Summary
We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.
Abstract
Menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten (hiPSC-A) en neuronen (hiPSC-N) bieden een krachtig hulpmiddel voor het modelleren van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) pathofysiologie in vitro. Multi-electrode array (MEA) opnames zijn een middel om elektrische veldpotentialen van grote populaties neuronen vast te leggen en netwerkactiviteit in de loop van de tijd te analyseren. Eerder werd aangetoond dat de aanwezigheid van hiPSC-A die worden gedifferentieerd met behulp van technieken om een ruggenmerg astrocytenfenotype te bevorderen, de rijping en elektrofysiologische activiteit van regionaal specifieke hiPSC-motorneuronen (MN) van het ruggenmerg verbeterde in vergelijking met die gekweekt zonder hiPSC-A of in de aanwezigheid van knaagdierastrocyten. Hier beschreven is een methode om ruggenmerg hiPSC-A te co-kweken met hiPSC-MN en elektrofysiologische activiteit te registreren met behulp van MEA-opnames. Hoewel de hier beschreven differentiatieprotocollen specifiek zijn voor astrocyten en neuronen die regionaal specifiek zijn voor het ruggenmerg, kan het co-kweekplatform worden toegepast op astrocyten en neuronen die zijn gedifferentieerd met technieken die specifiek zijn voor andere lotgevallen, waaronder corticale hiPSC-A en hiPSC-N. Deze protocollen hebben tot doel een elektrofysiologische test te bieden om te informeren over interacties tussen glia en neuronen en een platform te bieden voor het testen van geneesmiddelen met therapeutisch potentieel bij ALS.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten (hiPSC-A) en neuronen (hiPSC-N) zijn krachtige hulpmiddelen voor het modelleren van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) pathofysiologie in vitro en bieden een translationeel paradigma voor strategieën voor het ontdekken van geneesmiddelen1. Onderzoekers hebben aangetoond dat de co-cultuur van hiPSC-A met hiPSC-N de morfologische, moleculaire, elektrofysiologische en farmacologische rijping van beide celtypen verbetert, waardoor complexe neuronale netwerken en astrocyten-neuroninteracties worden gegenereerd die lijken op hun in vivo tegenhangers 2,3. Vergelijkbare co-kweekexperimenten kunnen kenmerken van ALS-pathobiologie samenvatten, zoals astrocytengemedieerde neurotoxiciteit 4,5 en neuronale hyper-exciteerbaarheid6. Bovendien, met vooruitgang in differentiatieprotocollen, kunnen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) worden gedifferentieerd in regionaal specifieke neurale subtypen, waaronder corticale en ruggenmerg hiPSC-A en hiPSC-N 7,8. Deze strategieën bieden het potentieel voor het modelleren van corticale en spinale motorneuronpathologie bij ALS, evenals de astrocytische invloed op beide. Dit vereist echter dat er een reproduceerbare functionele test is om deze effecten te bepalen.
Onlangs werd aangetoond dat multi-elektrode array (MEA) opname bijzonder geschikt is voor de elektrofysiologische karakterisering van neuron-astrocyten co-culturen2. In tegenstelling tot eencellige elektrofysiologische analyses, registreren deze elektrode-arrays met hoge dichtheid passief extracellulaire veldpotentialen van grote populaties neuronen zonder de kweekomstandigheden te verstoren en de integriteit van celmembranen te behouden. Deze platforms zijn vooral nuttig voor het registreren van de cellulaire en netwerkactiviteit van culturen in de loop van de tijd en als reactie op farmacologische manipulatie. Ten slotte, wanneer de aanwezigheid van astrocyten een cultuurvariabele is, kunnen MEA-opnames functionele inzichten bieden in bidirectionele interacties tussen astrocyten en neuronen 2,9.
Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor de differentiatie van hiPSC in ruggenmerg hiPSC-A en hiPSC-motorneuronen (MN) dat eerder is gevalideerd2. Het hiPSC-A-differentiatieprotocol van het ruggenmerg resulteert consequent in astrocytenculturen, die positief zijn voor S100 calciumbindend eiwit B (S100β), gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) en Homeobox B4 (HOXB4) in respectievelijk maximaal 80%, 50% en 90% van de cellen, wat wijst op een rijpende gliale en ruggenmergspecificatie 2,10 . Het hiPSC-MN differentiatieprotocol genereert neuronen die >90% positief zijn voor choline-acetyltransferase (ChAT), wat wijst op een volwassen alfa-motorneuronidentiteit2. Daarnaast beschrijft het protocol technieken voor het genereren van hiPSC-A/MN co-culturen waarvan eerder is aangetoond dat ze resulteren in neuronen met verbeterde morfologische complexiteit door Scholl-analyse en immunofluorescente microscopie in vergelijking met neuronale culturen zonder astrocyten of met knaagdierastrocyten2. Hoewel deze beschrijvingen specifiek zijn voor het ruggenmerg hiPSC-A en hiPSC-N, is een uniek voordeel dat de initiële onafhankelijke cultuur van astrocyten en neuronen gevolgd door stappen om op latere tijdstippen te co-kweken, kan worden vertaald om de effecten van neuron-astrocyteninteracties uit andere specifieke regio's en ziektespecifieke cellen te bestuderen 7,8 . Ten slotte beschrijft het protocol hoe deze culturen op MEA-platen kunnen worden gekweekt, zodat functionele activiteit als een factor van co-cultuursamenstelling in de loop van de tijd kan worden bestudeerd met het vermogen om de cellulaire samenstelling en kweekomstandigheden te manipuleren.
Het doel van deze protocollen is om een functionele test te bieden om astrocyten-neuron interacties te onderzoeken, ziektespecifieke veranderingen te onderzoeken en geneesmiddelen met therapeutisch potentieel op het gebied van ALS te testen. Video-instructies zijn voorzien voor de meest uitdagende stappen van dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek media voorbereiding
- Bereid de afzonderlijke celkweekmedia voor met behulp van de in tabel 1 vermelde samenstellingen.
- Meng en steriel filter de media in gefilterde flessen van 500 ml en bewaar beschermd tegen licht bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
2. Onderhoud en passaging van niet-confluente door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC)
- Ontdooi de keldermembraanmatrix (bewaard in aliquots bij -80 °C) in een koelkast van 2-8 °C 's nachts.
- Verdun de keldermembraanmatrix op 1:100 (v/v) in koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM).
- Voeg voldoende keldermembraanmatrix toe om de bodem van de weefselkweekplaat te coaten (5 ml voor een plaat van 10 cm, 2 ml voor enkele putten van 6-wellsplaat) en incubeer bij 37 °C gedurende minimaal 30 minuten 's nachts of bij kamertemperatuur gedurende minimaal 1 uur.
- Aspirateer de verdunde keldermembraanmatrix en was de plaat eenmaal met PBS voordat u kweekmedia en zaaicellen toevoegt.
- Onderzoek de platen dagelijks om te bepalen en te anticiperen wanneer ze klaar zijn om te worden doorgegeven. Passageplaten van hiPSC zodra de meerderheid van de kolonies voldoende dicht zijn geworden, zodat het centrum van de kolonies verspreide witte gebieden vertoont. Laat de platen niet voorbij dit punt rijpen. Het zal overmatige differentiatie veroorzaken, wat leidt tot het verschijnen van een geel gebied in het midden van de kolonies als gevolg van celverzameling, de overvloed aan langwerpige cellen aan de randen, losse compactheid binnen kolonies of verhoogde celdood.
- Teken op de dag van passage rasterlijnen op het onderste buitenoppervlak van de platen met een marker om een nauwkeurige dekking van de hele plaat te vergemakkelijken.
- Maak gedifferentieerde kolonies los in een kweekkap met behulp van een fasecontrastmicroscoop (10x vergroting) handmatig schrapend met een pipetpunt van 200 μL.
- Spoel de platen twee keer af met PBS (5 ml per wasbeurt voor platen van 10 cm).
- Voeg 5 ml voorverwarmd weefseldissociatieprotease (Tabel van materialen) toe en incubeer de cellen bij 37 °C totdat de randen van de kolonies beginnen af te ronden (4-7 min), maar voordat de kolonies van de plaat worden getild.
- Aspirateer voorzichtig het dissociatieprotease. Spoel de plaat voorzichtig twee keer af met PBS, waarbij u voorzichtig bent om de kolonies niet los te maken.
- Voeg 5 ml voorverwarmd hiPSC-medium (tabel 1) toe aan de kweekplaat.
- Til de kolonies op terwijl je ze opsplitst in kleinere celaggregaten door de hele plaat te krassen met de punt van een 5 ml pipet met behulp van een heen-en-weer beweging van boven naar beneden.
- Draai de plaat 90° en herhaal de bovenstaande stap.
- Trituur de celaggregaten voorzichtig door op en neer te pipetteren met een pipet van 5 ml en controleer de grootte van de aggregaten periodiek onder een microscoop totdat de meerderheid van de celaggregaten ongeveer 50-100 cellen zijn.
- Zaai de celaggregaten in de voorgecoate keldermembraanmatrixplaten, met behulp van een extra hiPSC-medium om de originele plaat te wassen. Verzamel en breng de meeste celaggregaten over naar de nieuwe platen met behulp van een pipet van 5 ml.
OPMERKING: Als het protocol consistent wordt toegepast, moet de oorspronkelijke plaat iPSC-kolonies bevatten die ongeveer 50% van het kweekoppervlak bedekken voorafgaand aan de passage. In dit geval moet de splitverhouding van één plaat naar vijf nieuwe platen zijn. Dit kan echter nodig zijn om te worden aangepast afhankelijk van de groeiomstandigheden en cellijnspecifieke groeisnelheden. - Schud de nieuw gezaaide platen heen en weer om de aggregaten gelijkmatig te verdelen.
- Breng de platen over naar een incubator (37 °C en 5% CO2) en laat ze een nacht ongestoord om een goede celhechting mogelijk te maken.
- Voer elke dag een volledige mediumverandering uit met 10 ml hiPSC-medium. Als er op de dag na passage overtollig cellulair puin is, was dan eenmaal met 5 ml van het medium voordat de media verandert.
- Plan om vervolgens door te gaan wanneer witte gebieden in het midden van de meerderheid van de iPSC-kolonies verschijnen (stap 2.5). Dit gebeurt 4-6 dagen na elke passage.
3. HiPSC invriezen
- Voer de eerste stappen uit zoals in stap 2.5-2.14 voor hiPSC-passage.
- Verzamel de celaggregaten in een buis van 15 ml en draai gedurende 2 minuten op 200 x g .
- Aspirateer het supernatant, resuspendeer de pellet in een vriesmedium en breng over naar cryobuizen met behulp van een 5 ml pipet.
OPMERKING: Vergelijkbaar met de passagestappen, is de gebruikelijke splitverhouding één iPSC-plaat tot vijf cryobuizen, afhankelijk van de dichtheid van kolonies. Gebruik een totaal volume van 1 ml vriesmedium voor elke cryobuis. - Plaats de cryobuizen in een gekoelde cryopreservatiecontainer en breng deze een nacht over op -80 °C.
- Breng de cellen na 24 uur over naar vloeibare stikstof.
4. HiPSC ontdooien
- Bekleed een plaat van 10 cm met de keldermembraanmatrix (zie 2.1-2.3).
- Verwijder een iPSC cryobuis uit vloeibare stikstof en plaats deze onmiddellijk in een waterbad van 37 °C gedurende maximaal 2 minuten om snel te ontdooien. Schud de injectieflacon in het bad totdat deze gedeeltelijk is ontdooid en een klein stukje ijs bevat, omgeven door vloeistof.
- Breng de celaggregaten over van de cryobuis naar een conische buis van 15 ml met behulp van een pipet van 1000 μL. Voeg tot 15 ml voorverwarmd hiPSC-medium toe om het dimethylsulfoxide (DMSO) in de vriesmedia te verdunnen.
- Centrifugeer de conische buis van 15 ml bij 200 x g gedurende 2 min.
- Aspirateer het supernatant en gebruik een pipet van 5 ml om de celpellet in hiPSC-medium met 20 μM Rho-geassocieerde coiled-coilvormende eiwitsurine / threoninekinaseremmer (ROCK-I, verbinding Y-27632) te resuspenderen om verdere trituratie van celaggregaten te voorkomen.
- Breng de celaggregaten over op een keldermembraanmatrix-gecoate 10 cm plaat met behulp van een 5 ml pipet.
OPMERKING: Als het protocol consistent wordt toegepast, kunnen cellen in één cryobuis worden overgebracht naar een enkele plaat van 10 cm. - Schud de plaat om de aggregaten gelijkmatig te verdelen.
- Breng de couveuse van de plaat over en laat deze een nacht ongestoord om een goede celhechting mogelijk te maken.
- Voer de dag na het ontdooien een volledige mediumverandering uit met 10 ml hiPSC-medium zonder ROCK-I.
5. HiPSC differentiëren in neurale voorlopercellen van het ruggenmerg (NPC)
- Zorg ervoor dat de 6-wellplaten met keldermembraanmatrix klaar zijn voor gebruik voordat u begint met differentiatie.
- Begin met iPSC die minstens één keer en bij voorkeur twee keer na het ontdooien zijn gepasseerd en met ten minste vier platen van 10 cm (zie uitleg in stap 5.11).
- Voer de eerste stappen uit zoals in stap 2.5-2.14 voor de hiPSC-passage.
- Breng de celaggregaten van ten minste twee platen van 10 cm over in een buis van 15 ml met behulp van een pipet van 5 ml.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 2 min.
- Adem het supernatant aan en resuspendeer de celpellet met 10 ml hiPSC-medium met behulp van een pipet van 10 ml en centrifugeer vervolgens opnieuw bij 200 x g gedurende 2 minuten om de cel-cel-verklevingen in elk aggregaat los te maken.
- Adem het supernatant aan en resuspendeer de celpellet in 1 ml hiPSC-medium met 20 μM ROCK-I met behulp van een pipet van 1000 μL.
- Pipet op en neer met een pipet van 1000 μL om de celaggregaten te tritureren. Controleer de grootte van de aggregaten periodiek onder een microscoop totdat het grootste deel van de celsuspensie bestaat uit enkele cellen of kleine aggregaten van <10 cellen.
- Tel de cellen met een hemocytometer (voorkeur) of een geautomatiseerde celteller en bereken de celdichtheid in de celsuspensie.
- Plaat 3,0 x 106 cellen in elke put van een 6-well plaat voorgecoat met keldermembraanmatrix. Gebruik een pipet van 1000 μL om de celsuspensie over te brengen.
OPMERKING: Als het protocol consistent wordt toegepast, komt dit overeen met een verhouding van twee platen van 10 cm in een enkele put van een 6-put / plaat. - Herhaal stap 5.3-5.10 met een tweede batch van twee platen van 10 cm en plaats het eindproduct in een keldermembraanmatrix gecoate put van een tweede 6-well plaat. Gebruik een pipet van 1000 μL om de celsuspensie over te brengen.
OPMERKING: Ideale voltooiing van het NPC-protocol van het ruggenmerg vereist twee putten gelijk aan vier platen van 10 cm. Voor het gemak van de workflow, voltooit u stap 5.3- 5.10 met twee batches van twee platen, elk met als eindproduct twee afzonderlijke 6-well platen en elk met één put met 3,0 x 106 cellen erin. - Houd de resulterende humane iPSC-monolaag in hiPSC-medium met 20 μM ROCK-I totdat de samenvloeiing >90% bereikt, meestal op de volgende dag maar niet langer dan 3 dagen na de eerste beplating om spontane (ongecontroleerde) differentiatie te voorkomen.
- Als de differentiatie niet kan worden gestart op de dag na het plateren van de cel, was de cellen dan eenmaal met PBS en verander de media dagelijks in een vers hiPSC-medium met 20 μM ROCK-I. Als het niet samenvloeit >90% binnen 3 dagen na plating, gooit u de cellen weg en begint u het protocol opnieuw.
- Zodra >90% samenvloeiing is bereikt, begint u met differentiatie. Dit is dag in vitro 1 (DIV1) van het differentiatieprotocol.
- Gooi op DIV 1 het hiPSC-medium met 20 μM ROCK-I weg en spoel tweemaal met PBS om de foetale groeifactor (FGF) en transformerende groeifactor-bèta (TGFβ) in het stamcelmedium te verwijderen.
- Verander het medium in WiCell-medium (tabel 1) aangevuld met 0,2 μM LDN193189 (LDN) en 10 μM SB431542 (SB) gedurende 48 uur.
- Op DIV 3 eenmaal wassen met PBS en het medium vervangen door WiCell-medium aangevuld met LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + Retinoïnezuur (RA; 1μM) gedurende 48 uur.
- Was op DIV 5 eenmaal met PBS en verander de media in WiCell: Neural induction medium (NIM) base (Tabel 1) (50%:50%, v/v) aangevuld met LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) gedurende 48 uur.
- Voer op DIV 7 mediumuitwisseling uit met hetzelfde medium als in stap 5.18.
- Op DIV 8, eenmaal wassen met PBS en verander medium in WiCell:NIM base (50%:50%) aangevuld met RA (1 μM) + puromorfamine (PMN) (1 μM) + Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (10 ng/ml) + Ascorbinezuur (ASAC) (0,4 μg/ml) gedurende 48 uur.
- Op DIV 10, eenmaal wassen met PBS en verander medium naar NIM-basis (100%) aangevuld zoals vermeld in stap 5.20 gedurende 48 uur.
- Op DIV 11 of 12, bekleed een 25 cm2 steriele kweekkolf met keldermembraanmatrix ter voorbereiding op passage.
- Aspirateer het medium uit elk putje van de 6-wells plaat l en spoel de cellen eenmaal met PBS.
- Voeg 2 ml 0,05% trypsine toe aan elk putje en incubeer bij 37 °C gedurende 5-15 minuten; het met tussenpozen schudden van de platen kan helpen bij het losmaken van cellen.
- Als de cellen nog steeds niet in suspensie zijn, maak dan mechanisch los door NIM-media uit een pipetpunt van 1000 μL op de cellen te werpen met een cirkelvormige beweging (zorg ervoor dat u het hele oppervlak bedekt), of door te schrapen met een celschraper (niet de voorkeur).
- Breng de cellen over van 2 putjes naar een buisje van 15 ml en voeg trypsineremmer toe in de juiste verhouding tot de hoeveelheid trypsine die wordt gebruikt met een pipet van 5 ml.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 2 minuten, zuig het supernatant aan en resuspenseer vervolgens met 10 ml NIM-basis met behulp van een pipet van 10 ml.
- Centrifugeer opnieuw bij 200 x g gedurende 2 minuten om de cel-tot-cel verklevingen los te maken.
- Verwijder na de tweede centrifugatiestap het supernatant en suspenseer de pellet opnieuw met 1 ml NIM-medium (100%) aangevuld met RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml) en ROCK-I (20 μM). Gebruik een pipetpunt van 1000 μL om de cellen ongeveer vijf keer op en neer te tritureren totdat een troebele suspensie wordt verkregen.
- Zaai de aggregaten in dit medium opnieuw naar de keldermembraanmatrix gecoate2 steriele kweekkolf, zodat het eindresultaat de combinatie is van de cellen van twee putten van een 6-putplaat naar een enkele keldermembraanmatrix-gecoate 25 cm2 steriele kweekkolf (2:1 passage). Gebruik een pipet van 1000 μL om de celsuspensie over te brengen.
OPMERKING: De cellen moeten >90% samenvloeien op DIV 13 en er zijn geen verdere stappen nodig tot dag 14. Als de cellen niet confluent zijn, bewaar ROCK-I dan nog eens 1 of 2 dagen in de media. - Verander op DIV 14 het medium in verse NIM-media + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml).
- Verander op DIV 15 het medium in NIM: Neural differentiation medium (NDM) base (Tabel 1) (50%:50%) met RA (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg/ml) + Supplement B (50x) + BDNF (10 ng/ml) + Gliacellijn-afgeleide neurotrofe (GDNF) (10 ng/ml) + Insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1) (10 ng/ml) + Ciliaire neurotrofe factor (CNTF) (10 ng/ml). Wissel om de dag met verse media.
- Verander op DIV 21 het medium in NDM-basis (100%) aangevuld zoals in stap 5.32, en verander om de dag met een nieuw medium.
- Op DIV 25-30 verzamelt u de NPC en bevriest u ze of passeert u ze naar een plaat van 10 cm voor terminale differentiatie.
- Spoel de T-25 kolf af met PBS en voeg 0,05% trypsine toe.
- Incubeer gedurende 5 min bij 37 °C.
- Spoel het trypsine en de cellen af met de NDM-basis en breng over in een conische buis van 15 ml. Voeg de trypsineremmer in de juiste verhouding toe aan trypsine en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g .
- Resuspendeer de celpellet met motorneuron of astrocytendifferentiatiemedium (tabel 1) en gebruik een pipet van 1000 μL om op en neer te tritureren om een eencellige suspensie te verkrijgen (meestal tot 5 keer).
- Tel de cellen en breng over naar een plaat van 10 cm die is gecoat zoals beschreven in rubriek 6, met behulp van differentiatiemedia +Rock-I, om hiPSC-MN en hiPSC-A te differentiëren.
- U kunt de culturen ook invriezen door te resuspenderen in een vriesmedium dat bestaat uit 90% NDM-medium met groeifactoren (zoals in stap 5.32-5.33) en 10% DMSO, op dezelfde manier tritureren en vervolgens overbrengen naar een cryobuis. Aliquot 6 x 106 NPC per cryobuis.
6. Ontdooien van NPC-culturen
- Bekleed platen van 10 cm met polyornithine (PLO) en laminine de dag voorafgaand aan het ontdooien van de cellen.
- Voeg 5 ml PLO verdund tot 100 μg/ml in PBS of gedestilleerd water (dH2O) toe aan de platen. Incubeer bij 37 °C gedurende minimaal 1 uur tot een nacht.
- Adem de PLO-oplossing aan en spoel de platen drie keer af met PBS. (PLO is giftig als het niet goed wordt gewassen.)
- Voeg laminine verdund in PBS tot een concentratie van 10 μg/ml toe aan de PLO-gecoate platen. Incubeer bij 37 °C gedurende minimaal 1 uur, bij voorkeur een nacht. Na incubatie, aspirateer de laminine-oplossing zonder te spoelen om de celadhesie te verbeteren.
OPMERKING: De platen kunnen van tevoren worden gecoat met PLO, drie keer worden gewassen met water, worden gedroogd in een steriele kap en worden bewaard bij 4 °C.
- Ontdooi één NPC-injectieflacon (d.w.z. DIV 25 of 30) met 6 x 106 cellen/injectieflacon voor elke celkweekplaat van 10 cm.
- Verwijder de NPC cryotube uit vloeibare stikstof en plaats deze onmiddellijk in een waterbad van 37 °C gedurende maximaal 2 minuten. Ontdooi snel door de injectieflacon te schudden totdat er een klein stukje ijs is omgeven door vloeistof.
- Breng celaggregaten over in een conisch van 15 ml met behulp van een pipet van 1000 μL en voeg tot 15 ml voorverwarmd NDM of Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham's F21 F12-supplement toe om de DMSO te verdunnen.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Aspirateer het supernatant, resuspendeer de celpellet met astrocyten- of MN-differentiatiemedium (tabel 1) + ROCK-I (20 μM) en gebruik een pipet van 1000 μL om op en neer te tritureren totdat een suspensie met één cel is verkregen (tot 5 keer).
- Breng de eencellige suspensie over op een PLO-Laminin gecoate plaat van 10 cm.
- Breng de plaat over naar een couveuse en laat deze een nacht ongestoord om een goede celhechting mogelijk te maken.
7. Het onderscheiden van ruggenmerg NPC in motorneuronen
- Voer de eerste stappen uit zoals vermeld in stap 6.1-6.8, waarbij het laatste medium MN-differentiatiemedium + ROCK-I (20 μM) is.
- Voer de dag na de beplating een volledige uitwisseling van het medium uit met MN-differentiatiemedium zonder ROCK-I en verander vervolgens om de andere dag de media. Voer in het weekend cellen op vrijdag en dan weer op maandag. Spoel de cellen af met PBS wanneer dat nodig is om celresten te verwijderen.
- Verander het medium met MN-differentiatiemedium + cytosine arabinoside (ARA-C) (0,02 μM) en incubeer gedurende 48 uur wanneer glial-geëngageerde voorlopers verschijnen als enkele prolifererende platte cellen onder post-mitotische MN-voorlopercellen geaggregeerd in celclusters.
OPMERKING: Meestal gebeurt dit binnen de eerste 7 dagen na de eerste beplating, hoewel er variabiliteit kan zijn, afhankelijk van de cellijn. - Na 48 uur aspirateer het medium dat ARA-C bevat, spoel culturen driemaal voorzichtig met PBS en verander het medium in vers MN-medium zonder ARA-C.
- Voer na behandeling met ARA-C om de andere dag (of maandag, woensdag en vrijdag) mediumuitwisselingen uit door het oude medium te verwijderen met een handmatige pipet in plaats van een vacuümaspirator om voortijdig loslaten van neuronale clusters te voorkomen. Verrijk bovendien het MN-medium met Laminin 1 μg / ml eenmaal per week om de neuronale hechting aan de kweekplaten verder te verbeteren.
8. NPC differentiëren in ruggenmergastrocyten
- Ontdooi NPC-culturen zoals in rubriek 6, met behulp van Astrocytendifferentiatiemedium (tabel 1) met toevoeging van foetaal runderserum (FBS) met een volume voor volumeconcentratie van 1% (NS + 1% FBS) en ROCK-I (20 μM) voor plating.
OPMERKING: In de handel verkrijgbare serumvervanging (tabel 1) kan worden vervangen door FBS met behulp van dezelfde verdunningsfactoren. - Verander op de dag na het plateren het kweekmedium met NS + 1% FBS-medium zonder ROCK-remmer en verander vervolgens het medium om de andere dag. In het weekend voeren de cellen op vrijdag en dan weer op maandag. Spoel de cellen af met PBS wanneer dat nodig is om celresten te verwijderen. Als de cellen blijven afsterven, vul dan media aan met ROCK-I (10 μM) om de overleving van de cel te bevorderen. Wees voorzichtig om ROCK-I niet te vaak of te lang te gebruiken, gezien het potentieel om onsterfelijke cellen te selecteren.
- Laat de astrocyten samenvloeien voordat ze overgaan.
OPMERKING: De celgrootte neemt in de loop van de tijd toe, dus er is geen vast aantal voor passage. De typische passaging ratio is 1:2 of 1:3. In het geval van een slechte overleving of overgang naar te veel platen, combineer twee (of meer, indien nodig) platen van 10 cm tot één plaat van 10 cm om de samenvloeiing te behouden. - Om astrocytenvoorloperculturen te passeren, wast u de platen eenmaal met PBS (om FBS te verwijderen), incubeert u met 0,05% trypsine gedurende 5 minuten, verzamelt u de cellen in NS-medium + 1% FBS (FBS inactiveert trypsine) en centrifugeert u vervolgens gedurende 5 minuten op 300 x g . Aspirateer het supernatant, resuspensieer de cellen in NS-medium + 1% FBS en triturateer vervolgens tot een eencellige suspensie. Verdeel cellen in NS + 1% FBS naar nieuwe platen van 10 cm.
OPMERKING: Naast het uitbreiden van astrocytenculturen, dient herhaald passeren van platen het doel om alle resterende voorlopercellen te doden die een neuronaal lot hebben gekozen. Daarom, zelfs als er geen zeer hoge mitotische snelheid is, kunnen platen worden gepasseerd in een verhouding van 1: 1 als er neuronale besmetting lijkt te zijn. - Verander de coating in de loop van de differentiatie om de opbrengst als volgt te verbeteren.
- Plaat de aanvankelijk ontdooide NPC-culturen en de eerste passages na de eerste beplating op PLO/Laminin.
- Plaats de onrijpe astrocyten op keldermembraan matrix gecoate platen.
- Plaat meer volwassen astrocyten (d.w.z. na dag 90) op keldermembraanmatrix, PLO / Laminin-gecoate platen (meestal voor co-cultuur met neuronen), of op ongecoate platen.
- Bevries de astrocytenvoorlopers op elk moment gedurende de rijpingsperiode van 60 dagen om culturen te synchroniseren of te bewaren voor latere experimenten. Wanneer u voorbij het NPC-stadium ontdooit, ontdooit u de astrocytenvoorlopers op de met keldermembraanmatrix gecoate platen in plaats van PLO / Laminin.
- Schakel bij DIV 90 en daarna het medium over van NS + 1% FBS naar NS + 5% FBS om de overleving van astrocyten te bevorderen en hun proliferatie te verminderen.
9. Co-kweken van MN en ruggenmerg astrocyten in multi-elektrode array platen
- Differentieer en plaat de motorneuronen en astrocyten wanneer ze klaar zijn om op dezelfde dag te worden gebruikt en gerijpt tot DIV 60 voor de motorneuronen en DIV 90 voor de astrocyten.
- Bekleed de MEA-platen op de dag ervoor of op de dag van beplating als volgt als u werkt met 24-wells plastic platen (Materiaaltabel).
- Verdun PLO in water of PBS tot 100 μg/ml.
- Voeg 15-20 μL toe aan elke put (afhankelijk van het comfortniveau van de pipet) en vorm een druppel op het midden van de put die het gebied van de elektroden en het omliggende gebied bedekt, maar niet het geheel van de put.
- Zorg ervoor dat u de elektroden niet beschadigt met de pipetpunt. Wees consistent met het volume van put tot put om dekking van hetzelfde oppervlak in elke put te garanderen.
- Incubeer PLO bij 37 °C gedurende minimaal 1 uur (bij voorkeur 2 uur).
OPMERKING: De kleine volumes zullen opdrogen als er niet voldoende vochtigheid in de platen zit. Voeg water toe aan de compartimenten rondom putten om voldoende vochtigheid te garanderen tijdens het coaten en opnemen.
- Aspirateer zoveel mogelijk PLO met behulp van een plastic micropipette tip. Zorg ervoor dat u de elektroden niet aanraakt. Driemaal wassen met 250 μL water. Als u een vacuümaspirator gebruikt voor wasbeurten, mag u de punt niet in de buurt van de elektrode-array laten komen. Verwijder na de derde wasbeurt zoveel mogelijk water en gebruik zo nodig een pipetpunt. Laat het oppervlak drogen onder de celkweekkap met het deksel verwijderd.
- Zodra de plaatoppervlakken droog zijn, voegt u Laminin verdund tot 10 μg / ml in PBS toe. Gebruik 15-20 μL om elke elektrode-array te bedekken. Voeg water toe aan de vochtigheidscompartimenten, vervang het deksel en breng de plaat terug naar 37 °C incubatie gedurende minimaal 2 uur tot een nacht.
- Spoel op de dag van plating de MN- en astrocytenculturen eenmaal af met PBS en voeg trypsine 0,05% toe bij 37 °C om cellen op te tillen (5 min). Verzamel in een conische buis van 15 ml met trypsineremmer en wasplaten met medium of basis om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer met een pipet van 1000 μL om 1 ml van een eencellige suspensie te genereren. Schakel bij het opnieuw opschorten van MN en astrocyten over op het cocultuurmedium (tabel 1), met toevoeging van 20 μM ROCK-I.
- Tel de MN en astrocyten parallel met behulp van een hemocytometer. Sluit tijdens het tellen en het maken van berekeningen de celsuspensies af en plaats ze in een piepschuimrek bij 4 °C.
- Bereken het volume dat nodig is om de culturen te resuspenderen tot een concentratie van 5 x 104 cellen per 5 μL voor motorneuronen en 2,5 x 104 cellen per 5 μL voor astrocyten. Centrifugeer de 1 ml celsuspensies bij 300 x g gedurende 5 minuten en resuspenseer in het berekende volume.
- Bereken het aantal gewenste putten dat moet worden gezaaid en vermenigvuldig dit met 5 μL van elke celsuspensie. Combineer het vereiste volume neuron- en astrocytensuspensies in een verhouding van 1:1 en mix door te pipetteren totdat het grondig wordt gecombineerd (meestal twee keer), maar vermijd te agressief te zijn.
- Verwijder de Laminin uit elk putje van de MEA-plaat met behulp van een pipetpunt. Breng 10 μL van de uiteindelijke gecombineerde celsuspensie over naar elke put en vorm een kleine druppel die de elektrode-array bedekt om een celdichtheid van 5 x 104 MN en 2,5 x 104 astrocyten per put te verkrijgen.
OPMERKING: Hoge celdichtheid in de gecombineerde suspensie vereist frequente resuspensie tussen putten tijdens de zaaistap om nauwkeurige en consistente celtellingen te garanderen. - Breng de platen terug naar de incubator gedurende 20-30 minuten. Zorg ervoor dat u de celdruppel niet verstoort en laat de cellen de eerste bevestigingen op de platen vormen.
- Voeg na 20-30 minuten warme co-kweekmedia + ROCK-I toe aan elke put door 250 μL op de wand van elke put te pipetteren, gevolgd door nog eens 250 μL langs de wand van dezelfde put aan de andere kant. Breng de plaat terug naar de couveuse.
- Onderzoek borden de dag na het zaaien (Co-kweek dag 1). Als er aanzienlijk celafval of dode cellen zijn, wissel het medium dan uit met een vers co-kweekmedium dat ROCK-I bevat. Verander anders het medium op de tweede dag na het zaaien (Co-Culture Day 2) naar het co-kweekmedium zonder ROCK-I. Voer half-medium uitwisselingen uit (aspirateer 50% en voeg 60% van het uiteindelijke volume toe om rekening te houden met verdamping) twee keer per week.
- Bij gebruik van MEA-systemen met enkele put 30 mm glasplaten (materiaaltabel), kan de plaatvoorbereiding 2 of meer dagen duren. Volg de onderstaande stappen om dit uit te voeren.
- Til de cellen en het celafval van de vorige MEA-culturen op met 0,05% Trypsine gedurende 5-15 minuten.
- Aspirate trypsine en spoel drie keer met water.
- Steriliseer door 70% ethanol toe te voegen en incubeer gedurende 10 minuten in de kap. Zuig de ethanol aan en spoel vervolgens drie keer met water.
- Breng 1% anionisch wasmiddel met protease-enzym aan in water. Bedek de platen met een deksel en wikkel ze met thermoplastische film en aluminiumfolie en laat ze vervolgens een nacht op kamertemperatuur op een rocker liggen.
- Zuig het wasmiddel aan en spoel vervolgens drie keer met water.
- Als u van plan bent om de platen op te slaan, voeg dan een voldoende hoeveelheid water toe. Bedek de borden met een deksel en wikkel ze met thermoplastische film en aluminiumfolie en laat ze in de koelkast staan tot het volgende gebruik.
- Als u van plan bent om te coaten, laat het oppervlak dan drogen onder de celkweekkap.
- Als extra sterilisatie nodig is (bijv. eerdere infectie of niet-recent gebruik), stel dan alleen op dit moment MEA-platen bloot aan ultraviolet (UV) licht onder de motorkap gedurende 30-60 minuten.
OPMERKING: Het vermijden van frequent UV-licht voorkomt schade aan de elektroden. Het gebruik van UV-licht wanneer platen serum bevatten, zal resulteren in niet-functionele elektroden, daarom mag het alleen op gereinigde platen worden gebruikt. - Wanneer de platen volledig droog zijn, gaat u verder met plasmareiniging gedurende 1 minuut om het glasoppervlak van MEA-platen op te laden en de effectiviteit van de coating te verbeteren. Plasma reinigt ten minste eenmaal per 4-5 cycli van MEA-plaatreinigingscycli.
- Als alternatief, wanneer plasmareiniging niet haalbaar of niet gerechtvaardigd is, voegt u een voldoende volume FBS-bevattend medium toe om het oppervlak van de MEA-platen te bedekken en brengt u deze 's nachts terug naar de incubator.
- Gebruik PLO/Laminin coating zoals hierboven beschreven in rubriek 6. Voeg PLO-oplossing (100 μg in PBS) onmiddellijk na plasmareiniging of aspiratie toe en spoel het FBS-bevattende medium uit.
- Plaats de cellen zoals hierboven bij de volgende dichtheden: 1 x 105 hiPSC-A / plaat en 5 x 105 hiPSC-MN / plaat.
10. Multi-elektrode array opname
- Extraheer de ruwe spanningsgegevens met een bemonsteringsfrequentie van 12,5 kHz, met behulp van een Butterworth-filter met een 200 Hz hoogdoorlaat- en 3 kHz laagdoorlaatfilter. Stel spikeherkenning in als momentane tijdspunten van spanningen ≥6 standaardafwijkingen ten opzichte van de basislijn. Identificeer bursts als een activiteit met >5 pieken in 100 ms. Definieer netwerkactiviteit wanneer meer dan 35% van de totale actieve elektroden binnen 100 ms afvuurt met een minimum van 50 pieken per netwerkuitbarsting.
- Begin zo snel mogelijk met opnemen na Co-Culture (CC) Dag 1.
OPMERKING: Elektrische activiteit zal zelden worden genoteerd vóór CC Day 3. - Plaatparallelculturen bij vergelijkbare dichtheden en repliceren in de juiste kweekplaten of coverslips voor biochemische assays, immunocytochemie (ICC) of qPCR.
- Voer opnames uit met de temperatuur ingesteld op 37 °C ad CO2 bij 5%. Breng platen over naar de machine en laat ze gedurende ten minste 5 minuten voor de opname in evenwicht zijn.
- Registreer de basislijnactiviteit om de andere dag of wekelijks, gedurende 1-15 minuten, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Neem niet op gedurende ten minste 1 uur na een medium uitwisseling en wacht idealiter 24 uur na elke media-uitwisseling.
- Om besmetting te voorkomen, vervangt u het medium (d.w.z. halve mediumuitwisseling zoals in stap 9.14) na elke registratie waarbij het deksel van de steriele plaat buiten de steriele kap moet worden geopend (d.w.z. de toepassing van geneesmiddelverbindingen). Voer volledige mediumuitwisselingen en wasbeurten uit om medicijnen uit te spoelen als platen verder worden gebruikt dan medicamenteuze behandeling.
- Gebruik voor analysedoeleinden ten minste drie technische en biologische replicaties voor elke aandoening. Druk elektrofysiologische gegevens uit als middel van n ≥ 3 repliceert.
11. Farmacologische testen op multi-elektrode array
- Gebruik een andere combinatie van coculturen, afhankelijk van de experimentele vraag: ALS-neuronen met controle-astrocyten, controleneuronen met ALS-astrocyten, ALS-neuronen en astrocyten, controleneuronen en astrocyten.
- Bij het onderzoeken van voorbijgaande elektrofysiologische effecten van verbindingen gericht op neuronen of astrocyten, registreert u de basisactiviteit gedurende minimaal 1 minuut met het plaatdeksel verwijderd maar het machinedeksel gesloten.
- Open het deksel handmatig naar de machine zonder de elektrofysiologische opname te stoppen en wissel 25 μL medium uit met het juiste geneesmiddelvoertuig (meestal vers medium) met behulp van een meerkanaals pipet bij behandeling van meerdere putjes. Sluit het deksel handmatig.
- Registreer gedurende nog eens 1 minuut (of meer als er significante door het voertuig veroorzaakte veranderingen zijn waarvan de cultuur moet herstellen).
- Open het deksel handmatig opnieuw en wissel 25 μL medium uit met het medicijn dat van belang is in hetzelfde voertuig. Sluit het deksel op het apparaat en ga verder met opnemen.
OPMERKING: De duur van de registratie en het volume van het toegediende geneesmiddel/medium kunnen variëren of moeten worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de experimentele vraag. - Zorg er voor analysedoeleinden voor dat de toevoeging van het voertuig geen significante veranderingen in elektrofysiologische parameters veroorzaakt. Bereken procentuele veranderingen van de activiteit na medicijn in vergelijking met na toevoeging van het voertuig en vergelijk tussen de omstandigheden.
- Om longitudinale elektrofysiologische effecten te onderzoeken, zoals kandidaat-ziektemodificerende geneesmiddelen, registreert u de baselineactiviteit die wordt beschreven in stap 11.2. Gebruik hiervoor het cocultuurmedium dat de drug(s) van belang bevat in het juiste voertuig of het medium dat alleen het voertuig bevat.
- Vergelijk voor analysedoeleinden de tijdsregistraties van ALS of controleer coculturen die longitudinaal met geneesmiddelen zijn behandeld met elkaar en controleer de omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het ruggenmergpatroonprotocol voor het genereren van hiPSC-MN en ruggenmerg hiPSC-A is beschreven in figuur 1. In dit protocol worden hiPSC's onderhouden en doorgegeven als niet-confluente kolonies (figuur 2A). Neurogenese wordt geïnitieerd (neurale inductie) door dubbele SMAD-remming door de toevoeging van LDN193189 en SB431542, waarbij respectievelijk het botmorfogenetische eiwit (BMP) en de transformerende groeifactor-bèta (TGF-β) -routes worden geïnactiveerd. Voor deze stap wordt een monolaag-gebaseerde methode gebruikt waarbij hiPSC wordt verguld op een adherente matrix, d.w.z. keldermembraanmatrix, om een neuro-epitheelachtige 2D-cultuur te genereren. Morfologisch wordt neurale inductie gekenmerkt door de overgang van iPSC met grote kernen en ronde vorm naar neuro-epitheliale (stam) cellen die strak verdicht zijn, met een groot cytoplasma en cilindrische vorm. Deze cellen delen zich zowel horizontaal als verticaal en genereren een meerlagig epitheel (figuur 2B,i).
De voorkeur voor een 2D, in tegenstelling tot een 3D-strategie (d.w.z. embryoïde lichaamsgebaseerd), is gebaseerd op literatuurbewijs11,12 dat suggereert dat de eerste het patroon van het ruggenmerg kan bevorderen door celextrinsieke omgevingssignalen te introduceren13. Neuro-epitheelcellen worden vervolgens temporeel en ruimtelijk gemodelleerd om regiospecifieke, d.w.z. ruggenmerg-, neurale voorlopercellen (NPC) te genereren (figuur 1). Twee belangrijke morfogenen worden voor dit doel gebruikt: retinoïnezuur, dat caudalisatie bepaalt, en purmorphamine, een egelsignalerende agonist, die ventrale specificatie veroorzaakt. In hun afwezigheid zou de cel-intrinsieke regionale identiteit van NPC rostrale en dorsale 14,15,16 zijn.
Van DIV 15 tot DIV 25-DIV 30 wordt de regionale identiteit van deze NPC versterkt door media aan te vullen met de morfogenen. Tegelijkertijd genereert de vroege blootstelling aan neuronale groeifactoren en een gliogeen cytokine zoals ciliaire neurotrofe factor (CNTF) een gemengde populatie van NPC (figuur 2B,ii). Morfologisch zijn deze cellen minder verdicht dan neuro-epitheelcellen, die weinig korte processen vertonen, gerangschikt in een monolaag na verstoring van het zuilvormige epitheel na passage bij DIV 12. Bij nader inzien zijn sommige van deze cellen langwerpig, terwijl andere meerdere processen vertonen, wat wijst op een vroege toewijding aan respectievelijk een gliaal versus neuronaal lot.
Neuronen zullen spontaan uit deze gemengde populatie ontstaan, tenzij de gliogene schakelaar wordt geactiveerd (figuur 1 en figuur 2B, iii). De toevoeging van de Notch Pathway-remmer, Compound E, zal de lagere MN-differentiatieverbeteren 17. De ruggenmergidentiteit van deze cellen wordt ondersteund door hoge niveaus van ChAT-expressie (figuur 2C, i). Daarnaast is eerder aangetoond2 dat een subpopulatie van deze motorneuronen ook ISL1+ is.
Astrocytendifferentiatie wordt geïnduceerd door de gliogene schakelaar door activering van de JAK/STAT-route (figuur 1 en figuur 2B, iv). CNTF en waarschijnlijk andere cytokines in foetaal runderserum dienen dit doel in het voorgestelde protocol. Tijd is ook een essentiële factor, omdat gliogenese spontaan zal volgen na neurogenese als gevolg van cel-intrinsieke aanwijzingen. Na DIV 90 vertoont hiPSC-A een rijpend fenotype zoals aangegeven door S100β en GFAP-expressie 2,11, terwijl hun spinale regionale identiteit wordt ondersteund door >90% expressie van HOXB4 (Figuur 2C, ii)2,11,14.
De methode voor het co-kweken van hiPSC-MN en hiPSC-A is opmerkelijk voor gelijktijdige plating van deze celsubtypen in tegenstelling tot technieken waarbij neuronen serieel worden verguld op de top van astrocytenculturen. In deze gelijktijdige coculturen zullen cellen zich spontaan herschikken, waarbij astrocyten een voedingslaag aan de onderkant creëren en neuronen zich verbinden in netwerken aan de bovenkant (figuur 2C, iii). Deze strategie heeft eerder aangetoond dat2 een meer uniforme verdeling van neuronen mogelijk maakt dan andere co-kweekstrategieën, waarbij deze celtypen de neiging hebben om te clusteren.
Menselijke iPSC-MN worden alleen of in co-cultuur met hiPSC-A op een 24-well MEA-plaat (n = 12 per conditie) geplateerd, waarbij elke put 16 elektroden bevat (figuur 3A). Fasecontrastbeelden van mono- of coculturen en rasterplots van spikingactiviteit uit twee representatieve putten worden getoond (figuur 3B,C). Humane iPSC-A verbetert de elektrofysiologische rijping van hiPSC-MN, zoals blijkt uit significant hogere graden van spiking en bursting-activiteit in de coculturen (figuur 3D). Dit loopt parallel met de effecten van hiPSC-A op de morfologische en moleculaire rijping van hiPSC-MN die eerder is aangetoond2.
Enkele van de technische uitdagingen van dit protocol worden gedetailleerd beschreven in de video-instructies, waar de technieken voor plating en opname met behulp van MEA-platforms en representatieve opnames van deze culturen worden getoond.
Figuur 1: Protocol voor de generatie van het ruggenmerg hiPSC-MN en hiPSC-A en hun co-cultuur. (A) Tijdlijn van het differentiatieprotocol met gedetailleerde kritieke stadia. Richt je in de insert op het 30-daagse protocol voor het genereren van NPC van het ruggenmerg, met dagelijkse acties (E-uitwisselingsmedium, P-passage of geen actie), celkweekbasis en supplementen (voor aanvullende informatie over de samenstelling, zie tabel 1 en tabel met materialen). (B) Afstammingslijnen en lotsverbintenissen van cellen worden schematisch weergegeven. Coculturen worden gegenereerd wanneer volwassen hiPSC-MN (d.w.z. DIV 60) en hiPSC-A (d.w.z. DIV 90) gelijktijdig worden gemengd en verguld. (Illustratie gemaakt met BioRender). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologische veranderingen tijdens het ruggenmergdifferentiatieprotocol. (A) Fasecontrastmicroscoopbeelden van hiPSC. Panelen (i) (lager vermogen, 10x) en (ii) (hoger vermogen, 20x) tonen normale hiPSC, panelen (iii) (10x) en (iv) (20x) tonen een gedifferentieerde hiPSC-kolonie. Schaalstaven = 200 μm en 50 μm. (B) Representatieve fasecontrastmicroscoopbeelden van neuro-epitheelcellen bij DIV 5 (i), NPC's bij DIV 21 (ii) en volwassen DIV 60-motorneuronen (iii) en DIV 90-astrocyten (iv). Schaalstaven = 100 μm en 50 μm (C) Representatieve immunocytochemische beelden op 40x olie van hiPSC-MN (i), hiPSC-A (ii) en hun co-cultuur (iii). Rijping en regiospecifieke markers werden gericht. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Multi-elektrode array opname van hiPSC-MN. (A) Heatmap van de gemiddelde spikingactiviteit van een enkele MEA-plaat (n = 24 putten) bij DIV 18 na beplating. Putten in rijen A en B (n = 12 putten / technische replicaties) vertegenwoordigen alleen culturen van hiPSC-MN, terwijl putten in rijen C en D (n = 12 putten) co-culturen zijn van hiPSC-MN / hiPSC-A. (B) Representatieve fasecontrastbeelden van hiPSC-MN alleen (MN) en in cocultuur met hiPSC-A (MN+SCA) op MEA-platen. Neuronen aggregeren in grote celclusters wanneer ze alleen worden gekweekt, terwijl de co-cultuur van hiPSC-MN met hiPSC-A resulteert in gelijkmatig verdeelde monolagen. Schaalbalk = 50 μm. (C) Representatieve rasterplot van spikingactiviteit over 120 s opnametijd van een enkele put met hiPSC-MN alleen en hiPSC-MN in co-cultuur met hiPSC-A. Netwerk burst-activiteit over alle elektroden wordt gemarkeerd met een paarse doos. (D) Kwantificering en vergelijking van spiking en bursting activiteit tussen neuronen alleen en neuronen in co-cultuur met astrocyten van de MEA-plaat weergegeven in paneel A. (*** p < 0,001, **** p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tot op heden hebben hiPSC- en MEA-gebaseerde methoden voor elektrofysiologische opnames van astrocyten-neuron co-culturen een beperkte toepassing gevonden op het gebied van ALS6 en nog steeds niet in volledig menselijke platforms, in tegenstelling tot hun meer wijdverspreide gebruik voor in vitro modellering van epilepsie9. Dit platform heeft echter het potentieel om pathofysiologisch relevante vragen in ALS-onderzoek aan te pakken, zoals de mechanismen van neuronale hyperexcitabiliteit, astrocytenbijdrage aan neurotoxiciteit of de rol van netwerkactiviteit in de progressie van de ziekte. Bovendien maakt dit platform het mogelijk om prospectieve elektrofysiologische gegevens gedurende meer dan 9 maanden in vitro te verzamelen en biedt daarom een aanpak voor het testen van verbindingen met therapeutisch potentieel2.
Protocollen voor het genereren van hiPSC-N en hiPSC-A in de literatuur verschillen sterk in relatie tot mediacondities, de timing van culturen, opbrengst- en rijpingsprofielen, naast andere factoren. Een groot voordeel van het voorgestelde platform is dat astrocyten en neuronen afzonderlijk worden gedifferentieerd en op latere tijdstippen samen worden gekweekt door de twee celtypen tegelijkertijd te platen. Na optimalisatie voor celdichtheden en timing kan deze methode worden vertaald om te worden gebruikt met celtypen die ook zijn afgeleid van andere protocollen, waaronder andere regiospecifieke cellen.
Van het grootste belang voor het voorgestelde platform is de regionale specificatie van motorneuronen en astrocyten. Hoewel het voorgestelde protocol ruggenmergspecifiek is in zijn vermogen om ChAT + MN en HOXB4 + astrocyten te genereren, kunnen gevestigde differentiatietechnieken worden gebruikt om hiPSC-afgeleide neuronen en astrocyten te genereren die corticale identiteiten vertonen, zoals CTIP2 + laag V corticale motorneuronen18 en OTX2 + voorhersene astrocyten14 . Het voorgestelde platform heeft dus het potentieel om neurale circuits van de cortex en het ruggenmerg te modelleren, evenals hun verbindingen.
Er zijn meerdere systemen beschikbaar voor MEA-registratie. Kunststof 24-well MEA-platen met 16 elektroden per put met CO2 en temperatuurregeling hadden de voorkeur voor het onderzoek. Dit platform is met name geschikt voor high-throughput screening in tegenstelling tot systemen op basis van single well opnames. De belangrijkste beperking van plastic platen is dat het oppervlak gevoeliger kan zijn voor degradatie bij herhaald gebruik. Systemen op basis van glazen MEA-platen hebben het voordeel dat ze meerdere keren herbruikbaar zijn na de juiste behandelingen zoals hierboven beschreven (tot 20 tot keer), zonder significant verlies van gegevensregistratiekwaliteit. Deze behandelingen en de coatingmethoden zijn echter tijdrovender en technisch uitdagender, gezien het hydrofobe oppervlak van deze platen.
Een van de belangrijkste obstakels van iPSC- en MEA-gebaseerde methoden voor elektrofysiologische registratie is de variabiliteit en reproduceerbaarheid van experimentele bevindingen. Eerdere studies tonen aan dat MEA-activiteit van neuronen afhankelijk is van rijping die wordt beïnvloed door meerdere factoren, waaronder, maar niet beperkt tot, geschikte differentiatietechnieken die worden gebruikt bij het genereren van zowel astrocyten als neuronen, celdichtheid van neuronen, de verhouding van astrocyten tot neuronen gedurende differentiatie en rijping, volgorde van astrocyten en neuron co-culturen2 . Het standaardiseren van deze variabelen zoals voorgesteld in dit protocol is een manier om reproduceerbaarheid te garanderen. De keuze voor multiwell MEA-systemen die gegevens met een hoge doorvoer genereren, zal rekening houden met experimentele variabiliteit. Als de elektrofysiologische activiteit van een cultuur minder is dan wat op een bepaald tijdstip wordt verwacht, is het belangrijk om te bepalen dat succesvolle differentiatie is opgetreden en dat zusterculturen die immunocytochemisch of biochemisch kunnen worden geanalyseerd nuttig zijn. Aangezien een zeer klein volume cellen in eerste instantie wordt gezaaid, kunnen kleine pipetteerfouten resulteren in relatief grote veranderingen in celaantallen en dus dichtheid. Het gebruik van MEA-platen die directe visualisatie en beoordeling van de celdichtheid mogelijk maken, is ook belangrijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit manuscript werd ondersteund door het volgende: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). We bedanken Dr. Raha Dastgheyb en Dr. Norman Haughey voor het leveren van het MEA-platform en de data-analysesoftware die we hebben gebruikt om het beschreven elektrofysiologische platform te valideren. We willen Khalil Rust bedanken voor hun hulp bij protocoldemonstraties en filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix - Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B - B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N - N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film - Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease - Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
References
- Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
- Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
- Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
- Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
- Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
- Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
- Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
- Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
- Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
- Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
- Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).
