Summary
该协议概述了在保留心包及其内容物的同时诱导小鼠心肌梗死的步骤。
Abstract
该方案表明，心包及其内容物在缺血性啮齿动物模型中起着重要的抗纤维化作用（冠状动脉结扎诱导心肌损伤）。大多数临床前心肌梗死模型需要破坏心包完整性并失去稳态细胞环境。然而，最近我们开发了一种诱导心肌梗塞的方法，该方法最大限度地减少心包损伤并保留心脏的常驻免疫细胞群。已经观察到冠状动脉结扎后心包间隙完整的小鼠的心脏功能恢复得到改善。该方法为研究心肌梗死后心包间隙的炎症反应提供了机会。标记技术的进一步发展可以与该模型相结合，以了解心包免疫细胞在调节驱动心脏重塑（包括纤维化）的炎症机制方面的命运和功能。
Introduction
时至今日，心血管疾病（CVD）仍被公认为全球主要死亡原因，导致巨大的经济负担和患者生活质量的降低1。冠状动脉疾病（CAD）是CVD的一种亚型，在心肌梗死（MI）的发展中起着至关重要的作用，心肌梗死是导致死亡的主要原因。根据定义，心肌梗死是由于长时间缺血和缺氧对心肌组织造成不可逆损伤所致。心肌组织缺乏再生能力，因此损伤是永久性的，并导致心肌被纤维化疤痕取代，纤维化疤痕最初可以起到保护作用，但最终会导致不良心脏重塑和最终的心力衰竭2。
尽管CAD患者的管理在过去几十年中得到了显着改善，但继发于缺血的慢性心力衰竭（CHF）影响着全世界的许多患者。为了预防和管理这种流行病，有必要更广泛地了解潜在的机制并开发新的治疗方法。此外，过去的研究结果强调了全身治疗的局限性以及开发精确替代方案的必要性。鉴于研究人类心肌梗死的分子后遗症受到进入梗死组织的能力的影响，概括与CVD相关的人心肌梗死和充血性心力衰竭的特征和发展的动物模型是必不可少的。
由于理想的动物模型在结构和功能特征上与人类疾病非常相似，因此疾病病因应指导其概念。在冠状动脉疾病中，它是冠状动脉的慢性动脉粥样硬化性狭窄或急性血栓性闭塞。已经开发并应用于各种实验动物的不同方法，以诱导冠状动脉狭窄或闭塞。这些策略大致可分为两组：（1）机械操作冠状动脉以诱发心肌梗死和（2）加速动脉粥样硬化以促进冠状动脉狭窄导致心肌梗死。第一种策略通常涉及结扎冠状动脉或在动脉内放置支架。第二种方法倾向于改变动物的饮食以包括高脂肪/胆固醇食物。后一种方法的一些局限性包括缺乏对冠状动脉闭塞的时间和部位的控制。
相比之下，在动物模型中手术诱导心肌梗死或缺血有几个优点，例如冠状动脉事件的位置、精确的时间和范围，从而获得更可重复的结果。最广泛使用的方法是手术结扎左前降冠状动脉（LAD）。这些模型概括了人类对急性缺血性损伤的反应，以及进展到CHF 3。LAD手术最初是在较大的动物身上开发的，随着技术的进步，对啮齿动物等小动物的LAD手术变得更加可行4。在建立这样的模型时，小鼠由于各种原因而受到青睐，包括它们的相对可用性，住房费用低以及遗传操作能力。
使用LAD闭塞的缺血性心脏病的当代手术模型要求研究人员打开心包以暂时或永久地结扎动脉5。这种策略导致心包空间的破坏，心包空间基本上起着机械和润滑功能，以确保正常的心脏功能。打开心包的另一个缺点是失去动物的天然心包液及其各种细胞和蛋白质成分6，7。作为回应，我们开发了一种在保持心包完整的同时诱导心肌梗死的方法。除了最大限度地减少这种稳态环境的扰动外，这种方法还允许在引起心肌梗死后标记和追踪特定细胞。此外，这种方法更好地代表了人类环境中的心肌缺血性损伤。
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Protocol
8-14周龄的雄性和雌性C57BL / 6J小鼠用于这些实验。该协议已获得卡尔加里大学动物护理委员会的伦理批准，并遵循所有动物护理指南。
1. 小鼠准备和手术
- 对手术工具进行消毒（通过珠状消毒器或高压灭菌器）。
- 称量小鼠术前体重和镇痛剂量。
- 将小鼠置于具有4%异氟醚和800mL / min氧气的诱导盒中。通过捏住脚趾并观察动物缺乏反射来确认麻醉平面。
- 皮下注射镇痛药（0.1mg / kg丁丙诺啡）（见 材料表）。
- 在手术过程中将鼠标放在加热的手术垫上，并通过鼻锥输送3%异氟醚保持麻醉。涂抹眼药膏以避免每只眼睛干眼。
- 剃掉胸部和颈部手术区域的头发。
- 约束鼠标的爪子并将它们放在手术台上。
- 通过将光滑的尖端 23 G 导管通过口腔和咽部插入气管来插管小鼠。
- 插管后用2%异氟醚和100%氧气作为载气，使用商用呼吸机（参见 材料表）以110次呼吸/分钟的速率，250μL的潮气量和4mmHg的呼气末正压（PEEP）给小鼠通风。
- 将鼠标在其右侧滚动 30%，以定位胸部左侧以进行手术。
- 用3个70%乙醇和甜菜碱的交替擦洗以圆周运动清洁手术区域（见材料表）。在手术区域周围放置无菌手术单。
- 在胸部皮肤上做一个2-3厘米的横向切口，以观察左侧的胸大肌。使用从中线向外切开 1 厘米的切口切开胸大肌和小胸肌，以观察第三和第四肋骨之间的肋间肌肉。
注意：应注意避免胸大肌通过烧灼出血血管而过度出血。 - 在左肋间肌上做一个2厘米的切口，将空气（通过被动空气运动）引入胸腔，使心脏和肺部脱离手术切口。此外，在烧灼装置（见 材料表）的帮助下扩大开口以切开肋间并防止出血
注意：在烧灼期间应暂时停止呼吸机，以避免与氧气发生爆炸反应。注意不要损坏心包囊。 - 使用牵开器，缩回肋骨以暴露心脏。
- 在体视显微镜下观察心包和下面的心脏。
注意：小鼠心包足够薄，可以观察心脏的脉管系统。 - 轻轻地将镊子放在心包表面，以减少其运动和潜在心脏的运动。
- 通过追踪左前降 （LAD） 冠状动脉从左附件下方的出现，在视觉上标记它。
- 使用微针驱动器，引导适当的缝合线（见 材料表）穿过LAD下方的心包，缝合线出现在LAD和心包的另一侧。绑住缝合线以限制通过冠状动脉的血流，并在剪刀的帮助下修剪多余的缝合线（图1A）。
注意：在限制流向冠状动脉的血流时，左心室前部的褪色应该是可见的。此过程表示永久性连接模型。然而，在这个阶段也可以应用具有不同缺血期的瞬时结扎方法。 - 在无菌区域内的切口部位下方，将24G导管经皮引入胸部（进入胸腔后取出导针）。然后，使用适当的缝合线（用于肌肉的锥形针，用于皮肤的传统切割针）闭合肋骨，然后关闭肌肉层和皮肤。
- 关闭胸部后，使用 3 mL 注射器轻轻抽吸和胸外按压，通过 24 G 导管排出胸腔中的剩余空气。去除空气后，取出 24 G 导管。
- 将异氟醚降低至1%。
- 关闭异氟醚，同时保持氧气通气，使小鼠从麻醉中恢复。一旦动物出现独立呼吸的迹象，从嘴里取出 23 G 气管插管并将小鼠放入恢复笼中以监测恢复正常呼吸。
- 让小鼠在笼子中恢复，将笼子的一部分放在加热垫上以提供外部热源。
- 手术后72小时每12小时提供镇痛药（丁丙诺啡0.1mg / kg，皮下注射）的维持注射。
- 每天监测小鼠的健康状况，持续7天，包括评估切口和动物不适。
注意：由于此手术（开胸术）的侵入性，可能需要使用抗生素。
2. 超声心动图（ECG）心脏功能评估
- 用1.5-2%异氟醚和800mL / min氧气诱导和维持小鼠全身麻醉。
- 将鼠标仰卧放在加热的载物台平台上，并将爪子连接到ECG导联线。
- 剃掉老鼠的胸部。
- 使用40 MHz线性换能器探头和接触凝胶采集超声心动图图像，并使用适当的软件进行分析（参见 材料表）。
- 关闭异氟醚，让鼠标在加热平台上恢复，然后再将笼子恢复到活动状态。
注意：超声心动图评估是非侵入性的，因此可以在整个实验过程中纵向进行，以确定冠状动脉结扎前后的变化。
3. 用于纤维化染色的心脏组织采集
- 用吸入100%CO2 处死小鼠并仔细解剖心脏。
注意：使用剪刀和镊子，这是通过切开进入（腔静脉，肺静脉）和离开（肺动脉，主动脉）心脏的大血管来实现的，以将其从胸腔中的循环系统中释放出来。 - 将心脏固定在10%福尔马林中至少24小时。
- 使用直剃刀刀片穿过右心室、室间隔和左心室切割样本，确保切口穿过梗死区的中心。然后将样品送到岩心设施进行石蜡包埋。
- 用切片机切割5μm厚的组织切片，并将它们放在载玻片上进行染色。
- 使用商业二甲苯和分级酒精洗涤液（2x 99%，1x 95%，1x 70%）用去离子水脱蜡，然后再水化。
- 在室温下用苦味酸中的0.1%天狼星红染色2小时。
- 用0.5%乙酸洗涤切片3分钟，然后用70%乙醇冲洗1分钟。
- 使用3.4中概述的洗涤顺序对切片进行脱水，增加和分级乙醇浓度，然后是二甲苯。
- 用安装溶液（见 材料表）安装组织切片以进行显微镜评估。
4.心包腔灌洗的流式细胞术
- 用吸入100%CO2 处死小鼠以达到效果。
- 将鼠标放在其背上，并使用胶带将手臂和腿固定在手术板上。
- 小心地打开胸腔的左侧（从实验者的角度来看右侧），首先将横膈膜切到中点左右，然后穿过外肋向胸骨。
注意：避免划伤大血管，尤其是与胸骨平行的血管。 - 使用止血器回缩肋骨，露出下面的心脏和心包。
注意：心包非常脆弱，因此在切割过程中一定不要用剪刀抓住它。 - 使用插入左心房和左心室交界处附近的心包腔的PE-10管（见 材料表）导管，将100μL无菌盐水注入心包腔。
- 让生理盐水从心脏后侧积聚和收集，注意不要在此过程中刺穿或撕裂心包。重复此步骤两次，并在处理心脏时将灌洗液放在冰上。
- 通过切割进出心脏的主要血管（主动脉、肺动脉、静脉和腔静脉）来切除心脏。切除左右心房，称量心室心脏组织。
- 使用剪刀将组织切成1mm2 小块，并放入含有450U / mL胶原酶I，125U / mL胶原酶XI，60 U / mL DNase I和60 U / mL透明质酸酶的10 mL消化缓冲液中PBS在37°C的轨道摇床上1小时。
- 使心脏组织匀浆通过70μm细胞过滤器（参见 材料表），并在4°C下以60× g 旋转5分钟以除去心脏实质细胞。
- 收集上清液，通过40μm细胞过滤器（参见 材料表）进行单细胞悬液，并在4°C下以400× g 旋转5分钟以沉淀细胞。
- 如前所述，对心包和心脏细胞上的细胞标志物进行片段结晶（Fc）受体阻断和染色8。
- 在流式细胞仪上运行样品。
5. 使用肋间胸膜间隙入路 （ICAPS） 方法标记心包巨噬细胞9
- 开始前对手术工具进行消毒（通过珠状消毒器或高压灭菌器）并喷洒 70% 乙醇。
- 用1.5-2%异氟醚和800mL / min氧气诱导和维持小鼠全身麻醉。通过捏住脚趾并观察动物缺乏反射来确认麻醉平面。
- 皮下注射镇痛药（丁丙诺啡0.1mg / Kg）。
- 在手术过程中将鼠标放在加热的手术垫上。
- 剃除右侧前外侧胸部区域。
- 用乙醇和倍他定清洁手术区域。
- 在皮肤上做一个3厘米长的切口，用镊子露出肋骨。
- 将 5 μL 荧光珠（市售荧光微球，1 μm，参见 材料表）和 45 μL 生理盐水加载到带有斜面尖端的 PE-10 管路注射器导管中。
- 如前所述将导管引导到肋间隙9，缓慢注入珠子溶液并以一个动作取出导管。
- 使用订书钉关闭皮肤。
注意：使用订书钉代替缝合线，以尽量减少切口可能重新打开的可能性。 - 关闭异氟醚，将小鼠放入恢复笼中，并在前24小时内监测并发症。
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Representative Results
这种改良的冠状动脉结扎模型已经过优化，可实现可重复性和动物存活。然而，由于心脏引起的严重损伤，一些预期的术中和术后死亡率与手术有关。男性的标准死亡率（~25-35%）通常高于女性（~10-15%）。
通过改良冠状动脉结扎术成功诱导心肌梗死应通过心脏功能参数和结构特征的变化来证明。对于功能，在心肌梗死后3-4周内，通过超声心动图评估的左心室（LV）射血分数等参数的降低将很明显（图1A）。这些功能变化应伴有左心室游离壁的显着纤维化，如组织学染色（如picrosirius red（PR）（图1B）。对于此分析，使用通过梗死的纵向横截面应可以表示梗死区域，梗死周围和心脏的远端区域。
在整个手术过程中保持完整的心包为研究心包腔中并发的炎症反应提供了机会。它还允许确定该隔室内的免疫细胞如何促进正在进行的重塑过程。将荧光珠标记方法与流式细胞术分析相结合，提供了一种追踪高选择性驻留 Gata6+ 心包巨噬细胞 （GPCM） 的方法。该过程涉及将珠子直接注入胸膜腔。由于这两个腔之间的通信，这些同样被胸膜和心包腔中的常驻Gata6巨噬细胞吸收（图2A）10。重要的是，在心脏或血液中几乎不应该检测到标记（图2A）。一旦标记，可以通过流式细胞术（图2B）和/或成像跟踪炎症挑战（如MI）后细胞的重新定位。为避免ICAPS程序的任何潜在炎症影响，应在后续干预前一周进行此标记。
图 1：完整的心包冠状动脉结扎模型诱导心脏功能和结构改变。 （A）心包破裂或完整动物在基线或冠状动脉结扎后4周的示意图时间表和左心室射血分数定量。数据表示为标准偏差±平均值。 ***= p < 0.001，*= p < 0.05 与基线，单因子方差分析。改编自 Deniset JF 等，经爱思唯尔8 许可。（B）使用破坏或完整的心包冠状动脉结扎模型在梗死后4周小鼠心脏横截面中皮克罗西里乌斯红色纤维化染色的代表性图像和定量。 请点击此处查看此图的大图。
图2：心肌梗死后心包腔巨噬细胞的标记和追踪 。 （A）使用ICAPS方法局部注射荧光珠后基线或7天时含有来自胸膜腔，心包腔，心脏组织和血液的髓系细胞的荧光珠的代表性流式细胞术图。底板 - 将心包腔中的磁珠和细胞表征为主要为 Gata6+ 心包巨噬细胞 （GPCM）。（B）心包腔和心脏中荧光珠标记的心包骨髓细胞的流式细胞术分析和定量，伴或不伴MI。 *= p < 0.05，** = p < 0.01。改编自 Deniset JF 等，经爱思唯尔8 许可。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在啮齿动物封闭的心包中诱导心肌梗死是独一无二的，并且可能具有潜在的重要应用。该手术在很大程度上依赖于外科医生对啮齿动物模型和啮齿动物心脏解剖学的熟悉程度。成功还取决于在三个关键步骤中给予的护理：肋间肌切口和肋骨回缩（步骤1.11-1.13），产生梗死（步骤1.17）和动物恢复（步骤1.22-1.24）。
开胸术必须认真进行，以避免刺穿或撕裂心包。该方案最关键的一步是缝合LAD以诱发梗死。与所有 LAD 结扎模型一样，在 LAD 上适当放置结扎缝合线至关重要：近端结扎可能导致致命性心肌梗死，而远端结扎可能不会引起功能相关的心肌梗死。 在心脏的近似中心标记 LAD 可避免这些问题。由于LAD结扎是在心脏跳动时进行的，因此用镊子轻轻地稳定心脏可以帮助减少运动，从而可以在不损坏LAD的情况下缝合LAD。在此过程中，心外膜上的小血管撕裂伤可能发生。轻微出血将在 2-3 天内消退，不会污染心包液。啮齿动物心包，特别是在小鼠中，非常薄，如果外科医生不谨慎，很容易撕裂。最后，操作人员必须在手术后（即恢复）阶段密切关注动物。停用异氟醚和移除气管插管的时机必须有条不紊地进行，以确保啮齿动物能够自我通气。小鼠在恢复后也应进行监测，以确保在进入动物饲养设施之前没有需要立即干预的术后并发症。这些并发症的例子包括血胸、气胸和麻醉后无法恢复意识。
目前大多数小鼠MI模型需要打开心包才能结扎LAD，导致心包不完整。本模型是独一无二的，因为它在梗死期间保留了心包间隙的稳态方面，因此提供了更具临床相关性的心肌梗死表示。 与分割心包的程序相比，维持心包间隙可改善小鼠心脏的功能特征。保存天然心包液也为研究可能性和梗死愈合提供了显着的益处。心包内压显著11，12，而心包液含有促进非纤维化愈合途径的蛋白质13。最近的研究表明，驻留在心包液中的巨噬细胞在心脏组织的修复和愈合中也起着至关重要的作用8。目前的协议提供了一种特定的标记方法来跟踪这些巨噬细胞在MI后的命运。心包空间内的其他细胞也可以进行类似的标记，以评估它们在心脏重塑中的作用。维持心包的动物模型可以更好地保留这些关键通路，使它们更准确地代表患者的病理生理学和愈合过程。
该模型允许用户研究和操纵整个心包空间，从而增强探索心包细胞介导的复杂愈合和炎症途径的研究。该模型还为不专注于心包间隙的研究提供了改进的啮齿动物梗死模型。保留的心包损伤通路使梗死具有更多的人类相关性。由于其技术性质，该模型的重大局限性在于用户技能。如果外科医生不精通组织处理和手术技术，错误可能导致心包撕裂或死亡。最后，为了利用该协议的优势，用户应该能够使用已建立和先进的成像方式，例如超声心动图和显微镜。
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Disclosures
作者没有需要披露的冲突。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141, 139 (2020).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. 52, 2581 (2011).
- De Villiers, C., Riley, P. R. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).
- Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment. JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).
- Pfaller, M. R., et al. The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).
- Deniset, J. F., et al. Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis. Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).
- Weber, G. F. Immune targeting of the pleural space by intercostal approach. BMC Pulmonary Medicine. 15, 14 (2015).
- Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities. The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).
- Tyberg, J. V., et al. The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study. Circulation. 73, 428-432 (1986).
- Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study. The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).
- Park, D. S. J., et al. Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).
