन करने के लिए उंगली चयनकर्ता उपकरण का उपयोग करें और डिटेक्शन टैब में कीड़े का पता लगाएँ बटन क्लिक करें।
      नोट:: यह चयन सॉफ़्टवेयर को दी गई शर्तों के लिए कीड़े की सही पहचान करने में मदद करता है और प्रत्येक वीडियो के लिए किया जाना चाहिए। कुछ सेकंड के बाद, अधिकांश कीड़े हरे रंग में हाइलाइट किए जाएंगे और पीले रंग में एक संख्या होगी। कीड़े जो छू रहे हैं या कर्ल किए गए हैं, उन्हें संभवतः हाइलाइट नहीं किया जाएगा; हालांकि, कार्यक्रम सबसे अधिक संभावना उन्हें ट्रैकिंग के दौरान मिल जाएगा. डिटेक्शन पैरामीटर को समायोजित करने का एक विकल्प है; हालांकि, डिफ़ॉल्ट अधिकांश परिस्थितियों में अच्छी तरह से काम करते हैं। यदि पता लगाने पैरामीटर के लिए समायोजन किए जाते हैं, तो नमूनों और प्रतिकृतियों के बीच संगत होना सुनिश्चित करें।
  26. अभी भी पता लगाएँ और ट्रैक विंडो में, ट्रैकिंग टैब (अनुपूरक चित्र2E) पर जाएँ। ट्रैकिंग पैरामीटर चेक में बैकट्रैकिंग का उपयोग करें, छवि के किनारे पर ट्रैक कीड़े को अनचेक करें।
  27. अधिकतम ट्रैक की गई परिकल्पना को 5 पर सेट करें। तैराकी करने के लिए ट्रैकिंग मोड सेट करें।
    नोट: मैक्स ट्रैक की गई परिकल्पना सेटिंग समायोजित करती है कि कितने संभावित वर्म-ट्रैक एक एकल ट्रैक किए गए कीड़े को रखने की अनुमति है और प्रोग्राम को कुछ छूट देता है कि इसका ट्रैक खोए बिना एकल कीड़े को ट्रैक करने के लिए कितनी सटीकता से ट्रैक किया जाए। 5 तैराकी के लिए एक अच्छी सेटिंग है।
  28. उन्नत सेटिंग्स अनुभाग में ले जाएँ और निम्न सेट करें: फ़्रेमवर्म सीमा को स्पर्श कर सकते हैं: 50, फ्रेम्स कीड़े ओवरलैप कर सकते हैं: 500, स्थिति सहिष्णुता: 0.50, आकृति सहिष्णुता: 0.50. इन सेटिंग्स को सहेजें और उन्हें एक कॉन्फ़िगरेशन के रूप में सहेजकर एक प्रयोग (और परे) में सभी वीडियो के लिए तैनात करें।
    नोट: ट्रैक फ़िल्टरिंग की सिफारिश नहीं की जाती है और आसानी से पोस्ट-प्रोसेसिंग किया जा सकता है, छोड़ दें।
  29. ऊपरी-बाएँ चिह्न मेनू में कॉन्फ़िगरेशन प्रबंधक (गियर चिह्न) पर नेविगेट करें. क्लिक करने पर, कॉन्फ़िगरेशन प्रबंधक साइडबार मेनू खुल जाएगा। इसके बाद, सहेजें (गियर +) आइकन पर क्लिक करें, इस कॉन्फ़िगरेशन को एक नाम और विवरण दें, फिर ठीक बटन पर क्लिक करें।
    1. भविष्य में इस कॉन्फ़िगरेशन तक पहुँचने के लिए, कॉन्फ़िगरेशन मेनू खोलें, इच्छित कॉन्फ़िगरेशन का चयन करें, और लोड करें (गियर अप तीर) आइकन पर क्लिक करें. फिर अनुक्रम जानकारी जोड़ें, संभवतः थ्रेशोल्ड स्तर को ठीक करें, और पता लगाने के लिए कीड़े का चयन करें। अन्य सभी सेटिंग्स समान होंगी।
  30. वर्कफ़्लो मेनू में, प्रोजेक्ट सहेजें क्लिक करें, सहेजें स्थान सत्यापित करें और कोई प्रोजेक्ट फ़ाइल नाम जोड़ें (वीडियो नाम से प्रोजेक्ट फ़ाइल नाम का मिलान निरंतरता में मदद करता है). वीडियो बंद करें.
    नोट:: इन प्रोजेक्ट्स .wpr filetype के साथ सहेजे जाते हैं।
  31. सभी वीडियो के लिए दोहराएँ: आयात छवि अनुक्रम (2.18), लोड सहेजे गए कॉन्फ़िगरेशन (2.28.1), थ्रेशोल्ड (2.23) समायोजित करें, अनुक्रम जानकारी सेट (2.19), कीड़े (2.24.1) का पता लगाने, प्रोजेक्ट (2.29) को बचाने के लिए, वीडियो बंद करें।
  32. वीडियो ट्रैक करें
    1. प्रोजेक्ट फ़ाइलों को ट्रैक करने के लिए, वर्कफ़्लो मेनू पर जाएँ और बैच (फ़ोल्डर जिसमें वर्म पृष्ठ हैं) चिह्न (अनुपूरक चित्र 2F) क्लिक करें.
      नोट:: बैच संसाधन पैनल प्रदर्शित किया जाएगा (अनुपूरक चित्र2G)। कभी-कभी यह छिपा हुआ होता है लेकिन बैच वर्कफ़्लो मेनू के बहुत नीचे तक पहुँचा जा सकता है; इसे देखने के लिए विंडो का विस्तार करने की आवश्यकता हो सकती है।
    2. इस बैच संसाधन मेनू के फ़ाइल चयन अनुभाग के अंतर्गत जोड़ें बटन क्लिक करें. नेविगेट करें और संसाधित करने के लिए सभी प्रोजेक्ट फ़ाइलों (.wpr) का चयन करें, खोलेंक्लिक करें।
      नोट:: बैच संसाधन मेनू चयनित फ़ाइल पथ, एक स्थिति संकेतक और प्रत्येक फ़ाइल के लिए एक ग्रे प्रगति पट्टी के साथ भर जाएगा।
    3. प्रारंभ (चलाएँ बटन चिह्न) क्लिक करें. पहली फ़ाइल पर हरे रंग की प्रगति सूचक नोट करें। सभी फ़ाइलों को संसाधित करने की अनुमति दें। जब सभी फ़ाइलें समाप्त (हरे) के रूप में पढ़ी जाती हैं, तो सॉफ़्टवेयर को बंद किया जा सकता है (अनुपूरक चित्रा 2 जी)।
    4. यदि कोई प्रोजेक्ट फ़ाइल अटक जाती है, तो हैंग-अप फ़ाइल को अपने आप चलाने पर विचार करें, यह आमतौर पर समस्या को हल करता है। यदि यह समस्या को ठीक नहीं करता है, तो प्रोजेक्ट फ़ाइल खोलें, चयनित वर्म्स (पता लगाएँ और ट्रैक करें मेनू) को हटाएँ, और किसी नए प्रशिक्षण सेट से पुन: चयन करें. उसके बाद प्रोजेक्ट फ़ाइल को पुन: संसाधित करें।
  33. पटरियों की मरम्मत (अनुशंसित)
    नोट:: पटरियों की मरम्मत पटरियों की सटीकता में वृद्धि कर सकते हैं। आम सुधार उन पटरियों को जोड़ रहे हैं जो स्पष्ट रूप से एक ही कीड़े से संबंधित हैं जैसा कि मानव आंख द्वारा देखा जाता है, पटरियों को हटाते हुए जो सटीक नहीं हैं या वास्तविक वर्म डेटा पर कब्जा नहीं करते हैं, और पटरियों को विभाजित करते हैं जिन्हें गलत तरीके से प्रस्तुत किया जाता है क्योंकि कीड़े छू रहे हैं (खराब अनुभाग को हटा दें और यदि व्यावहारिक हो तो गरीब अनुभाग से पहले और बाद में पटरियों को संयोजित करें)।
    1. सॉफ़्टवेयर खोलें और एक प्रोजेक्ट फ़ाइल खोलें [फ़ाइल | ब्याज की खुली परियोजना]। खोलें क्लिक करें और इस फ़ाइल का उपयोग करने के लिए हाँ क्लिक करें. अस्थायी फ़िल्टर लोड करने के लिए प्रतीक्षा करें। संसाधित वीडियो स्क्रीन पर होगा; कीड़े को हरे रंग में हाइलाइट किया जाएगा और पीले रंग में रेखांकित किया जाएगा। वीडियो प्लेयर के माध्यम से स्क्रब या वीडियो चलाने के लिए उपयोग करें।
    2. वर्कफ़्लो मेनू से, पता लगाएँ और ट्रैक करें (अनुपूरक चित्र 2D) का चयन करें. सुधार टैब पर जाएँ. चयनकर्ता उपकरण चिह्न (कर्सर तीर) पर क्लिक करके चयनकर्ता कर्सर को सक्रिय करें. वीडियो के माध्यम से स्क्रब करें, एक वर्म ट्रैक को ढूंढें और चुनें, और फिर वांछित परिवर्तन बनाने के लिए मरम्मत मेनू का उपयोग करें।
      नोट: रणनीतिक रूप से अधिकांश समस्याओं को जल्दी से ठीक करने के लिए, ज़ूम इन करें जैसे कि प्लेट का लगभग 1/6 वां भाग दिखाई दे रहा है, ट्रैक # 1 के आसपास के क्षेत्र से शुरू करें। कीड़े के लिए वीडियो की जांच के माध्यम से जल्दी से स्क्रब करें जो रहस्यमय रूप से कहीं से भी दिखाई नहीं देते हैं, ट्रैक जहां संख्याएं बदलती हैं, या कीड़े एक-दूसरे में टकराते हैं, समस्याओं के रूप में संपादन करते हैं। प्रारंभ स्थिति से संख्यात्मक क्रम में कीड़े का पालन करें। जब तक पूरी प्लेट की मरम्मत नहीं हो जाती है, तब तक प्रत्येक कीड़े का पालन करने के लिए आगे और पीछे स्क्रब करें। प्लेट के किनारों पर सावधानीपूर्वक ध्यान दें; अक्सर, नकली कीड़े प्लेट किनारों की छाया में दिखाई देते हैं।
  34. डेटा विश्लेषण
    1. वर्कफ़्लो मेनू से, डेटा का विश्लेषण करें (अनुपूरक चित्र 3A) का चयन करें.
      नोट:: डेटा विश्लेषण और प्लॉटिंग नामक एक नई विंडो दिखाई देगी (अनुपूरक चित्र 3B). इस विंडो में एक विशिष्ट प्रोजेक्ट फ़ाइल की वर्म आबादी के आंदोलन डेटा का आकलन करने और देखने के कई तरीके हैं। इनमें से अधिकांश विश्लेषण किसी दिए गए वीडियो से विशिष्ट, एकाधिक, या सभी कीड़े के चयन की अनुमति देते हैं, जिससे ट्रैक जानकारी को अलग-अलग तरीकों से प्लॉट किया जा सकता है।
    2. टर्न काउंट का विश्लेषण करने के लिए, ट्रैक सारांश पर नेविगेट करें [स्थिति और गति | ट्रैक सारांश] (अनुपूरक चित्रा 3C). किसी स्प्रेडशीट पठनीय स्वरूप (.csv) में डेटा निर्यात करने के लिए नीचे दाईं ओर निर्यात बटन का उपयोग करें, स्प्रेडशीट के वांछित स्थान के लिए एक पथ चुनें, जिसमें इसे कुछ यादगार में बदलना शामिल है। डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स एक अच्छा विकल्प हैं (अनुपूरक चित्रा 3 डी)।
    3. इस डेटा के साथ-साथ किसी अन्य प्रासंगिक प्रोजेक्ट डेटासेट को समेकित स्प्रेडशीट कार्यपुस्तिका (अनुपूरक चित्र3E) में चिपकाएँ.
    4. स्प्रेडशीटिंग फ़ंक्शंस (= टर्न्स/ट्रैक अवधि * 60) का उपयोग करने में प्रत्येक ट्रैक के लिए प्रति मिनट टर्न्स की गणना करने के लिए टर्न काउंट और ट्रैक अवधि का उपयोग करें या वांछित के रूप में एक अलग मीट्रिक का उपयोग करें (अनुपूरक चित्रा 3F)।
      नोट: प्रति मिनट बदल जाता है एक मैनुअल thrashing परख जो तरल में गतिविधि का एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मीट्रिक है के रूप में बहुत ही समान जानकारी पर कब्जा कर लेता है, लेकिन वहाँ कई विकल्प हैं, और यह काफी संभव है कि एक अलग मीट्रिक एक दिए गए उपचार या तुलना के लिए अन्य दिलचस्प डेटा की पहचान कर सकते हैं.
    5. यदि वांछित हो, तो वर्म आकार, ट्रैक अवधि, और / या कुछ अन्य चुने गए मीट्रिक (ओं) के लिए स्क्रीन सशर्त स्वरूपण उपकरण का उपयोग करके हटाने के लिए पटरियों को हाइलाइट करने के लिए यदि वे संभावित रूप से भ्रमित कर रहे हैं। उपचार और प्रतिकृति के बीच सुसंगत डेटा प्रसंस्करण बनाए रखें।
    6. उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषणों का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें जैसे कि 2 उपभेदों के लिए छात्र का टी-टेस्ट, या 3 या अधिक उपभेदों के लिए 1-तरफ़ा एनोवा। अलग-अलग दिनों में और कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों के लिए कीड़े की स्वतंत्र आबादी के साथ स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां करें।

Representative Results

रेडियल लोकोमोशन और तैराकी दोनों एसेस गतिशीलता हानि का संवेदनशील पता लगाने की पेशकश करते हैं (चित्रा 4 और चित्रा 5)। एएलएस में पैथोलॉजिकल टीडीपी -43 अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए, सी एलिगन्स मॉडल विकसित किए गए हैं जो जंगली-प्रकार या एएलएस-उत्परिवर्ती मानव टीडीपी -43 पैन-न्यूरोनल रूप से व्यक्त करते हैं। ये जानवर आणविक और सेलुलर विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं जो एएलएस की याद दिलाते हैं, जिसमें मोटर डिसफंक्शन 9 भी शामिल है। महत्वपूर्ण रूप से, वे जंगली प्रकार के मानव TDP-43 की अभिव्यक्ति के साथ मध्यम गतिशीलता हानि का प्रदर्शन करते हैं और रेडियल लोकोमोशन और तैराकी assays दोनों का उपयोग करके ALS-उत्परिवर्ती TDP-43 व्यक्त करने वाले जानवरों में अधिक गंभीर गतिशीलता हानि। कुछ उत्परिवर्ती या ट्रांसजेनिक जानवरों को तैराकी की तुलना में रेंगने में अधिक हानि होगी, या इसके विपरीत। दो अलग-अलग गतिशीलता assays का उपयोग करके, उपभेदों के बीच फेनोटाइपिक अंतर की एक स्पष्ट तस्वीर प्राप्त की जाती है।

रेडियल लोकोमोशन
जब एक बीजवाले आगर प्लेट पर रखा जाता है, तो सी एलिगन्स अपने परिवेश का पता लगाते हैं, जिसमें उनके खाद्य स्रोत की सीमाओं की तलाश भी शामिल है। रेडियल लोकोमोशन एसेस शारीरिक फिटनेस के लिए मीट्रिक के रूप में उस व्यवहार का लाभ उठाने का एक तरीका है। लोकोमोटर व्यवहार (एक ठोस सतह पर रेंगने) का एक नियंत्रित और मात्रात्मक तरीके से विश्लेषण करके, रेडियल लोकोमोटर परख मोटर घाटे और अन्य मोटर से संबंधित फेनोटाइप की गंभीरता का आकलन करने के लिए एक सरल और प्रभावी उपकरण प्रदान करता है। रेडियल लोकोमोशन assays मध्यम या गंभीर रूप से बिगड़ा हुआ ALS मॉडल कीड़े में गतिशीलता में अंतर पर कब्जा और गतिशीलता फेनोटाइप के मॉडुलन या उम्र के साथ गतिशीलता में परिवर्तन की तुलना करने के लिए एक आधार रेखा प्रदान करते हैं (चित्रा 6)। इस रणनीति को किसी भी तनाव के रेंगने वाले व्यवहार को मापने के लिए लागू किया जा सकता है जिसने जंगली प्रकार (एन 2) या नियंत्रण कीड़े से आंदोलन को बदल दिया है। हालांकि, यह विधि सामान्य रूप से क्रॉल करने में असमर्थ जानवरों का आकलन करने के लिए एक अच्छा विकल्प नहीं हो सकता है, जैसे कि रोलर म्यूटेंट या जानवर जो लकवाग्रस्त हैं। आमतौर पर, जंगली-प्रकार के कीड़े 200-300 μm / मिनट के बीच एक औसत विस्थापन पेश करेंगे जब 20 डिग्री सेल्सियस पर उठाए और परीक्षण किए जाएंगे। चित्रा 4 में प्रस्तुत उदाहरण डेटा N2 की तुलना में अपेक्षित परिणाम दिखाते हैं, दो अलग-अलग ट्रांसजेनिक उपभेदों ने एक हल्के फेनोटाइप के साथ जंगली-प्रकार के मानव TDP-43 को व्यक्त किया [TDP-43 (WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP)] या मजबूत फेनोटाइप [TDP-43 (WT-मध्यम), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], एक ट्रांसजेनिक तनाव उत्परिवर्ती मानव TDP-43 को एक गंभीर फेनोटाइप [TDP-43 (M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), और एक ट्रांसजेनिक तनाव एक और neurodegenerative-रोग से जुड़े प्रोटीन, जंगली प्रकार के मानव ताऊ [ताऊ (WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]]। जंगली-प्रकार के TDP-43 को व्यक्त करने वाले दो उपभेदों में रेडियल लोकोमोशन द्वारा पता लगाए गए हानि की अलग-अलग डिग्री होती है। TDP-43 (WT-low) N2 से काफी अलग नहीं है, जबकि TDP-43 (WT-high) गतिशीलता में स्पष्ट अंतर प्रदर्शित करता है। TDP-43 (M337V) और ताऊ (WT) उपभेदों में गतिशीलता में अधिक गंभीर हानि होती है।

तैराकी परख
C. elegans रूढ़िवादी तैराकी (thrashing) आंदोलन में संलग्न जब तरल में डूबा हुआ है. डूबने के तुरंत बाद, कीड़े लगभग 45 डिग्री के मोड़ कोण के साथ सिर और पूंछ को एक-दूसरे की ओर मोड़ना शुरू कर देते हैं, जिसमें कोण शीर्ष कीड़े का मध्य बिंदु होता है। कीड़े वेंट्रल और पृष्ठीय दिशाओं में वैकल्पिक झुकते हैं। एक थ्रैश, जैसा कि सॉफ़्टवेयर द्वारा मापा जाता है, सीधे से 20 डिग्री या उससे अधिक के बॉडी बेंड कोण पर जाने के आंदोलन का प्रतिनिधित्व करता है, दिशात्मकता के बावजूद (कोण थ्रेशोल्डिंग को विश्लेषण और प्लॉटिंग विंडो के भीतर पोस्ट-प्रोसेसिंग समायोजित किया जा सकता है [वर्कफ़्लो | डेटा | का विश्लेषण करें शरीर के आकार | बंकन कोण | मध्य बिंदु | आयाम थ्रेशोल्ड: # डिग्री]। तैराकी परख यहाँ वर्णित स्वचालित कंप्यूटर आधारित ट्रैकिंग और विश्लेषण तैराकी गतिविधि के निष्पक्ष स्कोरिंग प्रदान करने के लिए उपयोग करता है। यह उम्मीद की जाती है कि जंगली-प्रकार (एन 2) कीड़े प्रति मिनट 150-200 थ्रैश के बीच औसत होंगे जब 20 डिग्री सेल्सियस पर उठाए और दर्ज किए जाएंगे। चित्रा 5 में प्रस्तुत उदाहरण डेटा, N2 की तुलना में अपेक्षित परिणाम दिखाता है, दो अलग-अलग ट्रांसजेनिक उपभेदों ने एक हल्के फेनोटाइप के साथ जंगली-प्रकार के मानव TDP-43 को व्यक्त किया [TDP-43 (WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1:::TDP-43; Pmyo-3::GFP)] या मजबूत फेनोटाइप [TDP-43 (WT-मध्यम), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], और एक ट्रांसजेनिक तनाव एक और neurodegenerative-रोग से जुड़े प्रोटीन, जंगली प्रकार के मानव ताऊ [ताऊ (डब्ल्यूटी), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]]। एएलएस-उत्परिवर्ती TDP-43 [TDP-43 (M337V)] को व्यक्त करने वाला ट्रांसजेनिक तनाव तरल में नहीं धड़कता है, और इसलिए इसे ग्राफ पर एनडी (कोई डेटा नहीं) के रूप में दर्शाया जाता है। इस परख रेडियल लोकोमोशन परख चित्रा 4 में दिखाया गया की तुलना में विभिन्न फेनोटाइप भेदभाव कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, रेडियल लोकोमोशन परख (चित्रा 4) में, TDP-43 (WT-low) N2 से काफी अलग नहीं था। हालांकि, तैराकी परख (चित्रा 5) में, टीडीपी -43 (डब्ल्यूटी-कम) और टीडीपी -43 (डब्ल्यूटी-उच्च) दोनों एन 2 से काफी अलग हैं, साथ ही साथ एक दूसरे से काफी अलग हैं। इसके अलावा, टीडीपी -43 (एम 337 वी) और ताऊ (डब्ल्यूटी) दोनों के रेडियल लोकोमोशन (चित्रा 4) द्वारा गंभीर रेंगने वाली हानि होने के बावजूद, केवल ताऊ (डब्ल्यूटी) सॉफ्टवेयर (चित्रा 5) द्वारा ट्रैक किए जाने के लिए पर्याप्त रूप से कुचलने में सक्षम है। TDP-43 (M337V) जानवरों को कुचलने में असमर्थ हैं, और सॉफ्टवेयर-आधारित विश्लेषण इन कीड़े का सटीक रूप से पता नहीं लगाता है या ट्रैक नहीं करता है। इस प्रकार, इन कीड़े पर डेटा एकत्र नहीं किया गया था (एनडी, कोई डेटा नहीं)।

Figure 1
चित्रा 1: रेडियल लोकोमोशन परख वर्कफ़्लो. पैनलों ए-ई रेडियल लोकोमोशन परख के सामान्यीकृत चरणों को दिखाते हैं। चरण निम्नानुसार हैं: (ए) एनजीएम प्लेट्स, OP50 के साथ किनारों पर सीडेड, केंद्रीय बिंदु को लेबल और चिह्नित करके तैयार किए जाते हैं, (बी) कीड़े को केंद्रीय बिंदु द्वारा चिह्नित आगर के केंद्र में रखा जाता है, (सी) कीड़े को एक निर्धारित समय के लिए स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति दी जाती है, (डी) प्लेट को नीचे फ़्लिप किया जाता है और प्रत्येक कीड़े के अंतिम स्थान को केंद्रीय बिंदु की तुलना में एक अलग रंग में चिह्नित किया जाता है, (ई) केंद्र बिंदु से प्रत्येक अंतिम कृमि स्थान तक की दूरी या तो हाथ से या डिजिटल रूप से मापा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ImageJ का उपयोग कर अंतिम स्थान का डिजिटल माप.  केंद्र माप से दूरी को हाथ से या डिजिटल रूप से मापा जा सकता है, ताकि फ्रेम में एक शासक के साथ इमेजजे (ए) स्कैन बैकसाइड का उपयोग करके डिजिटल रूप से मापा जा सके। (B) लाइन उपकरण का उपयोग करके एक ज्ञात लंबाई आरेखित करें. (C) पैमाने को सेट करने के लिए (B) में खींची गई ज्ञात लंबाई का उपयोग करें [विश्लेषण | स्केल सेट करें...] (डी) केंद्र बिंदु से अंतिम स्थान चिह्न तक एक रेखा खींचने के लिए लाइन टूल का उपयोग करें, प्रत्येक चिह्न के लिए दोहराएं। (ई) एक पेंटब्रश लाइन स्कोरिंग में पहले निशान मापा एड्स को चिह्नित करती है (1 निशान के पास स्क्विगली ब्लैक लाइन)। अंतिम स्थान अंक स्कोरिंग की दिशात्मकता को चित्रित करने के लिए पीले रंग में गिने जाते हैं। (F) माप परिणाम विंडो में दर्ज किए जाते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए परिणाम कहीं और सहेजें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के लिए सामग्री और हार्डवेयर समायोजन. (ए) सॉफ़्टवेयर-सहायता प्राप्त तैराकी परख के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री। (बी) सॉफ्टवेयर और आवश्यक सामग्रियों की सामान्य स्थापना, ध्यान दें कि आवास उठाए गए स्थिति में है। (C) लेंस बढ़ते ब्रैकेट ऊंचाई को समायोजित किया जा सकता है। यह छवि समायोज्य ट्रैक और तैराकी assays प्रदर्शन के लिए पसंदीदा ऊंचाई को चिह्नित एक टेप संकेतक से पता चलता है. रिकॉर्डिंग से पहले ब्राइटफील्ड लाइट और कैमरा फोकस को समायोजित करना आवश्यक है। (डी) एक 35 मिमी परख प्लेट मंच पर रखा जाता है, M9 में जानवरों को प्लेट में जोड़ा जाता है, और एक 1 मिनट टाइमर शुरू किया जाता है। (ई) कभी-कभी कीड़े को केंद्र के करीब ले जाने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे घुमाना फायदेमंद होता है - लाइव कैप्चर स्क्रीन पर स्थान का निरीक्षण करें; वैकल्पिक रूप से, एक पिपेटर से एम 9 की कुछ बूंदों का उपयोग कीड़े को अलग करने के लिए किया जा सकता है। (एफ) कैमरा लेंस पर फोकस रिंग को समायोजित करें, इष्टतम फोकस निर्धारित करने के लिए स्क्रीन पर कीड़े का निरीक्षण करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: रेडियल लोकोमोशन assays रेंगने की गति में अंतर का पता लगाने. विकासात्मक रूप से मंचित एल 4 लार्वा के unstimulated फैलाव रेडियल लोकोमोशन परख ऊपर वर्णित का उपयोग कर मापा गया था और μm / मिनट यात्रा (ए-बी) के रूप में graphed. (ए) और (बी) में प्लॉट किया गया एक ही डेटा दो अलग-अलग संभावित ग्राफिकल प्रस्तुतियों को प्रदर्शित करता है। (ए) में, डेटा को एक बार ग्राफ के रूप में प्रदर्शित किया जाता है, जिससे उपभेदों के बीच सापेक्ष अंतर स्पष्ट हो जाता है। (बी) में, प्रत्येक कीड़े का अंतिम विस्थापन ग्राफ के भीतर लिखा जाता है, जिससे आबादी के भीतर भिन्नता को बेहतर ढंग से कल्पना की जा सकती है। परीक्षण किए गए उपभेदों के बीच महत्व का मूल्यांकन करने के लिए, टुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ विचरण (एनोवा) के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग किया गया था। ** पी = 0.0022, ****p<0.0001, ns = महत्वपूर्ण नहीं है। TDP-43 (M337V) और ताऊ (WT) भी N2, p<0.0001 से काफी अलग हैं। (ए) में त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि हैं और (B) में मानक विचलन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: तैराकी assays तरल में पिटाई के अंतर का पता लगाने. तैराकी की दरों (तरल में धड़कन या undulation आवृत्ति) निष्पक्ष कंप्यूटर-सहायता प्राप्त स्कोरिंग और ऊपर वर्णित विश्लेषण का उपयोग करके मापा गया था और थ्रैश / मिनट (ए-बी) के रूप में ग्राफ किया गया था। वही डेटा (A) और (B) में प्लॉट किया गया है। (ए) में, डेटा को एक बार ग्राफ के रूप में रेखांकित किया जाता है, जो उपभेदों के बीच सापेक्ष अंतर को देखना आसान बनाता है। (बी) में, स्कोर किए गए प्रत्येक व्यक्तिगत कीड़े के डेटा को ग्राफ के भीतर प्लॉट किया जाता है, जिससे आबादी के भीतर भिन्नता को बेहतर ढंग से विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है। परीक्षण किए गए उपभेदों के बीच महत्व का मूल्यांकन करने के लिए, टुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ विचरण (एनोवा) के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग किया गया था। p<0.0001, ns = महत्वपूर्ण नहीं है। TDP-43 (WT-मध्यम) और tau(WT) भी N2, p<0.0001.Error bars in (A) माध्य (SEM) की मानक त्रुटि हैं और (B) में मानक विचलन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: उत्परिवर्ती टीडीपी -43 कीड़े जंगली प्रकार के कीड़े की तुलना में कम यात्रा करते हैं। मंचित L4 N2 (जंगली-प्रकार) और TDP-43 (M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43 ) के अंतिम स्थान में एक प्रतिनिधि अंतर दिखाने वाली प्लेटें; Pmyo-2::GFP]), एक तनाव उत्परिवर्ती मानव TDP-43 को गंभीर रूप से बिगड़ा मोटर समारोह के साथ व्यक्त करने के बाद कमरे के तापमान पर unstimulated रेंगने के 1 घंटे के बाद. प्लेटों को केंद्र बिंदु के लिए एक लाल बिंदु और जानवरों के अंतिम स्थान के लिए नीले डॉट्स के साथ चिह्नित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: इमेजिंग और ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके तैराकी व्यवहार रिकॉर्डिंग। (A) ट्रैकिंग वर्कफ़्लो और वीडियो कैप्चर आइकन का स्थान. (बी) वीडियो कैप्चर विंडो को लाइव व्यू में दिखाया गया है, और सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं पर प्रकाश डाला गया है। हरे रंग के "लाइव दृश्य" शब्द रिकॉर्ड बटन सक्रिय होने पर लाल "रिकॉर्डिंग" में बदल जाएंगे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: तैराकी व्यवहार की तैयारी और ट्रैकिंग। यह आंकड़ा ट्रैकिंग के लिए एक वीडियो छवि अनुक्रम स्थापित करने में सहायता करने के लिए स्क्रीनशॉट की एक श्रृंखला दिखाता है। वीडियो अनुक्रम तैयार करने के लिए सामान्य प्रोटोकॉल प्रत्येक वर्कफ़्लो मेनू को इस क्रम में खोलना है: छवि अनुक्रम आयात करें | अनुक्रम जानकारी | सेट करें छवि | समायोजित करें पता लगाएँ और ट्रैक | प्रोजेक्ट सहेजें. डेटा का विश्लेषण करें विंडो का उपयोग केवल किसी प्रोजेक्ट फ़ाइल को ट्रैक करने के बाद किया जा सकता है. (A) ट्रैक वर्कफ़्लो के भीतर से सॉफ़्टवेयर में अनुक्रम आयात करने के बाद एक खुली हुई .avi (वीडियो) फ़ाइल दिखाता है. (बी) सेट अनुक्रम जानकारी विंडो नोट्स के लिए एक जगह प्रदान करती है, स्केल सेट/ पैमाने को बदलने के लिए निर्देश इस विंडो में पाए जाते हैं और कैमरा कम या उठाए जाने पर पालन किया जाना चाहिए (बी)। छवि (C) छवि समायोजित करें विंडो सेटिंग्स दिखाता है। (डी) स्क्रीनशॉट का पता लगाने और ट्रैक विंडो का पता लगाने टैब दिखा रहा है। कीड़े का पता लगाने का उपयोग सॉफ़्टवेयर को प्रशिक्षित करने के लिए किया जाता है और प्रत्येक वीडियो अनुक्रम के लिए सेट किया जाना चाहिए। यदि वांछित हो तो अतिरिक्त डिटेक्शन पैरामीटर यहां सेट किए जा सकते हैं। (ई) तैराकी व्यवहार पर नज़र रखने के लिए अनुशंसित सेटिंग्स के साथ पता लगाएँ और ट्रैक विंडो के ट्रैकिंग टैब का स्क्रीनशॉट। यह एक वीडियो अनुक्रम स्थापित करने में अंतिम चरण है। प्रोजेक्ट सहेजें विंडो का उपयोग कर अनुक्रम को प्रोजेक्ट के रूप में सहेजें । प्रत्येक वीडियो अनुक्रम के लिए इन चरणों को दोहराएँ। सेटिंग्स को वर्कलोड को कम करने के लिए कॉन्फ़िगरेशन के रूप में सहेजा जा सकता है और यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी अनुक्रमों को समान माना जाता है (दिखाया नहीं गया है)। विश्लेषण के लिए प्रोजेक्ट फ़ाइलों को ट्रैक करने के लिए, बैच वर्कफ़्लो पर नेविगेट करें. (F) बैच वर्कफ़्लो पर नेविगेट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आइकन को दिखाता है, और (G) बैच प्रोसेसिंग विंडो दिखाता है, जोड़ें और प्रारंभ बटन को हाइलाइट करता है, और ट्रैक की गई किसी प्रोजेक्ट फ़ाइल की अपेक्षित उपस्थिति दिखाता है. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 3: तैराकी व्यवहार विश्लेषण। एक प्रोजेक्ट फ़ाइल ट्रैक किया गया है के बाद, यह [फ़ाइल | का उपयोग कर खोला जा सकता है प्रोजेक्ट खोलें]। कीड़े हरे रंग में दिखाई देंगे जैसा कि (ए) में दिखाया गया है। वीडियो के माध्यम से स्क्रबिंग एक त्वरित जांच प्रदान करता है कि वीडियो उम्मीद के अनुसार संसाधित होता है, स्क्रबिंग करते समय हरे रंग की हाइलाइटिंग गायब हो जाएगी। डेटा विश्लेषण और प्लॉटिंग विंडो डेटा वर्कफ़्लो आइटम का विश्लेषण करें से खोली जाती है. (B) स्थिति दृश्य (डिफ़ॉल्ट) के साथ डेटा विश्लेषण और प्लॉटिंग विंडो दिखाता है, सभी पटरियों पर प्रकाश डाला जाता है। Datapoints के नीचे एक प्लॉट है जो प्रत्येक हाइलाइट किए गए कीड़े के लिए रिकॉर्ड किए गए ट्रैक को दिखाता है। ट्रैक सारांश विश्लेषण का उपयोग प्रति मिनट टर्न की गणना करने के लिए किया जाता है। (C-D) ट्रैक सारांश रिपोर्ट और निर्यात विवरण दिखाएँ. (ई-एफ) एक स्प्रेडशीट में ट्रैक सारांश दिखाते हैं और प्रति मिनट बारी की गणना कैसे करें, इस परख में मापा गया आउटपुट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

रेडियल लोकोमोशन:
इस परख के संकल्प आसानी से समय चर बदलने से नियंत्रित किया जाता है. समय की लंबाई बढ़ाने से गंभीर फेनोटाइप वाले जानवरों के बीच अंतर का निरीक्षण करना आसान हो जाता है, जिससे सूक्ष्म अंतर की पहचान होती है। हालांकि, क्योंकि यह परख विस्थापन को मापता है, अगर परख समय बहुत लंबे समय तक बढ़ाया जाता है, तो सामान्य गतिशीलता वाले जानवर, जैसे कि एन 2, प्लेट के किनारों की यात्रा करेंगे, और फोर्जिंग व्यवहार बैकट्रैकिंग का कारण बनेगा। यह कृत्रिम रूप से यात्रा की गई दूरी के माप को कम कर देगा। समय अवधि जो बहुत लंबी होती है, उपभेदों के बीच मतभेदों के गायब होने के परिणामस्वरूप हो सकती है, विशेष रूप से कम गंभीर मोटर फेनोटाइप वाले जानवरों के बीच, क्योंकि जानवर प्लेट में समान रूप से बिखरे हुए हो जाते हैं। समय चर को छोटा करने से प्लेट के किनारों को खोजने से अधिक सक्रिय कीड़े को रोका जा सकेगा। यह विधि प्रत्येक कीड़े के लिए यात्रा की गई कुल दूरी को ट्रैक नहीं करती है, लेकिन प्लेट के केंद्र से रैखिक दूरी में प्रत्येक कीड़े के लिए यात्रा की गई दूरी को संकुचित करती है। इस प्रकार, यह स्वाभाविक रूप से एक विधि की तुलना में कम मजबूत है जो व्यक्तिगत कीड़े की कुल ट्रैक लंबाई को रिकॉर्ड करता है। हालांकि, रेडियल लोकोमोशन परख के लिए बहुत कम शोधकर्ता प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, अपेक्षाकृत सस्ती अभिकर्मकों का उपयोग करता है जो आमतौर पर अधिकांश कृमि प्रयोगशालाओं में उपलब्ध होते हैं, और महत्वपूर्ण और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणामों का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील होते हैं। स्वचालित वीडियो ट्रैकिंग पसंद करने वाली प्रयोगशालाओं के लिए, क्रॉलिंग आंदोलनों को ट्रैक करने और विश्लेषण करने के लिए पहले कई तरीकों की स्थापना की गई है12, या इस पेपर में तैराकी परख के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर पैरामीटर को क्रॉलिंग डिटेक्शन और विश्लेषण की अनुमति देने के लिए बदला जा सकता है।

यह प्रयोग आमतौर पर प्रतिलिपि स्वतंत्र प्रतिकृतियों में किया जाता है, जिसमें प्रतिकृति प्रति 30-40 कीड़े का एक सेट होता है। प्रत्येक प्रतिकृति को दो अलग-अलग 100 मिमी या 150 मिमी प्लेटों पर विभाजित किया जाता है, जिसमें प्रति प्लेट 15-20 कीड़े होते हैं। प्रति प्लेट अनुशंसित से अधिक कीड़े का उपयोग करना कुशलतापूर्वक स्कोर करना मुश्किल बना सकता है। 90+ की कुल संख्या हल्के, मध्यम या गंभीर गतिशीलता हानि के लिए महत्व स्थापित करने के लिए पर्याप्त रूप से संचालित है। स्कोर किए गए उपभेदों के बीच समय के अनुरूप होने के नाते सटीकता और पुनरुत्पादन के लिए आवश्यक है। 30 मिनट आम तौर पर जंगली प्रकार के कीड़े (चित्रा 4) की तुलना में मानव उत्परिवर्ती टीडीपी -43 को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक उपभेदों जैसे मध्यम से गंभीर फेनोटाइप के बीच अंतर स्थापित करने के लिए काफी लंबा होता है। यदि समय चर को बढ़ाया जाएगा, तो प्लेट के आकार को 100 मिमी से 150 मिमी तक बढ़ाने की भी सलाह दी जाती है। तापमान और आर्द्रता जैसे पर्यावरणीय कारक इस परख को प्रभावित कर सकते हैं, जो आमतौर पर परिवेश के कमरे के तापमान पर आयोजित किया जाता है, इसलिए प्रतिकृतियों की तुलना करते समय हमेशा एक जंगली-प्रकार (एन 2) नियंत्रण का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इस परख कुछ उपभेदों है कि तरल (thrashing) में सामान्य तैराकी व्यवहार प्रदर्शित नहीं करते हैं की गतिशीलता को मापने कर सकते हैं, यह तैराकी परख के लिए एक उपयोगी पूरक बनाने.

तैराकी परख:
इमेजिंग और अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग ट्रैकिंग और वर्म तैराकी के विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए कठोर और निष्पक्ष डेटा के लिए अनुमति देता है। हालांकि, प्रयोग के प्रारंभिक सेटअप के दौरान कई कारक हैं जिन्हें नमूनों के बीच नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है। इनमें रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले तरल के अनुकूल होने का समय, परिवेश की स्थिति (यानी, तापमान, आर्द्रता), और लगातार प्रकाश और रिकॉर्डिंग सेटिंग्स शामिल हैं। रिकॉर्डिंग चरण पर, कई विशेषताएं हैं जो प्लेटों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद करती हैं। इनमें एक एकीकृत ट्रैक-माउंटेड कैमरा और ब्राइट-फील्ड स्टेज शामिल है जो प्लेटों के बीच रिकॉर्डिंग वीडियो को सुसंगत बनाता है, मंच के चारों ओर परिरक्षण करता है जो रिकॉर्डिंग के दौरान प्रतिबिंब, चकाचौंध और हवा के आंदोलनों को रोकता है, और एक मजबूत सॉफ़्टवेयर पैकेज जो मज़बूती से कीड़े का पता लगाता है और वीडियो पोस्ट-प्रोसेसिंग में पटरियों के मैनुअल सुधार की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में, कीड़े के साथ 35 मिमी प्लेट के वीडियो को 1 मिनट के लिए रिकॉर्ड किया जाता है और फिर सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके संसाधित किया जाता है। प्रसंस्करण के बाद, पटरियों का मैनुअल सुधार यह सुनिश्चित करता है कि वर्म व्यवहार ट्रैकिंग त्रुटियों को भ्रमित किए बिना सटीक रूप से दर्ज किए जाते हैं। टर्न काउंट और ट्रैक अवधि डेटा का उपयोग अंतिम रीडआउट के रूप में प्रति मिनट टर्न निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए, डेटा को कम से कम 3 स्वतंत्र प्रतिकृति प्रयोगों पर एकत्र किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक में 40-50 जानवरों ने स्कोर किया, ताकि 120-150 जानवरों की संयुक्त अंतिम संख्या प्राप्त की जा सके। यह संख्या नियंत्रण कीड़े से तैराकी व्यवहार में छोटे अंतर को भेदभाव करने के लिए पर्याप्त है। कुछ कीड़े मोटर घाटे भी तैराकी assays द्वारा कब्जा कर लिया जा करने के लिए गंभीर है. उदाहरण के लिए, यदि जानवरों को अपेक्षित पिटाई प्रतिक्रिया करने के बजाय एक तरल माध्यम कर्ल में रखा गया है, तो यह परख उन आंदोलनों को सटीक रूप से रिकॉर्ड नहीं करेगा और रेडियल लोकोमोशन जैसे एक और आंदोलन परख, उन गतिशीलता दोषों को बेहतर ढंग से कैप्चर कर सकते हैं। प्रदान किया गया प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करता है (अधिक विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें), लेकिन अन्य वर्म ट्रैकिंग सिस्टम एक समान उपयोगिता प्रदान कर सकते हैं, जिसमें कुछ खुले स्रोत 12 हैं। पहले प्रकाशित तरीके कीड़े thrashing13 के मैनुअल स्कोरिंग का वर्णन करते हैं। जबकि स्वचालित विश्लेषण प्रत्येक व्यक्तिगत कीड़े के लिए कई मीट्रिक का उत्पादन करता है, शरीर के मोड़ का पता लगाना जो प्रति मिनट थ्रैश में मापा जाता है, प्रयोगों के बीच सुसंगत परिणाम प्रदान करता है और आंखों द्वारा कीड़े की पिटाई के पारंपरिक स्कोरिंग के साथ अच्छी तरह से ट्रैक करता है।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रकटीकरण नहीं है।

Acknowledgments

हम उपयोगी टिप्पणियों और सुझावों के लिए समीक्षकों को धन्यवाद देते हैं। हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एलीन सैक्सटन, ब्रैंडन हेंडरसन और जेड सीढ़ी को धन्यवाद देते हैं। हम ब्रायन क्रेमर और रेबेका कोउ को इन assays को विकसित करने में सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। यह सामग्री संसाधनों के साथ समर्थित काम और VA Puget ध्वनि स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली में सुविधाओं के उपयोग का परिणाम है। इस काम को संयुक्त राज्य अमेरिका (यू.एस.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था दिग्गजों के मामलों के विभाग (वीए) जैव चिकित्सा प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास सेवा [मेरिट समीक्षा अनुदान #I01BX004044 N.F.L.]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) - Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass VWR 14673-010 Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. 
Disposable petri dishes, 35x10mm VWR 10799-192 Assay plates for WormLab Imaging System
Disposable petri dishes, 60x15mm VWR 25384-090 Stock plates for worms
Disposable petri dishes, 100x15mm VWR 25384-302 Standard radial locomotion assay plate
Disposable petri dishes, 150x15mm VWR 25384-326 Longer time frame radial locomotion assay plate
Dissecting microscope Leica M80 Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays
Fine-tipped markers VWR 52877-810 Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.
Flatbed Scanner Amazon Epson Perfection V850 Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine
ImageJ NIH - Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
M9 buffer VWR IC113037012 Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
NGM (Nematode Growth Medium) VWR 76347-412 Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
OP50  bacteria Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Primary food source for C. elegans
p1000 pipettor VWR 76207-552 Pipettor, used in swimming assay
p1000 tips VWR 83007-384 Tips for pipettor, used in swimming assay
Platinum wire, 0.2032mm diameter VWR BT136585-5M Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. 
Ruler VWR 56510-001 Need to score radial locomotion assays
WormLab Imaging System MBF Bioscience WormLab The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system

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References

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  13. Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M. WormBook. Hart, A. C. , 1551 (2006).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 175
<em>C. elegans</em> में मोटर हानि का मूल्यांकन Amyotrophic Lateral Sclerosis के मॉडल
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Currey, H. N., Liachko, N. F.… More

Currey, H. N., Liachko, N. F. Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (175), e62699, doi:10.3791/62699 (2021).

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