यह प्रोटोकॉल एनेस्थेटाइज्ड चूहों में पास के रक्त वाहिकाओं से मस्तिष्क एनेस्थिंग पेरिसाइट्स और रक्त प्रवाह डेटा से फ्लोरोसेंट कैल्शियम छवियों को प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए कदम प्रस्तुत करता है। ये तकनीक भित्ति कोशिका शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं और किसी भी कोशिका प्रकार में कैल्शियम यात्रियों की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
प्रोटीन जीव विज्ञान और माउस जेनेटिक्स में हाल ही में हुई प्रगति ने वीवो में मस्तिष्क कोशिकाओं के इंट्रासेलुलर कैल्शियम के उतार-चढ़ाव को मापना और स्थानीय हेमोडायनामिक्स के साथ इसे सहसंबंधित करना संभव बना दिया है। यह प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करता है जिन्हें एक पुरानी कपाल खिड़की के साथ तैयार किया गया है और α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन प्रमोटर के तहत आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर, RCaMP1.07 को विशेष रूप से भित्ति कोशिकाओं को लेबल करने के लिए व्यक्त करता है, जैसे कि संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और एनेथिंग पेरिसाइट्स। रक्त प्रवाह का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के नसों में इंजेक्शन के लिए पूंछ नस कैथेटर तैयार करने के तरीके के साथ-साथ मस्तिष्क पेरिसाइट कैल्शियम और स्थानीय रक्त वाहिका हीमोडायनामिक्स (व्यास, लाल रक्त कोशिका वेग, आदि) को केटामाइन/जाइलाज़ीन एनेस्थेट में कपाल खिड़की के माध्यम से वीवो में दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा कैसे मापने के लिए कदम रेखांकित किए गए हैं । अंत में, बैरेट एट अल 2018 द्वारा विकसित छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के माध्यम से कैल्शियम में उतार-चढ़ाव और रक्त प्रवाह फिल्मों के विश्लेषण के लिए विवरण प्रदान किए जाते हैं, जिसमें इस बात पर जोर दिया जाता है कि इन प्रक्रियाओं को अन्य सेलुलर इमेजिंग डेटा के अनुकूल कैसे किया जा सकता है।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र वाक्यूलेचर में मर्मज्ञ धमनियों, केशिकाओं और आरोही वेणुओं के होते हैं। इस नेटवर्क के भीतर, भित्ति कोशिकाएं जैसे संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं धमनियों को एनकेस करती हैं और पेरिसाइट्स पहली धमनियों की शाखाओं और केशिकाओं1के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं का विस्तार करती हैं। पेरिसाइट्स में मस्तिष्क के भीतर कई भूमिकाएं दिखाई देती हैं जिनमें रक्त-मस्तिष्क-बाधा1,2,माइग्रेशन और गतिशीलता3,संभावित स्टेम-सेल गुण, और मस्तिष्क रक्त प्रवाह4,5, 6का विनियमन शामिल है। पेरिसाइट्स की कई कार्यात्मक भूमिकाओं को इंट्रासेलुलर कैल्शियम में उतार – चढ़ाव से जोड़ा गया है जो इन कोशिकाओं के फैलाव या संकुचन को विनियमित कर सकता है4,5,6.
हाल के कई अध्ययनों में विभिन्न प्रकार के मस्तिष्क परिग्रहों की पहचान करने के लिए मानदंड निर्धारित किए गएहैं. मर्मज्ञ धमनियों की पहली 4 शाखाओं के भीतर भित्ति कोशिकाएं अनुबंधित प्रोटीन α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (αSMA) और उनके फैलाव, ओवॉयड सोमा की प्रक्रियाओं के साथ उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर पेरिसाइट्सको एनेस्थेट कर रही हैं जो7,8,9के चारों ओर घूमते हैं। पेरिसाइट्स को एनशिथिंग में कैल्शियम के उतार-चढ़ाव की कल्पना करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक उपन्यास ट्रांसजेनिक माउस लाइन, Acta2-RCaMP1.07 का उपयोग करता है, जिसे टीजी (RP23-370F21-RCaMP1.07) B3-3Mik/J10के रूप में भी जाना जाता है । ये चूहे लाल आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक, RCaMP1.07, αSMA में कोशिकाओं को व्यक्त करते हुए व्यक्त करते हैं (संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं और एनशेथिंग पेरिसाइट्स)। प्रजनन उपनिवेशों को हेमिज़िगोट्स के साथ गैर-ैरियर जानवरों को पार करके बनाए रखा जाता है। RCaMP1.07 एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जिसमें एक शांत रंग बाध्यकारी डोमेन है, जो इंट्रासेलुलर कैल्शियम10, 11के लिए बाध्यकारी होने पर फ्लोरेसेंस बढ़ाता है। यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट रंगों के पूंछ नस इंजेक्शन के लिए प्रक्रियाओं सहित दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा एनशीथिंग पेरिसाइट्स और रक्त प्रवाह माप के संयुक्त कैल्शियम इमेजिंग के लिए कदमों को रेखांकित करता है, एनेस्थेटाइज्ड चूहों में माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण, और प्रोग्रामिंग प्लेटफार्मों के साथ डेटा विश्लेषण(चित्र 1)। ये तकनीक भित्ति कोशिका शरीर विज्ञान के बारे में सवालों को संबोधित करने के लिए उपयोगी हैं, लेकिन मस्तिष्क या अन्य अंग प्रणाली में किसी भी कोशिका प्रकार में कैल्शियम यात्रियों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
इस लेख में प्रस्तुत प्रयोग के लिए एक 10 महीने की महिला Acta2-RCaMP1.07 माउस का इस्तेमाल किया गया था । माउस पुरानी कपाल खिड़की और सिर पोस्ट प्रत्यारोपण के लिए दो महीने पहले सर्जरी की गई । सर्जिकल प्रोटोकॉल के विवरण पर पिछले अध्ययनों में चर्चा की गई है12,13 और इसी तरह की प्रक्रियाएं अन्य पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 14,15में की गई हैं । वैक्यूलेचर को ग्रीन फ्लोरोसेइन-डेक्सट्रान (70,000 मेगावाट, एनियोनिक सॉल्यूशन, 2.5% डब्ल्यू/वी) के साथ लेबल किया गया है। यह डाई वाणिज्यिक स्रोतों से लागत प्रभावी और आसानी से उपलब्ध है, लेकिन इसमें एक व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है जो आरसीएएमपी उत्सर्जन के साथ ओवरलैप हो सकता है और माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण के दौरान खून बह सकता है। इस को दरकिनार करने के लिए नीचे धारा 4 में स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के लिए कदम रेखांकित किए गए हैं, लेकिन संकरा उत्सर्जन स्पेक्ट्रा वाले अन्य हरे रंग, जैसे ईजीएफपी पर आधारित, भी उपयोग किया जा सकता है।
वर्तमान विधि एक कैथेटर के साथ माउस पूंछ नस इंजेक्शन पर विवरण प्रदान करता है, गहराई के ढेर के लिए दो फोटॉन माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण, सेल कैल्शियम सिग्नलिंग फिल्में, हीमोडायनामिक कायनोग्राफ का निर्माण, और कैल्शियम और हमारे छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम17 (चित्रा 1)के साथ हीमोडायनामिक विश्लेषण। इन तकनीकों के कई फायदे हैं जो वीवो इमेजिंग परिणाम में सुधार करते हैं और सत्र के दौरान समय, संसाधनों और पशु तनाव को कम करते हैं। सबसे पहले, पूंछ नस इंजेक्शन के लिए कैथेटर का उपयोग सुई, सिरिंज और माउस के परिसंचरण में इंजेक्शन पदार्थ की मात्रा पर अधिक नियंत्रण प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, यह पूंछ के ऊतकों में डाई इंजेक्शन को रोकता है, महंगे अभिकर् स की बचत करता है। दूसरा, हम ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करते हैं जो आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर को एनशेथिंग पेरिसाइट्स में व्यक्त करते हैं और यह प्रदर्शित करते हैं कि मस्तिष्क संवहनी नेटवर्क के भीतर उन्हें गहराई जेड-स्टैक के साथ कैसे स्थानीयकृत किया जाए, जो बाद के इमेजिंग सत्रों में लंबे समय तक सेल पहचान और स्थानांतरण की सुविधा प्रदान करता है। यह पेरिसाइट अध्ययन में एक महत्वपूर्ण कारक है और उचित कोशिका वर्गीकरण सुनिश्चित करता है6,7. तीसरा, हम कैल्शियम फिल्मों और हेमोडायनामिक लाइन स्कैन डेटा एकत्र करने के लिए अपने पैरामीटर प्रदान करते हैं जो गतिशील सेलुलर संकेतों को मापने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। अंत में, हम अपनी छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम17,एक व्यापक छवि प्रसंस्करण टूलबॉक्स प्रस्तुत करते हैं जिसमें छवि पूर्व-प्रसंस्करण (जैसे स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग), कैल्शियम छवि विश्लेषण, और हीमोडायनामिक विश्लेषण (व्यास, वेग, आदि) के लिए कई दृष्टिकोण शामिल हैं। ये एल्गोरिदम परिणामों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक उपयोगकर्ता विशेषज्ञता के स्तर को कम करते हुए डेटा के त्वरित और आसान दृश्य के लिए भूखंड उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, इसे कोड की कुछ लाइनों के साथ स्वचालित किया जा सकता है ताकि एक ही पैरामीटर के साथ कई डेटासेट को जल्दी से बैच किया जा सके। यह संभावित रूप से डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और शोधकर्ता के समय निवेश में सुधार कर सकता है।
अच्छा कैल्शियम इमेजिंग डेटा इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण स्पष्ट फ्लोरेसेंस सिग्नल अधिग्रहण के लिए लेजर पावर और पीएमटी सेटिंग्स को समायोजित करना है, लेकिन पूरे कैल्शियम इवेंट को कैप्चर करने के लिए पर्याप्त फ्रेम दर पर डेटा एकत्र करना भी है। इस प्रोटोकॉल में डेटा प्रति सेकंड 10-11 फ्रेम पर प्राप्त किया गया था, जो पेरिसाइट्स को एनशिथिंग में धीमी कैल्शियम दोलनों को कैप्चर करता है। विश्लेषण के दौरान कई कदम भी हैं जो विश्लेषण परिणाम में सुधार कर सकते हैं। सबसे पहले, यदि फ्लोरोफोरस(चित्रा 2)के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच महत्वपूर्ण ओवरलैप होता है तो स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग फायदेमंद है। फ्लोरोसेसिन-डेक्सट्रान का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया गया था क्योंकि यह एक लागत प्रभावी और वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध डेक्सट्रान कंजूगेट है जिसका उपयोग आमतौर पर हीमोडायनामिक माप 5 के लिए कियाजाताहै। स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग कैल्शियम संकेतों का बेहतर पता लगाने के लिए डेटा को साफ करने में मदद करता है, लेकिन संकरा उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ वैकल्पिक फ्लोरोफोरस का भी उपयोग किया जा सकता है। दूसरा, आरओआई(चित्रा 3)के रूप में सेलुलर संरचनाओं का चयन करना सोमा या प्रक्रिया शाखाओं जैसे विभिन्न उप-सेलुलर क्षेत्रों में कैल्शियम की घटनाओं को वर्गीकृत करने के लिए उपयोगी है। गतिविधि आधारित आरओआई चयन(चित्रा 4)16 व्यक्तिगत कैल्शियम घटनाओं के बारे में अधिक स्थानिक और लौकिक जानकारी प्रदान करता है। किसी दिए गए क्षेत्र में कैल्शियम की घटनाओं की आवृत्ति या अन्य सेलुलर क्षेत्रों में घटनाओं के प्रचार का निर्धारण करते समय यह सहायक हो सकता है। इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग शोधकर्ताओं को घंटों समय बचा सकता है जब डेटा बैच-प्रोसेस्ड होता है, लेकिन इष्टतम परिणामों के मापदंडों को समायोजित करने के लिए कुछ प्रारंभिक समय निवेश की आवश्यकता होती है। सबसे महत्वपूर्ण कारक सक्रिय क्षेत्र के अपेक्षित आकार(माइक्रोन 2में) के साथ-साथ सिग्नल की अवधि (न्यूनतम सिग्नल समय और अधिकतम सिग्नल समय परिभाषित किया जाना चाहिए) हैं। शोधकर्ताओं ने कुछ उदाहरण टी श्रृंखला फिल्मों की जांच करने के लिए सबसे अच्छा निर्धारित करने के लिए जो मापदंडों उनके डेटा फिट चाहिए । अंत में, माइक्रोस्कोप पर प्राप्त खराब गुणवत्ता वाले डेटा कैल्शियम और हीमोडायनामिक्स(चित्र 6)के विश्लेषण में काफी बाधा डाल सकते हैं। इसलिए, शुरुआत में माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इन कारकों को ध्यान में रखते हुए, यह प्रोटोकॉल जिसे अन्य ऊतकों या सेल प्रकारों में कैल्शियम इमेजिंग या अन्य गतिशील सेलुलर संकेतों (जैसे, फ्लोरोसेंट सोडियम, पोटेशियम, मेटाबोलाइट, या वोल्टेज में उतार-चढ़ाव) के विश्लेषण को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, डेटा संज्ञाहरण के तहत एकत्र किया जाता है, जो मस्तिष्क गतिविधि को प्रभावित करता है और रक्त प्रवाह को प्रभावित कर सकता है । इसी तरह इमेजिंग जाग चूहों में किया जा सकता है कि अधिक शारीरिक परिणामों के लिए सिर निर्धारण स्वीकार करने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है । इसके अतिरिक्त, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि हम वीवो में3-आयामी कोशिका और रक्त वाहिका की 2-आयामी छवियों को इकट्ठा करते हैं। इसलिए, हम केवल इन कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम की घटनाओं के एक गुट या एक समय में रक्त वाहिका के एक वर्ग में रक्त प्रवाह पर कब्जा कर सकते हैं ।
ध्यान देने की एक और सीमा यह है कि दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग गति कलाकृतियों के प्रति संवेदनशील है, जहां फोकल विमान में और बाहर आंदोलन कैल्शियम के उतार-चढ़ाव के लिए गलत हो सकता है। यह प्रोटोकॉल संज्ञाहरण के तहत किया गया था, जो जानवर के आंदोलन को सीमित करता है; हालांकि, गति कलाकृतियों को माउस की श्वास दर, हृदय गति, संभावित ऊतक सूजन, और एनशिथिंग पेरिसाइट्स, पोत संकुचन या वासोमोशन 4, 6,18,19के मामले में पेश किया जा सकता है। मोशन कलाकृतियों को कई रणनीतियों द्वारा कम किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले छवि प्रसंस्करण पैकेजों में एक वैकल्पिक गति सुधार चरण शामिल है, जो दृश्यमान वाक्यूलेचर13, 17के आधार पर टी-श्रृंखला के भीतर छवियों को संरेखित करने के लिए 2डी कन्वोोल्यूशन इंजन का उपयोग करता है। फोकल विमान में महत्वपूर्ण परिवर्तन वाले फ्रेम इस एल्गोरिदम द्वारा पहचाने जाते हैं और विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इमेजिंग प्रोसेसिंग पैकेजों के भीतर सांख्यिकीय रणनीतियों का उपयोग करना संभव है, जैसे कि एक जेड-स्कोर जब आंदोलन को सामान्य बनाने के लिए फ्लोरेसेंस निशान उत्पन्न करते हैं कैल्शियम के उतार-चढ़ाव20प्रेरित होते हैं। दो फोटॉन इमेजिंग में गति कलाकृतियों के लिए खाते में सबसे मजबूत दृष्टिकोण एक ही कोशिका के भीतर दो फ्लोरोसेंट संकेतकों की अभिव्यक्ति को जोड़ना है, जैसे कैल्शियम संकेतक (जैसे, जीसीएएमपी) और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (जैसे, एमसीएचरी) जो कैल्शियम-स्वतंत्र है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर में उतार-चढ़ाव को तब आंदोलन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है और गति कलाकृतियों को सामान्य बनाने के लिए कैल्शियम संकेतक संकेत से घटाया जाता है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य वीवो में इष्टतम कैल्शियम इमेजिंग और रक्त प्रवाह डेटा एकत्र करने और नए तरीकों और विश्लेषण उपकरणों को पेश करने के तरीके की स्पष्ट समझ प्रदान करना है जिन्हें शोधकर्ता अपने परिणामों में सुधार करने के लिए लागू कर सकते हैं। इन तकनीकों को रक्त प्रवाह नियंत्रण में या विभिन्न मस्तिष्क रोग राज्यों में विभिन्न पेरिसाइट्स आबादी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। इन इमेजिंग मापदंडों का उपयोग अन्य कोशिका प्रकारों और अंग प्रणालियों में कैल्शियम और रक्त प्रवाह का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है और इसी तरह के सिद्धांत अन्य गतिशील इमेजिंग तकनीकों पर लागू होते हैं जो कैल्शियम से परे अन्य आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर द्वारा संभव बनाए जाते हैं।
The authors have nothing to disclose.
जे मेज़ा को मिटेक्स और रिसर्च मैनिटोबा से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है। इस काम के लिए फंडिंग कनाडा के इंस्टीट्यूट्स फॉर हेल्थ रिसर्च, रिसर्च मैनिटोबा, मैनिटोबा मेडिकल सर्विस फाउंडेशन, यूनिवर्सिटी ऑफ मैनिटोबा और ब्रेन कनाडा से कनाडा ब्रेन रिसर्च फंड के जरिए स्टार्ट-अप फंडिंग, हेल्थ कनाडा और अज्रिली फाउंडेशन की वित्तीय मदद से प्रदान की गई । यहां व्यक्त किए गए विचार स्वास्थ्य मंत्री या कनाडा सरकार के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं ।
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Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
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Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |