Evaluación del deterioro motor en modelos de C. elegans de esclerosis lateral amiotrófica

Summary

Este protocolo describe dos ensayos sensibles para discriminar entre deterioro motor leve, moderado y grave en modelos de esclerosis lateral amiotrófica de C. elegans , con utilidad general para cepas de C. elegans , con motilidad alterada.

Abstract

La enfermedad neurodegenerativa esclerosis lateral amiotrófica (ELA) presenta una pérdida progresiva de neuronas motoras acompañada de debilidad muscular y deterioro motor que empeora con el tiempo. Si bien se han logrado avances considerables en la determinación de los impulsores genéticos de la ELA para un subconjunto de pacientes, la mayoría de los casos tienen una etiología desconocida. Además, los mecanismos subyacentes a la disfunción y degeneración de las neuronas motoras no se comprenden bien; por lo tanto, existe una necesidad constante de desarrollar y caracterizar modelos representativos para estudiar estos procesos. Caenorhabditis elegans puede adaptar su movimiento a las limitaciones físicas de su entorno, con dos paradigmas de movimiento primarios estudiados en un entorno de laboratorio: gatear sobre una superficie sólida y nadar en líquido. Estos representan una interacción compleja entre la sensación, las neuronas motoras y los músculos. Los modelos de ELA de C. elegans pueden exhibir deterioro en uno o ambos de estos paradigmas de movimiento. Este protocolo describe dos ensayos sensibles para evaluar la motilidad en C. elegans: un ensayo de locomoción radial optimizado que mide el rastreo sobre una superficie sólida y un método automatizado para rastrear y analizar la natación en líquido (thrashing). Además de la caracterización del deterioro motor basal de los modelos de ELA, estos ensayos pueden detectar la supresión o mejora de los fenotipos a partir de intervenciones genéticas o de moléculas pequeñas. Por lo tanto, estos métodos tienen utilidad para estudiar modelos de ELA y cualquier cepa de C. elegans que exhiba motilidad alterada.

Introduction

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa debilitante relacionada con el envejecimiento con un impacto particular en las neuronas motoras. La enfermedad presenta pérdida de neuronas motoras en el cerebro y la médula espinal y deterioro motor progresivo. Esto resulta en una discapacidad funcional importante y muerte prematura, generalmente dentro de los 3-5 años posteriores al ^{diagnóstico1}. Las mutaciones en al menos 38 genes pueden causar ELA; sin embargo, la mayoría de los pacientes con ELA acumulan inclusiones ubiquitinadas de la proteína TDP-43 como patología primaria en neuronas y células gliales2,3,4. Se han desarrollado varios modelos animales para estudiar los mecanismos subyacentes que causan o contribuyen a la ELA in vivo (revisado ^en5). En C. elegans, estos modelos incluyen mutaciones genéticas de pérdida de función en homólogos de genes causantes de ELA o expresión transgénica de genes de ELA humana. Existen numerosas ventajas para modelar la ELA en C. elegans. C. elegans es un animal simple tratable con un sistema nervioso diferenciado, paradigmas conductuales bien caracterizados y una considerable homología genética con los ^humanos6,7. Existen muchas herramientas para trabajar con C. elegans, incluidas capacidades robustas de edición del genoma, reporteros fluorescentes in vivo de neurodegeneración, paradigmas de detección de ARNi, genética tratable y ensayos conductuales y fenotípicos establecidos. Los modelos de C. elegans de ELA recapitulan aspectos de la enfermedad humana, incluyendo la acumulación de proteína insoluble, la neurodegeneración y la muerte ^prematura8,9. Además, la disfunción motora con alteración de los comportamientos de gateo y natación está presente en muchos modelos de ELA de C. elegans.

Este protocolo describe dos métodos para caracterizar los fenotipos motores de C. elegans : el ensayo de locomoción radial para evaluar el gateo sobre una superficie sólida y la evaluación de la natación en líquido (thrashing) utilizando el seguimiento y análisis automatizado WormLab. Estos métodos sensibles para caracterizar los déficits motores permiten comparaciones de gravedad y ofrecen herramientas para medir la supresión y las mejoras de los fenotipos motores. El ensayo de locomoción radial cuantifica las diferencias en la motilidad de arrastre (movimiento sinusoidal en una superficie sólida) entre las poblaciones de gusanos. Este ensayo aprovecha el comportamiento natural de exploración no estimulada de C. elegans colocando gusanos en una sola ubicación en una placa y marcando su ubicación final después de un período de tiempo ^{determinado10}. Alternativamente, nadar en ensayos líquidos (thrashing) cuenta las curvas corporales de gusanos individuales durante un período de tiempo determinado. El conteo manual de las curvas del cuerpo por el ojo humano requiere mucho tiempo y, por lo general, exhibe una variabilidad considerable entre los experimentadores. El uso de seguimiento y análisis automatizados asistidos por computadora puede eliminar gran parte de esa variabilidad. Además de la caracterización del deterioro motor basal de los modelos de ELA, tanto la locomoción radial como los ensayos de natación pueden detectar la modulación de distintos fenotipos locomotores a partir de intervenciones genéticas o de moléculas pequeñas. Estos métodos tienen utilidad para estudiar modelos de ELA y cualquier cepa de C. elegans que exhiba motilidad alterada.

Protocol

1. Ensayo de locomoción radial

1. Prepare placas de Petri de 100 mm o 150 mm de diámetro aproximadamente medio llenas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) y sembradas con un césped uniforme de bacterias OP50 para cubrir toda la superficie del agar.
2. Voltee las placas de ensayo NGM al revés y etiquete la parte inferior con un identificador para las cepas de C. elegans que se van a ensayar, 2 placas por cepa (Figura 1A).
3. Haga un pequeño punto con el marcador en el centro de la placa invertida (Figura 1A).
4. Mientras trabaja con un microscopio de disección, transfiera 15-20 gusanos ^{emparejados11} por etapas al centro de la placa de ensayo directamente sobre el punto central (visible a través del NGM) utilizando una selección de alambre de platino (Figura 1B).
   NOTA: Intente transferir todos los gusanos al mismo tiempo o lo más rápido posible.
   1. Establezca un temporizador durante 30 minutos después de colocar los gusanos en el centro de la placa. Vuelva a colocar la tapa en la placa y déjela a un lado (Figura 1C).
5. Continúe transfiriendo gusanos hasta que todas las cepas estén en las placas de ensayo designadas, anotando aproximadamente cuánto tiempo se tarda en transferir entre placas (apunte a ~ 1 minuto entre placas). Mantenga todas las placas en el mismo orden en que fueron configuradas.
6. Después de 30 minutos, comience a anotar el primer plato.
   1. Retire la tapa y coloque la placa boca abajo debajo del microscopio de disección, de modo que la parte posterior etiquetada de la placa esté hacia arriba, y el agar NGM esté entre la línea de visión y los gusanos. La placa estará al revés del uso normal.
   2. Ajuste el foco del microscopio hasta que los gusanos sean visibles a través del agar.
   3. Usando una pluma de punta de fieltro de color diferente desde el punto central, coloque un pequeño punto en la ubicación de cada gusano: siga las huellas del gusano a través del césped bacteriano para encontrar los animales más distales.
   4. Revise el borde de la placa, ya que algunos gusanos pueden terminar allí. Además, cuente y registre el número de gusanos en el punto central (Figura 1D).
7. Continúe marcando todas las placas de ensayo en orden, de modo que todas las placas tengan 30 minutos de tiempo de actividad, teniendo cuidado de tener en cuenta el tiempo que tardó en configurar la placa. A continuación, realice mediciones manuales o digitales como se describe en los pasos 1.8 o 1.9.
8. Realice mediciones manuales utilizando una regla.
   1. Use una regla para medir en mm, la distancia desde el punto central hasta las marcas de ubicación final para cada gusano y registre la distancia. Para ayudar a realizar un seguimiento del progreso durante la puntuación, etiquete el primer punto anotado con una pequeña línea de marcado.
   2. Registre los datos de longitud para cada punto consecutivamente girando la placa en el sentido de las agujas del reloj (Figura 1E).
9. Realice mediciones digitales utilizando un escáner e ImageJ.
   1. Con un escáner de cama plana, escanee la parte posterior de la placa o placas de ensayo junto a una regla (números frente a la superficie de escaneo) (Figura 2A).
   2. Abra la imagen de la placa escaneada en ImageJ o en un programa similar.
      NOTA: ImageJ es un software gratuito de procesamiento de imágenes basado en Java alojado por el NIH.
   3. Haga clic en la herramienta Línea recta y luego dibuje una línea que conecte los puntos de 1 cm y 2 cm en la imagen escaneada de la regla (Figura 2B).
      NOTA: Mantener presionada la tecla Mayús de la computadora forzará la línea al ángulo de 45° más cercano.
   4. Desplácese hasta el menú Analizar y utilícelo para establecer la escala (Analizar | Establecer escala) (Figura 2C).
   5. Introduzca la distancia conocida (10) y las unidades de longitud (mm) en los cuadros correspondientes, no ajuste la distancia en número de píxeles. Marque Global para aplicar la misma escala a todas las imágenes que se analizan en cada sesión de ImageJ; de lo contrario, establezca la escala de cada imagen al abrirla (Figura 2D). Haga clic en Aceptar.
      NOTA: Los pasos 1.9.2-1.9.5 se realizan para establecer la escala de medición. Las mediciones para esta imagen ahora relacionarán automáticamente la longitud de las líneas con la relación píxel: longitud definida. Las imágenes escaneadas a 300 ppp tendrán una relación aproximada de 11,8 píxeles por mm.
   6. Utilice la herramienta Pincel para marcar justo encima del primer punto que se va a puntuar.
      NOTA: Este es un indicador visual para el primer gusano puntuado.
   7. Utilice la herramienta Línea recta para dibujar una línea desde el punto central hasta el primer punto de datos del gusano.
   8. Haga clic en la tecla M del teclado para medir la distancia. Como alternativa, vaya al menú Analizar y elija Medir (Analizar | Medida). En ambos casos, la medición aparecerá en una nueva ventana; esta ventana recogerá todas las medidas por imagen.
   9. Manteniendo el punto central constante, mueva el final de la línea tocando el primer punto de gusano al siguiente punto de gusano, moviéndose en el sentido de las agujas del reloj, y haga clic en la tecla M para medir.
   10. Continúe midiendo cada punto en el sentido de las agujas del reloj hasta que se anoten todos los puntos.
   11. Copie y pegue datos de medición de longitud en una hoja de cálculo para guardarlos. Luego, repita el proceso para cada imagen de placa escaneada.
       NOTA: Los pasos 1.9.6 a 1.9.11 miden los valores de desplazamiento del gusano (Figura 2E-F).
10. Realizar análisis estadísticos.
    1. Combine réplicas dentro de un solo experimento para que un número total puntuado esté entre 30-40 gusanos.
    2. Realizar réplicas experimentales independientes en diferentes días y con poblaciones independientes de gusanos para terminar con 3 réplicas experimentales independientes.
    3. Analice los datos utilizando análisis estadísticos apropiados, como la prueba t de Student para 2 cepas o ANOVA de 1 vía para tres o más cepas.

2. Ensayo de natación analizado por computadora

NOTA: Este protocolo contiene instrucciones detalladas para el sistema de hardware y software WormLab disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales). Sin embargo, el flujo de trabajo se puede aplicar a otros sistemas de ensayo de natación analizados por computadora.

1. Configuración y grabación de videos.
2. Eleve el blindaje del hardware de imagen (Figura 3) y compruebe que la altura de la cámara esté establecida en la ubicación esperada.
   NOTA: La altura óptima para capturar gusanos en una placa de 35 mm es tal que el tercero desde el orificio del tornillo roscado inferior es visible debajo del soporte de montaje de la cámara ajustable, pero no se ve ningún orificio de montaje adicional sobre el orificio del tornillo (aproximadamente 30,5 cm por encima del escenario) (Figura 3C). Esto dará como resultado una relación de captura de 11,43 μm/píxel. Considere agregar un indicador de "altura correcta" para que sea más fácil de confirmar antes de comenzar el ensayo. Consulte el paso de protocolo 2.18 para tener en cuenta los ajustes de altura.
3. Abra el software asociado (Figura suplementaria 1A).
4. Haga clic en el icono Captura de vídeo (película con un triángulo que apunta a la derecha en el centro) para abrir una nueva ventana captura de vídeo . La cámara estará en la vista en vivo, pero la pantalla será negra (Figura suplementaria 1B).
5. Presione la perilla del atenuador y gírela en el sentido de las agujas del reloj para ajustar la luz.
   NOTA: La perilla del atenuador está en el escenario del sistema de imágenes cerca de la fuente de luz de campo brillante. La pantalla de visualización en vivo de Captura de video pasará de negro a iluminado.
6. De vuelta en la ventana Captura de video, haga clic en la pestaña Configuración, ajuste de la siguiente manera: Modo de video: 2456 x 2052_Mono8, Velocidad de fotogramas: 14, Salida: monocromática, Exposición: 0.00300 s, Ganancia: 1 dB, Gamma: 1, Girar 180 (verificar).
7. Vuelva a la pestaña Capturar . Seleccione la carpeta de grabación (Figura suplementaria 1B).
   NOTA: Aquí es donde se almacenarán todas las grabaciones y archivos de proyecto. Cree carpetas únicas para experimentos individuales para mantener los datos organizados.
8. Asigne un nombre de archivo escribiéndolo en el cuadro de texto Prefijo de archivo .
   NOTA: El software agregará automáticamente un número progresivo al final del prefijo en el formato "0001". Es recomendable tener un esquema de nomenclatura consistente para los archivos como: "YYYYMMDD_treatmentName_rep#_".
9. Establezca otros ajustes de captura de la siguiente manera: Búfer: 128 fotogramas (predeterminado), Duración (comprobar): 00 h:01min:00 s. Ignore o desactive otras configuraciones en esta pestaña.
10. Coloque la placa de ensayo, tapa arriba, en el escenario del dispositivo y céntrela en la pantalla captura de video ; retire la tapa.
    NOTA: Prepare las placas de ensayo con anticipación. Cada placa consiste en una placa de Petri de 35 mm aproximadamente medio llena de NGM sin sembrar (sin césped bacteriano).
11. Use una micropipeta para lavar el escenario ^{sincronizado11} gusanos en 1 ml de M9 en la placa de ensayo - apunte a unos 50 gusanos (Figura 3D). Agite suavemente la placa para llevar a los animales al centro o use una micropipeta para agregar unas gotas de M9 para separar a los animales (Figura 3E). Establezca un temporizador para 60 s para permitir que los gusanos se aclimaten a nadar.
    NOTA: La placa no será 100% visible en la pantalla. Los animales no se rastrean con precisión mientras se superponen.
12. Mientras el temporizador cuenta atrás, ajuste manualmente el enfoque de la cámara girando el anillo de enfoque en el cuerpo de la lente de la cámara mientras mira la pantalla (Figura 3F). Es posible hacer zoom en los gusanos utilizando un ratón de rueda de desplazamiento que permite un enfoque más preciso.
13. Después de ajustar el enfoque, ajuste la perilla de luz para que la pantalla sea lo más brillante posible sin sobreexposición (aparece como píxeles rojos en la pantalla).
14. Después de 60 s, presione el botón Grabar .
    NOTA: El video pasará de la vista en vivo a la grabación y un temporizador será visible. Cuando se complete la captura, la pantalla captura de vídeo volverá a la vista en vivo (figura complementaria 1B).
15. Retire la placa después de grabar y configure la siguiente placa. Cambie el nombre del prefijo según sea necesario. Lave los gusanos en la placa de ensayo, incube durante 60 s y registre cada tratamiento.
16. Después de completar todas las grabaciones para un experimento, cierre las pestañas de video abiertas y apague la fuente de luz presionando la perilla del atenuador.
17. Cierre la ventana Captura de video haciendo clic en el botón x rojo en la esquina superior derecha de la ventana; alternativamente, cierre todo el paquete de software y vuelva a abrirlo.
18. Prepare videos para el seguimiento.
19. En el menú de la barra lateral Flujo de trabajo , seleccione el primer botón de este menú, Importar secuencia de imágenes, y busque y haga doble clic en un video. El video se abrirá en la ventana central (Figura suplementaria 2A).
    NOTA: La pantalla predeterminada para el software es el menú de la barra lateral Flujo de trabajo ; También se puede acceder a este menú a través del menú desplegable superior de la vista en Ver [Ver | Flujo de trabajo]. El menú Flujo de trabajo tiene varias opciones de vista; la vista Seguimiento es apropiada en este punto del protocolo. Si el botón Establecer información de secuencia no está visible en el menú, esta no es la vista correcta. Primero, mire la parte inferior del menú y verifique que la pestaña Flujo de trabajo esté activa, luego verifique que la vista Rastrear esté activa haciendo clic en el ícono Rastrear . El lugar donde aparecen los menús en la ventana depende del tamaño del monitor y de la ubicación de otros menús abiertos. Los menús se pueden mover arrastrando y soltando, redimensionando y cerrando. La mayoría de los menús también se pueden abrir a través del menú desplegable Ver .
20. En el menú Flujo de trabajo, seleccione Establecer información de secuencia (Figura suplementaria 2B). En la nueva ventana del menú, compruebe el esquema de nomenclatura, agregue notas y valide los metadatos.
21. Compruebe que la escala está configurada correctamente; Escala: 11.43 μm / píxel y La medida se llenará automáticamente ya que 1000 μm son 87 píxeles. Si la altura de la cámara se ha ajustado de forma diferente a la prescrita aquí, siga las instrucciones de este menú para actualizar la báscula. Haga clic en el botón Guardar .
22. En el menú Flujo de trabajo, seleccione Ajustar imagen y se abrirá un nuevo menú emergente denominado Ajustes de imagen (Figura suplementaria 2C). Seleccione Gusanos oscuros en fondo claro (campo brillante)..
23. Ajuste la configuración adicional. Los ajustes de procesamiento de imágenes recomendados son los siguientes : Suavizado de fondo: 10, Suavizado gaussiano: 5, Rellenar taladros: 2, Filtro de objetos pequeños: 0 y omitir segmentación derivada integral.
24. Ajuste el nivel umbral de modo que los animales estén completamente llenos de verde pero aún distintos del fondo. Haga clic en Aplicar.
    NOTA: Está permitido recoger algunos objetos que no son gusanos.
25. En el menú Flujo de trabajo , seleccione Detectar y realizar un seguimiento (figura complementaria 2D).
    NOTA: Aparecerá un menú al costado del video con 3 pestañas: Detección, Seguimiento y Reparación. El cursor se verá como un dedo señalador cuando esté sobre la pantalla de video. Alternativamente, haga clic en el icono Seleccionar (flecha del cursor) en el menú de iconos en la parte superior izquierda del software.
    1. Utilice la herramienta de selección de dedos para seleccionar de 3 a 7 gusanos y haga clic en el botón Detectar gusanos en la ficha Detección .
       NOTA: Esta selección ayuda al software a identificar con precisión los gusanos para condiciones dadas y debe hacerse para cada video. Después de unos segundos, la mayoría de los gusanos se resaltarán en verde y tendrán un número en amarillo. Los gusanos que se tocan o se acurrucan probablemente no se resaltarán; sin embargo, lo más probable es que el programa los encuentre durante el seguimiento. Hay una opción para ajustar los parámetros de detección; sin embargo, los valores predeterminados funcionan bien en la mayoría de las condiciones. Si se realizan ajustes en los parámetros de detección, asegúrese de ser coherente entre las muestras y las réplicas.
26. Aún en la ventana Detectar y rastrear , vaya a la pestaña Seguimiento (Figura suplementaria 2E). En la casilla Parámetros de seguimiento Usar retroceso, desactive Rastrear gusanos en el borde de la imagen.
27. Establezca la hipótesis de seguimiento máximo en 5. Establezca el modo de seguimiento en Natación.
    NOTA: La configuración de hipótesis de seguimiento max ajusta la cantidad de posibles pistas de gusanos que se permite tener a un solo gusano rastreado y le da al programa cierto margen de maniobra en la precisión de rastrear un solo gusano sin perder el rastro de él. 5 es un buen escenario para nadar.
28. Vaya a la sección Configuración avanzada y establezca lo siguiente: Los gusanos marcos pueden tocar el límite: 50, los gusanos marcos pueden superponerse: 500, Tolerancia de posición: 0.50, Tolerancia de forma: 0.50. Guarde esta configuración e impleméntela para todos los vídeos de un experimento (y más allá) guardándolas como configuración.
    NOTA: No se recomienda el filtrado de pistas y se puede hacer fácilmente después del procesamiento, déjelo.
29. Desplácese hasta Configuration Manager (icono de engranaje) en el menú de iconos de la parte superior izquierda. Cuando se haga clic en él, se abrirá el menú de la barra lateral de Configuration Manager . A continuación, haga clic en el icono Guardar (engranaje +), asigne a esta configuración un nombre y una descripción y, a continuación, haga clic en el botón Aceptar .
    1. Para acceder a esta configuración en el futuro, abra el menú Configuración , seleccione la configuración deseada y haga clic en el icono Cargar (flecha hacia arriba). A continuación, agregue información de secuencia, posiblemente ajuste el nivel de umbral y seleccione gusanos para la detección. Todas las demás configuraciones serán las mismas.
30. En el menú Flujo de trabajo , haga clic en Guardar proyecto, compruebe la ubicación de guardado y agregue un nombre de archivo de proyecto (hacer coincidir el nombre del archivo de proyecto con el nombre de vídeo ayuda a la continuidad). Cierra el vídeo.
    Nota : estos proyectos se guardan con el tipo de archivo .wpr.
31. Repetir para todos los vídeos: Importar secuencia de imagen (2.18), Cargar configuración guardada (2.28.1), ajustar el umbral (2.23), establecer información de secuencia (2.19), detectar gusanos (2.24.1), guardar el proyecto (2.29), cerrar vídeo.
32. Seguimiento de vídeos
    1. Para realizar un seguimiento de los archivos del proyecto, vaya al menú Flujo de trabajo y haga clic en el icono Lote (carpeta que contiene páginas de gusano) (Figura suplementaria 2F).
       NOTA: Se mostrará el panel Procesamiento por lotes (Figura suplementaria 2G). A veces está oculto, pero se puede acceder a él en la parte inferior del menú Flujo de trabajo por lotes ; es posible que sea necesario ampliar la ventana para verla.
    2. Haga clic en el botón Agregar en la sección Selección de archivos de este menú Procesamiento por lotes . Desplácese hasta todos los archivos de proyecto (.wpr) que se van a procesar y selecciónelos, haga clic en Abrir.
       NOTA: El menú Procesamiento por lotes se rellenará con la ruta del archivo seleccionado, un indicador de estado y una barra de progreso gris para cada archivo.
    3. Haga clic en inicio ( icono del botón de reproducción). Anote el indicador de progreso verde en el primer archivo. Permita que se procesen todos los archivos. Cuando todos los archivos se leen como terminados (verde), el software se puede cerrar (Figura suplementaria 2G).
    4. Si un archivo de proyecto se atasca, considere ejecutar el archivo colgado por sí mismo, esto generalmente soluciona el problema. Si esto no soluciona el problema, abra el archivo de proyecto, elimine los gusanos seleccionados (menú Detectar y realizar seguimiento ) y vuelva a seleccionar de un nuevo conjunto de entrenamiento. A continuación, vuelva a procesar el archivo de proyecto.
33. Reparación de pistas (recomendado)
    NOTA: La reparación de pistas puede aumentar la precisión de las pistas. Las soluciones comunes son combinar pistas que claramente pertenecen al mismo gusano visto por el ojo humano, eliminar pistas que no son precisas o que no capturan datos reales de gusanos, y dividir pistas que están tergiversadas porque los gusanos se tocan (elimine la sección mala y combine pistas de antes y después de la sección pobre si es práctico).
    1. Abra el software y abra un archivo de proyecto [Archivo | Proyecto Abierto] de interés. Haga clic en Abrir y haga clic en sí para utilizar este archivo. Espere a que se cargue el filtro temporal. El video procesado estará en la pantalla; los gusanos se resaltarán en verde y se delinearán en amarillo. Use el reproductor de video para fregar o reproducir el video.
    2. En el menú Flujo de trabajo , seleccione Detectar y realizar un seguimiento (figura complementaria 2D). Cambie a la pestaña Reparar . Active el cursor Selector haciendo clic en el icono de la herramienta Selector (flecha del cursor). Revise el video, busque y seleccione una pista de gusano y luego use el menú de reparación para crear el cambio deseado.
       NOTA: Para solucionar estratégicamente la mayoría de los problemas rápidamente, acerque el ^{zoom de tal} manera que aproximadamente 1/6 de la placa sea visible, comience con el área que rodea la pista # 1. Revisa rápidamente el video buscando gusanos que aparecen misteriosamente de la nada, rastrea dónde cambian los números o gusanos chocando entre sí, editando a medida que surgen problemas. Siga los gusanos en orden numérico desde la posición inicial. Frote hacia adelante y hacia atrás para seguir cada gusano según sea necesario hasta que se repare toda la placa. Preste mucha atención a los bordes de la placa; a menudo, los gusanos falsos aparecen en las sombras de los bordes de las placas.
34. Análisis de datos
    1. En el menú Flujo de trabajo , seleccione Analizar datos (Figura suplementaria 3A).
       NOTA: Aparecerá una nueva ventana denominada Análisis y trazado de datos (Figura complementaria 3B). Esta ventana tiene muchas formas de evaluar y ver los datos de movimiento de la población de gusanos de un archivo de proyecto específico. La mayoría de estos análisis permiten la selección de gusanos específicos, múltiples o todos de un video determinado, lo que permite que la información de la pista se trace de diferentes maneras.
    2. Para analizar el recuento de giros, vaya al Resumen de la pista [| de posición y velocidad Resumen de la pista] (Figura suplementaria 3C). Use el botón Exportar en la parte inferior derecha para exportar datos en un formato legible de hoja de cálculo (.csv), elija una ruta a la ubicación deseada de la hoja de cálculo, incluido el cambio de nombre a algo memorable. La configuración predeterminada es una buena opción (Figura suplementaria 3D).
    3. Pegue estos datos, así como cualquier otro conjunto de datos relevante del proyecto en un libro de cálculo consolidado (Figura suplementaria 3E).
    4. Utilice el recuento de turnos y la duración de la pista para calcular las vueltas por minuto para cada pista mediante el uso de funciones de hoja de cálculo (= vueltas/duración de la pista * 60) o utilice una métrica diferente según lo desee (Figura suplementaria 3F).
       NOTA: Las vueltas por minuto capturan información muy similar a la de un ensayo manual de thrashing, que es una métrica de actividad en líquido ampliamente utilizada, pero hay muchas opciones, y es muy posible que una métrica diferente pueda identificar otros datos interesantes para un tratamiento o comparación determinados.
    5. Si lo desea, busque el tamaño del gusano, la duración de la pista y / o algunas otras métricas elegidas utilizando herramientas de formato condicional para resaltar las pistas para su eliminación si son potencialmente confusas. Mantenga un procesamiento de datos consistente entre tratamientos y réplicas.
    6. Analice los datos utilizando análisis estadísticos apropiados, como la prueba t de Student para 2 cepas, o ANOVA de 1 vía para 3 o más cepas. Realizar réplicas experimentales independientes en diferentes días y con poblaciones independientes de gusanos durante al menos 3 réplicas experimentales independientes.

Representative Results

Tanto la locomoción radial como los ensayos de natación ofrecen una detección sensible del deterioro de la motilidad (Figura 4 y Figura 5). Para investigar los mecanismos subyacentes al TDP-43 patológico en la ELA, se han desarrollado modelos de C. elegans que expresan TDP-43 humano de tipo salvaje o mutante de ALS pan-neuronalmente. Estos animales presentan características moleculares y celulares que recuerdan a la ELA, incluida la disfunción ^motora9. Es importante destacar que exhiben un deterioro moderado de la motilidad con la expresión de TDP-43 humano de tipo salvaje y un deterioro de la motilidad más grave en animales que expresan TDP-43 mutante de ELA utilizando ensayos de locomoción radial y natación. Algunos animales mutantes o transgénicos tendrán un mayor deterioro en el gateo que en la natación, o viceversa. Mediante el uso de dos ensayos de motilidad diferentes, se obtiene una imagen más clara de las diferencias fenotípicas entre las cepas.

Locomoción radial
Cuando se coloca en un plato de agar con semillas, C. elegans explora su entorno, incluida la búsqueda de los límites de su fuente de alimento. Los ensayos de locomoción radial son una forma de aprovechar ese comportamiento como una métrica para la aptitud física. Al analizar el comportamiento locomotor (gatear sobre una superficie sólida) de manera controlada y cuantificable, el ensayo locomotor radial ofrece una herramienta simple y efectiva para evaluar la gravedad de los déficits motores y otros fenotipos relacionados con la motricidad. Los ensayos de locomoción radial capturan las diferencias en la motilidad en gusanos modelo de ELA con deterioro moderado o grave y ofrecen una línea de base para comparar la modulación de los fenotipos de motilidad o los cambios en la motilidad con la edad (Figura 6). Esta estrategia se puede aplicar para cuantificar el comportamiento de rastreo de cualquier cepa que haya alterado el movimiento de los gusanos de tipo salvaje (N2) o de control. Sin embargo, este método puede no ser una buena opción para evaluar a los animales incapaces de gatear normalmente, como los mutantes de rodillos o los animales que están paralizados. Por lo general, los gusanos de tipo salvaje presentarán un desplazamiento promedio entre 200-300 μm / min cuando se crían y prueban a 20 ° C. Los datos de ejemplo presentados en la Figura 4 muestran resultados esperados comparando N2, dos cepas transgénicas diferentes que expresan TDP-43 humano de tipo salvaje con un fenotipo leve [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] o fenotipo más fuerte [TDP-43(WT-moderado), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], una cepa transgénica que expresa TDP-43 humano mutante con un fenotipo severo [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), y una cepa transgénica que expresa otra proteína asociada a enfermedades neurodegenerativas, tau humana de tipo salvaje [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. Las dos cepas que expresan TDP-43 de tipo salvaje tienen diferentes grados de deterioro según lo detectado por la locomoción radial. TDP-43 (WT-bajo) no es significativamente diferente de N2, mientras que TDP-43 (WT-alto) exhibe claras diferencias en la motilidad. Las cepas TDP-43 (M337V) y tau (WT) tienen deficiencias más graves en la motilidad.

Ensayo de natación
C. elegans se involucra en el movimiento estereotipado de natación (thrashing) cuando se sumerge en líquido. Inmediatamente después de la inmersión, los gusanos comienzan a doblar característicamente la cabeza y la cola entre sí con un ángulo de curvatura de aproximadamente 45 °, siendo el vértice angular el punto medio del gusano. Los gusanos alternan la flexión en las direcciones ventral y dorsal. Un thrash, medido por el software, representa el movimiento de pasar de un ángulo recto a un ángulo de curvatura del cuerpo de 20 ° o más, independientemente de la direccionalidad (el umbral de ángulo se puede ajustar después del procesamiento dentro de la ventana Análisis y trazado [Flujo de trabajo | Analizar datos | | de la forma del cuerpo | de ángulo de flexión | de punto medio Umbral de amplitud: # grados]. El ensayo de natación descrito aquí utiliza el seguimiento y análisis automatizados basados en computadora para proporcionar una puntuación imparcial de la actividad de natación. Se espera que los gusanos de tipo salvaje (N2) promedien entre 150-200 golpes por minuto cuando se levanten y registren a 20 ° C. Los datos de ejemplo presentados en la Figura 5, muestran resultados esperados comparando N2, dos cepas transgénicas diferentes que expresan TDP-43 humano de tipo salvaje con un fenotipo leve [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] o fenotipo más fuerte [TDP-43(WT-moderado), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], y una cepa transgénica que expresa otra proteína asociada a enfermedades neurodegenerativas, tau humana de tipo salvaje [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. La cepa transgénica que expresa TDP-43 mutante de ELA [TDP-43(M337V)] no se golpea en líquido, por lo que se denota en el gráfico como ND (sin datos). Este ensayo puede discriminar diferentes fenotipos que el ensayo de locomoción radial que se muestra en la Figura 4. Por ejemplo, en el ensayo de locomoción radial (Figura 4), TDP-43 (WT-bajo) no fue significativamente diferente de N2. Sin embargo, en el ensayo de natación (Figura 5), tanto TDP-43 (WT-bajo) como TDP-43 (WT-alto) son significativamente diferentes de N2, así como significativamente diferentes entre sí. Además, a pesar de que tanto TDP-43 (M337V) como tau (WT) tienen deficiencias graves de rastreo por locomoción radial (Figura 4), solo tau (WT) puede golpear lo suficiente como para ser rastreado por el software (Figura 5). Los animales TDP-43 (M337V) no pueden golpear, y el análisis basado en software no detecta ni rastrea estos gusanos con precisión. Por lo tanto, no se recopilaron datos sobre estos gusanos (ND, sin datos).

Figura 1: Flujo de trabajo de ensayo de locomoción radial. Los paneles A-E muestran los pasos generalizados del ensayo de locomoción radial. Los pasos son los siguientes: (A) Las placas NGM, con OP50 sembrados en los bordes, se preparan etiquetando y marcando el punto central, (B) los gusanos se colocan en el centro del agar como lo marca el punto central, (C) los gusanos pueden moverse libremente durante un período de tiempo determinado, (D) la placa se voltea de abajo hacia arriba y la ubicación final de cada gusano se marca en un color diferente al punto central, (E) La distancia desde el punto central hasta cada ubicación final del gusano se mide a mano o digitalmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Medición digital de la ubicación final utilizando ImageJ.  Las mediciones de distancia desde el centro se pueden medir a mano o digitalmente, para medir digitalmente utilizando ImageJ (A) escanear la parte posterior de la placa con una regla en el marco. (B) Dibuje una longitud conocida usando la herramienta de línea. (C) Utilice la longitud conocida dibujada en (B) para establecer la escala [Analizar | Establecer escala...]. (D) Utilice la herramienta de línea para dibujar una línea desde el punto central hasta una marca de ubicación final, repita para cada marca. (E) Una línea de pincel que marque la primera marca medida ayuda a la puntuación (línea negra ondulada cerca de la marca 1). Las marcas de ubicación finales están numeradas en amarillo para ilustrar la direccionalidad de la puntuación. (F) Las mediciones se registran en la ventana Resultados. Guarde los resultados en otro lugar para el análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ajustes de materiales y hardware para el uso del software. (A) Materiales utilizados para el ensayo de natación asistido por software. (B) Configuración general del software y los materiales necesarios, tenga en cuenta que la carcasa está en la posición elevada. (C) La altura del soporte de montaje de la lente se puede ajustar. Esta imagen muestra la pista ajustable y un indicador de cinta que marca la altura preferida para realizar ensayos de natación. Es necesario ajustar la luz de campo brillante y el enfoque de la cámara antes de grabar. (D) Se coloca una placa de ensayo de 35 mm en el escenario, se agregan animales en M9 a la placa y se inicia un temporizador de 1 minuto. (E) A veces es ventajoso girar suavemente la placa para mover los gusanos más cerca del centro: observe la ubicación en la pantalla de captura en vivo; alternativamente, se pueden usar unas gotas de M9 de un pipeteador para separar gusanos. (F) Ajuste el anillo de enfoque en la lente de la cámara, observe los gusanos en la pantalla para determinar el enfoque óptimo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los ensayos de locomoción radial detectan diferencias en la velocidad de rastreo. La dispersión no estimulada de larvas L4 en etapa de desarrollo se midió utilizando el ensayo de locomoción radial descrito anteriormente y se graficó como μm / min viajado (A-B). Los mismos datos trazados en (A) y (B) demuestran dos posibles presentaciones gráficas diferentes. En (A), los datos se muestran como un gráfico de barras, lo que hace que las diferencias relativas entre las cepas sean más claras. En (B), el desplazamiento final de cada gusano se grafica dentro del gráfico, lo que permite visualizar mejor la variación dentro de la población. Para evaluar la significación entre las cepas probadas, se utilizó el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey. **p=0.0022, ****p<0.0001, ns=no significativo. TDP-43 (M337V) y tau (WT) también son significativamente diferentes de N2, p<0.0001. Las barras de error en (A) son errores estándar de la media (SEM) y en (B) son desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Los ensayos de natación detectan diferencias de golpeo en líquido. Las tasas de natación (frecuencia de golpeteo o ondulación en líquido) se midieron utilizando la puntuación y el análisis imparciales asistidos por computadora descritos anteriormente y se graficaron como golpes / min (A-B). Mismos datos trazados en (A) y (B). En (A), los datos se grafican como un gráfico de barras, lo que hace que las diferencias relativas entre las cepas sean más fáciles de ver. En (B), los datos de cada gusano individual puntuado se trazan dentro del gráfico, lo que permite visualizar mejor la variación dentro de la población. Para evaluar la significación entre las cepas probadas, se utilizó un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey. p<0,0001, ns=no significativo. TDP-43(WT-moderado) y tau(WT) también son significativamente diferentes de N2, p<0.0001.Las barras de error en (A) son errores estándar de la media (SEM) y en (B) son desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Los gusanos mutantes TDP-43 viajan menos que los gusanos de tipo salvaje. Placas que muestran una diferencia representativa en la ubicación final de L4 N2 (tipo salvaje) y TDP-43 (M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), una cepa que expresa TDP-43 humano mutante con una función motora gravemente deteriorada después de 1 hora de gateo no estimulado a temperatura ambiente. Las placas están marcadas con un punto rojo para el punto central y puntos azules para la ubicación final de los animales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Registro del comportamiento de natación utilizando el software de imágenes y seguimiento. (A) El flujo de trabajo de seguimiento y la ubicación del icono de captura de vídeo. (B) La ventana Captura de video se muestra en Live View y se resaltan los aspectos más importantes. Las palabras verdes "Vista en vivo" cambiarán a una "Grabación" roja cuando se active el botón de grabación. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Preparación y seguimiento del comportamiento de natación. Esta figura muestra una serie de capturas de pantalla para ayudar a configurar una secuencia de imágenes de video para el seguimiento. El protocolo general para preparar una secuencia de vídeo es abrir cada menú de flujo de trabajo en este orden: Importar secuencia de | Establecer información de secuencia | Ajustar | de imagen Detectar y rastrear | Guardar proyecto. La ventana Analizar datos solo se puede usar después de realizar un seguimiento de un archivo de proyecto. (A) muestra un archivo de .avi (video) abierto después de importar la secuencia al software desde el flujo de trabajo track . (B) La ventana Establecer información de secuencia proporciona un lugar para notas, establecer/cambiar la escala y verificar los metadatos de una secuencia de video. Las instrucciones para cambiar la escala se encuentran en esta ventana y deben seguirse cuando la cámara se baja o se eleva (B). Imagen (C) muestra la configuración de la ventana Ajustar imagen . (D) Captura de pantalla que muestra la pestaña de detección de la ventana Detectar y rastrear . La detección de gusanos se utiliza para entrenar el software y debe configurarse para cada secuencia de video. Se pueden establecer parámetros de detección adicionales aquí si se desea. (E) Captura de pantalla de la pestaña Seguimiento de la ventana Detectar y rastrear con la configuración recomendada para rastrear el comportamiento de la natación. Este es el último paso para configurar una secuencia de video. Guarde la secuencia como un proyecto mediante la ventana Guardar proyecto . Repita estos pasos para cada secuencia de vídeo. La configuración se puede guardar como una configuración para reducir la carga de trabajo y garantizar que todas las secuencias se traten de la misma manera (no se muestran). Para realizar un seguimiento de los archivos de proyecto para su análisis, vaya al flujo de trabajo por lotes . (F) muestra el icono utilizado para navegar al flujo de trabajo por lotes , y (G) muestra la ventana de procesamiento por lotes, resalta los botones de agregar e inicio y muestra la apariencia esperada de un archivo de proyecto del que se ha realizado un seguimiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Análisis del comportamiento de la natación. Después de realizar un seguimiento de un archivo de proyecto, se puede abrir utilizando [File | Abrir proyecto]. Los gusanos aparecerán en verde como se muestra en (A). Fregar a través del video ofrece una verificación rápida de que el video procesado como se esperaba, el resaltado verde desaparecerá durante el fregado. La ventana Análisis y trazado de datos se abre desde el elemento Analizar flujo de trabajo de datos . (B) muestra la ventana Análisis y trazado de datos con la vista Posición abierta (predeterminada), todas las pistas están resaltadas. Debajo de los puntos de datos hay una gráfica que muestra la pista grabada para cada gusano resaltado. El análisis de resumen de pista se utiliza para calcular los giros por minuto. (C-D) mostrar el informe de resumen de la pista y los detalles de exportación. (E-F) muestra el resumen de la pista en una hoja de cálculo y cómo calcular los turnos por minuto, la salida medida en este ensayo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Locomoción radial:
La resolución de este ensayo se controla fácilmente cambiando la variable de tiempo. El aumento de la duración del tiempo hace que sea más fácil observar las diferencias entre animales con fenotipos severos, identificando así diferencias sutiles. Sin embargo, debido a que este ensayo mide el desplazamiento, si el tiempo de ensayo se extiende demasiado tiempo, los animales con motilidad normal, como N2, viajarán a los bordes de la placa, y el comportamiento de búsqueda de alimento conducirá a un retroceso. Esto disminuirá artificialmente la medición de la distancia recorrida. Los períodos de tiempo que son demasiado largos pueden resultar en la desaparición de las diferencias entre las cepas, particularmente entre animales con fenotipos motores menos graves, ya que los animales se dispersan uniformemente a través de la placa. Acortar la variable de tiempo evitará que los gusanos más activos encuentren los bordes de la placa. Este método no rastrea la distancia total recorrida para cada gusano, sino que comprime la distancia recorrida para cada gusano en una distancia lineal desde el centro de la placa. Como tal, es inherentemente menos robusto que un método que registra la longitud total de la pista de gusanos individuales. Sin embargo, el ensayo de locomoción radial requiere muy poca capacitación de investigadores, utiliza reactivos relativamente asequibles que están comúnmente disponibles en la mayoría de los laboratorios de gusanos y es lo suficientemente sensible como para producir resultados significativos y reproducibles. Para los laboratorios que prefieren el seguimiento automatizado por video, se han establecido previamente varios métodos para rastrear y analizar los movimientos de ^rastreo12, o los parámetros de software utilizados para el ensayo de natación en este documento podrían modificarse para permitir la detección y el análisis de rastreo.

Este experimento generalmente se realiza en réplicas independientes triplicadas, con un conjunto de 30-40 gusanos por réplica. Cada réplica se divide en dos placas diferentes de 100 mm o 150 mm, con 15-20 gusanos por placa. El uso de más gusanos de los recomendados por placa puede dificultar la puntuación eficiente. Un número total puntuado de más de 90 tiene el poder suficiente para establecer la importancia del deterioro de la motilidad leve, moderado o grave. Ser consistente con el tiempo entre las cepas anotadas es esencial para la precisión y la reproducibilidad. 30 minutos es generalmente lo suficientemente largo como para establecer diferencias entre fenotipos moderados a severos, como cepas transgénicas que expresan TDP-43 mutante humano en comparación con gusanos de tipo salvaje (Figura 4). Si la variable de tiempo se extenderá, es recomendable aumentar también el tamaño de la placa de 100 mm a 150 mm. Los factores ambientales como la temperatura y la humedad pueden afectar este ensayo, que generalmente se realiza a temperatura ambiente, por lo que es importante usar siempre un control de tipo salvaje (N2) al comparar entre réplicas. Además, este ensayo puede medir la motilidad de algunas cepas que no exhiben un comportamiento normal de natación en líquido (thrashing), por lo que es un complemento útil para el ensayo de natación.

Ensayo de natación:
El uso del sistema de imágenes y adquisición para automatizar el seguimiento y el análisis de la natación de gusanos permite datos rigurosos e imparciales. Sin embargo, hay varios factores durante la configuración inicial del experimento que deben controlarse entre muestras. Estos incluyen el tiempo para aclimatarse al líquido antes de comenzar la grabación, las condiciones ambientales (es decir, la temperatura, la humedad) y la configuración constante de luz y grabación. En la etapa de grabación, hay varias características que ayudan a reducir la variabilidad entre placas. Estos incluyen una cámara integrada montada en la pista y una etapa de campo brillante que hace que la grabación de video sea consistente entre placas, blindaje alrededor del escenario que evita reflejos, deslumbramientos y movimientos de aire durante la grabación, y un paquete de software robusto que detecta gusanos de manera confiable y permite la corrección manual de pistas en el posprocesamiento de video. En este protocolo, los videos de una placa de 35 mm con gusanos se graban durante 1 minuto y luego se procesan utilizando el paquete de software. Después del procesamiento, la corrección manual de las pistas garantiza que los comportamientos de los gusanos se registren con precisión sin confundir los errores de seguimiento. Los datos de recuento de turnos y duración del seguimiento se utilizan para determinar las vueltas por minuto como lectura final. Para garantizar la reproducibilidad, los datos se recopilan en un mínimo de 3 experimentos replicados independientes, cada uno con 40-50 animales puntuados, para lograr un número final combinado de animales 120-150. Este número es suficiente para discriminar pequeñas diferencias en el comportamiento de natación de los gusanos de control. Algunos gusanos tienen déficits motores demasiado graves para ser capturados por ensayos de natación. Por ejemplo, si los animales se colocan en un rizo medio líquido en lugar de realizar la respuesta de golpeteo esperada, este ensayo no registrará esos movimientos con precisión y otro ensayo de movimiento, como la locomoción radial, puede capturar mejor esos defectos de motilidad. El protocolo proporcionado utiliza un sistema de imágenes disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), pero otros sistemas de seguimiento de gusanos pueden proporcionar una utilidad similar, y algunos son de código ^abierto12. Los métodos publicados anteriormente describen la puntuación manual de la golpiza de ^gusanos13. Si bien el análisis automatizado produce una serie de métricas para cada gusano individual, la detección de curvas corporales, que se mide en golpes por minuto, proporciona resultados consistentes entre experimentos y rastrea bien la puntuación convencional de los golpes de gusano a ojo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	-	Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass	VWR	14673-010	Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.
Disposable petri dishes, 35x10mm	VWR	10799-192	Assay plates for WormLab Imaging System
Disposable petri dishes, 60x15mm	VWR	25384-090	Stock plates for worms
Disposable petri dishes, 100x15mm	VWR	25384-302	Standard radial locomotion assay plate
Disposable petri dishes, 150x15mm	VWR	25384-326	Longer time frame radial locomotion assay plate
Dissecting microscope	Leica	M80	Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays
Fine-tipped markers	VWR	52877-810	Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.
Flatbed Scanner	Amazon	Epson Perfection V850	Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine
ImageJ	NIH	-	Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
M9 buffer	VWR	IC113037012	Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
NGM (Nematode Growth Medium)	VWR	76347-412	Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
OP50  bacteria	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Primary food source for C. elegans
p1000 pipettor	VWR	76207-552	Pipettor, used in swimming assay
p1000 tips	VWR	83007-384	Tips for pipettor, used in swimming assay
Platinum wire, 0.2032mm diameter	VWR	BT136585-5M	Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.
Ruler	VWR	56510-001	Need to score radial locomotion assays
WormLab Imaging System	MBF Bioscience	WormLab	The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system