Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Создание электрофизиологической платформы для моделирования БАС с регионально-специфическими человеческими плюрипотентными астроцитами и нейронами, полученными из стволовых клеток

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62726
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

Описан метод дифференциации индуцированных человеком плюрипотентных астроцитов и нейронов спинного мозга и их кокультуры для электрофизиологической записи.

Abstract

Человеческие плюрипотентные астроциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-A) и нейроны (hiPSC-N), обеспечивают мощный инструмент для моделирования патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro. Записи многоэлектродной решетки (MEA) являются средством регистрации потенциалов электрического поля от больших популяций нейронов и анализа сетевой активности с течением времени. Ранее было продемонстрировано, что наличие hiPSC-A, которые дифференцируются с использованием методов продвижения фенотипа астроцитов спинного мозга, улучшает созревание и электрофизиологическую активность регионально специфических hiPSC-моторных нейронов спинного мозга (MN) по сравнению с теми, которые культивируются без hiPSC-A или в присутствии астроцитов грызунов. Здесь описан метод совместного культивирования спинного мозга hiPSC-A с hiPSC-MN и регистрации электрофизиологической активности с использованием записей MEA. В то время как протоколы дифференцировки, описанные здесь, характерны для астроцитов и нейронов, которые регионально специфичны для спинного мозга, платформа кокультурирования может быть применена к астроцитам и нейронам, дифференцированным с помощью методов, специфичных для других судеб, включая корковый hiPSC-A и hiPSC-N. Эти протоколы направлены на предоставление электрофизиологического анализа для информирования о взаимодействиях глиа-нейронов и обеспечения платформы для тестирования лекарств с терапевтическим потенциалом при БАС.

Introduction

Человеческие плюрипотентные астроциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-A) и нейроны (hiPSC-N), являются мощными инструментами для моделирования патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro и обеспечивают трансляционную парадигму для стратегий открытия лекарств1. Исследователи продемонстрировали, что кокультура hiPSC-A с hiPSC-N усиливает морфологическое, молекулярное, электрофизиологическое и фармакологическое созревание обоих типов клеток, генерируя сложные нейронные сети и взаимодействия астроцитов и нейронов, которые напоминают их аналоги in vivo 2,3. Подобные эксперименты с кокультурой могут повторить признаки патобиологии БАС, такие как астроцитарно-опосредованная нейротоксичность 4,5 и нейрональная гипервозбудимость6. Кроме того, благодаря достижениям в протоколах дифференцировки, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) могут быть дифференцированы в регионально-специфические нервные подтипы, включая кортикальный и спинной мозг hiPSC-A и hiPSC-N 7,8. Эти стратегии обеспечивают потенциал для моделирования патологии кортикальных и спинальных двигательных нейронов при БАС, а также астроцитарного влияния на оба. Однако для этого требуется воспроизводимый функциональный анализ для определения этих эффектов.

Недавно было показано, что запись многоэлектродной решетки (МЭА) особенно подходит для электрофизиологической характеристики нейрон-астроцитарных кокультур2. В отличие от одноклеточных электрофизиологических анализов, эти электродные массивы высокой плотности пассивно регистрируют потенциалы внеклеточного поля от больших популяций нейронов, не нарушая условия культивирования и сохраняя целостность клеточных мембран. Эти платформы особенно полезны для записи клеточной и сетевой активности культур с течением времени и в ответ на фармакологические манипуляции. Наконец, когда присутствие астроцитов является переменной культуры, записи MEA могут обеспечить функциональное понимание двунаправленных взаимодействий астроцитов и нейронов 2,9.

Здесь представлен оптимизированный протокол для дифференциации hiPSC в hiPSC-A спинного мозга и hiPSC-моторные нейроны (MN), который был ранее проверен2. Протокол дифференцировки hiPSC-A спинного мозга последовательно приводит к культурам астроцитов, которые являются положительными для S100 кальций-связывающего белка B (S100β), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и гомеобокса B4 (HOXB4) в 80%, 50% и 90% клеток соответственно, что указывает на созревание глиального и спинного мозга 2,10 . Протокол дифференцировки hiPSC-MN генерирует нейроны, которые >90% положительны для холина ацетилтрансферазы (ChAT), что наводит на мысль о зрелой идентичности альфа-моторных нейронов2. Кроме того, протокол описывает методы генерации кокультур hiPSC-A/MN, которые, как было ранее продемонстрировано, приводят к появлению нейронов с повышенной морфологической сложностью с помощью анализа Шолля и иммунофлуоресцентной микроскопии по сравнению с нейронными культурами без астроцитов или с астроцитами грызунов2. Хотя эти описания специфичны для спинного мозга hiPSC-A и hiPSC-N, уникальное преимущество заключается в том, что первоначальная независимая культура астроцитов и нейронов, за которой следуют шаги по совместной культивированию в более поздние моменты времени, может быть переведена для изучения эффектов взаимодействия нейронов-астроцитов из других конкретных областей, а также специфических для заболевания клеток 7,8 . Наконец, протокол описывает, как выращивать эти культуры на пластинах MEA, чтобы функциональная активность как фактор состава кокультуры могла быть изучена с течением времени с возможностью манипулировать клеточным составом, а также условиями культуры.

Целью этих протоколов является предоставление функционального анализа для исследования взаимодействий астроцитов и нейронов, изучения специфических для заболевания изменений и тестирования лекарств с терапевтическим потенциалом в области БАС. Видеоинструкции приведены для наиболее сложных шагов этого протокола.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка среды для клеточных культур

  1. Подготавливают отдельные клеточные питательные среды, используя композиции, указанные в таблице 1.
  2. Смешайте и стерильно фильтруйте среду в бутылках с фильтром по 500 мл и храните защищенными от света при 4 °C в течение 2 недель.

2. Поддержание и передача несмешивающихся человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC)

  1. Разморозить матрицу базальной мембраны (хранить в аликвотах при -80 °C) в холодильнике с температурой 2-8 °C на ночь.
  2. Разбавьте матрицу базальной мембраны при 1:100 (v/v) в холодном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) или модифицированной среде Dulbecco Eagles Medium (DMEM).
  3. Добавьте достаточное количество матрицы базальной мембраны для покрытия нижней части пластины культуры ткани (5 мл для пластины размером 10 см, 2 мл для одиночных лунок из 6-луночной пластины) и инкубируйте при 37 °C в течение минимум 30 мин в течение ночи или при комнатной температуре в течение минимум 1 ч.
  4. Аспирируйте разбавленную матрицу базальной мембраны и промывайте пластину один раз PBS перед добавлением культуральной среды и посевных клеток.
  5. Ежедневно осматривайте пластины, чтобы определить и предвидеть, когда они будут готовы к прохождению. Проходные пластины hiPSC когда-то большинство колоний стали достаточно плотными, так что в центре колоний отображаются разбросанные белые участки. Не позволяйте пластинам созревать после этой точки. Это вызовет избыточную дифференцировку, приводящую к появлению желтой области в центре колоний из-за многослойности клеток, переизбытка удлиненных клеток по краям, рыхлой компактности внутри колоний или повышенной гибели клеток.
  6. В день прохождения проведите линии сетки на нижней наружной поверхности плит маркером, чтобы облегчить точное покрытие всей плиты.
  7. Отсоедините дифференцированные колонии в культуральной вытяжке с помощью фазоконтрастного микроскопа (10-кратное увеличение), вручную соскребая наконечник пипетки объемом 200 мкл.
  8. Дважды промойте пластины PBS (5 мл на стирку на 10 см пластины).
  9. Добавьте 5 мл предварительно подогретой тканевой диссоциационной протеазы (Таблица материалов) и инкубируйте клетки при 37 °C до тех пор, пока края колоний не начнут округляться (4-7 мин), но до того, как колонии выйдут из пластины.
  10. Осторожно аспирируйте диссоциационную протеазу. Осторожно промойте тарелку дважды PBS, стараясь не выбить колонии.
  11. Добавьте 5 мл предварительно нагретой среды hiPSC (таблица 1) в культуральную пластину.
  12. Поднимите колонии, разбив их на более мелкие клеточные агрегаты, поцарапав всю пластину кончиком пипетки объемом 5 мл, используя движение вперед-назад сверху вниз.
  13. Поверните пластину на 90° и повторите описанный выше шаг.
  14. Аккуратно тритурируйте клеточные агрегаты путем пипетки вверх и вниз пипеткой 5 мл и периодически проверяйте размер агрегатов под микроскопом, пока большинство клеточных агрегатов не составят приблизительно 50-100 клеток.
  15. Засейте клеточные агрегаты в предварительно покрытые матричные пластины базальной мембраны, используя дополнительную среду hiPSC для промывки исходной пластины. Соберите и переложите большую часть клеточных агрегатов на новые пластины с помощью пипетки объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если протокол применяется последовательно, оригинальная пластина должна содержать колонии iPSC, покрывающие приблизительно 50% поверхности культуры до прохождения. При этом соотношение расщепления должно составлять от одной пластины до пяти новых пластин. Однако это, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от условий роста и темпов роста, специфичных для клеточной линии.
  16. Встряхните только что посеянные пластины вперед и назад, чтобы равномерно распределить агрегаты.
  17. Перенесите пластины в инкубатор (37 °C и 5% CO2) и оставьте их нетронутыми на ночь, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток.
  18. Выполняйте полную смену среды каждый день с 10 мл среды hiPSC. При наличии избытка клеточного мусора на следующий день после прохождения промыть один раз 5 мл среды перед сменой среды.
  19. Планируйте прохождение следующим, когда белые области появятся в центре большинства колоний iPSC (шаг 2.5). Это будет происходить через 4-6 дней после каждого прохождения.

3. Замораживание hiPSC

  1. Выполните начальные шаги, как показано в шагах 2.5-2.14 для прохождения hiPSC.
  2. Соберите клеточные агрегаты в пробирку объемом 15 мл и вращайте при 200 х г в течение 2 мин.
  3. Аспирировать супернатант, повторно суспендировать гранулу в морозильной среде и перенести в криотрубы с помощью пипетки объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подобно шагам прохождения, обычное соотношение расщепления составляет одну пластину iPSC на пять криотрубок, в зависимости от плотности колоний. Используйте общий объем 1 мл морозильной среды для каждой криотрубы.
  4. Поместите криотрубы в охлажденный криоконсервационный контейнер и переложите его до -80 °C на ночь.
  5. Переведите клетки на жидкий азот через 24 ч.

4. Размораживание hiPSC

  1. Покрыть пластину размером 10 см матрицей базальной мембраны (см. 2.1-2.3).
  2. Извлеките криотрубу iPSC из жидкого азота и немедленно поместите ее на водяную баню с температурой 37 °C на срок до 2 мин, чтобы быстро оттаять. Встряхните флакон в ванне до тех пор, пока он частично не разморозится и не будет содержать небольшой кусочек льда, окруженный жидкостью.
  3. Перенесите клеточные агрегаты из криотрубы в коническую трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1000 мкл. Добавьте до 15 мл предварительно нагретой среды hiPSC для разбавления диметилсульфоксида (ДМСО) в морозильной среде.
  4. Центрифугировать коническую трубку объемом 15 мл при 200 х г в течение 2 мин.
  5. Аспирировать надосадочный агент и использовать пипетку 5 мл для повторного суспендирования клеточной гранулы в среде hiPSC, содержащей 20 мкМ Rho-ассоциированного спирально-образующего ингибитора серина/треонинкиназы (ROCK-I, соединение Y-27632), чтобы избежать дальнейшего тритурации клеточных агрегатов.
  6. Переложите клеточные агрегаты на пластину с матричным покрытием базальной мембраны размером 10 см с помощью пипетки объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если протокол применяется последовательно, ячейки в одной криотрубе могут быть перенесены на одну пластину размером 10 см.
  7. Встряхните тарелку, чтобы распределить агрегаты равномерно.
  8. Переложите пластинку в инкубатор и оставьте ее ненарушенной на ночь, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток.
  9. Выполните полную смену среды на следующий день после оттаивания с 10 мл среды hiPSC без ROCK-I.

5. Дифференцировка hiPSC в нейронные клетки-предшественники спинного мозга (NPC)

  1. Убедитесь, что 6-луночные пластины с покрытием фундаментной мембраны с покрытием из 6 скважин готовы к использованию до начала дифференцировки.
  2. Начните с iPSC, которые были пройдены по меньшей мере один раз, а предпочтительно два раза после размораживания и с по меньшей мере четырех пластин размером 10 см (см. объяснение на этапе 5.11).
  3. Выполните начальные шаги, как показано в шагах 2.5-2.14 для прохождения hiPSC.
  4. Переложите ячейки заполнителей с по меньшей мере двух пластин размером 10 см в трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл.
  5. Центрифуга при 200 х г в течение 2 мин.
  6. Аспирируйте надосадочный агент и повторно суспендируйте клеточную гранулу 10 мл среды hiPSC с помощью пипетки объемом 10 мл, а затем снова центрифугируйте при 200 х г в течение 2 мин, чтобы ослабить клеточные спайки в каждом агрегате.
  7. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл среды hiPSC, содержащей 20 мкМ ROCK-I, используя пипетку объемом 1000 мкл.
  8. Пипетка вверх и вниз с пипеткой 1000 мкл для тритурации клеточных агрегатов. Периодически проверяйте размер агрегатов под микроскопом, пока большая часть клеточной суспензии не состоит из одиночных клеток или небольших агрегатов из <10 клеток.
  9. Подсчитайте ячейки с помощью гемоцитометра (предпочтительно) или автоматизированного счетчика клеток и рассчитайте плотность клеток в клеточной суспензии.
  10. Пластина 3,0 х 106 ячеек в каждой скважине из 6-луночной пластины предварительно покрытой базальной мембранной матрицей. Используйте пипетку объемом 1000 мкл для переноса клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если протокол применяется последовательно, это соответствует соотношению двух пластин по 10 см в одну скважину из 6 скважин/плит.
  11. Повторите этапы 5.3-5.10 со второй партией из двух 10-сантиметровых пластин и нанесите конечный продукт на основную мембранную матрицу, покрытую скважиной второй 6-луночной пластины. Используйте пипетку объемом 1000 мкл для переноса клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное завершение протокола NPC спинного мозга требует двух лунок, равных четырем пластинам по 10 см. Для удобства рабочего процесса выполните этапы 5.3- 5.10 с двумя партиями по две пластины, каждая из которых представляет собой два отдельных 6-луночных листа и каждую с одной скважиной, содержащей 3,0 х 106 ячеек в ней.
  12. Поддерживайте полученный монослой iPSC человека в среде hiPSC, содержащей 20 мкМ ROCK-I, до тех пор, пока слияние не достигнет >90%, как правило, на следующий день, но не более чем через 3 дня после первоначального покрытия, чтобы избежать спонтанной (неконтролируемой) дифференцировки.
  13. Если дифференцировка не может быть начата на следующий день после покрытия клеток, промывайте клетки один раз PBS и ежедневно меняйте среду на свежую среду hiPSC, содержащую 20 мкМ ROCK-I. Если он не сливается >90% в течение 3 дней после покрытия, выбросьте клетки и начните протокол заново.
  14. Как только >90% слияния достигнут, начните дифференциацию. Это день in vitro 1 (DIV1) протокола дифференциации.
  15. На DIV 1 отбросьте среду hiPSC, содержащую 20 мкМ ROCK-I, и дважды промойте PBS, чтобы удалить фактор роста плода (FGF) и трансформирующий фактор роста-бета (TGFβ), присутствующий в среде стволовых клеток.
  16. Замените среду на среду WiCell (таблица 1), дополненную 0,2 мкМ LDN193189 (LDN) и 10 мкМ SB431542 (SB) в течение 48 ч.
  17. На DIV 3 промыть один раз PBS и поменять среду на среду WiCell, дополненную LDN (0,5 мкМ) + SB (10 мкМ) + ретиноевой кислотой (РА; 1 мкМ) в течение 48 ч.
  18. На DIV 5 промыть один раз PBS и поменять носитель на WiCell: основание нейронной индукционной среды (NIM) (таблица 1) (50%:50%, v/v) с добавлением LDN (0,5 мкМ) + SB (10 мкМ) + RA (1 мкМ) в течение 48 ч.
  19. На DIV 7 выполните обмен средой с той же средой, что и на шаге 5.18.
  20. На DIV 8 промыть один раз PBS и изменить среду на основание WiCell: NIM (50%:50%) с добавлением РА (1 мкМ) + пуроморфамина (PMN) (1 мкМ) + рекомбинантного нейротрофического фактора человеческого мозга (BDNF) (10 нг / мл) + аскорбиновой кислоты (ASAC) (0,4 мкг / мл) в течение 48 ч.
  21. На DIV 10 промыть один раз PBS и заменить среду на основание NIM (100%), дополненное, как указано в шаге 5.20 в течение 48 ч.
  22. На DIV 11 или 12 покройте стерильную культуральную колбу размером25 см2 базальной мембранной матрицей при подготовке к прохождению.
  23. Аспирируйте среду из каждой лунки 6-луночной пластины l и промывайте клетки один раз PBS.
  24. Добавить в каждую лунку 2 мл 0,05% трипсина и инкубировать при 37 °С в течение 5-15 мин; периодическое встряхивание пластин может помочь в отслоении клеток.
  25. Если ячейки все еще не находятся в суспензии, отсоедините механически, выталкивая среду NIM из наконечника пипетки объемом 1000 мкл на ячейки круговым движением (обязательно покрывайте всю поверхность) или соскребая с помощью скребка для ячеек (не предпочтительно).
  26. Перенесите клетки из 2 лунок в трубку объемом 15 мл и добавьте ингибитор трипсина в соответствующей пропорции к количеству трипсина, используемого с использованием пипетки 5 мл.
  27. Центрифуга при 200 х г в течение 2 мин, аспирируют супернатант, а затем повторно суспендируют 10 мл основания NIM с помощью пипетки 10 мл.
  28. Центрифугу снова при 200 х г в течение 2 мин, чтобы ослабить межклеточные спайки.
  29. После второй стадии центрифугирования удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу с 1 мл среды NIM (100%), дополненной РА (1 мкМ) + ПМН (1 мкМ) + BDNF (10 нг/мл) + ASAC (0,4 мкг/мл) и ROCK-I (20 мкМ). Используя наконечник пипетки объемом 1000 мкл, тритурируйте клетки вверх и вниз примерно пять раз, пока не получится мутная суспензия.
  30. Повторно засевают агрегаты в этой среде в матрицу базальной мембраны, покрытую 25см2 стерильной колбой для культивирования таким образом, что конечным результатом является объединение клеток из двух скважин из 6-луночной пластины в одну основную мембрану, покрытую матрицей 25см2 стерильной колбы для культивирования (проход 2:1). Используйте пипетку объемом 1000 мкл для переноса клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки должны быть >90% сливающимися на DIV 13, и никаких дальнейших шагов не требуется до 14-го дня. Если клетки не сливаются, держите ROCK-I в среде еще 1 или 2 дня.
  31. На DIV 14 измените среду на свежую среду NIM + RA (1 мкМ) + PMN (1 мкМ) + BDNF (10 нг/мл) + ASAC (0,4 мкг/мл).
  32. На DIV 15 измените среду на NIM: основание нейронной дифференцировки (NDM) (таблица 1) (50%:50%) с РА (1 мкМ) + PMN (1 мкМ) + ASAC (0,4 мкг/мл) + добавка B (50x) + BDNF (10 нг/мл) + нейротрофический глиально-клеточный линейный (GDNF) (10 нг/мл) + инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) (10 нг/мл) + цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) (10 нг/мл). Меняйтесь свежими медиа через день.
  33. На DIV 21 измените среду на основание NDM (100%), дополненное как на шаге 5.32, и измените на свежую среду через день.
  34. На DIV 25-30 соберите NPC и либо заморозьте их, либо переместите на пластину размером 10 см для дифференциации терминалов.
  35. Промыть колбу Т-25 PBS и добавить 0,05% трипсина.
  36. Инкубировать в течение 5 мин при 37 °C.
  37. Промыть трипсин и клетки основанием NDM и перенести в коническую трубку объемом 15 мл. Добавляют ингибитор трипсина в соответствующей пропорции к трипсину и центрифуге по 300 х г в течение 5 мин.
  38. Повторно суспендируют клеточную гранулу с помощью моторного нейрона или среды дифференцировки астроцитов (таблица 1) и используют пипетку объемом 1000 мкл для тритурации вверх и вниз с получением одноклеточной суспензии (обычно до 5 раз).
  39. Подсчитайте клетки и переведите на пластину размером 10 см, покрытую, как описано в разделе 6, используя либо дифференцирующую среду + Rock-I, чтобы дифференцировать hiPSC-MN и hiPSC-A.
  40. Альтернативно, заморозить культуры путем повторного использования в морозильной среде, состоящей из 90% среды NDM с факторами роста (как на этапах 5,32-5,33) и 10% DMSO, тритурировать аналогичным образом, а затем перенести в криотрубу. Aliquot 6 x 106 NPC на криотрубу.

6. Оттаивание NPC культур

  1. Обложите 10 см пластины полиорнитином (PLO) и ламинином за день до размораживания клеток.
    1. Добавьте к пластинам 5 мл ООП, разбавленной до 100 мкг/мл в ПБС или дистиллированной воде (dH2O). Инкубировать при 37 °C в течение минимум 1 ч до ночи.
    2. Аспирируйте раствор PLO и трижды промойте пластины PBS. (PLO токсичен, если его неправильно промыть.)
    3. Добавьте ламинин, разбавленный в PBS, до концентрации 10 мкг/мл к пластинам, покрытым PLO. Инкубировать при 37 °C в течение минимум 1 ч, предпочтительно в течение ночи. После инкубации аспирируют раствор ламинина без промывки для усиления клеточной адгезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины могут быть покрыты PLO заранее, вымыты три раза водой, высушены в стерильном капюшоне и сохранены при температуре 4 °C.
  2. Разморозьте один флакон NPC (т.е. DIV 25 или 30), содержащий 6 x 106 клеток/флакон для каждой 10 см клеточной культуральной пластины.
  3. Извлеките криотрубу NPC из жидкого азота и поместите сразу же на водяную баню с температурой 37 °C на срок до 2 мин. Быстро оттаивайте, встряхивая флакон, пока не появится небольшой кусочек льда, окруженный жидкостью.
  4. Переместите клеточные агрегаты в коническую форму объемом 15 мл с использованием пипетки 1000 мкл и добавьте до 15 мл предварительно нагретого NDM или добавки Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham F21 F12 для разбавления DMSO.
  5. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
  6. Аспирируйте надосадочный агент, повторно суспендируйте клеточную гранулу либо астроцитарной, либо МН-дифференцировочной средой (таблица 1) + ROCK-I (20 мкМ) и используйте пипетку объемом 1000 мкл для тритурации вверх и вниз до получения одноклеточной суспензии (до 5 раз).
  7. Перенесите одноэлементную суспензию на пластину с покрытием PLO-Laminin размером 10 см.
  8. Перенесите пластину в инкубатор и оставьте ее ненарушенной на ночь, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток.

7. Дифференциация NPC спинного мозга в двигательные нейроны

  1. Выполните начальные этапы, как указано в шагах 6.1-6.8, при этом конечной средой является среда дифференциации MN + ROCK-I (20 мкМ).
  2. На следующий день после нанесения покрытия выполняют полный обмен среды с средой дифференцировки MN без ROCK-I, а затем меняют носитель через день. В выходные дни кормите клетки в пятницу, а затем снова в понедельник. Промывайте клетки PBS, когда это необходимо, чтобы удалить клеточный мусор.
  3. Изменять среду с помощью среды дифференцировки MN + цитозина арабинозида (ARA-C) (0,02 мкМ) и инкубировать в течение 48 ч, когда глиальные преданные предшественники появляются в виде одиночных пролиферирующих плоских клеток под постмитотическими предшественниками MN, агрегированными в клеточных кластерах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это происходит в течение первых 7 дней после первоначального покрытия, хотя может быть изменчивость в зависимости от клеточной линии.
  4. Через 48 ч аспирировать среду, содержащую ARA-C, аккуратно промыть культуры PBS три раза и изменить среду на свежую среду MN без ARA-C.
  5. После лечения ARA-C выполняйте обмен средой через день (или в понедельник, среду и пятницу), удаляя старую среду с помощью ручной пипетки, а не вакуумного аспиратора, чтобы предотвратить преждевременное отсоединение кластеров нейронов. Кроме того, обогащайте среду MN ламинином 1 мкг/мл один раз в неделю для дальнейшего усиления прикрепления нейронов к культуральным пластинам.

8. Дифференциация NPC в астроциты спинного мозга

  1. Размораживать NPC-культуры, как в разделе 6, используя среду дифференцировки астроцитов (таблица 1) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) с объемом объемной концентрации 1% (NS + 1% FBS), а также ROCK-I (20 мкМ) для покрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступная замена сыворотки (таблица 1) может быть заменена на FBS с использованием тех же коэффициентов разбавления.
  2. На следующий день после нанесения покрытия меняют культуральную среду на NS+1% FBS среду без ROCK-ингибитора, а затем меняют среду через день. В выходные дни кормите клетки в пятницу, а затем снова в понедельник. Промывайте клетки PBS, когда это необходимо, чтобы удалить клеточный мусор. Если клетки продолжают умирать, дополните среду ROCK-I (10 мкМ), чтобы способствовать выживанию клеток. Будьте осторожны, чтобы не использовать ROCK-I слишком часто или слишком долго, учитывая потенциал для выбора бессмертных клеток.
  3. Позвольте астроцитам стать сливающимися, прежде чем пропускать их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер ячейки будет увеличиваться с течением времени, поэтому нет установленного числа для прохождения. Типичный коэффициент пропускания составляет 1:2 или 1:3. В случае плохой выживаемости или перехода к слишком большому количеству пластин, объедините две (или более, по мере необходимости) пластины 10 см в одну пластину 10 см для поддержания слияния.
  4. Для прохождения культур-предшественников астроцитов промыть пластины один раз PBS (для удаления FBS), инкубировать с 0,05% трипсином в течение 5 мин, собрать клетки в NS-среде + 1% FBS (FBS инактивирует трипсин), а затем центрифугировать при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант, повторно суспендируйте клетки в среде NS + 1% FBS, а затем тритурируйте до одноклеточной суспензии. Распределите ячейки в NS + 1% FBS на новые 10 см пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к расширению культур астроцитов, повторное прохождение пластин служит цели уничтожения любых оставшихся клеток-предшественников, которые выбрали судьбу нейронов. Поэтому, даже если существует не очень высокая митотическая скорость, пластины могут проходить в соотношении 1:1, если кажется, что есть нейронное загрязнение.
  5. Меняйте покрытие в ходе дифференциации для повышения выхода следующим образом.
    1. Нанесите первоначально размороженные культуры NPC и первые проходы после первоначального покрытия на PLO/Laminin.
    2. Пластинчатость незрелых астроцитов на базальной мембране матрицы покрыта пластинами.
    3. Пластинчатые более зрелые астроциты (т.е. после 90-го дня) либо на матрице базальной мембраны, либо на пластинах, покрытых PLO/Laminin (обычно для совместной культивации с нейронами), либо на пластинах без покрытия.
  6. Заморозьте предшественников астроцитов в любой момент времени в течение 60-дневного периода созревания, чтобы синхронизировать культуры или сохранить для последующих экспериментов. При оттаивании за пределами стадии NPC разморозьте предшественников астроцитов на пластинах, покрытых матрицей базальной мембраны, а не НА PLO / Laminin.
  7. При DIV 90 и после этого переключите среду с NS + 1% FBS на NS + 5% FBS, чтобы способствовать выживаемости астроцитов и уменьшить их пролиферацию.

9. Совместное культивирование MN и астроцитов спинного мозга в многоэлектродных пластинах

  1. Дифференцируют и пластинчат двигательные нейроны и астроциты, когда они будут готовы к использованию в тот же день и состарятся до DIV 60 для двигательных нейронов и DIV 90 для астроцитов.
  2. Нанесите покрытие на пластины MEA за день до или в день нанесения покрытия следующим образом при работе с 24-луночными пластиковыми пластинами (Таблица материалов).
  3. Разбавить PLO в воде или PBS до 100 мкг/мл.
    1. Добавьте 15-20 мкл к каждой скважине (в зависимости от уровня комфорта пипетки), образуя каплю в центре скважины, покрывающую площадь электродов и прилегающую область, но не всю скважину.
    2. Следите за тем, чтобы не повредить электроды наконечником пипетки. Быть в соответствии с объемом от скважины до скважины, чтобы обеспечить покрытие одной и той же площади поверхности в каждой скважине.
    3. Инкубировать PLO при 37 °C в течение как минимум 1 ч (предпочтительно 2 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие объемы будут высыхать, если в пластинах не будет достаточной влажности. Добавляйте воду в отсеки, окружающие колодцы, чтобы обеспечить достаточную влажность на протяжении всего процесса нанесения покрытия и регистрации.
  4. Аспирируйте как можно больше PLO, используя пластиковый наконечник микропипетки. Следите за тем, чтобы не прикасаться к электродам. Трижды промыть 250 мкл воды. Если вы используете вакуумный аспиратор для стирки, не допускайте наконечника рядом с электродной решеткой. После третьей стирки удалите как можно больше воды, используя наконечник пипетки по мере необходимости. Дайте поверхности высохнуть под вытяжкой культуры клеток со снятой крышкой.
  5. Как только поверхности пластин высохнут, добавьте ламинин, разбавленный до 10 мкг/мл в PBS. Используйте 15-20 мкл для покрытия каждого электродного массива. Добавьте воду в отсеки влажности, замените крышку и верните пластину к инкубации при температуре 37 °C в течение как минимум 2 ч до ночи.
  6. В день нанесения покрытия промыть культуры MN и астроцитов один раз PBS и добавить трипсин 0,05% при 37 °C для подъема клеток (5 мин). Соберите в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую ингибитор трипсина, и промойте пластины со средой или основанием, чтобы убедиться, что все клетки собраны. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин и повторное суспендирование пипеткой 1000 мкл для получения 1 мл одноклеточной суспензии. При повторной суспендации МН и астроцитов переходят на кокультурную среду (табл. 1), с добавлением 20 мкМ ROCK-I.
  7. Подсчитывайте МН и астроциты параллельно с помощью гемоцитометра. Во время подсчета и расчетов закройте суспензии ячейки и поместите их в стойку из пенополистирола при температуре 4 °C.
  8. Рассчитайте объем, необходимый для повторного суспендирования культур до концентрации 5 х 104 клеток на 5 мкл для двигательных нейронов и 2,5 х 104 клеток на 5 мкл для астроцитов. Центрифугируют 1 мл клеточных суспензий по 300 х г в течение 5 мин и повторно суспендируют в расчетном объеме.
  9. Рассчитайте количество желаемых скважин для посева и умножьте его на 5 мкл каждой клеточной суспензии. Объедините необходимый объем суспензий нейронов и астроцитов в соотношении 1:1 и перемешайте путем пипетирования до полного объединения (обычно дважды), но избегайте слишком агрессивности.
  10. Извлеките ламинин из каждого колодца пластины MEA с помощью наконечника пипетки. Перенесите 10 мкл конечной комбинированной клеточной суспензии в каждую лунку, образуя небольшую каплю, покрывающую электродный массив, чтобы обеспечить плотность клеток 5 х 104 МН и 2,5 х 104 астроцитов на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая плотность клеток в комбинированной суспензии требует частого повторного суспендирования между скважинами на этапе посева для обеспечения точного и последовательного подсчета клеток.
  11. Верните тарелки в инкубатор на 20-30 мин. Позаботьтесь о том, чтобы не потревожить клеточную каплю и позволить клеткам образовывать первоначальные прикрепления на пластинах.
  12. Через 20-30 мин добавьте теплые кокультурные среды + ROCK-I в каждую скважину, пипетируя 250 мкл вниз на стенке каждой скважины, а затем еще 250 мкл вниз по стенке той же скважины на противоположной стороне. Верните тарелку в инкубатор.
  13. Осмотрите тарелки на следующий день после посева (Кокультура День 1). При наличии значительного количества клеточного мусора или мертвых клеток замените среду свежей кокультурной средой, содержащей ROCK-I. В противном случае измените среду на второй день после посева (День кокультуры 2) на среду совместной культуры без ROCK-I. Выполняйте полусредний обмен (аспират 50% и добавление 60% от конечного объема для учета испарения) два раза в неделю.
  14. При использовании МЭА-систем с однотонными стеклянными пластинами 30 мм (Таблица материалов) подготовка плиты может занять 2 и более дней. Для этого выполните следующие действия.
  15. Поднимите клетки и клеточный мусор из предыдущих культур MEA с 0,05% трипсина в течение 5-15 мин.
  16. Аспират трипсина и трижды промыть водой.
  17. Стерилизуют, добавляя 70% этанола и инкубируют в вытяжке в течение 10 мин. Аспирировать этанол, а затем трижды промыть водой.
  18. Наносите 1% анионное моющее средство с ферментом протеазой в воде. Накройте пластины крышкой и оберните термопластичной пленкой и алюминиевой фольгой, а затем оставьте их на коромысле при комнатной температуре на ночь.
  19. Аспирировать моющее средство, а затем трижды смыть водой.
  20. Если планируется хранение тарелок, добавьте достаточный объем воды. Накройте пластины крышкой и оберните их термопластичной пленкой и алюминиевой фольгой, а затем оставьте в холодильнике до следующего использования.
  21. Если планируется покрыть, дайте поверхности высохнуть под вытяжкой клеточной культуры.
  22. Если требуется дополнительная стерилизация (например, предыдущая инфекция или недавнее использование), только на этом этапе подвергайте пластины MEA ультрафиолетовому (УФ) свету под капотом в течение 30-60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегание частого ультрафиолетового излучения предотвратит повреждение электродов. Использование ультрафиолетового света, когда пластины имеют сыворотку на них, приведет к нефункциональным электродам, поэтому его следует использовать только на очищенных пластинах.
  23. Когда пластины полностью высохнут, приступайте к плазменной очистке в течение 1 мин, чтобы зарядить стеклянную поверхность MEA-пластин и повысить эффективность покрытия. Плазменная очистка не реже одного раза в 4-5 циклов циклов очистки и покрытия пластин MEA.
    1. В качестве альтернативы, когда плазменная очистка невозможна или не оправдана, добавьте достаточный объем среды, содержащей FBS, чтобы покрыть поверхность пластин MEA и вернуть их в инкубатор на ночь.
  24. Используйте покрытие PLO/Laminin, как описано выше в разделе 6. Добавляют раствор PLO (100 мкг в PBS) сразу после плазменной очистки или аспирации и промывки FBS-содержащей среды.
  25. Обложите ячейки, как указано выше, в следующих плотностях: 1 x 105 hiPSC-A / пластина и 5 x 105 hiPSC-MN / пластина.

10. Запись многоэлектродной решетки

  1. Извлеките необработанные данные о напряжении с частотой дискретизации 12,5 кГц, используя фильтр Баттерворта с высокими частотами 200 Гц и фильтром нижних частот 3 кГц. Установите распознавание всплесков как мгновенные временные точки напряжений ≥6 стандартных отклонений от исходного уровня. Идентифицируйте всплески как активность с пиками >5 за 100 мс. Определите сетевую активность, когда более 35% от общего числа активных электродов срабатывают в течение 100 мс с минимум 50 всплесками на сетевой всплеск.
  2. Начните запись как можно скорее после Co-Culture (CC) Day 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электрическая активность будет редко отмечаться до CC Day 3.
  3. Пластинчатые параллельные культуры с одинаковой плотностью и реплицируются в соответствующих культуральных пластинах или покровных листах для биохимических анализов, иммуноцитохимии (ICC) или qPCR.
  4. Выполняйте записи с температурой, установленной на уровне 37 °C и CO2 при 5%. Переложите пластины на машину и позвольте им уравновеситься в течение не менее 5 минут перед записью.
  5. Регистрируйте базовую активность либо через день, либо еженедельно, в течение 1-15 минут в зависимости от экспериментального проекта. Не записывайте в течение как минимум 1 ч после среднего обмена, а в идеале ждите 24 ч после каждого медиаобмена.
  6. Чтобы предотвратить загрязнение, измените среду (т.е. половинный обмен среды, как на этапе 9.14) после любой записи, при которой крышка стерильной пластины должна быть открыта за пределами стерильной вытяжки (т.е. применение лекарственных соединений). Выполняйте полные средние обмены и промывки, чтобы вымыть лекарства, если пластины будут продолжать использоваться после медикаментозного лечения.
  7. Для целей анализа используйте не менее трех технических и биологических реплик для каждого состояния. Экспресс-электрофизиологические данные как средство n ≥ 3 реплик.

11. Фармакологические анализы на многоэлектродной матрице

  1. Используют различную комбинацию кокультур в зависимости от экспериментального вопроса: нейроны БАС с контрольными астроцитами, контрольные нейроны с астроцитами БАС, нейроны БАС и астроциты, контрольные нейроны и астроциты.
  2. При исследовании переходных электрофизиологических эффектов соединений, нацеленных на нейроны или астроциты, регистрируйте исходную активность в течение как минимум 1 мин со снятой крышкой пластины, но закрытой крышкой машины.
  3. Вручную открывают крышку машины без остановки электрофизиологической регистрации и обменивают 25 мкл среды с соответствующим лекарственным средством (обычно свежей средой) с помощью многоканальной пипетки при обработке нескольких скважин. Закройте крышку вручную.
  4. Запись в течение дополнительного 1 мина (или более, если есть значительные изменения, вызванные транспортным средством, от которых культура должна восстановиться).
  5. Вручную снова откройте крышку и замените 25 мкл среды с интересующим препаратом в том же транспортном средстве. Закройте крышку устройства и продолжите запись.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность регистрации и объем вводимого лекарственного средства/транспортного средства могут варьироваться или должны быть оптимизированы в зависимости от экспериментального вопроса.
  6. Для целей анализа убедитесь, что добавление транспортного средства не провоцирует существенных изменений электрофизиологических параметров. Рассчитайте процентные изменения активности после приема препарата по сравнению с добавлением в транспортное средство и сравните между условиями.
  7. Для исследования продольных электрофизиологических эффектов, таких как препараты-кандидаты, модифицирующие заболевание, запишите исходную активность, описанную на этапе 11.2. Для этого используйте либо среду для совместной культивирования, содержащую лекарственное средство(и), представляющее(ые) интересующее (представляющие) лекарственный препарат(ы), либо среду, содержащую только транспортное средство.
  8. Для целей анализа сравните записи временных точек от БАС или контрольных кокультур, продольно обработанных препаратами, друг с другом и контрольными состояниями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол формирования паттернов спинного мозга для генерации hiPSC-MN и hiPSC-A спинного мозга описан на рисунке 1. В этом протоколе hiPSCs поддерживаются и проходят как несмешивающиеся колонии (рисунок 2A). Нейрогенез инициируется (нейронная индукция) путем двойного ингибирования SMAD путем добавления ПУТЕй LDN193189 и SB431542, инактивируя костной морфогенетический белок (BMP) и трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β) пути соответственно. Для этой стадии используется монослойный метод, где hiPSC наносятся на адгезивную матрицу, то есть матрицу базальной мембраны, для создания нейроэпителий-подобной 2D-культуры. Морфологически нейронная индукция отмечена переходом от iPSC с крупными ядрами и круглой формой к нейроэпителиальным (стволовым) клеткам, плотно уплотненным, с большой цитоплазмой и цилиндрической формой. Эти клетки будут делиться как по горизонтали, так и по вертикали, образуя многослойный эпителий (рисунок 2B,i).

Предпочтение 2D, в отличие от 3D-стратегии (т.е. эмбриоидной телесной), опирается на литературные данные11,12, предполагающие, что первый может способствовать формированию спинного мозга путем введения внешнеклеточных сигналов окружающей среды13. Нейроэпителиальные клетки затем временно и пространственно формируются для генерации специфических для региона, то есть спинного мозга, нервных клеток-предшественников (NPC) (рисунок 1). Для этой цели используются два ключевых морфогена: ретиноевая кислота, которая определяет каудализацию, и пурморфамин, сигнальный агонист ежа, который вызывает вентральную спецификацию. В их отсутствие клеточная внутренняя региональная идентичность NPC была бы ростральной и дорсальной 14,15,16.

От DIV 15 до DIV 25-DIV 30 региональная идентичность этих NPC усиливается путем дополнения сред морфогенами. В то же время раннее воздействие факторов роста нейронов и глиогенного цитокина, такого как цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), генерирует смешанную популяцию NPC (рисунок 2B, ii). Морфологически эти клетки менее уплотнены, чем нейроэпителиальные клетки, демонстрируя несколько коротких отростков, расположенных в монослое после нарушения столбчатого эпителия после пассажа при DIV 12. При ближайшем рассмотрении некоторые из этих клеток вытянуты, в то время как другие демонстрируют множественные процессы, что указывает на раннюю приверженность глиальной и нейрональной судьбе, соответственно.

Нейроны будут спонтанно возникать из этой смешанной популяции, если не активируется глиогенный переключатель (рисунок 1 и рисунок 2B, iii). Добавление ингибитора пути Notch, соединения E, усилит более низкую дифференцировку MN17. Идентичность спинного мозга этих клеток поддерживается высокими уровнями экспрессии ChAT (рисунок 2C, i). Кроме того, ранее было показано2 , что субпопуляция этих моторных нейронов также ISL1+.

Дифференцировка астроцитов индуцируется глиогенным переключателем посредством активации пути JAK/STAT (Рисунок 1 и Рисунок 2B,iv). CNTF и, вероятно, другие цитокины, содержащиеся в фетальной бычьей сыворотке, служат этой цели в предлагаемом протоколе. Время также является важным фактором, поскольку глиогенез будет спонтанно следовать после нейроногенеза из-за клеточных подсказок. После DIV 90 hiPSC-A демонстрируют созревающий фенотип, как указано в экспрессии S100β и GFAP 2,11, в то время как их региональная идентичность спинного мозга поддерживается экспрессией hoXB4 >90% (рисунок 2C, ii)2,11,14.

Метод совместного культивирования hiPSC-MN и hiPSC-A отличается одновременным покрытием этих подтипов клеток в отличие от методов, при которых нейроны последовательно покрываются поверх культур астроцитов. В этих одновременных кокультурах клетки будут перестраиваться спонтанно, причем астроциты создают питательный слой внизу, а нейроны соединяются в сети наверху (рисунок 2C, iii). Эта стратегия ранее показала2 , чтобы обеспечить более равномерное распределение нейронов, чем другие стратегии кокультуры, где эти типы клеток имеют тенденцию группироваться.

Человеческие iPSC-MN покрываются отдельно или в совместной культуре с hiPSC-A на 24-луночной MEA-пластине (n = 12 на условие), причем каждая скважина содержит 16 электродов (рисунок 3A). Показаны фазоконтрастные изображения моно- или сокультур и растровые графики пиковой активности из двух репрезентативных скважин (рисунок 3B,C). Человеческий iPSC-A усиливает электрофизиологическое созревание hiPSC-MN, о чем свидетельствуют значительно более высокие степени всплесков и разрывов активности в кокультурах (рисунок 3D). Это соответствует влиянию hiPSC-A на морфологическое и молекулярное созревание hiPSC-MN, что было ранее продемонстрировано2.

Некоторые из технических проблем этого протокола подробно описаны в видеоинструкциях, где показаны методы покрытия и записи с использованием платформ MEA, а также репрезентативные записи из этих культур.

Figure 1
Рисунок 1: Протокол генерации hiPSC-MN и hiPSC-A спинного мозга и их совместная культура. (A) Хронология протокола дифференциации с подробным описанием критических стадий. Во вставке сосредоточьтесь на 30-дневном протоколе генерации NPC спинного мозга с ежедневными действиями (среда обмена E, прохождение P или отсутствие действия), основание клеточной культуры и добавки (дополнительную информацию о составе см. в Таблице 1 и Таблице материалов). (B) Линии преемственности и обязательства по судьбе клеток схематично представлены. Кокультуры образуются, когда зрелые hiPSC-MN (т.е. DIV 60) и hiPSC-A (т.е. DIV 90) смешиваются и покрываются одновременно. (Иллюстрация создана с помощью BioRender). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Морфологические изменения во время протокола дифференцировки спинного мозга. (A) Фазово-контрастные микроскопические изображения hiPSC. Панели (i) (более низкая мощность, 10x) и (ii) (более высокая мощность, 20x) показывают нормальный hiPSC, панели (iii) (10x) и (iv) (20x) показывают дифференцированную колонию hiPSC. Шкала баров = 200 мкм и 50 мкм. (B) Репрезентативные фазовые контрастные микроскопические изображения нейроэпителиальных клеток в DIV 5 (i), NPC в DIV 21 (ii) и зрелых DIV 60 моторных нейронов (iii) и DIV 90 астроцитов (iv). Шкала стержней = 100 мкм и 50 мкм (С) Репрезентативные иммуноцитохимические изображения на 40-кратном масле hiPSC-MN (i), hiPSC-A (ii) и их кокультуре (iii). Были нацелены маркеры созревания и региона. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Многоэлектродная запись hiPSC-MN. (A) Тепловая карта средней пиковой активности от одной плиты MEA (n = 24 скважины) при DIV 18 после нанесения покрытия. Скважины в рядах A и B (n = 12 скважин / технических реплик) представляют культуры только hiPSC-MN, в то время как скважины в рядах C и D (n = 12 скважин) являются кокультурами hiPSC-MN / hiPSC-A. (B) Репрезентативные фазоконтрастные изображения hiPSC-MN в одиночку (MN) и в совместной культуре с hiPSC-A (MN + SCA) на пластинах MEA. Нейроны объединяются в большие кластеры клеток при культивировании в одиночку, в то время как кокультура hiPSC-MN с hiPSC-A приводит к равномерно распределенным монослоям. Шкала = 50 мкм. (C) Репрезентативный растровый график пиковой активности в течение времени записи более 120 с из одной скважины только с hiPSC-MN и hiPSC-MN в совместной культуре с hiPSC-A. Активность разрыва сети на всех электродах подсвечивается фиолетовым прямоугольником. (D) Количественная оценка и сравнение пиковой и разрывной активности между нейронами в одиночку и нейронами в кокультуре с астроцитами из пластины MEA, показанной на панели A. (*** p < 0,001, **** p < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

На сегодняшний день методы электрофизиологических записей кокультур астроцитарных нейронов на основе hiPSC и MEA нашли ограниченное применение в области ALS6 и до сих пор не полностью человеческие платформы, в отличие от их более широкого использования для моделирования эпилепсии in vitro 9. Эта платформа, однако, имеет потенциал для решения патофизиологически значимых вопросов в исследованиях БАС, таких как механизмы гипервозбудимости нейронов, вклад астроцитов в нейротоксичность или роль сетевой активности в прогрессировании заболевания. Кроме того, эта платформа позволяет собирать проспективные электрофизиологические данные в течение более 9 месяцев in vitro и, следовательно, обеспечивает подход к тестированию соединений с терапевтическим потенциалом2.

Протоколы генерации hiPSC-N и hiPSC-A, найденные в литературе, сильно различаются в отношении условий среды, сроков культур, профилей урожайности и созревания, среди других факторов. Основным преимуществом предлагаемой платформы является то, что астроциты и нейроны дифференцируются отдельно и культивируются вместе в более поздние моменты времени путем одновременного покрытия двух типов клеток. После оптимизации плотности и времени клеток этот метод может быть переведен для использования с типами клеток, полученными из других протоколов, включая другие ячейки, специфичные для региона.

Первостепенное значение для предлагаемой платформы имеет региональная спецификация двигательных нейронов и астроцитов. В то время как предлагаемый протокол специфичен для спинного мозга в своей способности генерировать астроциты ChAT + MN и HOXB4 + , хорошо зарекомендовавшие себя методы дифференцировки могут быть использованы для генерации нейронов и астроцитов, полученных из hiPSC, демонстрирующих кортикальные идентичности, такие как CTIP2 + слой V кортикальных моторных нейронов18 и OTX2 + астроциты переднего мозга14 . Таким образом, предлагаемая платформа имеет потенциал для моделирования нейронных цепей коры и спинного мозга, а также их связей.

Для записи MEA доступно несколько систем. Для исследования были предпочтительными пластиковые 24-луночные MEA-пластины с 16 электродами на скважину с CO2 и контролем температуры. Эта платформа особенно подходит для высокопроизводительного скрининга, в отличие от систем, основанных на записи одиночных скважин. Основным ограничением пластиковых пластин является то, что поверхность может быть более восприимчива к деградации при повторном использовании. Системы, основанные на стеклянных MEA-пластинах, имеют то преимущество, что их можно использовать многократно после соответствующих обработок, как описано выше (в 20 раз), без значительной потери качества записи данных. Однако эти обработки и методы покрытия являются более трудоемкими и технически сложными, учитывая гидрофобную поверхность этих пластин.

Одним из основных препятствий методов электрофизиологической регистрации на основе iPSC и MEA является изменчивость и воспроизводимость экспериментальных результатов. Предыдущие исследования показывают, что MEA-активность нейронов зависит от созревания, на которое влияют несколько факторов, включая, но не ограничиваясь, соответствующими методами дифференцировки, используемыми в генерации как астроцитов, так и нейронов, плотностью клеток нейронов, отношением астроцитов к нейронам на протяжении дифференцировки и созревания, последовательностью астроцитарных и нейронных кокультур2 . Стандартизация этих переменных, как это предлагается в настоящем протоколе, является одним из способов обеспечения воспроизводимости. Выбор многолуночных MEA-систем, генерирующих данные с высокой пропускной способностью, будет учитывать экспериментальную изменчивость. Если электрофизиологическая активность культуры меньше, чем ожидается в данный момент времени, важно определить, что произошла успешная дифференциация и полезны родственные культуры, которые могут быть иммуноцитохимически или биохимически проанализированы. Учитывая, что изначально засеивается очень небольшой объем клеток, небольшие ошибки пипетирования могут привести к относительно большим изменениям числа клеток и, следовательно, плотности. Использование пластин MEA, которые позволяют напрямую визуализировать и оценивать плотность клеток, также важно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта рукопись была поддержана следующим: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Премия за развитие карьеры клинического ученого Благотворительного фонда Дорис Дьюк (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Мы благодарим д-ра Раху Дастгейба и д-ра Нормана Хоги за предоставление платформы MEA и программного обеспечения для анализа данных, которое мы использовали для проверки описанной электрофизиологической платформы. Мы хотели бы поблагодарить Халила Руста за помощь в демонстрации протокола и съемках.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm sterile culture plates Falcon 353003
25 cm2 sterile culture flasks Falcon 353136
2-Mercaptoethanol (β-ME) Thermofisher 21985023 Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System Corning 430769
5 mL pipette Falcon 357543
6 well sterile culture plates Falcon 3046
Amphotericine B Gibco 15290018 Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme Sigma-Aldrich Z273287 Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC) Sigma A4403 Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) Axion OPT-24
Axion Edge MEA platform Axion Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel Corning 354277 Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) Zeiss 415510-1100-000 Primo Vert
Bicuculline Sigma Aldrich 14340 Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13 Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge AirGas/Harris 9296NC
Compound E Abcam ab142164 Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX) Sigma Aldrich C239 Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK) Tocris 111 Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12 Thermofisher 113300 Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement Thermofisher A1517001 Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermofisher 16140071 Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) Peprotech 450-10 Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer Election Microscopy Sciences 63510-20
Heparin Millipore-sigma H3149-100KU Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator ThermoFisher 370 set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) R&D systems 291-G1-200 Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid Abcam ab144490 Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10828 Working concentration 1x
Laminin Thermofisher 23017-015 Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189 Stemgent 04-0074 Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine Thermofisher 25030 Working concentration 100x
MEA glass plates MultiChannel Systems 60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200 Gilson PJ22224
Neurobasal Thermofisher 21103049 Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermofisher 11140050 Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin Thermofisher 15140122 Working concentration 100x
Polyornithine (PLO) Sigma-Aldrich P3655 Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl) NA NA Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN) Millipore-Sigma 540223 Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor Peprotech 1293823 Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542 Sigma S4317 Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods Baker Company SG-600
Supplement B - B27 Supplement Thermofisher 21985023 Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement Thermofisher 17502048 Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge ThermoFisher 75004261 Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm PARAFILM P7793
Tissue dissociation protease - Dispase StemCell Technologies 7923 Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermofisher 2530054 Working concentration 1x
Waterbath ThermoFisher 2332 Isotemp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Tags

Неврология выпуск 174 многоэлектродный массив внеклеточная запись скрининг анализ спинной мозг глия двигательный нейрон боковой амиотрофический склероз hiPSC болезнь двигательных нейронов моделирование заболеваний
Создание электрофизиологической платформы для моделирования БАС с регионально-специфическими человеческими плюрипотентными астроцитами и нейронами, полученными из стволовых клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A.,… More

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A., Liu, S., O'Brien, M., Maragakis, N. J. Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (174), e62726, doi:10.3791/62726 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter