Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Undersøgelser af Chaperone-Cochaperone interaktioner ved hjælp af homogen perle-baseret assay

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62762
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1
1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

Summary

Denne protokol præsenterer en teknik til sondering protein-protein interaktioner ved hjælp af glutathion-linked donor perler med GST-fusioneret TPR-motiv co-chaperones og acceptor perler kombineret med en Hsp90-afledt peptid. Vi har brugt denne teknik til at screene små molekyler til at forstyrre Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaktioner og identificeret potente og selektive Hsp90-FKBP51 interaktionshæmmere.

Abstract

Målretning af varmechokproteinet 90 (Hsp90)-cochaperone-interaktioner giver mulighed for specifikt at regulere Hsp90-afhængige intracellulære processer. Den bevarede MEEVD pentapeptid på C-terminus af Hsp90 er ansvarlig for samspillet med tetratricopeptid repeat (TPR) motiv af co-chaperones. FK506-bindende protein (FKBP) 51 og FKBP52 er to lignende TPR-motiv co-chaperones involveret i steroid hormon-afhængige sygdomme med forskellige funktioner. Derfor giver identifikation af molekyler, der specifikt blokerer interaktioner mellem Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52, et lovende terapeutisk potentiale for flere menneskelige sygdomme. Her beskriver vi protokollen for en forstærket selvlysende nærhed homogen analyse til sonde interaktioner mellem Hsp90 og dens partner co-chaperones FKBP51 og FKBP52. For det første har vi renset TPR-motivholdige proteiner FKBP51 og FKBP52 i glutathion S-transferase (GST)-mærket form. Ved hjælp af glutathion-forbundet donor perler med GST-fusioneret TPR-motiv proteiner og acceptor perler kombineret med en 10-mer C-terminal peptid af Hsp90, har vi undersøgt protein-protein interaktioner i et homogent miljø. Vi har brugt denne analyse til at screene små molekyler til at forstyrre Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaktioner og identificeret potente og selektive Hsp90-FKBP51 interaktionshæmmere.

Introduction

Molekylære chaperoner bidrager til protein homøostase, herunder protein foldning, transport, og nedbrydning. De regulerer flere cellulære processer og er forbundet med mange sygdomme som kræft og neurodegenerative sygdomme1. Varmechokprotein 90 (Hsp90) er en af de vigtigste chaperoner, hvis funktion er afhængig af kropsbygningsændringer drevet af ATP hydrolyse og binding med klientproteiner medieret af sine co-chaperones2. På trods af et indlysende potentiale i Hsp90 som det terapeutiske mål udgør finjustering af dets funktion en stor udfordring. Der er flere Hsp90-hæmmere rettet mod N-terminal ATP-bindingsregionen, som er blevet evalueret i kliniske forsøg, men ingen af dem er godkendt til markedsføring3. På grund af manglen på en veldefineret ligandbindende lomme4har målretning mod C-terminal-regionen Hsp90 haft begrænset succes4. For nylig er afbrydelse af Hsp90-cochaperone interaktioner med små molekyler blevet undersøgt som en alternativ strategi5. Målretning af Hsp90-cochaperone interaktioner ville ikke fremkalde generelle celle stressrespons og giver mulighed for specifikt at regulere forskellige intracellulære processer. Den bevarede MEEVD pentapeptid ved C-terminus af Hsp90 er ansvarlig for samspillet med tetratricopeptid repeat (TPR) motiv af co-chaperones6. Af de 736 TPR-motivholdige proteiner, der er kommenteret i humanproteindatabasen, interagerer ~ 20 forskellige proteiner med Hsp90 via dette peptid7. Molekyler, der konkurrerer om MEEVD peptidbinding, ville forstyrre samspillet mellem Hsp90 og co-chaperones, der indeholder et TPR-domæne. Peptidbindingsstedet har en lignende tertiær struktur, men den overordnede homologi mellem forskellige TPR-motivdomæner er relativt lav7, hvilket giver mulighed for at identificere molekyler, der specifikt er i stand til at blokere interaktioner mellem Hsp90 og bestemte TPR-motiv co-chaperones. Blandt disse TPR-motiv co-chaperones, FK506-bindende protein (FKBP) 51 og FKBP52 er regulatorer af steroid hormon receptor (SHR) signalering og involveret i flere steroid hormon-afhængige sygdomme, herunder kræft, stress-relaterede sygdomme, metaboliske sygdomme, og Alzheimers sygdom8. Selvom FKBP51 og FKBP52 deler > 80% sekvenslighed, er deres funktioner forskellige: FKBP52 er en positiv regulator for SHR-aktivitet, mens FKBP51 er en negativ regulator i de fleste tilfælde8. Derfor giver identifikation af molekyler, der specifikt blokerer interaktioner mellem Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52, et lovende terapeutisk potentiale for relaterede sygdomme.

Enmplified Luminescent Proximity Homogenes Assay (AlphaScreen) blev først udviklet i 1994 af Ullman EF et al.9. Nu er det meget udbredt til at opdage forskellige typer af biologiske interaktioner, såsom peptid10, protein11, DNA12,RNA13,og sukker14. I denne teknik er der to slags perler (diameter 200 nm), den ene er donorperle og den anden er acceptor perlen. Biomolekylerne er immobiliseret på disse perler; deres biologiske interaktioner bringer donor- og acceptorperler i nærheden. Ved 680 nm lyser og omdanner en fotoensibilisator i donorperlen ilt til singlet oxygen. Fordi singlet ilt har en kort levetid, kan det kun diffuse op til 200 nm. Hvis acceptor perlen er i nærheden, dens thioxen derivat reagerer med singlet ilt generere chemiluminescens ved 370 nm. Denne energi aktiverer yderligere fluorophorer i samme accept eller perle til at udsende lys ved 520-620 nm15. Hvis de biologiske interaktioner afbrydes, kan acceptorperperen og donorperlen ikke nå nærhed, hvilket resulterer i det enkelte iltfald og lavtproducerede signal.

Her beskriver vi en protokol ved hjælp af denne teknik til screening af små molekyler, der hæmmer interaktioner mellem Hsp90 og TPR co-chaperones, især FKBP51 og FKBP52. De 10 aminosyre lange peptider svarende til Hsp90 ekstreme C-endestation er knyttet til acceptor perler. Renset GST-mærkede TPR co-chaperones interagerer med glutathion-linkede donorperler. Når samspillet mellem Hsp90-afledte peptider og TPR-motiv co-chaperones bringer perlerne sammen, produceres et forstærket signal (Figur 1A). Hvis de screenede små molekyler kan hæmme samspillet mellem Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones, vil dette forstærkede signal blive reduceret (Figur 1B). Deres IC50 kan beregnes ved kvantitativ måling. Denne protokol kan udvides til enhver chaperone - TPR-motiv co-chaperone interaktioner af interesse og er af stor betydning i udviklingen af nye molekyler, der specifikt blokerer samspillet mellem Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52.

Figure 1
Figur 1: Det grundlæggende princip i denne analyse. (A) Renset GST-FKBP51 interagerer med glutathion-linkede donorperler. De 10 aminosyre lange peptider svarende til den ekstreme C-endestation af Hsp90 er knyttet til acceptor perler. Samspillet mellem Hsp90-afledte peptider og TPR domæne FKBP51 bringer donor og acceptor perler i nærheden. Ved 680 nm lyser og omdanner en fotoensibilisator i donorperlen ilt til singlet oxygen. Thioxen-derivatet på acceptorperlen reagerer med singlet oxygen og genererer chemiluminescens ved 370 nm. Denne energi aktiverer yderligere fluorophorer i samme accept eller perle til at udsende lys ved 520-620 nm. (B) Når små molekyler hæmmer samspillet mellem Hsp90 og FKBP51, kan donor- og acceptorperlerne ikke nå nærhed. Derefter henfalder singlet oxygen med kort levetid, og der produceres ikke noget påviseligt signal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: En oversigt over denne protokol findes i figur 2.

1. Udtryk og rensning af GST-FKBP51 og GST-FKBP52 (Figur 2A)

  1. Plasmider
    BEMÆRK: Få cDNA kloner til menneskelige FKBP51 (klon-id: 5723416) og for menneskelige FKBP52 (klon-id: 7474554) fra IMAGE konsortium.
    1. Forstærke det menneskelige FKBP51 DNA af PCR med primere (fremad; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', omvendt; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') indeholder BamHI og XhoI udhæng og klon i pGEX6-1 vektor på BamHI / XhoI begrænsning sites.
    2. Forstærke det menneskelige FKBP52 DNA af PCR med primere (fremad; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', omvendt; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') indeholder EcoRI og XhoI udhæng og klon i pGEX6-2 vektor på EcoRI / XhoI begrænsning sites.
      BEMÆRK: Pcr-reaktionen er konfigureret, og betingelserne er vist i tabel 1 og tabel 2.
    3. Kontroller den indsatte sekvens, og omdan plasmiderne til den kemisk kompetente E. coli i henhold til fremstillingsprotokollen.
  2. Proteinudtryk og -rensning
    1. Tilsæt 25 g Luria bouillon (LB) base i 1 L destilleret vand for at gøre LB-opløsningen. Autoklave det ved 121 °C i 15 min. Efter afkøling tilsættes 50 μg/mL ampicillin.
    2. Tag en koloni af bakterier, der udtrykker GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 og bland med 500 μL LB-opløsning i et 1,5 mL rør. Vortex.
    3. Blandingen af "1.2.2" tilsættes i 1 L LB-opløsning i Erlenmeyer-kolben, der er dækket af en aluminiumsfolie. Inkuberes Erlenmeyer-kolben i shakeren natten over ved 37 °C.
    4. Fremprovokere proteinudtryk ved at tilsætte 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) til Erlenmeyer kolben og fortsætte inkubationen i yderligere 2 timer.
    5. For at få celle pellets, centrifuge ved 5.000 x g i 15 min. Fjern supernatanten.
      BEMÆRK: Cellepillerne kan opbevares ved -20 °C.
    6. Resuspend cellen pellets i 40 mL af PBS og sonikere 3 x 20 s på is. Tilsæt 1 mM PMSF, 1 mM EDTA og proteasehæmmercocktail (1 tablet) for at forhindre proteolyse.
    7. Centrifugere suspensionen i 30 min 50.000 x g for at fjerne cellerester og anvende supernatanten på 5 mL GST-trap kolonne.
    8. Efter vask af søjlen med 30 mL PBS, elute GST-FKBP51 og GST-FKBP52 med 5 mL 10 mM glutathion i PBS.
    9. Koncentrer proteiner på 15 mL 10.000 MWCO centrifugeringsenhed. For at fjerne fri glutathion skal du passere koncentrater gennem PD-10 kolonne eklibreret med 0,5x PBS og igen koncentrere sig om filtercentrifugeenheden.
    10. Saml proteinholdige fraktioner. Kontroller proteinerne i SDS-PAGE og juster proteinkoncentrationerne til 1 mg/mL.
      BEMÆRK: Typisk proteinudbytte er 2-5 mg/L-kultur. Proteinet kan opbevares ved -20 °C.

2. Kobling af Hsp90 C-terminal peptid til acceptor perler (Figur 2B)

  1. Hsp90 peptid forberedelse
    1. Syntetisere ti aminosyre peptid NH2-EDASRMEEVD-COOH svarende til aminosyrer 714-724 af menneskelige Hsp90 beta isoform (UniProt ID: P08238) af en peptid syntese service.
    2. Fortynd Hsp90-peptid i PBS til 1 mg/mL-koncentration.
  2. Acceptor perler forberedelse
    1. Fortynd de ukonkret acceptor perler i PBS til 1 mg / mL koncentration og overføre til en 1,5 mL rør.
    2. Vask ved centrifugering ved 16.000 x g i 15 min. Fjern forsigtigt supernatanten.
  3. Konjugation
    1. Indstil forholdet mellem perler og peptid som 10:1. I 1,5 mL-rør, der indeholder 1 mg acceptorperlepille (fremstillet som beskrevet ovenfor), tilsættes 1 mL PBS (pH 7,4), 0,1 mg fortyndet peptid, 1,25 μL på Mellem-20, 10 μL af en 400 mM opløsning af natriumcyaniobohydrid (NaBH3CN) i vand.
      FORSIGTIG: NaBH3CN er giftigt; brug en røghætte og handsker. NaBH3CN-opløsning skal være frisklavet.
    2. Inkuberes i 24 timer ved 37 °C med end-over-end agitation (10-20 rpm) på en roterende shaker.
  4. Reaktionsslukning og vask af perler
    1. Der tilsættes 20 μL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) opløsning til reaktionen på at blokere ureakterede steder. Inkuberes i 1 time ved 37 °C.
    2. Centrifuge ved 16.000 x g (eller maksimal hastighed) i 15 min ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og perlepillen tages ud igen i 1 mL Tris-HCl-opløsning (100 mM, pH 8.0).
    3. Gentag vasketrinnet tre gange.
    4. Efter den sidste centrifugering skal perlerne genbruges ved 1 mg/mL i opbevaringsbuffer (1 mL af 0,5 × PBS med 0,01% natriumazid som konserveringsmiddel). Opbevar den konjugede acceptor perleopløsning ved 4 °C lysbeskyttet.
      FORSIGTIG: Natriumazid er giftigt; brug en røghætte og handsker.

3. Analysen sondering samspillet mellem GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 og Hsp90 C-terminal peptid, og hæmning med små molekylære masseforbindelser (Figur 2C)

  1. GST-mærkede proteiner, der interagerer med glutathiondonorperler
    1. Opsætning af reaktionerne i 384-brønd plader.
    2. Opløsningen, der indeholder 10 μg/mL af glutathiondonor perlerne, fremstilles i 0,5x PBS, pH 7.4.
      BEMÆRK: Efter længere tids opbevaring sætter perlerne sig ned og skal hvirvles.
    3. Tilsættes GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 til en endelig koncentration på 10 μg/mL.
    4. Inkuberes i mørke ved 25 °C i 10 min.
      BEMÆRK: På dette trin vil GST-mærkede proteiner interagere med glutathion, der er fastgjort til perlerne. For hver brønd vil der blive anvendt 22,5 μL af denne blanding. Koncentrationen af de bindende partnere skal bestemmes empirisk. Titrere GST-FKBP51 og GST-FKBP52 og vælg den koncentration, der giver det bedste signal.
  2. Sammensat tilsætning
    1. Lav seriel fortyndinger af testforbindelser i DMSO.
      BEMÆRK: De anvendte koncentrationer er typisk 10, 30, 100, 300, 1.000 og 3.000 μM.
    2. Der tilsættes 0,25 μL DMSO (negativ kontrol) eller Hsp90 C-terminal peptid (positiv kontrol, 30 μM) eller forbindelser i DMSO til hjørnet af hver brønd af pladen. Brug triplikater til hver sammensat koncentration.
    3. 22,5 μL af opløsningen indeholder glutathion donorperler med GST-mærkede proteiner til hver brønd.
    4. Ryst pladen forsigtigt med hånden, men grundigt. Inkuberes i mørke ved 25 °C i 15 min.
      BEMÆRK: I løbet af denne tid vil forbindelser interagere med TPR-domænet på Hsp90 C-terminal peptidbindingsstedet.
  3. Acceptor perler tilføjelse
    1. Fortynd acceptor perler med vedhæftet Hsp90 C-terminal peptid til 100 μg/mL i 0,5x PBS.
    2. Tilsæt 2,25 μL fortyndede acceptor perler til hver brønd.
    3. Bland forsigtigt, men grundigt. Inkuberes i mørke ved 25 °C i 15 min.
      BEMÆRK: På dette trin bringes donor- og acceptorperler i nærheden af protein-peptidinteraktionerne. Det sidste volumen af reaktionsblandingen er 25 μL. Derfor er de endelige koncentrationer af forbindelser spænder fra 0,1 til 30 μM.
  4. Pladeaflæsning
    BEMÆRK: Læs pladen ved hjælp af en pladelæser, der er indstillet i den relevante tilstand.
    1. Tænd instrumentet, og åbn softwaren
    2. Vælg den relevante protokol.
    3. Klik på Rediger pladekort, og vælg den brønd, der bruges i pladen til måling.
    4. Klik på Næste for at fortsætte og køre den valgte protokol.
    5. Klik på Vis resultater efter målingen for at få vist resultater.
    6. Eksporter dataene.

4. Dataanalyse

  1. Z'-faktor og signal-til-baggrund (S/B) forhold
    1. Beregn Z'-faktoren og S/B-forholdet for analysen ved hjælp af følgende ligning:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
      S/B=μneg/μpos
      hvor σ og μ repræsenterer standardafvigelserne og midlerne i de positive (Hsp90 C-terminal peptid, henholdsvis 30 μM) og negative (DMSO) kontroller. En Z 'faktor > 0,5 vil sikre, at analysen er robust nok til screening. For at overvåge analysens følsomhed er S/B-forholdet også beregnet.
  2. Dosis-respons kurve og IC 50
    BEMÆRK: Brug ikke-lineær regressionsanalyse til at passe til data fra Hsp90-cochaperones PPI-hæmmere af software.
    1. Opret en XY-datatabel i dialogboksen Velkommen , og vælg X-tal, og Y Enter 3 (hvis triplikater) replikerer værdier i kolonner side om side.
    2. Normaliser signaldataene for prøver til den negative kontrolgruppe. Importer koncentrationsværdier til X-kolonnen og signalværdierne til kolonnen Y.
    3. Klik på Analyser, og vælg Transformer koncentration (X) under Transformer | Normaliser. Vælg Transformer til Logaritmer.
      BEMÆRK: Dette vil omdanne koncentrationen til en log skala. Hvis din startkoncentration er nul, skal du indstille den til et meget lille tal, der faktisk er nul (f.eks. 0,1 nM) for ikke at miste disse værdier, da logaritmen på nul ikke er defineret.
    4. Klik på Analyser og vælg Ikke-lineær regression (kurve passer) under XY-analyser, åbn dosis-respons-hæmning, og vælg Log(hæmmer) vs. respons - Variabel hældning.
    5. Klik på OK for at få vist resultaterne (der indeholder IC50-værdien) og Grafer.

Figure 2
Figur 2: Skematisk for denne protokol. (A) Udtryk og rensning af GST-FKBP51 og GST-FKBP52. (B) Kobling af Hsp90 C-terminal peptid til acceptor perler. (C) Analysen sondering samspillet mellem GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 og Hsp90 C-terminal peptid. Hæmning med små molekylære masseforbindelser. Oprettet med BioRender.com Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vores analyse er Z's faktor og S/B-forhold henholdsvis 0,82 og 13,35 (figur 3A), hvilket viser, at vores analyse er robust og pålidelig til screening med høj kapacitet. Vi brugte det derefter til at screene små molekylære masseforbindelser. Figur 3B præsenterer dosisafhængig hæmning af chaperone-cochaperoneinteraktioner med et udvalgt lille molekyle (D10). Dosis-respons kurverne for D10 genereres ved ikke-lineær regressionsanalyse, baseret på hvilken værdierne af IC50 beregnes. D10 viser dosisafhængig hæmning både på Hsp90 - GST-FKBP51 og Hsp90 - GST-FKBP52 PPI. Men værdierne af IC50 er forskellige: dens IC50 for Hsp90 - GST-FKBP51 interaktioner er 65 nM, mens for Hsp90 - GST-FKBP52 interaktioner, fuldstændig hæmning blev ikke opnået med den højeste sammensatte koncentration (100 μM), dens IC50 anslås at være > 30 μM. Disse resultater viser, at selektiv hsp90-HKBP51 eller Hsp90-FKBP52 PPI med små molekyler kan opnås (TPR domæner af FKBP51 og FKBP52 har 60% sekvens identitet og > 80% sekvens lighed), og denne analyse kan anvendes til denne screening.

Figure 3
Figur 3: Analyseanalyse og resultater. (A) Z' faktor og forholdet mellem signal til baggrund (S/B) i denne analyse. Data repræsenterer signaler om (○) positiv kontrol (Hsp90 C-terminal peptid, 30 μM) og (●) negativ kontrol (DMSO) fra 48 brønde. En Z'-værdi på 0,82 og et S/B-forhold på 13,35 blev beregnet ud fra disse to populationer af data. (B) Hæmning af udvalgte forbindelser (D10) på interaktioner af Hsp90 med FKBP51 (●) eller FKBP52 (○) i denne analyse. D10 hæmmer Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 dosisafhængigt. Dens IC50 er 65 nM for Hsp90-FKBP51 interaktion, men over 30 μM for Hsp90-FKBP52 interaktion. Data normaliseres til kontrolgruppen og udtrykkes som middel ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Reaktionskomponent Volumen (μL)
PCR-buffer (5 x koncentrat) 4
Fremadrettet primer 1
Omvendt primer 1
Plasmid 0.5
dNTP mix (10 mM hver) 0.5
Phusion DNA polymerase 0.5
Vand (DNA-kvalitet) 12.5
Total 20

Tabel 1: PCR-reaktion, der er konfigureret til human FKBP51 og FKBP52 DNA-forstærkning.

Stadie Temperatur (°C) Tidspunkt Cykler
Indledende denaturering 94 3 min. 1
Denaturering 94 30 sek. 35
Udglødning 56 30 sek.
Forlængelse 72 1 min.
Endelig forlængelse 72 5 min 1
Bemærk: Lågtemperaturen er 105 °C.

Tabel 2: Termocyler betingelser for human FKBP51 og FKBP52 DNA forstærkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en protokol ved hjælp af analysen til screening af små molekyler, der hæmmer interaktioner mellem Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones, især FKBP51 og FKBP52. Dens høje Z 'score (>0,8) viser robusthed og pålidelighed for en høj-throughput format. Resultater kan opnås inden for en time, og små mængder af perler, protein og forbindelser er påkrævet. Desuden kan denne protokol let udvides til enhver Hsp90/Hsp70 - TPR-motiv co-chaperone interaktioner af interesse. Flere TPR-motiv co-chaperones af Hsp90 har været impliceret i forskellige menneskelige lidelser lige fra Alzheimers sygdom til autoimmune sygdomme, kræft, osv. Protokollen beskrevet her giver en in vitro robust og billig analyse for high-throughput screening af små molekyler hæmmer chaperone-cochaperone interaktioner af høj medicinsk betydning.

Desuden skal lægemidler, der er rettet mod TPR-domæner og hæmmende interaktion med Hsp90, vurderes ikke blot for deres affinitet mod målet, men også for deres selektivitet over for andre TPR-motivproteiner. Det menneskelige genom koder > 20 TPR motivproteiner, der er i stand til at interagere med Hsp90 C-terminal peptid. Denne analyse ved hjælp af glutathion perler og GST-tagged proteiner giver mulighed for vurdering af lægemidlet effekt på flere bindende TPR partnere. Vores laboratorium har et bibliotek med 20 humane TPR-proteiner i deres GST-mærkede form og kan opnå affinitets- og selektivitetsprofiler for hvert lille molekyle, der testes.

Det har tidligere vist sig, at PPI mellem Hsp90 og TPR co-chaperones er medieret af C-terminal peptid af Hsp90; sletningen af Hsp90 C-endestation helt afskaffer bindingen af TPR-motiv co-chaperones6. Vi har konstateret, at forbindelser effektiv i vores analyse, hvor Hsp90 C-terminal peptid blev brugt også var i stand til at hæmme samspillet mellem fuld længde Hsp90 med GST-FKBP51/52 i en pull-down assay ved hjælp af glutathion sepharose perler (data ikke vist). Nogle af de udvalgte forbindelser viser også den bindende affinitet med FKBP51 ved overflade plasmon resonans teknologi, og deres specifikke bindende steder bestemt af co-krystallisering er i øjeblikket under undersøgelse.

Et afgørende skridt i vores protokol er rækkefølgen af tilføjelsen. vi danner først et kompleks mellem et lille molekyle og dets TPR-mål. Hvis der allerede er dannet komplekser mellem FKBP51 og Hsp90 C-terminal peptid, kræves der længere inkubationstid og højere koncentrationer af stofforbindelser for at bryde PPI'erne. Dette skyldes for det meste den steriske hindring af perle, der begrænser molekylernes adgang til interaktionsstedet.

Det er muligt at kovalent par TPR proteiner og Hsp90 C-terminal peptider til donor og acceptor perler, henholdsvis, og direkte sonde PPI. Det anbefales dog ikke at binde begge bindingspartnere til perlerne på grund af den reducerede bevægelse af molekyler i opløsning, der påvirker kinetikken af interaktionerne. Dette øger også risikoen for sterisk hindring på grund af perlestørrelsen. Derfor vælger vi acceptor perler kombineret med Hsp90 C-terminal peptid og glutathion donor perler, der interagerer med GST-mærkede proteiner i vores analyse, hvor flere TPR partnere kan vurderes.

I denne analyse, Er det sandsynligt, at nogle identificerede forbindelser kan være falsk-positive på grund af deres indblanding i analysen teknologi, såsom at slukke singlet ilt, slukke lys, og sprede lys. Falsk-positive resultater kan også induceres ved at forstyrre bindingen af GST-tag med glutathion donorperler. Disse falsk-positive resultater kan undgås, når de screener molekyler både på Hsp90-FKBP51 og Hsp90-FKBP52 PPI for at identificere selektive hæmmere. Andre metoder til påvisning af PPI bør også anvendes til at kontrollere de valgte hæmmere.

Begrænsningen af vores analyse er, at det ikke kan bruges til at opdage samspillet mellem Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones i rå biologiske prøver, såsom celle lysater. Efter screeningen med høj gennemløb skal hæmningerne af udvalgte forbindelser på Hsp90 - TPR-motiv co-chaperones PPI i biologiske prøver verificeres ved andre metoder, såsom co-immunprecipitation og nærhed ligation assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere rapporterer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af bevillinger fra Swedish Research Council (2018-02843), Brain Foundation (Fo 2019-0140), Foundation for Geriatric Diseases ved Karolinska Institutet, Gunvor og Josef Anérs Foundation, Magnus Bergvalls Foundation, Gun and Bertil Stohnes Foundation, Tore Nilssons Foundation for medical research, Margaretha af Ugglas foundation og Foundation for Old Servants.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plates Perkin Elmer 6008350 Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit Millipore UFC901008 Concentrate protein
Ampicillin Sigma A0166 Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010 Heidolph Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51 Source BioScience clone id: 5723416 pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52 Source BioScience clone id: 7474554 pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli Invitrogen C602003 One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software GraphPad Prism 9.0.0 Analysis data and make figures
Data analysis software Excel Analysis data
DMSO Supelco 1.02952.1000 Dilute compounds
DPBS Gibco 14190-144 Prepare solution
EDTA Calbiochem 344504 Prevent proteolysis during sonication
Glutathione Sigma G-4251 Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads Perkin Elmer 6765300 Donor bead
GST-trap column Cytiva (GE Healthcare) 17528201 Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside Thermo Fisher Scientific R0392 Induce protein expression
LB Broth (Miller) Sigma L3522 Microbial growth medium
PCR instrument BIO-RAD S1000 Thermal Cycler Amplification/PCR
PD-10 column Cytiva (GE Healthcare) 17085101 Solution exchange
pGEX-6P-1 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954648 Plasmid
pGEX-6P-2 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954650 Plasmid
Plate reader Perkin Elmer EnSpire 2300 Multilabel Reader Read alpha plate
Plate reader software Perkin Elmer EnSpire Manager Plate reader software
Plate reader software protocol Perkin Elmer Alpha 384-well Low volume Use this protocol to read plate
PMSF Sigma P7626 Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail Sigma S8830 Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide Sigma S2002 As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma 156159 Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform Peptide 2.0 inc Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator LABINCO Make end-over-end agitation
Tris-HCl Sigma 10708976001 Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20 Sigma P1379 Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP Beckman Coulter Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor Microson Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads Perkin Elmer 6762003 Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Invitrogen EI0002 SDS-PAGE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
  3. Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
  4. Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
  5. Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
  6. Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
  7. Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
  8. Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
  9. Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
  10. Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
  11. Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
  12. Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
  13. Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
  14. Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
  15. Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021).
  16. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Tags

Biokemi Udgave 173 AlphaScreen protein-protein interaktioner molekylær chaperone Hsp90 FKBP51 FKBP52 TPR proteiner sammensatte screening
Undersøgelser af Chaperone-Cochaperone interaktioner ved hjælp af homogen perle-baseret assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R.,… More

Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R., Winblad, B., Pavlov, P. F. Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. Exp. (173), e62762, doi:10.3791/62762 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter