Summary
Dit protocol presenteert een techniek voor het onderzoeken van eiwit-eiwitinteracties met behulp van glutathion-gekoppelde donorkralen met GST-gefuseerde TPR-motief co-chaperones en acceptor kralen in combinatie met een Hsp90-afgeleid peptide. We hebben deze techniek gebruikt om kleine moleculen te screenen om Hsp90-FKBP51- of Hsp90-FKBP52-interacties te verstoren en hebben krachtige en selectieve Hsp90-FKBP51-interactieremmers geïdentificeerd.
Abstract
Het richten op de heat shock eiwit 90 (Hsp90)-cochaperon interacties biedt de mogelijkheid om specifiek Hsp90-afhankelijke intracellulaire processen te reguleren. Het geconserveerde MEEVD pentapeptide aan de C-terminus van Hsp90 is verantwoordelijk voor de interactie met het tetratricopeptide repeat (TPR) motief van co-chaperones. FK506-bindend eiwit (FKBP) 51 en FKBP52 zijn twee vergelijkbare TPR-motief co-chaperones die betrokken zijn bij steroïde hormoonafhankelijke ziekten met verschillende functies. Daarom biedt het identificeren van moleculen die specifiek interacties tussen Hsp90 en FKBP51 of FKBP52 blokkeren, een veelbelovend therapeutisch potentieel voor verschillende menselijke ziekten. Hier beschrijven we het protocol voor een versterkte luminescerende nabijheid homogene assay om interacties tussen Hsp90 en zijn partner co-chaperones FKBP51 en FKBP52 te onderzoeken. Ten eerste hebben we de TPR-motiefbevattende eiwitten FKBP51 en FKBP52 gezuiverd in glutathion S-transferase (GST)-gelabelde vorm. Met behulp van de glutathion-gekoppelde donorkralen met GST-gefuseerde TPR-motiefeiwitten en de acceptorkralen in combinatie met een 10-mer C-terminal peptide van Hsp90, hebben we eiwit-eiwitinteracties in een homogene omgeving onderzocht. We hebben deze test gebruikt om kleine moleculen te screenen om Hsp90-FKBP51- of Hsp90-FKBP52-interacties te verstoren en hebben krachtige en selectieve Hsp90-FKBP51-interactieremmers geïdentificeerd.
Introduction
Moleculaire chaperones dragen bij aan eiwithomeostase, inclusief eiwitvouwing, transport en afbraak. Ze reguleren verschillende cellulaire processen en zijn gekoppeld aan tal van ziekten zoals kanker en neurodegeneratieve ziekten1. Heat shock protein 90 (Hsp90) is een van de belangrijkste chaperones waarvan de functie afhankelijk is van conformatiesveranderingen aangedreven door ATP-hydrolyse en binding met cliënteiwitten gemedieerd door zijn co-chaperones2. Ondanks een duidelijk potentieel van Hsp90 als het therapeutische doelwit, vormt het verfijnen van de functie ervan een grote uitdaging. Er zijn verschillende Hsp90-remmers gericht op het N-terminale ATP-bindingsgebied, die zijn geëvalueerd in klinische onderzoeken, maar geen van hen is goedgekeurd voor het op de markt brengen3. Vanwege het ontbreken van een goed gedefinieerde ligandbindende pocket4,heeft het richten op het C-terminale gebied van Hsp90 beperkt succes gehad4. Onlangs is verstoring van Hsp90-cochaperoninteracties door kleine moleculen onderzocht als een alternatieve strategie5. Het richten op de Hsp90-cochaperoninteracties zou geen algemene celstressrespons uitlokken en biedt de mogelijkheid om specifiek verschillende intracellulaire processen te reguleren. Het geconserveerde MEEVD pentapeptide aan de C-terminus van Hsp90 is verantwoordelijk voor de interactie met het tetratricopeptide repeat (TPR) motief van co-chaperones6. Van de 736 TPR-motiefbevattende eiwitten die zijn geannoteerd in de menselijke eiwitdatabase, interageren ~ 20 verschillende eiwitten met Hsp90 via dit peptide7. Moleculen die concurreren om MEEVD-peptidebinding zouden de interacties tussen Hsp90 en co-chaperones die een TPR-domein bevatten, verstoren. De peptidebindingsplaats heeft een vergelijkbare tertiaire structuur, maar de algehele homologie tussen verschillende TPR-motiefdomeinen is relatief laag7, wat een mogelijkheid biedt om moleculen te identificeren die specifiek in staat zijn om interacties tussen Hsp90 en bepaalde TPR-motief co-chaperones te blokkeren. Onder deze TPR-motief co-chaperones, FK506-bindend eiwit (FKBP) 51 en FKBP52 zijn regulatoren van steroïde hormoonreceptor (SHR) signalering en betrokken bij verschillende steroïde hormoon-afhankelijke ziekten, waaronder kanker, stress-gerelateerde ziekten, metabole ziekten, en de ziekte van Alzheimer8. Hoewel FKBP51 en FKBP52 > 80% sequentie-gelijkenis delen, verschillen hun functies: FKBP52 is een positieve regulator van SHR-activiteit, terwijl FKBP51 in de meeste gevallen een negatieve regulator is8. Daarom biedt het identificeren van moleculen, die specifiek interacties tussen Hsp90 en FKBP51 of FKBP52 blokkeren, een veelbelovend therapeutisch potentieel voor gerelateerde ziekten.
Eenmplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) werd voor het eerst ontwikkeld in 1994 door Ullman EF et al.9. Nu wordt het veel gebruikt om verschillende soorten biologische interacties te detecteren, zoals peptide10,eiwit11,DNA12,RNA13en suiker14. Bij deze techniek zijn er twee soorten kralen (diameter 200 nm), de ene is de donorkraal en de andere is de acceptorkraal. De biomoleculen worden op deze kralen geïmmobiliseerd; hun biologische interacties brengen donor- en acceptorkralen in de buurt. Bij 680 nm licht een foto-ensitizer in de donorkraal op en zet zuurstof om in singletzuurstof. Omdat de singletzuurstof een korte levensduur heeft, kan deze slechts tot 200 nm diffunderen. Als de acceptorkraal in de buurt is, reageert het thioxeenderivaat met de singletzuurstof die chemiluminescentie genereert bij 370 nm. Deze energie activeert verder fluoroforen in dezelfde acceptorkraal om licht uit te stralen bij 520-620 nm15. Als de biologische interacties worden verstoord, kunnen de acceptorkraal en donorkraal de nabijheid niet bereiken, wat resulteert in het singlet zuurstofverval en een laag geproduceerd signaal.
Hier beschrijven we een protocol met behulp van deze techniek voor het screenen van kleine moleculen die interacties tussen Hsp90 en TPR co-chaperones remmen, met name FKBP51 en FKBP52. De 10 aminozuur lange peptiden die overeenkomen met Hsp90 extreme C-terminus zijn bevestigd aan acceptor kralen. Gezuiverde GST-gelabelde TPR co-chaperones interageren met glutathion-gekoppelde donorkralen. Wanneer de interactie tussen Hsp90-afgeleide peptiden en TPR-motief co-chaperones de kralen samenbrengt, wordt een versterkt signaal geproduceerd (Figuur 1A). Als de gescreende kleine moleculen de interacties tussen Hsp90 en TPR-motief co-chaperones kunnen remmen, zal dit versterkte signaal worden verminderd(figuur 1B). Hun IC50 kan worden berekend door kwantitatieve meting. Dit protocol kan worden uitgebreid naar alle chaperonne - TPR-motief co-chaperonne interacties van belang en is van groot belang bij de ontwikkeling van nieuwe moleculen, met name het blokkeren van de interactie tussen Hsp90 en FKBP51 of FKBP52.
Figuur 1: Het basisprincipe van deze test. (A) Purified GST-FKBP51 interageert met glutathion-gebonden donorkralen. De 10 aminozuur lange peptiden die overeenkomen met de extreme C-terminus van Hsp90 zijn bevestigd aan acceptor kralen. De interactie tussen van Hsp90 afgeleide peptiden en het TPR-domein van FKBP51 brengt de donor- en acceptorparels in de nabijheid. Bij 680 nm licht een foto-ensitizer in de donorkraal op en zet zuurstof om in singletzuurstof. Het thioxeenderivaat op de acceptorkraal reageert met de singletzuurstof en genereert chemiluminescentie bij 370 nm. Deze energie activeert verder fluoroforen in dezelfde acceptorkraal om licht uit te stralen bij 520-620 nm. BWanneer kleine moleculen de interacties tussen Hsp90 en FKBP51 remmen, kunnen de donor- en acceptorparels de nabijheid niet bereiken. Dan vervalt de singletzuurstof met een korte levensduur en wordt er geen detecteerbaar signaal geproduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Een overzicht van dit protocol is weergegeven in figuur 2.
1. Expressie en zuivering van GST-FKBP51 en GST-FKBP52 (Figuur 2A)
-
Plasmiden
OPMERKING: Verkrijg cDNA-klonen voor menselijke FKBP51 (kloon-id: 5723416) en voor menselijke FKBP52 (kloon-id: 7474554) van het IMAGE-consortium.- Amplify the human FKBP51 DNA by PCR with primers (forward; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', reverse; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') containing BamHI and XhoI overhangs and clone into pGEX6-1 vector at BamHI / XhoI restriction sites.
- Versterk het menselijke FKBP52 DNA door PCR met primers (voorwaarts; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', omgekeerd; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCTCCAC-3') die EcoRI- en XhoI-overhangen bevatten en klonen tot pGEX6-2 vector op EcoRI / XhoI-beperkingslocaties.
OPMERKING: De opstelling en de omstandigheden van de PCR-reactie zijn weergegeven in tabel 1 en tabel 2. - Controleer de ingebrachte sequentie en zet de plasmiden om in de chemisch competente E. coli volgens het fabricageprotocol.
-
Eiwitexpressie en -zuivering
- Voeg 25 g Luria bouillon (LB) basis toe aan 1 L gedestilleerd water om de LB-oplossing te maken. Autoclaaf het bij 121 °C gedurende 15 min. Voeg na afkoeling 50 μg/ml ampicilline toe.
- Neem een kolonie bacteriën die GST-FKBP51 of GST-FKBP52 tot expressie brengen en meng met 500 μL LB-oplossing in een buis van 1,5 ml. Draaikolk.
- Voeg het mengsel van "1.2.2" toe aan 1 l LB-oplossing in de erlenmeyer bedekt met een aluminiumfolie. Incubeer de Erlenmeyer in de shaker een nacht bij 37 °C.
- Induceer eiwitexpressie door 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) toe te voegen aan de Erlenmeyer en zet de incubatie nog 2 uur voort.
- Om celkorrels te krijgen, centrifugeer je gedurende 15 minuten bij 5.000 x g. Verwijder het supernatant.
OPMERKING: De celkorrels kunnen worden bewaard bij -20 °C. - Resuspend de celkorrels in 40 ml PBS en soniceer 3 x 20 s op ijs. Voeg 1 mM PMSF, 1 mM EDTA en proteaseremmercocktail (1 tablet) toe om proteolyse te voorkomen.
- Centrifugeer de suspensie gedurende 30 min 50.000 x g om celresten te verwijderen en breng het supernatant aan op de GST-valkolom van 5 ml.
- Na het wassen van de kolom met 30 ml PBS, elueert u GST-FKBP51 en GST-FKBP52 met 5 ml glutathion van 10 mM glutathion in PBS.
- Concentreer eiwitten op een centrifugatie-eenheid van 15 ml 10.000 MWCO. Om vrij glutathion te verwijderen, passeert u concentraten door de PD-10-kolom in evenwicht met 0,5x PBS en concentreert u zich opnieuw op het filtercentrifugeapparaat.
- Verzamel eiwithoudende fracties. Controleer de eiwitten in SDS-PAGE en pas de eiwitconcentraties aan op 1 mg/ml.
OPMERKING: Typische eiwitopbrengst is 2-5 mg / L cultuur. Het eiwit kan worden opgeslagen bij -20 °C.
2. Koppeling van Hsp90 C-terminal peptide aan de acceptor kralen (Figuur 2B)
-
Hsp90 peptide voorbereiding
- Synthetiseer tien aminozuurpeptide NH2-EDASRMEEVD-COOH overeenkomend met aminozuren 714-724 van menselijke Hsp90 beta isoform (UniProt ID: P08238) door een peptidesynthesedienst.
- Verdun het Hsp90-peptide in PBS tot een concentratie van 1 mg/ml.
-
Acceptor kralen voorbereiding
- Verdun de niet-geconjugeerde acceptorparels in PBS tot een concentratie van 1 mg/ml en breng over in een buis van 1,5 ml.
- Voer het wassen uit door centrifugeren op 16.000 x g gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant voorzichtig.
-
Vervoeging
- Stel de verhouding tussen kralen en peptide in op 10:1. Voeg in de buis van 1,5 ml met 1 mg acceptorkraalkorrel (bereid zoals hierboven beschreven) 1 ml PBS (pH 7,4), 0,1 mg verdund peptide, 1,25 μl Tween-20, 10 μL van een 400 mM-oplossing van natriumcyanoboorhydride (NaBH3CN) in water toe.
LET OP: NaBH3CN is giftig; gebruik een zuurkast en handschoenen. NaBH3CN-oplossing moet vers worden bereid. - Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C met end-over-end agitatie (10-20 rpm) op een roterende shaker.
- Stel de verhouding tussen kralen en peptide in op 10:1. Voeg in de buis van 1,5 ml met 1 mg acceptorkraalkorrel (bereid zoals hierboven beschreven) 1 ml PBS (pH 7,4), 0,1 mg verdund peptide, 1,25 μl Tween-20, 10 μL van een 400 mM-oplossing van natriumcyanoboorhydride (NaBH3CN) in water toe.
-
Reactie blussen en kralen wassen
- Voeg 20 μL van 1 M Tris-HCl (pH 8.0) oplossing toe aan de reactie om niet-gereageerde plaatsen te blokkeren. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Centrifugeer bij 16.000 x g (of maximale snelheid) gedurende 15 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspend de kraalkorrel in 1 ml Tris-HCl-oplossing (100 mM, pH 8,0).
- Herhaal de wasstap drie keer.
- Na de laatste centrifugering, resuspend de kralen met 1 mg / ml in opslagbuffer (1 ml van 0,5 × PBS met 0,01% natriumazide als conserveermiddel). Bewaar de geconjugeerde acceptorkraaloplossing bij 4 °C lichtdicht.
LET OP: Natriumazide is giftig; gebruik een zuurkast en handschoenen.
3. De test die de interactie onderzoekt tussen GST-FKBP51 of GST-FKBP52 en Hsp90 C-terminal peptide, en remming met verbindingen met kleine moleculaire massa(Figuur 2C)
-
GST-gelabelde eiwitten die interageren met glutathiondonorkralen
- Zet de reacties in 384-putplaten.
- Bereid de oplossing met 10 μg/ml glutathiondonorparels in 0,5x PBS, pH 7,4.
OPMERKING: Na langdurige opslag bezinken kralen en moeten ze worden vortexed. - Voeg GST-FKBP51 of GST-FKBP52 toe aan een eindconcentratie van 10 μg/ml.
- Incubeer in het donker bij 25 °C gedurende 10 min.
OPMERKING: Bij deze stap zullen GST-gelabelde eiwitten interageren met glutathion dat aan de kralen is bevestigd. Voor elke put wordt 22,5 μL van dit mengsel gebruikt. De concentratie van de bindende partners moet empirisch worden bepaald. Titreer GST-FKBP51 en GST-FKBP52 en kies de concentratie die het beste signaal geeft.
-
Samengestelde toevoeging
- Maak seriële verdunningen van teststoffen in DMSO.
OPMERKING: De gebruikte concentraties zijn meestal 10, 30, 100, 300, 1.000 en 3.000 μM. - Voeg 0,25 μL DMSO (negatieve controle) of Hsp90 C-terminal peptide (positieve controle, 30 μM) of verbindingen in DMSO toe aan de hoek van elke put van de plaat. Gebruik drievoud voor elke samengestelde concentratie.
- Voeg 22,5 μL van de oplossing met glutathiondonorparels met GST-gelabelde eiwitten toe aan elke put.
- Schud het bord voorzichtig met de hand maar grondig. Incubeer in het donker bij 25 °C gedurende 15 min.
OPMERKING: Gedurende deze tijd zullen verbindingen interageren met het TPR-domein op de Hsp90 C-terminale peptidebindingsplaats.
- Maak seriële verdunningen van teststoffen in DMSO.
-
Acceptor kralen toevoeging
- Verdun de acceptorparels met bevestigd Hsp90 C-terminal peptide tot 100 μg/ml in 0,5x PBS.
- Voeg 2,25 μL verdunde acceptorparels toe aan elk putjes.
- Meng voorzichtig maar grondig. Incubeer in het donker bij 25 °C gedurende 15 min.
OPMERKING: Bij deze stap worden donor- en acceptorparels in de buurt gebracht door de eiwit-peptide-interacties. Het uiteindelijke volume van het reactiemengsel is 25 μL. Daarom variëren de uiteindelijke concentraties van verbindingen van 0,1 tot 30 μM.
-
Plaat lezen
OPMERKING: Lees de plaat met behulp van een plaatlezer die is ingesteld in de relevante modus.- Schakel het instrument in en open de software
- Kies het relevante protocol.
- Klik op Plaatkaart bewerken en selecteer het welzijn dat in de plaat wordt gebruikt voor meting.
- Klik op Volgende om door te gaan en voer het geselecteerde protocol uit.
- Klik na de meting op Resultaten weergeven om de resultaten weer te geven.
- Exporteer de gegevens.
4. Data-analyse
-
Z'-factor en signaal-achtergrondverhouding (S/B)
- Bereken de Z'-factor en S/B-verhouding voor de test met behulp van de volgende vergelijking:
Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
S / B = μneg /μpos
waarbij σ en μ de standaardafwijkingen en -gemiddelden van respectievelijk de positieve (Hsp90 C-terminale peptide, 30 μM) en negatieve (DMSO) controles vertegenwoordigen. A Z'-factor > 0,5 zorgt ervoor dat de test robuust genoeg is voor screening. Om de testgevoeligheid te monitoren is ook de S/B-ratio berekend.
- Bereken de Z'-factor en S/B-verhouding voor de test met behulp van de volgende vergelijking:
-
Dosis-responscurve en IC 50
OPMERKING: Gebruik niet-lineaire regressieanalyse om de gegevens van Hsp90-cochaperones PPI-remmers softwarematig te passen.- Maak een XY-gegevenstabel in het welkomstdialoogvenster en selecteer X-getallenen Y Enter 3 (indien drievoud) repliceer waarden in kolommen naast elkaar.
- Normaliseer de signaalgegevens van monsters naar de negatieve controlegroep. Importeer concentratiewaarden in de X-kolom en de signaalwaarden in de Y-kolom.
- Klik op Analyseren en kies Transformatieconcentratie (X) onder Transformatie | Normaliseren. Kies Transformeren naar logaritmen.
OPMERKING: Dit zal de concentratie transformeren naar een logschaal. Als uw beginconcentratie nul is, stelt u deze in op een zeer klein getal dat effectief nul is (bijvoorbeeld 0,1 nM) om die waarden niet te verliezen, omdat de logaritme van nul niet is gedefinieerd. - Klik op Analyseren en kies Niet-lineaire regressie (curve fit) onder XY-analyses, open de Dosis-Respons-Inhibitie en kies Log(inhibitor) vs. respons -- Variabele helling.
- Klik op OK om de resultaten (met IC50-waarde) en grafieken weer te geven.
Figuur 2: Schema van dit protocol. (A) Expressie en zuivering van GST-FKBP51 en GST-FKBP52. (B) Koppeling van Hsp90 C-terminal peptide aan de acceptor kralen. (C) De test die de interactie tussen GST-FKBP51 of GST-FKBP52 en Hsp90 C-terminal peptide onderzoekt. Remming met kleine moleculaire massaverbindingen. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze test zijn de Z'-factor en S/B-verhouding respectievelijk 0,82 en 13,35(figuur 3A),wat aantoont dat onze test robuust en betrouwbaar is voor screening met hoge doorvoer. We gebruikten het vervolgens om kleine moleculaire massaverbindingen te screenen. Figuur 3B toont dosisafhankelijke remming van chaperone-cochaperon interacties met een geselecteerd klein molecuul (D10). De dosis-responscurven voor D10 worden gegenereerd door niet-lineaire regressieanalyse, op basis waarvan de waarden van IC50 worden berekend. D10 toont dosisafhankelijke remming op zowel Hsp90 - GST-FKBP51 als Hsp90 - GST-FKBP52 PPI's. Maar de waarden van IC50 zijn anders: de IC50 voor Hsp90 - GST-FKBP51-interacties is 65 nM, terwijl voor Hsp90 - GST-FKBP52-interacties volledige remming niet werd bereikt met de hoogste samengestelde concentratie (100 μM), de IC50 wordt geschat op > 30 μM. Deze resultaten leveren bewijs dat selectieve remming van Hsp90-HKBP51 of Hsp90-FKBP52 PPI's met kleine moleculen kan worden bereikt (TPR-domeinen van FKBP51 en FKBP52 hebben 60% sequentie-identiteit en > 80% sequentie-gelijkenis), en deze test kan worden toegepast voor deze screening.
Figuur 3: Analyse en resultaten vande assay. (A) Z' factor en signaal-achtergrond (S/B) ratio van deze assay. Gegevens vertegenwoordigen signalen van (○) positieve controle (Hsp90 C-terminal peptide, 30 μM) en (●) negatieve controle (DMSO) van 48 putten. Een Z'-waarde van 0,82 en een S/B-ratio van 13,35 werden berekend uit deze twee populaties van gegevens. (B) De remming van geselecteerde verbinding (D10) op interacties van Hsp90 met FKBP51 (●) of FKBP52 (○) in deze test. D10 remt Hsp90-FKBP51 of Hsp90-FKBP52 dosisafhankelijk. De IC50 is 65 nM voor Hsp90-FKBP51 interactie, maar boven 30 μM voor Hsp90-FKBP52 interactie. De gegevens worden genormaliseerd naar de controlegroep en uitgedrukt als middel ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reactie component | Volume (μL) |
| PCR buffer (5 x concentraat) | 4 |
| Voorwaartse primer | 1 |
| Omgekeerde primer | 1 |
| Plasmide | 0.5 |
| dNTP mix (10 mM elk) | 0.5 |
| Phusion DNA polymerase | 0.5 |
| Water (DNA-kwaliteit) | 12.5 |
| Totaal | 20 |
Tabel 1: PCR-reactie ingesteld voor menselijke FKBP51 en FKBP52 DNA-amplificatie.
| Podium | Temperatuur (°C) | Tijd | Cycli |
| Initiële denaturatie | 94 | 3 min. | 1 |
| Denaturatie | 94 | 30 seconden | 35 |
| Annealing | 56 | 30 seconden | |
| Extensie | 72 | 1 min. | |
| Definitieve uitbreiding | 72 | 5 min. | 1 |
| Opmerking: De temperatuur van het deksel is 105 °C. |
Tabel 2: Thermocylercondities voor menselijke FKBP51 en FKBP52 DNA-amplificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol met behulp van de test voor het screenen van kleine moleculen die interacties tussen Hsp90 en TPR-motief co-chaperones remmen, met name FKBP51 en FKBP52. De hoge Z'-score (>0,8) toont de robuustheid en betrouwbaarheid voor een formaat met hoge doorvoer. Resultaten kunnen binnen een uur worden verkregen en kleine hoeveelheden kralen, eiwitten en verbindingen zijn vereist. Bovendien kan dit protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar alle Hsp90 / Hsp70 - TPR-motief co-chaperonne-interacties van belang. Verschillende TPR-motief co-chaperones van Hsp90 zijn betrokken bij verschillende menselijke aandoeningen, variërend van de ziekte van Alzheimer tot auto-immuunziekten, kanker, enz. Het hier beschreven protocol biedt een in vitro robuuste en goedkope test voor high-throughput screening van kleine moleculen die chaperone-cochaperone interacties van hoog medisch belang remmen.
Bovendien moeten geneesmiddelen die gericht zijn op TPR-domeinen en de interactie met Hsp90 remmen, niet alleen worden beoordeeld op hun affiniteit ten opzichte van het doelwit, maar ook op hun selectiviteit ten opzichte van andere TPR-motiefeiwitten. Het menselijk genoom codeert voor > 20 TPR-motiefeiwitten die in staat zijn om te interageren met het Hsp90 C-terminale peptide. Deze test met behulp van glutathionparels en GST-gelabelde eiwitten maakt het mogelijk om het geneesmiddeleffect op meerdere bindende TPR-partners te beoordelen. Ons laboratorium beschikt over een bibliotheek van 20 menselijke TPR-eiwitten in hun GST-gelabelde vorm en kan affiniteits- en selectiviteitsprofielen verkrijgen voor elk getest klein molecuul.
Eerder is aangetoond dat PPI tussen Hsp90 en TPR co-chaperones wordt gemedieerd door het C-terminale peptide van Hsp90; het schrappen van Hsp90 C-terminus schaft de binding van TPR-motief co-chaperones6volledig af . We hebben ontdekt dat verbindingen die efficiënt zijn in onze test waar het Hsp90 C-terminale peptide werd gebruikt, ook in staat waren om de interactie van Hsp90 over de volledige lengte met GST-FKBP51 /52 te remmen in een pull-down assay met glutathion sepharose kralen (gegevens niet getoond). Sommige van de geselecteerde verbindingen vertonen ook de bindingsaffiniteit met FKBP51 door oppervlakteplasmonresonantietechnologie, en hun specifieke bindingsplaatsen bepaald door co-kristallisatie worden momenteel onderzocht.
Een cruciale stap in ons protocol is de volgorde van toevoeging; we vormen eerst een complex tussen een klein molecuul en zijn TPR-doelwit. Als er al complexen tussen FKBP51 en Hsp90 C-terminal peptide zijn gevormd, zijn langere incubatietijden en hogere concentraties van geneesmiddelverbindingen nodig om de PPI's te breken. Dit is vooral te wijten aan de sterische belemmering van kralen die de toegang van moleculen tot de plaats van interactie beperken.
Het is mogelijk om TPR-eiwitten en Hsp90 C-terminale peptiden covalent te koppelen aan respectievelijk donor- en acceptorparels en PPI's direct te onderzoeken. Het wordt echter niet aanbevolen om beide bindingspartners covalent aan de kralen te hechten vanwege de verminderde beweging van moleculen in oplossing die de kinetiek van de interacties beïnvloedt. Dit verhoogt ook het risico op sterische hinder door de kraalgrootte. Daarom kiezen we voor acceptorkralen in combinatie met Hsp90 C-terminale peptide en glutathiondonorkralen die interageren met GST-gelabelde eiwitten in onze test, waar meerdere TPR-partners kunnen worden beoordeeld.
In deze test is het waarschijnlijk dat sommige geïdentificeerde verbindingen vals-positief kunnen zijn vanwege hun interferentie met de testtechnologie, zoals het blussen van singletzuurstof, het doven van licht en het verstrooien van licht. Vals-positieve resultaten kunnen ook worden geïnduceerd door de binding van GST-tag met glutathiondonorparels te verstoren. Deze vals-positieve resultaten kunnen worden vermeden bij het screenen van moleculen op zowel Hsp90-FKBP51 als Hsp90-FKBP52 PPI's om selectieve remmers te identificeren. Andere methoden voor het detecteren van PPI's moeten ook worden toegepast om de geselecteerde remmers te verifiëren.
De beperking van onze test is dat het niet kan worden gebruikt om de interactie tussen Hsp90 en TPR-motief co-chaperones in ruwe biologische monsters, zoals cellysaten, te detecteren. Na de high-throughput screening moeten de remmingen van geselecteerde verbindingen op Hsp90 - TPR-motief co-chaperones PPI in biologische monsters worden geverifieerd met andere methoden, zoals co-immunoprecipitatie en nabijheidsligatietest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs melden geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Swedish Research Council (2018-02843), Brain Foundation (Fo 2019-0140), Foundation for Geriatric Diseases aan het Karolinska Institutet, Gunvor and Josef Anérs Foundation, Magnus Bergvalls Foundation, Gun and Bertil Stohnes Foundation, Tore Nilssons Foundation for medical research, Margaretha af Ugglas foundation en de Foundation for Old Servants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
References
- Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
- Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
- Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
- Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
- Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
- Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
- Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
- Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
- Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
- Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
- Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
- Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
- Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
- Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
- Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
