Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Etablering av en elektrofysiologisk plattform för modellering av ALS med regionalt specifika humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter och neuroner

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62726
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en metod för att differentiera ryggmärgsinducerade pluripotenta härledda astrocyter och neuroner och deras samkultur för elektrofysiologisk registrering.

Abstract

Humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter (hiPSC-A) och neuroner (hiPSC-N) ger ett kraftfullt verktyg för modellering av amyotrofisk lateral skleros (ALS) patofysiologi in vitro. Multi-electrode array (MEA) inspelningar är ett sätt att registrera elektriska fältpotentialer från stora populationer av neuroner och analysera nätverksaktivitet över tiden. Det har tidigare visats att närvaron av hiPSC-A som differentieras med hjälp av tekniker för att främja en ryggmärgs astrocytfenotyp förbättrade mognad och elektrofysiologisk aktivitet hos regionalt specifika ryggmärgs hiPSC-motorneuroner (MN) jämfört med de som odlades utan hiPSC-A eller i närvaro av gnagarastrocyter. Här beskrivs en metod för att samodla ryggmärgen hiPSC-A med hiPSC-MN och registrera elektrofysiologisk aktivitet med hjälp av MEA-inspelningar. Medan differentieringsprotokollen som beskrivs här är specifika för astrocyter och neuroner som är regionalt specifika för ryggmärgen, kan samodlingsplattformen tillämpas på astrocyter och neuroner differentierade med tekniker som är specifika för andra öden, inklusive kortikala hiPSC-A och hiPSC-N. Dessa protokoll syftar till att tillhandahålla en elektrofysiologisk analys för att informera om glia-neuroninteraktioner och tillhandahålla en plattform för att testa läkemedel med terapeutisk potential vid ALS.

Introduction

Humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter (hiPSC-A) och neuroner (hiPSC-N) är kraftfulla verktyg för modellering av patofysiologi för amyotrofisk lateral skleros (ALS) in vitro och ger ett translationellt paradigm för strategier för läkemedelsupptäckt1. Forskare har visat att samkulturen av hiPSC-A med hiPSC-N förbättrar den morfologiska, molekylära, elektrofysiologiska och farmakologiska mognaden av båda celltyperna, vilket genererar komplexa neuronala nätverk och astrocyt-neuroninteraktioner som liknar deras in vivo-motsvarigheter 2,3. Liknande samodlingsexperiment kan rekapitulera kännetecken för ALS-patobiologi såsom astrocytmedierad neurotoxicitet 4,5 och neuronal hyperexcitabilitet6. Dessutom, med framsteg i differentieringsprotokoll, kan humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) differentieras till regionalt specifika neurala subtyper, inklusive kortikala och ryggmärgs hiPSC-A och hiPSC-N 7,8. Dessa strategier ger potential för modellering av kortikal och spinal motorneuronpatologi vid ALS såväl som det astrocytiska inflytandet på båda. Detta kräver dock att det finns en reproducerbar funktionell analys för att bestämma dessa effekter.

Nyligen visades att multielektrodmatris (MEA) inspelning är särskilt lämplig för elektrofysiologisk karakterisering av neuron-astrocyt-samkulturer2. I motsats till encelliga elektrofysiologiska analyser registrerar dessa elektroduppsättningar med hög densitet passivt extracellulära fältpotentialer från stora populationer av neuroner utan att störa odlingsförhållandena och bevara cellmembranens integritet. Dessa plattformar är särskilt användbara för att registrera kulturernas cellulära och nätverksaktivitet över tid och som svar på farmakologisk manipulation. Slutligen, när närvaron av astrocyter är en kulturvariabel, kan MEA-inspelningar ge funktionella insikter i dubbelriktade interaktioner mellan astrocyt-neuron 2,9.

Här presenteras ett optimerat protokoll för differentiering av hiPSC till ryggmärgs hiPSC-A och hiPSC-motorneuroner (MN) som tidigare har validerats2. Ryggmärgs hiPSC-A-differentieringsprotokoll resulterar konsekvent i astrocytkulturer, som är positiva för S100 kalciumbindande protein B (S100β), glialt fibrillärt surt protein (GFAP) och Homeobox B4 (HOXB4) i upp till 80%, 50% respektive 90% av cellerna, vilket indikerar en mognad glial och ryggmärgsspecifikation 2,10 . HiPSC-MN-differentieringsprotokollet genererar neuroner som är >90% positiva för kolinacetyltransferas (ChAT), vilket tyder på en mogen alfa-motorisk neuronidentitet2. Dessutom beskriver protokollet tekniker för generering av hiPSC-A/MN-samkulturer som tidigare visat sig resultera i neuroner med förbättrad morfologisk komplexitet genom Scholl-analys och immunofluorescerande mikroskopi jämfört med neuronala kulturer utan astrocyter eller med gnagarastrocyter2. Även om dessa beskrivningar är specifika för ryggmärgs hiPSC-A och hiPSC-N, är en unik fördel att den initiala oberoende kulturen av astrocyter och neuroner följt av steg till samodling vid senare tidpunkter kan översättas för att studera effekterna av neuron-astrocytinteraktioner från andra specifika regioner såväl som sjukdomsspecifika celler 7,8 . Slutligen beskriver protokollet hur man odlar dessa kulturer på MEA-plattor så att funktionell aktivitet som en faktor för samkulturkomposition kan studeras över tid med förmågan att manipulera cellulär sammansättning såväl som odlingsförhållanden.

Målet med dessa protokoll är att tillhandahålla en funktionell analys för att undersöka astrocyt-neuroninteraktioner, undersöka sjukdomsspecifika förändringar och testa läkemedel med terapeutisk potential inom ALS-området. Videoinstruktioner tillhandahålls för de mest utmanande stegen i detta protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av cellodlingsmedia

  1. Bered de enskilda cellodlingsmedierna med de kompositioner som anges i tabell 1.
  2. Blanda och sterilfiltrera mediet i 500 ml filtrerade flaskor och förvara skyddat från ljus vid 4 °C i upp till 2 veckor.

2. Underhåll och överföring av icke-konfluenta humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC)

  1. Tina basalmembranmatrisen (förvaras i alikvoter vid -80 °C) i ett kylskåp på 2–8 °C över natten.
  2. Späd basalmembranmatrisen vid 1:100 (v/v) i kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM).
  3. Tillsätt tillräckligt med basalmembranmatris för att täcka botten av vävnadsodlingsplattan (5 ml för en 10 cm platta, 2 ml för enkla brunnar med 6-brunnsplatta) och inkubera vid 37 °C i minst 30 minuter över natten eller vid rumstemperatur i minst 1 timme.
  4. Aspirera den utspädda basalmembranmatrisen och tvätta plattan en gång med PBS innan du tillsätter odlingsmedia och såddceller.
  5. Undersök plattorna dagligen för att bestämma och förutse när de är redo att passeras. Passageplattor av hiPSC när majoriteten av kolonierna har blivit tillräckligt täta så att koloniernas centrum visar spridda vita områden. Låt inte plattorna mogna förbi denna punkt. Det kommer att orsaka överdriven differentiering som leder till utseendet av ett gult område i mitten av kolonierna på grund av cellflerskiktning, överflöd av långsträckta celler vid kanterna, lös kompaktitet inom kolonier eller ökad celldöd.
  6. På dagen för passage, rita rutnät på plattans nedre yttre yta med en markör för att underlätta korrekt täckning av hela plattan.
  7. Lossa differentierade kolonier i en kulturhuv med hjälp av ett faskontrastmikroskop (10x förstoring) manuellt skrapa med en 200 μL pipettspets.
  8. Skölj plattorna två gånger med PBS (5 ml per tvätt för 10 cm plattor).
  9. Tillsätt 5 ml förvärmt vävnadsdissociationsproteas (Table of Materials) och inkubera cellerna vid 37 °C tills koloniernas kanter börjar runda uppåt (4-7 min), men innan kolonierna lyfter från plattan.
  10. Aspirera försiktigt dissociationsproteaset. Skölj försiktigt plattan två gånger med PBS, var försiktig så att du inte lossar kolonierna.
  11. Tillsätt 5 ml förvärmt hiPSC-medium (tabell 1) till odlingsplattan.
  12. Lyft kolonierna medan du bryter upp dem i mindre cellaggregat genom att skrapa hela plattan med spetsen på en 5 ml pipett med en fram och tillbaka rörelse från topp till botten.
  13. Vrid plattan 90° och upprepa ovanstående steg.
  14. Triturera cellaggregaten försiktigt genom pipettering upp och ner med en 5 ml pipett och kontrollera storleken på aggregaten regelbundet under ett mikroskop tills majoriteten av cellaggregaten är cirka 50-100 celler.
  15. Frö cellaggregaten i de förbelagda matrisplattorna för basalmembran med hjälp av ett extra hiPSC-medium för att tvätta originalplattan. Samla upp och överför de flesta cellaggregaten till de nya plattorna med en 5 ml pipett.
    Anmärkning: Om protokollet tillämpas konsekvent bör originalplattan innehålla iPSC-kolonier som täcker cirka 50% av odlingsytan före passage. I detta fall bör delningsförhållandet vara från en platta till fem nya plattor. Detta kan dock behöva justeras beroende på tillväxtförhållandena och cellinjespecifika tillväxthastigheter.
  16. Skaka de nysådda plattorna fram och tillbaka för att fördela aggregaten jämnt.
  17. Överför plattorna till en inkubator (37 °C och 5 %CO2) och lämna dem ostörda över natten för att möjliggöra korrekt celladhesion.
  18. Utför en komplett mediumförändring varje dag med 10 ml hiPSC-medium. Om det finns överskott av cellulärt skräp dagen efter passage, tvätta en gång med 5 ml av mediet före mediebyte.
  19. Planera att passera nästa när vita områden visas i mitten av majoriteten av iPSC-kolonierna (steg 2.5). Detta kommer att inträffa 4-6 dagar efter varje passage.

3. Frysning av hiPSC

  1. Utför de inledande stegen som i steg 2.5–2.14 för hiPSC-passage.
  2. Samla cellaggregaten i ett 15 ml rör och snurra vid 200 x g i 2 minuter.
  3. Aspirera supernatanten, suspendera pelleten i ett frysmedium och överför till kryorör med en 5 ml pipett.
    OBS: I likhet med passagestegen är det vanliga delningsförhållandet en iPSC-platta till fem kryorör, beroende på koloniernas densitet. Använd en total volym på 1 ml frysmedel för varje kryorör.
  4. Placera kryorören i en kyld kryokonserveringsbehållare och överför den till -80 ° C över natten.
  5. Överför cellerna till flytande kväve efter 24 timmar.

4. Tina hiPSC

  1. Belägg en 10 cm platta med basalmembranmatrisen (se 2.1-2.3).
  2. Ta bort ett iPSC-kryorör från flytande kväve och placera det omedelbart i ett 37 °C vattenbad i upp till 2 minuter för att tina snabbt. Skaka injektionsflaskan i badet tills den är delvis tinad och innehåller en liten isbit omgiven av vätska.
  3. Överför cellaggregaten från kryoröret till ett 15 ml koniskt rör med en 1000 μL pipett. Tillsätt upp till 15 ml förvärmt hiPSC-medium för att späda dimetylsulfoxid (DMSO) i frysmediet.
  4. Centrifugera det 15 ml koniska röret vid 200 x g i 2 minuter.
  5. Aspirera supernatanten och använd en 5 ml pipett för att resuspendera cellpelleten i hiPSC-medium innehållande 20 μM Rho-associerat coiled-coil-bildande protein serin/treoninkinashämmare (ROCK-I, förening Y-27632) för att undvika ytterligare triturering av cellaggregat.
  6. Överför cellaggregaten till en matrisbelagd platta med 10 cm basalmembran med en 5 ml pipett.
    OBS: Om protokollet tillämpas konsekvent kan celler i ett kryorör överföras till en enda 10 cm platta.
  7. Skaka plattan för att fördela aggregaten jämnt.
  8. Överför plattan till en inkubator och lämna den ostörd över natten för att möjliggöra korrekt celladhesion.
  9. Utför ett fullständigt mediumbyte dagen efter upptining med 10 ml hiPSC-medium utan ROCK-I.

5. Differentiering av hiPSC till ryggmärgs neurala stamceller (NPC)

  1. Se till att de 6-brunnsbelagda plattorna med basalmembran är redo att användas innan differentieringen påbörjas.
  2. Börja med iPSC som har passerats minst en gång och helst två gånger efter upptining och med minst fyra 10 cm plattor (se förklaring i steg 5.11).
  3. Utför de inledande stegen som i steg 2.5–2.14 för hiPSC-passagen.
  4. Överför cellaggregaten från minst två 10 cm plattor till ett 15 ml rör med en 5 ml pipett.
  5. Centrifugera vid 200 x g i 2 min.
  6. Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten igen med 10 ml hiPSC-medium med en 10 ml pipett och centrifugera sedan igen vid 200 x g i 2 minuter för att lossa cell-till-cell-adhesionerna i varje aggregat.
  7. Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten i 1 ml hiPSC-medium innehållande 20 μM ROCK-I med en 1000 μL pipett.
  8. Pipettera upp och ner med en 1000 μL pipett för att triturera cellaggregaten. Kontrollera storleken på aggregaten under ett mikroskop regelbundet tills majoriteten av cellsuspensionen består av enstaka celler eller små aggregat av <10 celler.
  9. Räkna cellerna med en hemocytometer (föredras) eller en automatiserad cellräknare och beräkna celldensiteten i cellsuspensionen.
  10. Platta 3,0 x 10 6 celler i varje brunn i en 6-brunnsplatta förbelagd med basalmembranmatris. Använd en 1000 μL pipett för att överföra cellsuspensionen.
    OBS: Om protokollet tillämpas konsekvent motsvarar detta ett förhållande mellan två 10 cm plattor i en enda brunn i en 6-brunn / platta.
  11. Upprepa steg 5.3-5.10 med en andra sats med två 10 cm plattor och platta slutprodukten i en basalmembranmatrisbelagd brunn av en andra 6-brunnsplatta. Använd en 1000 μL pipett för att överföra cellsuspensionen.
    OBS: Perfekt slutförande av ryggmärgs NPC-protokollet kräver två brunnar lika med fyra 10 cm plattor. För att underlätta arbetsflödet, slutför steg 5.3-5.10 med två satser med två plattor, var och en med slutprodukten som två separata 6-brunnsplattor och var och en med en brunn som innehåller 3,0 x 106 celler i den.
  12. Behåll det resulterande humana iPSC-monolagret i hiPSC-medium innehållande 20 μM ROCK-I tills sammanflödet når >90%, vanligtvis följande dag men inte längre än 3 dagar efter initial plätering för att undvika spontan (okontrollerad) differentiering.
  13. Om differentiering inte kan påbörjas dagen efter cellplätering, tvätta cellerna en gång med PBS och byt media dagligen till ett nytt hiPSC-medium innehållande 20 μM ROCK-I. Om det inte sammanfaller >90% inom 3 dagar efter plätering, kassera cellerna och starta protokollet om.
  14. När >90% sammanflöde har uppnåtts, börja differentiering. Detta är dag in vitro 1 (DIV1) i differentieringsprotokollet.
  15. På DIV 1, kassera hiPSC-mediet som innehåller 20 μM ROCK-I och skölj två gånger med PBS för att avlägsna fostrets tillväxtfaktor (FGF) och transformerande tillväxtfaktor-beta (TGFβ) som finns i stamcellsmediet.
  16. Byt medium till WiCell-medium (tabell 1) kompletterat med 0,2 μM LDN193189 (LDN) och 10 μM SB431542 (SB) under 48 timmar.
  17. På DIV 3, tvätta en gång med PBS och byt medium till WiCell-medium kompletterat med LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + retinsyra (RA; 1μM) i 48 timmar.
  18. På DIV 5, tvätta en gång med PBS och byt media till WiCell: Neuralt induktionsmedium (NIM) bas (tabell 1) (50%: 50%, v / v) kompletterat med LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) i 48 timmar.
  19. På DIV 7, utför mediumutbyte med samma medium som i steg 5.18.
  20. På DIV 8, tvätta en gång med PBS och byt medium till WiCell: NIM bas (50%: 50%) kompletterat med RA (1 μM) + puromorfamin (PMN) (1 μM) + Rekombinant human-hjärn-härledd neurotrofisk faktor (BDNF) (10 ng / ml) + askorbinsyra (ASAC) (0,4 μg / ml) i 48 timmar.
  21. På DIV 10, tvätta en gång med PBS och byt medium till NIM-bas (100%) kompletterat som nämnts i steg 5.20 i 48 timmar.
  22. På DIV 11 eller 12, täck en 25 cm2 steril odlingskolv med basalmembranmatris som förberedelse för passage.
  23. Aspirera mediet från varje brunn på 6-brunnsplattan l och skölj cellerna en gång med PBS.
  24. Tillsätt 2 ml 0,05% trypsin till varje brunn och inkubera vid 37 ° C i 5-15 minuter; Intermittent skakning av plattorna kan hjälpa till vid cellavlossning.
  25. Om cellerna fortfarande inte är i suspension, lossa mekaniskt genom att mata ut NIM-media från en 1000 μL pipettspets på cellerna med en cirkulär rörelse (se till att täcka hela ytan) eller genom att skrapa med en cellskrapa (inte föredraget).
  26. Överför cellerna från 2 brunnar till ett 15 ml rör och tillsätt trypsinhämmare i lämplig proportion till mängden trypsin som används med en 5 ml pipett.
  27. Centrifugera vid 200 x g i 2 minuter, aspirera supernatanten och resuspendera sedan med 10 ml NIM-bas med en 10 ml pipett.
  28. Centrifugera igen vid 200 x g i 2 minuter för att lossa cell-till-cell-vidhäftningarna.
  29. Efter det andra centrifugeringssteget, avlägsna supernatanten och suspendera pelleten igen med 1 ml NIM-medium (100%) kompletterat med RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng / ml) + ASAC (0,4 μg / ml) och ROCK-I (20 μM). Triturera cellerna upp och ner ungefär fem gånger med en 1000 μL pipettspets tills en grumlig suspension erhålls.
  30. Återsådd av aggregaten i detta medium till basalmembranmatrisen belagd 25 cm 2 steril odlingskolv så att slutresultatet är kombinationen av cellerna från två brunnar på en 6-brunnsplatta till en enda matrisbelagd 25 cm2 steril odlingskolv (2:1 passage). Använd en 1000 μL pipett för att överföra cellsuspensionen.
    OBS: Cellerna ska vara >90% sammanflytande på DIV 13, och inga ytterligare steg behövs förrän dag 14. Om cellerna inte är sammanflytande, behåll ROCK-I i mediet i ytterligare 1 eller 2 dagar.
  31. På DIV 14, byt medium till färskt NIM-medium + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng / ml) + ASAC (0,4 μg / ml).
  32. På DIV 15, ändra mediet till NIM: Neuralt differentieringsmedium (NDM) bas (tabell 1) (50%: 50%) med RA (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg / ml) + tillägg B (50x) + BDNF (10 ng / ml) + glialcellinje-härledd neurotrofisk (GDNF) (10 ng / ml) + insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1) (10 ng / ml) + ciliär neurotrofisk faktor (CNTF) (10 ng / ml). Byt med nya medier varannan dag.
  33. På DIV 21, byt medium till NDM-bas (100%) kompletterat som i steg 5.32 och byt med nytt medium varannan dag.
  34. På DIV 25-30, samla NPC och antingen frysa dem eller passera dem till en 10 cm platta för terminaldifferentiering.
  35. Skölj T-25-kolven med PBS och tillsätt 0,05% trypsin.
  36. Inkubera i 5 minuter vid 37 °C.
  37. Skölj trypsinet och cellerna med NDM-basen och överför till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt trypsinhämmaren i lämplig proportion till trypsin och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter.
  38. Resuspendera cellpelleten med motorneuron eller astrocytdifferentieringsmedium (tabell 1) och använd en 1000 μL pipett för att triturera upp och ner för att erhålla en enda cellsuspension (vanligtvis upp till 5 gånger).
  39. Räkna cellerna och överför till en 10 cm platta, belagd enligt beskrivningen i avsnitt 6, med antingen differentieringsmedia + Rock-I, för att skilja hiPSC-MN och hiPSC-A.
  40. Alternativt frysa kulturerna genom att resuspendera i ett frysmedium bestående av 90% NDM-medium med tillväxtfaktorer (som i steg 5.32-5.33) och 10% DMSO, triturera på samma sätt och överför sedan till ett kryorör. Alikvot 6 x 106 NPC per kryorör.

6. Tina NPC-kulturer

  1. Belägg 10 cm plattor med polyornitin (PLO) och laminin dagen före upptining av cellerna.
    1. Tillsätt 5 ml PLO utspädd till 100 μg/ml i PBS eller destillerat vatten (dH2O) till plattorna. Inkubera vid 37 °C i minst 1 timme till natten.
    2. Aspirera PLO-lösningen och skölj plattorna tre gånger med PBS. (PLO är giftigt om det inte tvättas ordentligt.)
    3. Tillsätt laminin utspätt i PBS till en koncentration av 10 μg/ml till de PLO-belagda plattorna. Inkubera vid 37 °C i minst 1 timme, helst över natten. Efter inkubation, aspirera lamininlösningen utan sköljning för att förbättra celladhesionen.
      OBS: Plattorna kan beläggas med PLO i förväg, tvättas tre gånger med vatten, torkas i en steril huv och förvaras vid 4 °C.
  2. Tina en injektionsflaska med NPC (dvs. DIV 25 eller 30) innehållande 6 x 106 celler/injektionsflaska för varje 10 cm cellodlingsplatta.
  3. Ta bort NPC-kryoröret från flytande kväve och placera omedelbart i ett 37 ° C vattenbad i upp till 2 minuter. Tina snabbt genom att skaka flaskan tills det finns en liten isbit omgiven av vätska.
  4. Överför cellaggregat till en 15 ml konisk med en 1000 μL pipett och tillsätt upp till 15 ml förvärmd NDM eller Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) / Hams F21 F12-tillskott för att späda DMSO.
  5. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
  6. Aspirera supernatanten, suspendera cellpelleten igen med antingen astrocyt- eller MN-differentieringsmedium (tabell 1) + ROCK-I (20 μM) och använd en 1000 μL pipett för att triturera upp och ner tills en encellssuspension erhålls (upp till 5 gånger).
  7. Överför encellssuspensionen till en PLO-Laminin-belagd 10 cm platta.
  8. Överför plattan till en inkubator och lämna den ostörd över natten för att möjliggöra korrekt celladhesion.

7. Differentiera ryggmärgs NPC till motorneuroner

  1. Utför de inledande stegen enligt anvisningarna i steg 6.1–6.8, där det slutliga mediet är MN-differentieringsmedium + ROCK-I (20 μM).
  2. Dagen efter plätering, utför ett fullständigt utbyte av mediet med MN-differentieringsmedium utan ROCK-I och byt sedan media varannan dag. Under helgen, mata celler på fredag och sedan igen på måndag. Skölj cellerna med PBS vid behov för att ta bort cellskräp.
  3. Byt medium med MN-differentieringsmedium + cytosinarabinosid (ARA-C) (0,02 μM) och inkubera i 48 timmar när gliaengagerade förfäder framträder som enstaka prolifererande platta celler under postmitotiska MN-förfäder aggregerade i cellkluster.
    OBS: Vanligtvis sker detta inom de första 7 dagarna efter den första pläteringen, även om det kan finnas variationer beroende på cellinjen.
  4. Efter 48 timmar, aspirera mediet som innehåller ARA-C, skölj kulturerna försiktigt med PBS tre gånger och byt medium till färskt MN-medium utan ARA-C.
  5. Efter behandling med ARA-C, utför mediumbyten varannan dag (eller måndag, onsdag och fredag) genom att avlägsna det gamla mediet med en manuell pipett snarare än en vakuumsugare för att förhindra för tidig lossning av neuronala kluster. Dessutom berika MN-mediet med Laminin 1 μg / ml en gång i veckan för att ytterligare förbättra neuronal bindning till odlingsplattorna.

8. Differentiera NPC i ryggmärgs astrocyter

  1. Tina NPC-kulturer som i avsnitt 6, med användning av astrocytdifferentieringsmedium (tabell 1) med tillsats av fetalt bovint serum (FBS) med en volym för volymkoncentration på 1% (NS + 1% FBS) samt ROCK-I (20 μM) för plätering.
    OBS: Kommersiellt tillgänglig serumersättning (tabell 1) kan ersätta FBS med användning av samma utspädningsfaktorer.
  2. Dagen efter plätering, byt odlingsmedium med NS + 1% FBS-medium utan ROCK-hämmare och byt sedan mediet varannan dag. Under helgerna, mata celler på fredag och sedan igen på måndag. Skölj cellerna med PBS vid behov för att ta bort cellskräp. Om cellerna fortsätter att dö, komplettera media med ROCK-I (10 μM) för att främja cellöverlevnad. Var försiktig så att du inte använder ROCK-I för ofta eller för länge, med tanke på risken att selektera odödliga celler.
  3. Låt astrocyterna bli sammanflytande innan du passerar dem.
    OBS: Cellstorleken kommer att öka med tiden, så det finns inget inställt antal att passera. Det typiska passaging-förhållandet är 1: 2 eller 1: 3. Vid dålig överlevnad eller överföring till för många plattor, kombinera två (eller flera, efter behov) 10 cm plattor till en 10 cm platta för att upprätthålla sammanflödet.
  4. För att passera astrocytprogenitorkulturer, tvätta plattorna en gång med PBS (för att avlägsna FBS), inkubera med 0,05% trypsin i 5 minuter, samla cellerna i NS-medium + 1% FBS (FBS inaktiverar trypsin) och centrifugera sedan vid 300 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten, resuspendera cellerna i NS-medium + 1% FBS och triturera sedan till en encellssuspension. Fördela celler i NS + 1% FBS till nya 10 cm plattor.
    OBS: Förutom expanderande astrocytkulturer tjänar upprepad passaging av plattor syftet att döda eventuella återstående stamceller som har valt ett neuronalt öde. Därför, även om det inte finns en mycket hög mitotisk hastighet, kan plattor passeras i förhållandet 1: 1 om det verkar finnas neuronal förorening.
  5. Byt beläggningen under differentieringen för att förbättra utbytet enligt följande.
    1. Platta de initialt tinade NPC-kulturerna och de första passagerna efter initial plätering på PLO / Laminin.
    2. Platta de omogna astrocyterna på matrisbelagda plattor med basalmembran.
    3. Platta mer mogna astrocyter (dvs efter dag 90) på antingen basalmembranmatris, PLO / Laminin-belagda plattor (vanligtvis för samodling med neuroner) eller på obelagda plattor.
  6. Frys astrocytprogenitorerna när som helst under 60-dagars mognadsperioden för att synkronisera kulturer eller spara för senare experiment. Vid upptining bortom NPC-stadiet, tina astrocytprogenitorerna på basalmembranmatrisbelagda plattor snarare än PLO / Laminin.
  7. Vid DIV 90 och därefter, byt medium från NS + 1% FBS till NS + 5% FBS för att främja astrocytöverlevnad och minska deras spridning.

9. Samodling av MN och ryggmärgastrocyter i multielektrodplattor

  1. Differentiera och platta motorneuronerna och astrocyterna när de är redo att användas samma dag och åldras till DIV 60 för motorneuronerna och DIV 90 för astrocyterna.
  2. Belägg MEA-plattorna dagen före eller på pläteringsdagen enligt följande om du arbetar med 24-brunns plastplattor (materialtabell).
  3. Späd PLO i vatten eller PBS till 100 μg/ml.
    1. Tillsätt 15-20 μL till varje brunn (beroende på pipettens komfortnivå) och bilda en droppe i mitten av brunnen som täcker elektrodernas yta och omgivningen men inte hela brunnen.
    2. Var försiktig så att du inte skadar elektroder med pipettspetsen. Var konsekvent med volymen från brunn till brunn för att säkerställa täckning av samma yta i varje brunn.
    3. Inkubera PLO vid 37 °C i minst 1 timme (helst 2 timmar).
      OBS: De små volymerna torkar upp om det inte finns tillräckligt med fuktighet i plattorna. Tillsätt vatten i facken som omger brunnarna för att säkerställa tillräcklig fuktighet under beläggning och registreringar.
  4. Aspirera så mycket PLO som möjligt med en mikropipettspets av plast. Var försiktig så att du inte rör elektroderna. Tvätta med 250 μL vatten tre gånger. Om du använder en vakuumsugare för tvättar, låt inte spetsen nära elektrodmatrisen. Efter den tredje tvätten, ta bort så mycket vatten som möjligt med en pipettspets efter behov. Låt ytan torka under cellodlingshuven med locket borttaget.
  5. När plattytorna är torra, tillsätt laminin utspätt till 10 μg / ml i PBS. Använd 15-20 μL för att täcka varje elektroduppsättning. Tillsätt vatten i fuktutrymmena, sätt tillbaka locket och sätt tillbaka plattan till 37 °C inkubation i minst 2 timmar upp till natten.
  6. På pläteringsdagen, skölj MN- och astrocytkulturerna en gång med PBS och tillsätt trypsin 0,05% vid 37 ° C för att lyfta celler (5 min). Samla i ett 15 ml koniskt rör innehållande trypsinhämmare och tvätta plattorna med medium eller bas för att säkerställa att alla celler samlas in. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter och suspendera igen med en 1000 μl pipett för att generera 1 ml av en encellssuspension. Vid återsuspendering av MN och astrocyter, byt till samodlingsmediet (tabell 1) med tillsats av 20 μM ROCK-I.
  7. Räkna MN och astrocyter parallellt med en hemocytometer. Medan du räknar och gör beräkningar, täck cellsuspensionerna och placera dem i ett frigolitställ vid 4 ° C.
  8. Beräkna den volym som krävs för att resuspendera kulturerna till en koncentration av 5 x 104 celler per 5 μL för motorneuroner och 2,5 x 104 celler per 5 μL för astrocyter. Centrifugera 1 ml cellsuspensioner vid 300 x g i 5 minuter och suspendera igen i den beräknade volymen.
  9. Beräkna antalet önskade brunnar som ska sås och multiplicera det med 5 μL av varje cellsuspension. Kombinera den erforderliga volymen neuron- och astrocytsuspensioner i förhållandet 1: 1 och blanda genom pipettering tills den är grundligt kombinerad (vanligtvis två gånger), men undvik att vara för aggressiv.
  10. Ta bort lamininet från varje brunn på MEA-plattan med en pipettspets. Överför 10 μL av den slutliga kombinerade cellsuspensionen till varje brunn och bilda en liten droppe som täcker elektroduppsättningen för att ge en celldensitet på 5 x 10 4 MN och 2,5 x 104 astrocyter per brunn.
    OBS: Hög celldensitet i den kombinerade suspensionen kräver frekvent resuspension mellan brunnarna under såddsteget för att säkerställa korrekt och konsekvent cellräkning.
  11. Sätt tillbaka plattorna till inkubatorn i 20-30 min. Var försiktig så att du inte stör celldroppen och låt cellerna bilda initiala fästen på plattorna.
  12. Efter 20-30 minuter, tillsätt varmt samkulturmedia + ROCK-I till varje brunn genom att pipettera 250 μL ner på väggen i varje brunn, följt av ytterligare 250 μL ner på väggen i samma brunn på motsatt sida. Sätt tillbaka plattan till inkubatorn.
  13. Undersök tallrikar dagen efter sådd (Samkultur dag 1). Om det finns betydande cellskräp eller döda celler, byt ut mediet mot ett nytt samodlingsmedium som innehåller ROCK-I. Annars byter du mediet den andra dagen efter sådd (samkulturdag 2) till samodlingsmediet utan ROCK-I. Utför halvmedelsutbyten (aspirera 50% och tillsätt 60% av den slutliga volymen för att ta hänsyn till avdunstning) två gånger i veckan.
  14. Om du använder MEA-system med 30 mm glasplattor med en brunn (Table of Materials) kan plåtberedningen ta 2 eller flera dagar. Följ stegen nedan för att utföra detta.
  15. Lyft cellerna och cellskräpet från de tidigare MEA-kulturerna med 0,05% trypsin i 5-15 min.
  16. Aspirera trypsin och skölj tre gånger med vatten.
  17. Sterilisera genom att tillsätta 70% etanol och inkubera i huven i 10 minuter. Aspirera etanolen och skölj sedan med vatten tre gånger.
  18. Applicera 1% anjoniskt tvättmedel med proteasenzym i vatten. Täck plattorna med lock och linda med termoplastfilm och aluminiumfolie och lämna dem sedan på en vippa vid rumstemperatur över natten.
  19. Aspirera tvättmedlet och skölj sedan tre gånger med vatten.
  20. Om du planerar att lagra plattorna, tillsätt en tillräcklig mängd vatten. Täck plattorna med lock och linda dem med termoplastfilm och aluminiumfolie och låt dem stå i kylen tills nästa användning.
  21. Om du planerar att belägga, låt ytan torka under cellodlingshuven.
  22. Om extra sterilisering behövs (t.ex. tidigare infektion eller icke-ny användning), utsätt endast MEA-plattorna för ultraviolett (UV) ljus under huven i 30-60 minuter.
    OBS: Att undvika frekvent UV-ljus förhindrar skador på elektroderna. Användningen av UV-ljus när plattor har serum på dem kommer att resultera i icke-funktionella elektroder, varför det endast ska användas på rengjorda plattor.
  23. När plattorna är helt torra, fortsätt med plasmarengöring i 1 minut för att ladda glasytan på MEA-plattorna och förbättra beläggningseffektiviteten. Plasmarengöring minst en gång var 4-5 cykler av MEA-plattornas rengöringspläteringscykler.
    1. Som ett alternativ, när plasmarengöring inte är möjlig eller inte motiverad, tillsätt en tillräcklig volym FBS-innehållande medium för att täcka MEA-plattornas yta och återför dem till inkubatorn över natten.
  24. Använd PLO / Laminin-beläggning enligt beskrivningen ovan i avsnitt 6. Tillsätt PLO-lösning (100 μg i PBS) omedelbart efter plasmarengöring eller aspirering och sköljning av det FBS-innehållande mediet.
  25. Platta cellerna enligt ovan med följande densiteter: 1 x 10 5 hiPSC-A / platta och 5 x 105 hiPSC-MN / platta.

10. Inspelning av multielektrodmatris

  1. Extrahera råspänningsdata vid en samplingsfrekvens på 12,5 kHz med hjälp av ett Butterworth-filter med ett 200 Hz högpass och 3 kHz lågpassfilter. Ställ in spikigenkänning som momentana tidpunkter för spänningar ≥6 standardavvikelser från baslinjen. Identifiera skurar som en aktivitet med >5 spikar på 100 ms. Definiera nätverksaktivitet när över 35 % av de totala aktiva elektroderna avfyras inom 100 ms med minst 50 toppar per nätverksbrist.
  2. Börja spela in så snart som möjligt efter Co-Culture (CC) dag 1.
    OBS: Elektrisk aktivitet kommer sällan att noteras före CC dag 3.
  3. Parallella plattkulturer med liknande densitet och replikat i lämpliga odlingsplattor eller täckglas för biokemiska analyser, immunocytokemi (ICC) eller qPCR.
  4. Utför inspelningar med temperaturen inställd på 37 °C ochCO2 vid 5 %. Överför plattorna till maskinen och låt dem vara i jämvikt i minst 5 minuter före registreringen.
  5. Registrera baslinjeaktivitet antingen varannan dag eller varje vecka, över 1-15 minuter beroende på experimentell design. Spela inte in i minst 1 timme efter ett mediumutbyte, och vänta helst i 24 timmar efter varje medieutbyte.
  6. För att förhindra kontaminering, byt medium (dvs. halvmedium utbyte som i steg 9.14) efter varje registrering där locket på den sterila plattan måste öppnas utanför den sterila huven (dvs. applicering av läkemedelsföreningar). Utför fullständiga medelbyten och tvättar för att tvätta ut droger om plattorna kommer att fortsätta att användas utöver läkemedelsbehandling.
  7. För analysändamål används minst tre tekniska och biologiska replikat för varje tillstånd. Uttrycka elektrofysiologiska data som medel för n ≥ 3 replikerar.

11. Farmakologiska analyser på multielektrodmatris

  1. Använd en annan kombination av samkulturer beroende på den experimentella frågan: ALS-neuroner med kontrollastrocyter, kontrollneuroner med ALS-astrocyter, ALS-neuroner och astrocyter, kontrollneuroner och astrocyter.
  2. Vid undersökning av övergående elektrofysiologiska effekter av föreningar som riktar sig mot antingen neuroner eller astrocyter, registrera baslinjeaktivitet i minst 1 minut med plattlocket borttaget men maskinlocket stängt.
  3. Öppna locket manuellt till maskinen utan att stoppa den elektrofysiologiska registreringen och byt ut 25 μl medium med lämplig läkemedelsvehikel (vanligtvis färskt medium) med hjälp av en flerkanalig pipett om du behandlar flera brunnar. Stäng locket manuellt.
  4. Spela in i ytterligare 1 minut (eller mer om det finns betydande fordonsinducerade förändringar som kulturen behöver återhämta sig från).
  5. Öppna locket manuellt igen och byt ut 25 μL medium med läkemedlet av intresse i samma fordon. Stäng locket på maskinen och fortsätt spela in.
    OBS: Varaktigheten av registrering och volymen av läkemedel / vehikel som administreras kan variera eller behöva optimeras beroende på experimentfrågan.
  6. För analysändamål, se till att tillägget av fordonet inte framkallar signifikanta förändringar i elektrofysiologiska parametrar. Beräkna procentuella förändringar av aktiviteten efter läkemedel jämfört med efter tillägg av vehikel och jämför mellan tillstånd.
  7. För att undersöka longitudinella elektrofysiologiska effekter, såsom kandidatsjukdomsmodifierande läkemedel, registrera baslinjeaktivitet som beskrivs i steg 11.2. För detta, använd antingen det samodlingsmedium som innehåller läkemedlet/läkemedlen av intresse i lämpligt vehikel eller mediet som endast innehåller vehikeln.
  8. För analysändamål, jämför tidpunktsregistreringarna från ALS eller kontrollsamkulturer som behandlas longitudinellt med läkemedel med varandra och kontrollförhållandena.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet för ryggmärgsmönstring för generering av hiPSC-MN och ryggmärgs hiPSC-A beskrivs i figur 1. I detta protokoll upprätthålls hiPSC och passeras som icke-sammanflytande kolonier (figur 2A). Neurogenes initieras (neural induktion) genom dubbel SMAD-hämning genom tillägg av LDN193189 och SB431542, vilket inaktiverar benmorfogenetiskt protein (BMP) respektive transformerande tillväxtfaktor-beta (TGF-β) vägar. En monolagerbaserad metod används för detta steg där hiPSC pläteras på en vidhäftande matris, dvs basalmembranmatris, för att generera en neuroepitelliknande 2D-kultur. Morfologiskt markeras neural induktion av övergången från iPSC med stora kärnor och rund form till neuroepiteliala (stam) celler som är tätt komprimerade, med en stor cytoplasma och cylindrisk form. Dessa celler kommer att dela horisontellt såväl som vertikalt och generera ett flerskiktat epitel (figur 2B, i).

Preferensen för en 2D, i motsats till en 3D-strategi (dvs. embryoid kroppsbaserad), bygger på litteraturbevis 11,12 som tyder på att den förra kan främja ryggmärgsmönster genom att införa cell-yttre miljösignaler13. Neuroepitelceller mönstras sedan temporärt och rumsligt för att generera regionspecifika, dvs ryggmärg, neurala stamceller (NPC) (figur 1). Två viktiga morfogener används för detta ändamål: retinsyra, som bestämmer caudalisering, och purmorfamin, en igelkottsignalagonist, vilket orsakar ventral specifikation. I deras frånvaro skulle NPC: s cellinneboende regionala identitet vara rostral och dorsal14,15,16.

Från DIV 15 till DIV 25-DIV 30 förstärks den regionala identiteten hos dessa NPC genom att komplettera media med morfogenerna. Samtidigt genererar den tidiga exponeringen för neuronala tillväxtfaktorer och ett gliogent cytokin, såsom ciliär neurotrofisk faktor (CNTF), en blandad population av NPC (figur 2B, ii). Morfologiskt är dessa celler mindre komprimerade än neuroepitelceller, och uppvisar få korta processer, arrangerade i ett monolager efter störning av det kolonnerade epitelet efter passage vid DIV 12. Vid en närmare titt är några av dessa celler långsträckta, medan andra visar flera processer, vilket indikerar tidigt engagemang mot ett glialt respektive neuronalt öde.

Neuroner kommer att uppstå spontant från denna blandade population om inte den gliogena omkopplaren aktiveras (figur 1 och figur 2B, iii). Tillsatsen av Notch-väghämmaren, Compound E, kommer att förbättra lägre MN-differentiering17. Ryggmärgsidentiteten hos dessa celler stöds av höga nivåer av ChAT-uttryck (figur 2C,i). Dessutom har det tidigare visats2 att en subpopulation av dessa motorneuroner också är ISL1+.

Astrocytdifferentiering induceras av den gliogena omkopplaren genom aktivering av JAK/STAT-vägen (figur 1 och figur 2B,iv). CNTF och sannolikt andra cytokiner som ingår i fetalt bovint serum tjänar detta syfte i det föreslagna protokollet. Tid är också en viktig faktor, eftersom gliogenes spontant kommer att följa efter neuronogenes på grund av cellinneboende ledtrådar. Efter DIV 90 uppvisar hiPSC-A en mognande fenotyp som indikeras av S100β och GFAP-uttryck 2,11, medan deras ryggmärgs regionala identitet stöds av >90% uttryck av HOXB4 (figur 2C, ii)2,11,14.

Metoden för samodling av hiPSC-MN och hiPSC-A är anmärkningsvärd för samtidig plätering av dessa cellsubtyper i motsats till tekniker där neuroner är seriellt pläterade på toppen av astrocytkulturer. I dessa samtidiga samkulturer kommer cellerna att omorganisera spontant, med astrocyter som skapar ett matningsskikt längst ner och neuroner som ansluter i nätverk högst upp (figur 2C, iii). Denna strategi hartidigare visat 2 för att möjliggöra en mer enhetlig fördelning av neuroner än andra samodlingsstrategier, där dessa celltyper tenderar att kluster.

Humant iPSC-MN pläteras ensamt eller i samkultur med hiPSC-A på en 24-brunns MEA-platta (n = 12 per tillstånd), där varje brunn innehåller 16 elektroder (figur 3A). Faskontrastbilder av antingen mono- eller samkulturer och rasterdiagram över spikningsaktivitet från två representativa brunnar visas (figur 3B, C). Humant iPSC-A förbättrar den elektrofysiologiska mognaden av hiPSC-MN, vilket visas av signifikant högre grader av spiknings- och sprängningsaktivitet i samkulturerna (figur 3D). Detta är en parallell till effekterna av hiPSC-A på den morfologiska och molekylära mognaden av hiPSC-MN som tidigare har visats2.

Några av de tekniska utmaningarna med detta protokoll beskrivs i videoinstruktionerna, där teknikerna för plätering och inspelning med MEA-plattformar samt representativa inspelningar från dessa kulturer visas.

Figure 1
Figur 1: Protokoll för generering av ryggmärgen hiPSC-MN och hiPSC-A och deras samkultur . (A) Tidslinje för differentieringsprotokollet med detaljerade kritiska steg. I insatsen fokuserar du på 30-dagarsprotokollet för att generera ryggmärgs NPC, med dagliga åtgärder (E-utbytesmedium, P-passage eller ingen åtgärd), cellodlingsbas och kosttillskott (för ytterligare information om kompositionen, se tabell 1 och materialförteckning). (B) Härstamningar och cellödesengagemang är schematiskt representerade. Samkulturer genereras när mogna hiPSC-MN (dvs. DIV 60) och hiPSC-A (dvs. DIV 90) blandas och pläteras samtidigt. (Illustration skapad med BioRender). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Morfologiska förändringar under ryggmärgsdifferentieringsprotokollet. (A) Faskontrastmikroskopbilder av hiPSC. Panelerna (i) (lägre effekt, 10x) och (ii) (högre effekt, 20x) visar normal hiPSC, panelerna (iii) (10x) och (iv) (20x) visar en differentierad hiPSC-koloni. Skalstänger = 200 μm och 50 μm. (B) Representativa faskontrastmikroskopbilder av neuroepitelceller vid DIV 5 (i), NPC vid DIV 21 (ii) och mogna DIV 60-motorneuroner (iii) och DIV 90-astrocyter (iv). Skalstänger = 100 μm och 50 μm (C) Representativa immuncytokemiska bilder på 40x olja av hiPSC-MN (i), hiPSC-A (ii) och deras samkultur (iii). Mognad och regionspecifika markörer var måltavlor. Skalstapel = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Inspelning av hiPSC-MN med flera elektroder. (A) Värmekarta över genomsnittlig spikningsaktivitet från en enda MEA-platta (n = 24 brunnar) vid DIV 18 efter plätering. Brunnar i raderna A och B (n = 12 brunnar/tekniska replikat) representerar kulturer av enbart hiPSC-MN, medan brunnar i raderna C och D (n = 12 brunnar) är samkulturer av hiPSC-MN/hiPSC-A. (B) Representativa faskontrastbilder av enbart hiPSC-MN (MN) och i samkultur med hiPSC-A (MN+SCA) på MEA-plattor. Neuroner aggregerar i stora cellkluster när de odlas ensamma, medan samkulturen av hiPSC-MN med hiPSC-A resulterar i jämnt fördelade monolager. Skalstapel = 50 μm. (C) Representativt rasterdiagram över spikningsaktivitet över 120 s registreringstid från en enda brunn med enbart hiPSC-MN och hiPSC-MN i samkultur med hiPSC-A. Nätverkets burst-aktivitet över alla elektroder markeras med en lila ruta. (D) Kvantifiering och jämförelse av spiknings- och sprängningsaktivitet mellan enbart neuroner och neuroner i samodling med astrocyter från MEA-plattan som visas i panel A. (*** p < 0,001, **** p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hittills har hiPSC- och MEA-baserade metoder för elektrofysiologiska registreringar av astrocyt-neuron-samkulturer funnit begränsad tillämpning inom ALS6-området och fortfarande inte i helt mänskliga plattformar, i motsats till deras mer utbredda användning för in vitro-modellering av epilepsi9. Denna plattform har dock potential att ta itu med patofysiologiskt relevanta frågor i ALS-forskning, såsom mekanismerna för neuronal hyperexcitabilitet, astrocytbidrag till neurotoxicitet eller nätverksaktivitetens roll i sjukdomsprogressionen. Dessutom möjliggör denna plattform insamling av prospektiva elektrofysiologiska data i över 9 månader in vitro och ger därför ett tillvägagångssätt för att testa föreningar med terapeutisk potential2.

Protokoll för generering av hiPSC-N och hiPSC-A som finns i litteraturen skiljer sig mycket åt i förhållande till medieförhållanden, tidpunkten för kulturer, utbyte och mognadsprofiler, bland andra faktorer. En stor fördel med den föreslagna plattformen är att astrocyter och neuroner differentieras separat och odlas tillsammans vid senare tidpunkter genom att samtidigt plätera de två celltyperna. Efter optimering för celldensiteter och timing kan denna metod översättas för att användas med celltyper härledda från andra protokoll också, inklusive andra regionspecifika celler.

Avgörande för den föreslagna plattformen är den regionala specifikationen av motorneuroner och astrocyter. Medan det föreslagna protokollet är ryggmärgsspecifikt i sin förmåga att generera ChAT+ MN och HOXB4+ astrocyter, kan väletablerade differentieringstekniker användas för att generera hiPSC-härledda neuroner och astrocyter som uppvisar kortikala identiteter, såsom CTIP2+ lager V kortikala motorneuroner18 och OTX2+ framhjärnastrocyter14 . Således har den föreslagna plattformen potential att modellera neurala kretsar i cortex och ryggmärgen, liksom deras anslutningar.

Flera system finns tillgängliga för MEA-inspelning. Plast 24-brunns MEA-plattor med 16 elektroder per brunn med CO2 och temperaturkontroll föredrogs för studien. Denna plattform är särskilt lämplig för screening med hög genomströmning i motsats till system baserade på inspelningar av enskilda brunnar. Den största begränsningen med plastplattor är att ytan kan vara mer mottaglig för nedbrytning vid upprepad användning. System baserade på MEA-plattor av glas har fördelen att de kan återanvändas flera gånger efter lämpliga behandlingar enligt beskrivningen ovan (upp 20 till gånger), utan betydande förlust av dataregistreringskvalitet. Dessa behandlingar och beläggningsmetoderna är dock mer tidskrävande och tekniskt utmanande, med tanke på den hydrofoba ytan på dessa plattor.

Ett av de största hindren för iPSC- och MEA-baserade metoder för elektrofysiologisk registrering är variationen och reproducerbarheten av experimentella fynd. Tidigare studier visar att MEA-aktivitet hos neuroner är beroende av mognad som påverkas av flera faktorer, inklusive, men inte begränsat till, lämpliga differentieringstekniker som används vid generering av både astrocyter och neuroner, celldensitet hos neuroner, förhållandet mellan astrocyter och neuroner under differentiering och mognad, sekvens av astrocyt- och neuronsamkulturer2 . Standardisering av dessa variabler som föreslås i detta protokoll är ett sätt att säkerställa reproducerbarhet. Valet av multiwell MEA-system som genererar data med hög genomströmning kommer att ta hänsyn till experimentell variabilitet. Om den elektrofysiologiska aktiviteten hos en kultur är mindre än vad som förväntas vid en given tidpunkt är det viktigt att bestämma att framgångsrik differentiering har inträffat och systerkulturer som kan analyseras immunocytokemiskt eller biokemiskt är till hjälp. Med tanke på att en mycket liten volym celler såddas initialt kan små pipetterfel resultera i relativt stora förändringar i cellantal och därmed densitet. Att använda MEA-plattor som möjliggör direkt visualisering och bedömning av celldensitet är också viktigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta manuskript stöddes av följande: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Vi tackar Dr. Raha Dastgheyb och Dr. Norman Haughey för att ha tillhandahållit MEA-plattformen och dataanalysprogramvaran som vi har använt för att validera den beskrivna elektrofysiologiska plattformen. Vi vill tacka Khalil Rust för deras hjälp med protokolldemonstration och filmning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm sterile culture plates Falcon 353003
25 cm2 sterile culture flasks Falcon 353136
2-Mercaptoethanol (β-ME) Thermofisher 21985023 Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System Corning 430769
5 mL pipette Falcon 357543
6 well sterile culture plates Falcon 3046
Amphotericine B Gibco 15290018 Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme Sigma-Aldrich Z273287 Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC) Sigma A4403 Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) Axion OPT-24
Axion Edge MEA platform Axion Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel Corning 354277 Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) Zeiss 415510-1100-000 Primo Vert
Bicuculline Sigma Aldrich 14340 Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13 Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge AirGas/Harris 9296NC
Compound E Abcam ab142164 Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX) Sigma Aldrich C239 Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK) Tocris 111 Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12 Thermofisher 113300 Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement Thermofisher A1517001 Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermofisher 16140071 Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) Peprotech 450-10 Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer Election Microscopy Sciences 63510-20
Heparin Millipore-sigma H3149-100KU Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator ThermoFisher 370 set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) R&D systems 291-G1-200 Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid Abcam ab144490 Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10828 Working concentration 1x
Laminin Thermofisher 23017-015 Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189 Stemgent 04-0074 Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine Thermofisher 25030 Working concentration 100x
MEA glass plates MultiChannel Systems 60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200 Gilson PJ22224
Neurobasal Thermofisher 21103049 Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermofisher 11140050 Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin Thermofisher 15140122 Working concentration 100x
Polyornithine (PLO) Sigma-Aldrich P3655 Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl) NA NA Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN) Millipore-Sigma 540223 Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor Peprotech 1293823 Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542 Sigma S4317 Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods Baker Company SG-600
Supplement B - B27 Supplement Thermofisher 21985023 Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement Thermofisher 17502048 Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge ThermoFisher 75004261 Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm PARAFILM P7793
Tissue dissociation protease - Dispase StemCell Technologies 7923 Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermofisher 2530054 Working concentration 1x
Waterbath ThermoFisher 2332 Isotemp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Tags

Neurovetenskap utgåva 174 multielektroduppsättning extracellulär inspelning screening analys ryggmärg glia motorneuron amyotrofisk lateralskleros hiPSC motorneuronsjukdom sjukdomsmodellering
Etablering av en elektrofysiologisk plattform för modellering av ALS med regionalt specifika humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter och neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A.,… More

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A., Liu, S., O'Brien, M., Maragakis, N. J. Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (174), e62726, doi:10.3791/62726 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter