Summary
我们描述了一种区分脊髓人诱导的多能源星形胶质细胞和神经元及其共培养以进行电生理记录的方法。
Abstract
人多能干细胞衍生的星形胶质细胞(hiPSC-A)和神经元(hiPSC-N)为 体外肌萎缩侧索硬化症(ALS)病理生理学建模提供了强大的工具。多电极阵列(MEA)记录是一种记录大量神经元的电场电位并分析网络活动随时间变化的方法。先前已经证明,与没有hiPSC-A或在存在啮齿动物星形胶质细胞的情况下培养的hiPSC-A相比,使用促进脊髓星形胶质细胞表型的技术分化的hiPSC-A的存在改善了区域特异性脊髓hiPSC-运动神经元(MN)的成熟和电生理活性。这里描述的是一种将脊髓hiPSC-A与hiPSC-MN共培养并使用MEA记录记录电生理活性的方法。虽然这里描述的分化方案特定于星形胶质细胞和脊髓区域特异性的神经元,但共培养平台可应用于星形胶质细胞和神经元,这些分化技术特定于其他命运,包括皮质hiPSC-A和hiPSC-N。这些协议旨在提供电生理测定,以告知神经胶质神经元相互作用,并为测试ALS中具有治疗潜力的药物提供平台。
Introduction
人类多能干细胞衍生的星形胶质细胞(hiPSC-A)和神经元(hiPSC-N)是体 外 模拟肌萎缩侧索硬化症(ALS)病理生理学的强大工具,并为药物发现策略提供了转化范式1。研究人员已经证明,hiPSC-A 与 hiPSC-N 的共培养增强了两种细胞类型的形态、分子、电生理和药理成熟,产生复杂的神经元网络和星形胶质细胞-神经元相互作用,类似于 体内 对应物2,3。类似的共培养实验可以概括ALS病理生物学的特征,例如星形胶质细胞介导的神经毒性4,5 和神经元过度兴奋性6。此外,随着分化方案的进步,人诱导多能干细胞(hiPSC)可以分化为区域特异性神经亚型,包括皮质和脊髓hiPSC-A和hiPSC-N7,8。这些策略为模拟ALS中的皮质和脊髓运动神经元病理学以及星形胶质细胞对两者的影响提供了潜力。然而,这需要有可重现的功能测定来确定这些影响。
最近研究表明,多电极阵列(MEA)记录特别适用于神经元-星形胶质细胞共培养物的电生理表征2。与单细胞电生理分析相反,这些高密度电极阵列被动记录来自大量神经元的细胞外场电位,而不会破坏培养条件并保持细胞膜的完整性。这些平台对于记录培养物随时间推移的细胞和网络活性以及对药物操作的响应特别有用。最后,当星形胶质细胞的存在是一个培养变量时,MEA记录可以提供星形胶质细胞-神经元双向相互作用的功能见解2,9。
这里介绍的是将hiPSC分化为脊髓hiPSC-A和hiPSC运动神经元(MN)的优化方案,该方案先前已经过验证2。脊髓 hiPSC-A 分化方案一致导致星形胶质细胞培养,分别在多达 80%、50% 和 90% 的细胞中对 S100 钙结合蛋白 B (S100β)、神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 和同源盒 B4 (HOXB4) 呈阳性,表明神经胶质细胞和脊髓规格成熟2,10.hiPSC-MN 分化方案产生的神经元胆碱乙酰转移酶 (ChAT) 呈 >90% 阳性,提示成熟的 α 运动神经元身份2。此外,该协议描述了用于生成hiPSC-A / MN共培养的技术,与没有星形胶质细胞或啮齿动物星形胶质细胞的神经元培养物相比,先前通过Scholl分析和免疫荧光显微镜证明导致神经元具有增强的形态复杂性2。虽然这些描述特定于脊髓hiPSC-A和hiPSC-N,但一个独特的优势是,星形胶质细胞和神经元的初始独立培养,然后在以后的时间点进行共培养的步骤可以转化为研究来自其他特定区域以及疾病特异性细胞的神经元 - 星形胶质细胞相互作用的影响7,8.最后,该协议描述了如何在MEA平板上培养这些培养物,以便随着时间的推移,可以通过操纵细胞组成和培养条件的能力来研究作为共培养组成因子的功能活性。
这些协议的目标是提供一种功能测定,以研究星形胶质细胞 - 神经元相互作用,检查疾病特异性变化,并测试在ALS领域具有治疗潜力的药物。为该协议最具挑战性的步骤提供了视频说明。
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Protocol
1. 细胞培养基制备
- 使用 表1中提到的组合物制备单个细胞培养基。
- 在500mL过滤瓶中混合并无菌过滤培养基,并在4°C避光下储存长达2周。
2. 维持和传代非融合人诱导多能干细胞 (hiPSC)
- 将基底膜基质(在-80°C下等分储存)在2-8°C冰箱中解冻过夜。
- 在冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Dulbecco的改良鹰培养基(DMEM)中以1:100(v / v)稀释基底膜基质。
- 加入足够的基底膜基质以涂覆组织培养板的底部(10cm板为5mL,6孔板的单孔为2mL),并在37°C下孵育至少30分钟过夜或在室温下孵育至少1小时。
- 吸出稀释的基底膜基质并用PBS洗涤板一次,然后加入培养基和接种细胞。
- 每天检查板,以确定和预测它们何时准备好通过。一旦大多数菌落变得足够致密,hiPSC的传代板就会使菌落的中心显示分散的白色区域。不要让板成熟超过这一点。由于细胞多层、边缘细长细胞过多、菌落内松散致密性或细胞死亡增加,它会导致过度分化,导致菌落中心出现黄色区域。
- 在通过当天,用记号笔在板的底部外表面上绘制网格线,以方便准确覆盖整个板。
- 使用相衬显微镜(10 倍放大倍率)用 200 μL 移液器吸头手动刮擦,在培养罩中分离分化菌落。
- 用PBS冲洗板两次(每次洗涤5毫升,10厘米板)。
- 加入5mL预热的组织解离蛋白酶(材料表),并在37°C下孵育细胞,直到菌落的边缘开始四舍五入(4-7分钟),但在菌落从平板上抬起之前。
- 小心地吸出解离蛋白酶。用PBS轻轻冲洗板两次,小心不要移开菌落。
- 向培养板中加入 5 mL 预热的 hiPSC 培养基(表 1)。
- 用 5 mL 移液器的尖端从上到下来回运动刮擦整个板,从而提起菌落,同时将它们分解成更小的细胞聚集体。
- 将板旋转 90° 并重复上述步骤。
- 用 5 mL 移液器上下移液轻轻研磨细胞聚集体,并在显微镜下定期检查聚集体的大小,直到大多数细胞聚集体约为 50-100 个细胞。
- 将细胞聚集体接种到预包被的基底膜基质板中,使用额外的hiPSC培养基洗涤原始板。使用 5 mL 移液器收集大部分细胞聚集体并将其转移到新板上。
注意:如果方案一致应用,则原始板在传代前应包含覆盖约50%培养表面的iPSC菌落。在这种情况下,分光比应为一个板到五个新板。 然而,这可能需要根据生长条件和细胞系特异性生长速率进行调整。 - 来回摇动新播种的板以均匀分布骨料。
- 将板转移到培养箱(37°C和5%CO2)中,并将它们不受干扰地放置过夜,以使细胞适当粘附。
- 每天用 10 mL hiPSC 培养基进行一次完整的培养基更换。如果在传代后第二天有多余的细胞碎片,请在更换培养基之前用 5 mL 培养基洗涤一次。
- 计划在大多数iPSC集落的中心出现白色区域时进行下一次传代(步骤2.5)。这将在每次通过后 4-6 天发生。
3. 冷冻 hiPSC
- 执行步骤2.5-2.14中的初始步骤,用于hiPSC传代。
- 将细胞聚集体收集到 15 mL 管中并以 200 x g 离心 2 分钟。
- 吸出上清液,将沉淀重悬于冷冻培养基中,并使用 5 mL 移液器转移到冷冻管中。
注意:与传代步骤类似,通常的分流比是一个iPSC板与五个冷冻管,具体取决于菌落的密度。每个冷冻管使用总体积为 1 mL 的冷冻培养基。 - 将冷冻管放入冷冻保存容器中,并将其转移到-80°C过夜。
- 24小时后将细胞转移到液氮中。
4. 解冻 hiPSC
- 用基底膜基质涂覆10厘米板(见2.1-2.3)。
- 从液氮中取出iPSC冷冻管,并立即将其置于37°C水浴中长达2分钟以快速解冻。在浴缸中摇动小瓶,直到它部分解冻并含有一小块被液体包围的冰。
- 使用 1000 μL 移液器将细胞聚集体从冷冻管转移到 15 mL 锥形管中。加入最多 15 mL 预热的 hiPSC 培养基,以稀释冷冻培养基中的二甲基亚砜 (DMSO)。
- 将 15 mL 锥形管以 200 x g 离心 2 分钟。
- 吸出上清液并使用 5 mL 移液管将细胞沉淀重悬于含有 20 μM R 相关螺旋线圈形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(ROCK-I,化合物 Y-27632)的 hiPSC 培养基中,以避免细胞聚集体的进一步研磨。
- 使用 5 mL 移液器将细胞聚集体转移到基底膜基质包被的 10 cm 板上。
注意:如果一致应用该方案,则可以将一个冷冻管中的细胞转移到单个10厘米板上。 - 摇动盘子以均匀分布骨料。
- 将板转移到培养箱中,使其不受干扰过夜,以允许适当的细胞粘附。
- 在解冻后的第二天,用不含 ROCK-I 的 10 mL hiPSC 培养基进行完全更换培养基。
5. 将hiPSC分化为脊髓神经祖细胞(NPC)
- 在开始分化之前,确保基底膜基质包被的 6 孔板已准备好使用。
- 从至少传代一次的iPSC开始,最好在解冻后传代两次,并且至少有四个10厘米板(参见步骤5.11中的解释)。
- 执行步骤2.5-2.14中针对hiPSC传代的初始步骤。
- 使用 5mL 移液器将细胞聚集体从至少两个 10 cm 板转移到 15 mL 管中。
- 以200 x g 离心2分钟。
- 吸出上清液并使用 10 mL 移液管用 10 mL hiPSC 培养基重悬细胞沉淀,然后再次以 200 x g 离心 2 分钟以松开每个聚集体中的细胞间粘附。
- 吸出上清液并使用 1000 μL 移液器将细胞沉淀重悬于 1 mL 含有 20 μM ROCK-I 的 hiPSC 培养基中。
- 用 1000 μL 移液器上下移液以研磨细胞聚集体。定期在显微镜下检查聚集体的大小,直到大部分细胞悬液包含单个细胞或<10个细胞的小聚集体。
- 用血细胞计数器(首选)或自动细胞计数器计数细胞,并计算细胞悬液中的细胞密度。
- 在预涂有基底膜基质的6孔板的每个孔中板3.0 x 106 个细胞。使用 1000 μL 移液器转移细胞悬液。
注意:如果协议一致应用,这对应于两个 10 cm 板与 6 孔/板的单个孔的比例。 - 用第二批两个10厘米板重复步骤5.3-5.10,并将最终产品板到第二个6孔板的基底膜基质中涂覆。使用 1000 μL 移液器转移细胞悬液。
注意:脊髓NPC方案的理想完成需要两个孔等于四个10厘米板。为了简化工作流程,使用两批两块板完成步骤5.3- 5.10,每批最终产物是两个独立的6孔板,每个孔中包含一个包含3.0 x 106 细胞的孔。 - 将所得的人 iPSC 单层维持在含有 20 μM ROCK-I 的 hiPSC 培养基中,直到汇合度达到 >90%,通常在第二天,但不超过初始接种后 3 天,以避免自发(不受控制)分化。
- 如果在细胞接种后的第二天无法开始分化,请用PBS洗涤细胞一次,并每天更换培养基至含有20μM ROCK-I的新鲜hiPSC培养基。如果在接种后3天内没有汇合>90%,则丢弃细胞并重新开始方案。
- 一旦达到 >90% 汇合率,就开始分化。这是分化方案的 体外 1(DIV1)。
- 在DIV 1上,丢弃含有20μM ROCK-I的hiPSC培养基,并用PBS冲洗两次,以去除干细胞培养基中存在的胎儿生长因子(FGF)和转化生长因子β(TGFβ)。
- 将培养基更换为WiCell培养基(表1),补充有0.2μM的LDN193189(LDN)和10μM的SB431542(SB)48小时。
- 在DIV 3上,用PBS洗涤一次,并将培养基更换为补充有LDN(0.5μM)+ SB(10μM)+ 视黄酸(RA; 1μM)的WiCell培养基48小时。
- 在DIV 5上,用PBS洗涤一次并将培养基更改为WiCell:神经诱导培养基(NIM)基底(表1)(50%:50%,v / v)补充有LDN(0.5μM)+ SB(10μM)+ RA(1μM)48小时。
- 在DIV 7上,使用与步骤5.18中相同的介质进行培养基交换。
- 在DIV 8上,用PBS洗涤一次,并将培养基更换为WiCell:NIM碱(50%:50%),补充有RA(1μM)+嘌吗呤胺(PMN)(1μM)+重组人脑源性神经营养因子(BDNF)(10ng / mL)+抗坏血酸(ASAC)(0.4μg/ mL)48小时。
- 在DIV 10上,用PBS洗涤一次,并将培养基更换为NIM碱(100%),如步骤5.20中所述补充48小时。
- 在DIV 11或12上,用基底膜基质涂覆25cm2 无菌培养瓶以准备传代。
- 从6孔板l的每个孔中吸出培养基,并用PBS冲洗细胞一次。
- 向每个孔中加入2mL的0.05%胰蛋白酶,并在37°C下孵育5-15分钟;间歇性摇动板可能有助于细胞脱离。
- 如果细胞仍未悬浮,则通过以圆周运动将 NIM 培养基从 1000 μL 移液器吸头喷射到细胞上(确保覆盖整个表面)或用细胞刮刀刮擦(不是首选)来机械分离。
- 将细胞从 2 孔转移到 15 mL 管中,并使用 5 mL 移液管以与所用胰蛋白酶量成适当比例添加胰蛋白酶抑制剂。
- 以 200 x g 离心 2 分钟,吸出上清液,然后使用 10 mL 移液管用 10 mL NIM 碱重悬。
- 再次以200× g 离心2分钟以松开细胞间粘附。
- 在第二个离心步骤后,除去上清液,并用 1 mL 补充有 RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0.4 μg/mL) 和 ROCK-I (20 μM) 的 1 mL NIM 培养基 (100%) 重新悬浮沉淀。使用 1000 μL 移液器吸头,上下研磨细胞约 5 次,直到获得浑浊的悬浮液。
- 将该培养基中的聚集体重新播种到包被的25cm 2无菌培养瓶的基底膜基质中,以便最终结果是将细胞从6孔板的两个孔组合到单个基底膜基质包被的25cm 2无菌培养瓶(2:1传代)。使用 1000 μL 移液器转移细胞悬液。
注意:细胞在DIV 13上应>90%汇合,直到第14天才需要进一步的步骤。如果细胞不汇合,请将 ROCK-I 在培养基中再保留 1 或 2 天。 - 在DIV 14上,将培养基更换为新鲜的NIM培养基+ RA(1μM)+ PMN(1μM)+ BDNF(10 ng / mL)+ ASAC(0.4μg/ mL)。
- 在DIV 15上,将培养基更改为NIM:神经分化培养基(NDM)基础(表1)(50%:50%),RA(1μM)+ PMN(1μM)+ ASAC(0.4μg/ mL)+补充剂B(50x)+ BDNF(10ng / mL)+神经胶质细胞系衍生神经营养(GDNF)(10ng / mL)+胰岛素样生长因子1(IGF-1)(10ng / mL)+睫状神经营养因子(CNTF)(10ng / mL)。每隔一天更换一次新鲜媒体。
- 在DIV 21上,将培养基更换为NDM基料(100%),如步骤5.32所示,并每隔一天更换一次新鲜培养基。
- 在DIV 25-30上,收集NPC并冷冻它们或将它们传到10厘米的板上进行终末分化。
- 用PBS冲洗T-25烧瓶并加入0.05%胰蛋白酶。
- 在37°C孵育5分钟。
- 用NDM碱冲洗胰蛋白酶和细胞,并转移到15 mL锥形管中。加入胰蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶成适当比例,并以300× g 离心5分钟。
- 用运动神经元或星形胶质细胞分化培养基重悬细胞沉淀(表1),并使用1000μL移液器上下研磨以获得单细胞悬液(通常最多5次)。
- 计数细胞并转移到如第6节所述涂被的10cm平板上,使用分化培养基+ Rock-I来区分hiPSC-MN和hiPSC-A。
- 或者,通过将培养物重悬于由具有生长因子的90%NDM培养基(如步骤5.32-5.33)和10%DMSO组成的冷冻培养基中来冷冻培养物,类似地研磨,然后转移到冷冻管中。每个冷冻管等分试样 6 x 106 鼻咽癌。
6. 解冻NPC文化
- 在解冻细胞的前一天用聚鸟氨酸(PLO)和层粘连蛋白涂覆10厘米板。
- 将 5 mL 的 PLO 稀释至 100 μg/mL 的 PBS 或蒸馏水 (dH2O) 加入板中。在37°C孵育至少1小时至过夜。
- 吸出PLO溶液并用PBS冲洗板三次。(如果清洗不当,巴解组织是有毒的。
- 将用PBS稀释至浓度为10μg/ mL的层粘连蛋白添加到PLO包被板中。在37°C孵育至少1小时,最好过夜。孵育后,在不冲洗的情况下吸出层粘连蛋白溶液以增强细胞粘附。
注意:板可以提前涂上PLO,用水洗涤三次,在无菌罩中干燥,并储存在4°C。
- 对于每个10cm细胞培养板,解冻一个含有6 x 106个细胞 /小瓶的NPC小瓶(即DIV 25或30)。
- 从液氮中取出NPC冷冻管,并立即置于37°C水浴中长达2分钟。通过摇动小瓶快速解冻,直到有一个被液体包围的小冰块。
- 使用 1000 μL 移液器将细胞聚集体转移到 15 mL 锥形中,并加入最多 15 mL 预热的 NDM 或 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) / Ham's F21 F12 添加剂以稀释 DMSO。
- 以300 x g 离心5分钟。
- 吸出上清液,用星形胶质细胞或MN分化培养基(表1)+ ROCK-I(20μM)重悬细胞沉淀,并使用1000μL移液器上下研磨,直到获得单细胞悬液(最多5次)。
- 将单细胞悬液转移到PLO-层粘连蛋白包被的10cm板上。
- 将板转移到培养箱中,使其不受干扰过夜,以允许适当的细胞粘附。
7. 脊髓鼻咽癌分化为运动神经元
- 执行步骤6.1-6.8中提到的初始步骤,最终培养基为MN分化培养基+ ROCK-I(20μM)。
- 电镀后的第二天,用不含ROCK-I的MN分化培养基进行完全更换培养基,然后每隔一天更换一次培养基。在周末,在周五喂食细胞,然后在周一再次喂食。需要时用PBS冲洗细胞以去除细胞碎片。
- 用MN分化培养基+胞嘧啶阿拉伯糖苷(ARA-C)(0.02μM)更换培养基,当神经胶质承诺祖细胞在有丝分裂后膜性肾病祖细胞下作为单个增殖扁平细胞在细胞簇中聚集时孵育48小时。
注意:通常,这发生在初始接种后的前7天内,尽管根据细胞系的不同,可能存在差异。 - 48小时后,吸出含有ARA-C的培养基,用PBS轻轻冲洗培养物三次,然后将培养基更换为没有ARA-C的新鲜MN培养基。
- 用ARA-C治疗后,每隔一天(或周一,周三和周五)进行一次培养基更换,方法是用手动移液器而不是真空吸引器去除旧培养基,以防止神经元簇过早脱离。此外,每周一次用层粘连蛋白 1 μg/mL 富集 MN 培养基,以进一步增强神经元对培养板的附着。
8.将鼻咽癌分化为脊髓星形胶质细胞
- 如第6节所述解冻NPC培养物,使用星形胶质细胞分化培养基(表1),加入体积浓度为1%(NS + 1%FBS)的胎牛血清(FBS)以及用于电镀的ROCK-I(20μM)。
注意:市售血清替代品(表1)可以使用相同的稀释因子代替FBS。 - 在铺板后的第二天,用不含ROCK抑制剂的NS + 1%FBS培养基更换培养基,然后每隔一天更换一次培养基。在周末,周五喂食细胞,然后在周一再次喂食细胞。需要时用PBS冲洗细胞以去除细胞碎片。如果细胞继续死亡,请用ROCK-I(10μM)补充培养基以促进细胞存活。注意不要太频繁或太长时间使用ROCK-I,因为有可能选择永生细胞。
- 让星形胶质细胞在传代之前融合。
注意:细胞大小会随着时间的推移而增加,因此没有设定的传代数量。典型的传代比率为 1:2 或 1:3。在存活率差或传代到太多平板的情况下,将两个(或更多,根据需要)10 cm板合并到一个10 cm板上以保持汇合。 - 为了传代星形胶质细胞祖细胞培养物,用PBS洗涤板一次(以去除FBS),用0.05%胰蛋白酶孵育5分钟,将细胞收集在NS培养基+ 1%FBS中(FBS将使胰蛋白酶失活),然后以300× g 离心5分钟。吸出上清液,将细胞重悬于NS培养基+ 1%FBS中,然后研磨至单细胞悬液。将NS + 1%FBS中的细胞分配到新的10厘米板上。
注意:除了扩增星形胶质细胞培养物外,平板的重复传代还用于杀死任何选择神经元命运的剩余祖细胞。因此,即使有丝分裂率不是很高,如果出现神经元污染,板也可以以 1:1 的比例传代。 - 在分化过程中改变涂层以提高产量,如下所示。
- 将最初解冻的NPC培养物和初始接种到PLO /层粘连蛋白后的第一批传代中铺板。
- 将未成熟的星形胶质细胞铺在基底膜基质涂层板上。
- 将更成熟的星形胶质细胞(即,90天后)铺在基底膜基质、PLO/层粘连蛋白包被的平板(通常用于与神经元共培养)或未包被的平板上。
- 在60天成熟期内的任何时间点冷冻星形胶质细胞祖细胞,以同步培养物或保存以供以后的实验使用。当解冻超过NPC阶段时,将星形胶质细胞祖细胞解冻到基底膜基质包被的平板上,而不是PLO /层粘连蛋白。
- 在DIV 90及以后,将培养基从NS + 1%FBS切换到NS + 5%FBS,以促进星形胶质细胞存活并减少其增殖。
9. 在多电极阵列板中共培养 MN 和脊髓星形胶质细胞
- 当运动神经元和星形胶质细胞准备在同一天使用并老化至运动神经元的DIV 60和星形胶质细胞的DIV 90时,分化并铺板。
- 如果使用 24 孔塑料板,请在电镀前一天或当天涂覆 MEA 板,如下所示(材料表)。
- 将 PLO 在水或 PBS 中稀释至 100 μg/mL。
- 向每个孔中加入 15-20 μL(取决于移液器的舒适度),在孔的中心形成一个液滴,覆盖电极区域和周围区域,但不是整个孔。
- 注意不要损坏移液器吸头的电极。与孔与孔的体积一致,以确保覆盖每个孔中相同的表面积。
- 将PLO在37°C孵育至少1小时(优选2小时)。
注意:如果板中没有足够的湿度,小体积会变干。向井周围的隔间加水,以确保在整个涂层和记录过程中有足够的湿度。
- 使用塑料微量移液器吸头吸出尽可能多的PLO。注意不要触摸电极。用 250 μL 水洗涤 3 次。如果使用真空吸液器进行洗涤,请勿让尖端靠近电极阵列。第三次洗涤后,根据需要使用移液器吸头尽可能多地去除水。取下盖子,让表面在细胞培养罩下干燥。
- 板表面干燥后,加入在PBS中稀释至10μg/ mL的层粘连蛋白。使用 15-20 μL 覆盖每个电极阵列。向湿度室中加水,更换盖子,然后将板返回到37°C孵育至少2小时至过夜。
- 在铺板当天,用PBS冲洗MN和星形胶质细胞培养物一次,并在37°C下加入胰蛋白酶0.05%以提升细胞(5分钟)。收集到含有胰蛋白酶抑制剂的 15 mL 锥形管中,并用培养基或碱洗涤板,以确保收集所有细胞。以 300 x g 离心 5 分钟,然后用 1000 μL 移液器重悬以产生 1 mL 的单细胞悬液。当重新悬浮MN和星形胶质细胞时,切换到共培养基(表1),加入20μM ROCK-I。
- 使用血细胞计数器平行计数MN和星形胶质细胞。在计数和计算时,盖上细胞悬浮液并将其置于4°C的聚苯乙烯泡沫塑料架中。
- 计算将培养物重悬至运动神经元每 5 μL 5 x 10 4 个细胞和星形胶质细胞每 5 μL 2.5 x 104 个细胞的浓度所需的体积。将 1 mL 细胞悬液以 300 x g 离心 5 分钟,并以计算的体积重悬。
- 计算要接种的所需孔数,并将其乘以每个细胞悬液的 5 μL。以 1:1 的比例混合所需体积的神经元和星形胶质细胞悬浮液,并通过移液混合直至完全混合(通常两次),但避免过于激进。
- 使用移液器吸头从MEA板的每个孔中取出层粘连蛋白。将 10 μL 最终组合细胞悬液转移到每个孔中,形成覆盖电极阵列的小液滴,以提供每孔 5 x 10 4 MN 和 2.5 x 104 个星形胶质细胞的细胞密度。
注意:组合悬浮液中的高细胞密度需要在接种步骤期间在孔之间频繁重悬,以确保准确和一致的细胞计数。 - 将板放回培养箱20-30分钟。注意不要干扰细胞液滴,让细胞在平板上形成初始附着。
- 20-30 分钟后,将 250 μL 向下移液到每个孔壁上,然后在另一侧的同一孔壁上再移取 250 μL,向每个孔中加入温热的共培养基 + ROCK-I。将板放回培养箱。
- 播种后第二天检查平板(共培养第1天)。如果有明显的细胞碎片或死细胞,请用含有ROCK-I的新鲜共培养基交换培养基。否则,在播种后的第二天(共培养第2天)将培养基更换为不含ROCK-I的共培养基。每周进行两次半介质交换(吸出50%,并添加最终体积的60%以解决蒸发)。
- 如果使用单孔30 mm玻璃板的MEA系统(材料表),板制备可能需要2天或更长时间。请按照以下步骤执行此操作。
- 用0.05%胰蛋白酶从先前的MEA培养物中取出细胞和细胞碎片5-15分钟。
- 吸出胰蛋白酶并用水冲洗三次。
- 通过加入70%乙醇进行灭菌,并在罩中孵育10分钟。吸出乙醇,然后用水冲洗三次。
- 在水中涂抹含有蛋白酶的1%阴离子洗涤剂。用盖子盖住板,用热塑性薄膜和铝箔包裹,然后将它们放在室温下的摇杆上过夜。
- 吸出洗涤剂,然后用水冲洗三次。
- 如果计划储存盘子,请添加足够体积的水。用盖子盖住盘子,用热塑性薄膜和铝箔包裹,然后将它们放在冰箱中,直到下次使用。
- 如果计划涂覆,让表面在细胞培养罩下干燥。
- 如果需要额外的灭菌(例如,以前的感染或最近的非使用),仅在此时,将MEA板暴露在引擎盖下的紫外线(UV)下30-60分钟。
注意:避免频繁的紫外线将防止损坏电极。当板上有血清时,使用紫外线会导致电极不起作用,这就是为什么它应该只用于清洁的板。 - 当板完全干燥时,进行等离子清洗1分钟,以对MEA板的玻璃表面充电并提高涂层效果。等离子清洗至少每4-5个MEA板清洗电镀循环一次。
- 作为替代方案,当等离子清洗不可行或无需保证时,添加足够体积的含FBS的培养基以覆盖MEA板的表面,并将它们放回培养箱过夜。
- 使用PLO/层粘连蛋白涂层,如上文第6节所述。在等离子体清洁或吸出并冲洗出含FBS的培养基后立即加入PLO溶液(PBS中的100μg)。
- 如上所述以以下密度铺板细胞:1 x 10 5 hiPSC-A /板和5 x 105 hiPSC-MN /板。
10. 多电极阵列记录
- 使用具有200 Hz高通和3 kHz低通滤波器的巴特沃兹滤波器,以12.5 kHz采样频率提取原始电压数据。将尖峰识别设置为电压的瞬时时间点≥基线的 6 个标准偏差。将突发识别为 100 毫秒内具有 >5 个峰值的活动。当超过 35% 的总有源电极在 100 毫秒内发射且每个网络突发至少 50 个峰值时,定义网络活动。
- 在共培养 (CC) 第 1 天后尽快开始录制。
注意:在CC第3天之前很少会注意到电活动。 - 以相似的密度进行平行培养,并在适当的培养板或盖玻片中重复进行生化测定、免疫细胞化学 (ICC) 或 qPCR。
- 在温度设置为 37 °C 和 CO2 的 5% 的情况下进行记录。将板转移到机器上,并在记录前让它们平衡至少 5 分钟。
- 每隔一天或每周记录一次基线活动,超过1-15分钟,具体取决于实验设计。更换培养基后至少1小时不要记录,理想情况下在每次更换培养基后等待24小时。
- 为了防止污染,在任何记录后更换培养基(即,如步骤9.14中的半培养基交换),其中无菌板的盖子必须在无菌罩外打开(即,应用药物化合物)。如果板要在药物治疗后继续使用,请进行完整的培养基更换和洗涤以洗掉药物。
- 出于分析目的,每种情况至少使用三个技术和生物学重复。将电生理数据表达为 n ≥ 3 个重复的平均值。
11. 多电极阵列的药理学分析
- 根据实验问题使用不同的共培养组合:具有对照星形胶质细胞的ALS神经元,具有ALS星形胶质细胞的对照神经元,ALS神经元和星形胶质细胞,对照神经元和星形胶质细胞。
- 在研究靶向神经元或星形胶质细胞的化合物的瞬时电生理效应时,在取下板盖但关闭机器盖的情况下记录基线活性至少 1 分钟。
- 在不停止电生理记录的情况下手动打开机器的盖子,如果处理多个孔,则使用多通道移液器将 25 μL 培养基与适当的药物载体(通常是新鲜培养基)交换。手动合上盖子。
- 再记录 1 分钟(如果有显着的载体引起的变化需要恢复培养物,则记录更长时间)。
- 再次手动打开盖子,将 25 μL 培养基与同一载体中感兴趣的药物交换。合上机器的盖子并继续记录。
注意:记录的持续时间和给药的药物/载体的体积可能会有所不同或需要优化,具体取决于实验问题。 - 出于分析目的,请确保车辆的添加不会引起电生理参数的显着变化。计算药物后活性与车辆添加后相比的百分比变化,并在条件之间进行比较。
- 为了研究纵向电生理效应,例如候选疾病修饰药物,记录步骤11.2中概述的基线活性。为此,在适当的载体中使用含有目标药物的共培养基或仅包含载体的培养基。
- 出于分析目的,比较ALS的时间点记录或对照用药物纵向处理的共培养物以及对照条件。
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Representative Results
用于生成hiPSC-MN和脊髓hiPSC-A的脊髓模式方案如图 1所示。在该协议中,hiPSCs作为非融合集落维持和传代(图2A)。通过添加LDN193189和SB431542的双重SMAD抑制启动神经发生(神经诱导),分别灭活骨形态发生蛋白(BMP)和转化生长因子-β(TGF-β)途径。此步骤使用基于单层的方法,其中将hiPSC接种到贴壁基质(即基底膜基质)上,以产生神经上皮样2D培养物。在形态学上,神经诱导的特征是从具有大细胞核和圆形的iPSC过渡到紧密紧凑,具有大细胞质和圆柱形的神经上皮(干细胞)细胞。这些细胞将水平和垂直分裂,产生多层上皮(图2B,i)。
与3D策略(即基于胚胎体)相比,对2D的偏好依赖于文献证据11,12,表明前者可能通过引入细胞外在环境线索来促进脊髓模式化13。然后将神经上皮细胞在时间和空间上模式化以产生区域特异性,即脊髓,神经祖细胞(NPC)(图1)。两种关键的形态原用于此目的:视黄酸,它决定尾部化,和紫吗啡胺,一种刺猬信号激动剂,它导致腹侧规格。在它们缺席的情况下,NPC的细胞内在区域身份将是喙和背14,15,16。
从 DIV 15 到 DIV 25-DIV 30,这些 NPC 的区域身份通过补充具有形态原的培养基得到加强。同时,早期暴露于神经元生长因子和神经胶质生成细胞因子(如睫状神经营养因子(CNTF))会产生混合的NPC群体(图2B,ii)。在形态上,这些细胞比神经上皮细胞更不紧凑,显示出很少的短过程,在DIV 12传代后柱状上皮破裂后以单层排列。仔细观察,其中一些细胞被拉长,而另一些则显示出多个过程,这分别表明了对神经胶质与神经元命运的早期承诺。
神经元将从这个混合群体中自发出现,除非胶质生成开关被激活(图1和图2B,iii)。添加Notch途径抑制剂化合物E将增强较低的MN分化17。这些细胞的脊髓特性得到了高水平的ChAT表达的支持(图2C,i)。此外,先前已经表明2这些运动神经元的亚群也是ISL1+。
星形胶质细胞分化是由胶质细胞通过激活JAK / STAT途径诱导的(图1和图2B,iv)。CNTF和胎牛血清中可能含有的其他细胞因子在拟议的方案中用于此目的。时间也是一个重要因素,因为由于细胞内在线索,神经胶质发生会在神经发生后自发地随之而来。在DIV 90之后,hiPSC-A显示出由S100β和GFAP表达2,11所示的成熟表型,而它们的脊髓区域特性得到HOXB4表达的>90%的支持(图2C,ii)2,11,14。
共培养hiPSC-MN和hiPSC-A的方法值得注意的是同时接种这些细胞亚型,而不是将神经元连续接种在星形胶质细胞培养物顶部的技术。在这些同时的共培养中,细胞将自发地重新排列,星形胶质细胞在底部形成喂养层,神经元在顶部连接网络(图2C,iii)。该策略先前已显示2 允许神经元比其他共培养策略更均匀的分布,其中这些细胞类型倾向于聚集。
将人iPSC-MN单独接种或与hiPSC-A共培养在24孔MEA板上(每个条件n = 12),每个孔包含16个电极(图3A)。显示了来自两个代表性井的单培养或共培养的相差图像以及尖峰活动的光栅图(图3B,C)。人 iPSC-A 增强了 hiPSC-MN 的电生理成熟,如共培养物中显著更高的尖峰和爆裂活性所示(图 3D)。这与hiPSC-A对hiPSC-MN形态和分子成熟的影响相似,先前已证明2。
视频说明中详细介绍了该协议的一些技术挑战,其中显示了使用MEA平台进行电镀和记录的技术以及来自这些培养物的代表性记录。
图 1:脊髓 hiPSC-MN 和 hiPSC-A 的生成方案及其共培养 。 (A)详细说明关键阶段的分化方案时间表。在插页中,重点关注产生脊髓 NPC 的 30 天方案,包括逐日作用(E 交换培养基、P 传代或无作用)、细胞培养基和补充剂(有关组成的更多信息,请参阅表 1 和 材料表)。(B)谱系和细胞命运承诺示意性地表示。当成熟的hiPSC-MN(即DIV 60)和hiPSC-A(即DIV 90)同时混合和铺板时,会产生共培养物。(使用BioRender创建的插图)。 请点击此处查看此图的大图。
图2:脊髓分化方案期间的形态变化 。 (A)hiPSC的相差显微镜图像。图(i)(较低功率,10x)和(ii)(较高功率,20x)显示正常的hiPSC,面板(iii)(10x)和(iv)(20x)显示分化的hiPSC集落。比例尺= 200 μm和50 μm。 (B)DIV 5(i)的神经上皮细胞,DIV 21(ii)的NPC以及成熟的DIV 60运动神经元(iii)和DIV 90星形胶质细胞(iv)的代表性相差显微镜图像。比例尺 = 100 μm 和 50 μm (C) 40x 油的 hiPSC-MN (i)、hiPSC-A (ii) 及其共培养 (iii) 上的代表性免疫细胞化学图像。靶向成熟和区域特异性标志物。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:hiPSC-MN 的多电极阵列记录。 (A)电镀后DIV 18处单个MEA板(n = 24孔)的平均尖峰活动热图。A行和B行中的孔(n = 12孔/技术重复)代表单独的hiPSC-MN培养物,而C行和D行(n = 12孔)中的孔是hiPSC-MN/hiPSC-A的共培养物。(B)单独使用hiPSC-MN和在MEA平板上与hiPSC-A(MN + SCA)共培养的代表性相衬图像。当单独培养时,神经元聚集在大细胞簇中,而hiPSC-MN与hiPSC-A的共培养导致均匀分布的单层。比例尺 = 50 μm。 (C) 单独使用 hiPSC-MN 和与 hiPSC-A 共培养的 hiPSC-MN 的单个孔记录时间超过 120 秒的尖峰活动的代表性光栅图。所有电极的网络突发活动用紫色框突出显示。(D)单独神经元与来自图A所示的MEA板星形胶质细胞共培养的神经元之间的尖峰和爆发活性的定量和比较(*** p < 0.001,**** p < 0.0001)。 请点击此处查看此图的大图。
表 1.请按此下载此表格。
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Discussion
迄今为止,基于hiPSC和MEA的星形胶质细胞-神经元共培养电生理记录方法在ALS6领域的应用有限,并且仍然没有在完全人类平台上应用,相比之下,它们更广泛地用于癫痫9的体外建模。然而,该平台有可能解决ALS研究中的病理生理学相关问题,例如神经元过度兴奋的机制,星形胶质细胞对神经毒性的贡献或网络活动在疾病进展中的作用。此外,该平台允许在体外收集超过9个月的前瞻性电生理数据,因此提供了一种测试具有治疗潜力的化合物的方法2。
文献中发现的生成hiPSC-N和hiPSC-A的方案在培养基条件、培养时间、产量和成熟曲线等因素方面差异很大。所提出的平台的一个主要优点是星形胶质细胞和神经元通过同时接种两种细胞类型分别分化并在以后的时间点一起培养。在优化细胞密度和时间后,该方法也可以转换为用于来自其他协议的细胞类型,包括其他区域特异性细胞。
所提出的平台最重要的是运动神经元和星形胶质细胞的区域规范。虽然提出的方案在产生ChAT+ MN和HOXB4 +星形胶质细胞的能力方面具有脊髓特异性,但成熟的分化技术可用于生成显示皮质身份的hiPSC衍生神经元和星形胶质细胞,例如CTIP2 +层V皮质运动神经元18和OTX2 +前脑星形胶质细胞14.因此,所提出的平台有可能模拟皮层和脊髓的神经回路,以及它们的连接。
有多个系统可用于MEA记录。该研究首选塑料24孔MEA板,每孔16个电极,CO2 和温度控制。该平台特别适用于高通量筛选,而不是基于单孔记录的系统。塑料板的主要限制是表面在重复使用后更容易降解。基于玻璃MEA板的系统具有在如上所述的适当处理后可多次重复使用的优点(最多20次),而不会显着损失数据记录质量。然而,考虑到这些板的疏水表面,这些处理和涂层方法更耗时且技术上更具挑战性。
基于iPSC和MEA的电生理记录方法的主要障碍之一是实验结果的可变性和可重复性。先前的研究表明,神经元的MEA活性取决于受多种因素影响的成熟,包括但不限于星形胶质细胞和神经元生成中使用的适当分化技术,神经元的细胞密度,星形胶质细胞在整个分化和成熟过程中与神经元的比例,星形胶质细胞和神经元共培养的序列2.按照本协议中提出的标准化这些变量是确保可重复性的一种方法。选择生成高通量数据的多孔MEA系统将考虑实验的可变性。如果培养物的电生理活性低于给定时间点的预期,则确定已成功分化并且可以通过免疫细胞化学或生化分析的姊妹培养物是有帮助的,这一点很重要。鉴于最初接种的细胞体积非常小,因此小的移液误差会导致细胞数量发生相对较大的变化,从而导致密度发生较大变化。使用允许直接可视化和评估细胞密度的MEA板也很重要。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该手稿得到以下支持:2019 MSCRFF 5119 (AT)。K08NS102526 NIH/NINDS (CWH),2020 年多丽丝杜克慈善基金会临床科学家职业发展奖 (CWH)。1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM).我们感谢Raha Dastgheyb博士和Norman Haughey博士提供MEA平台和数据分析软件,我们用它来验证所描述的电生理平台。我们要感谢Khalil Rust在协议演示和拍摄方面的协助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
Basement Membrane matrix - Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
Supplement B - B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
Supplement N - N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
Thermoplastic film - Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
Tissue dissociation protease - Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
References
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