Summary
Il test dell'alimentatore di micropiasche offre un metodo economico e ad alta produttività per quantificare il consumo di alimenti liquidi in Drosophila. Un dispositivo stampato in 3D collega una micropiastra a 96 pozzette in cui le mosche sono alloggiate a una micropiastra da 1536 pozzene da cui le mosche consumano una soluzione di alimentazione con un colorante tracciante. Il declino del volume della soluzione viene misurato spettrofotometricamente.
Abstract
Quantificare l'assunzione di cibo in Drosophila viene utilizzato per studiare le basi genetiche e fisiologiche dei tratti associati al consumo, i loro fattori ambientali e gli effetti tossicologici e farmacologici di numerose sostanze. Pochi metodi attualmente implementati sono suscettibili di misurazione ad alta produttività. Il Microplate Feeder Assay (MFA) è stato sviluppato per quantificare il consumo di cibo liquido per le singole mosche utilizzando l'assorbanza. In questo test, le mosche consumano cibo liquido da pozzi selezionati di una micropiastra da 1536 pozzetto. Incorporando un colorante tracciante diluito nel mezzo alimentare liquido e caricando un volume noto in ciascun pozzo, le misurazioni di assorbanza del pozzo acquisito prima e dopo il consumo riflettono la variazione di volume risultante (cioè il volume consumato). Per consentire l'analisi ad alta produttività con questo metodo, è stato progettato un accoppiatore stampato in 3D che consente di ordinare le mosche individualmente in micropiasche a 96 pozze. Questo dispositivo orienta con precisione le micropiasche a 96 e 1536 pozzi per consentire a ciascuna mosca di accedere a un massimo di 4 pozzi per il consumo, consentendo così la quantificazione delle preferenze alimentari oltre al consumo regolare. Inoltre, il dispositivo è dotato di strisce barriera che alternano tra posizioni aperte e chiuse per consentire il contenimento controllato e il rilascio di una colonna di campioni alla volta. Questo metodo consente misurazioni ad alta produttività del consumo di soluzioni acquose da parte di molte mosche contemporaneamente. Ha anche il potenziale per essere adattato ad altri insetti e per schermare il consumo di sostanze nutritive, tossine o prodotti farmaceutici.
Introduction
Drosophila melanogaster ha visto ampio uso come organismo modello genetico per studiare le basi biologiche dell'assunzione di cibo e i tratti associati al consumo1. Si stima che il 65% dei geni umani che causano malattie abbiano omologhi funzionali nelle mosche, con una percentuale significativa di quelli espressi in tessuti funzionalmente equivalenti tra mosche e umani2. Inoltre, le dimensioni di D. melanogaster, il breve tempo intergenerazionale, la semplice manutenzione e la trattabilità genetica lo rendono un modello attraente per gli studi sul consumo di nutrienti3,4 e sugli effetti tossicologici e farmacologici di una varietà di sostanze, tra cui insetticidi5,inquinanti6,prodotti farmaceutici7e droghe d'abuso8,9,10.
In molti casi, lo studio di tali tratti richiede una quantificazione precisa del consumo. I metodi per quantificare il consumo sono diversi e includono il saggio CApillary FEeder (CAFE)11, il saggio MAnual FEeding (MAFE)12, Proboscis Extension Response (PER) assay13, tracer dye extraction14,15, oligonucleotide tracer extraction16e radio-isotope extraction5,17. Gli sforzi recenti si sono concentrati sul miglioramento della produttività di questi saggi, come nel saggio Expresso18 o nel sistema Whole Animal Feeding FLat (WAFFL) basato su piastra19. Nonostante la loro utilità, questi test possono essere complicati, costosi o laboriosi, ostacolando il loro uso in studi ad alta produttività.
Figura 1: Componenti del test dell'alimentatore di micropiasse. (A) Rendering 3D del test di alimentazione di micropiasse assemblato. La micropiastra a 1536 pozzi è orientata dall'accoppiatore stampato in 3D in modo tale che ogni pozzo della micropiastra inferiore a 96 pozzi abbia accesso a quattro pozzi della micropiastra superiore a 1536 pozzi. L'accesso ai pozzi può essere controllato regolando la posizione delle strisce barriera scanalato attraverso l'accoppiatore. (B) Rappresentazione grafica di ciascun pozze pozzo del saggio di alimentazione a micropiasche. Le soluzioni di consumo vengono trattenute in ogni pozzo utilizzando un film sigillante che è stato perforato per consentire l'accesso da parte della mosca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica delle procedure nel microplate feeder Assay. La figura mostra un diagramma di flusso che corrisponde ai passaggi 4.1-5.8 del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per superare questi ostacoli, il Microplate Feeder Assay (MFA; Figura 1) è stato sviluppato. In questo test, le mosche sono alloggiate individualmente in micropiasse da 96 pozzi. Ogni micropiastra è accoppiata a una micropiastra da 1536 pozzette utilizzando un dispositivo personalizzato stampato in 3D. Il dispositivo orienta con precisione le due piastre in modo tale che ogni mosca nel rispettivo pozzo della piastra a 96 pozzi abbia accesso a 4 pozzi della micropiastra da 1536 pozzi. Utilizzando una piastra senza fondo da 1536 pozzetti e pellicole sigillanti, le soluzioni vengono erogate in pozzetti selezionati e perforate con aghi precisi da 0,25 mm di diametro per fornire l'accesso alle mosche. Criticamente, consentire il consumo direttamente da una micropiastra consente misurazioni immediate basate sull'assorbanza utilizzando un lettore di micropiasche. Un colorante tracciante diluito viene incorporato nel mezzo di consumo e la variazione dell'assorbanza dopo l'esposizione viene utilizzata per determinare il volume consumato (Figura 2 e Figura 3). Poiché il liquido in ciascun pozzo si avvicina a una colonna di fluido, le differenze volumetriche si manifesteranno come differenze nell'altezza della colonna. (Figura 3A) Secondo la legge Beer-Lambert20:
dove A è l'assorbanza, ε è il coefficiente di assorbimento molare per l'analita attenuante, l è la lunghezza del percorso ottico e c è la concentrazione dell'analita attenuante. Pertanto, con coefficiente di assorbimento molare e concentrazione costanti, i cambiamenti nell'assorbanza sono dovuti esclusivamente a cambiamenti nel percorso ottico della luce, cioè il livello del fluido all'interno di un dato pozzo. Misurando l'assorbanza prima e dopo l'esposizione, la variazione proporzionale dell'assorbanza riflette la variazione proporzionale del volume (Figura 3B).
Figura 3: Quantificazione del volume del pozzo basata sull'assorbanza. ( A )Laluce incidente di intensità di ingresso nota (I0) attraversa ciascun pozzo. L'attenuazione della luce a diversi volumi di riempimento produce diverse intensità di uscita (I), che mostrano una relazione lineare tra volume e assorbanza. (B) Misura empirica dell'assorbanza rispetto al volume. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
In base alla variazione di volume, la quantità di qualsiasi composto ingerito può essere calcolata dalla sua concentrazione nota nella soluzione di alimentazione. Le parti necessarie per il test sono a basso costo e hanno un alto grado di riutilizzabilità, riducendo sostanzialmente il costo ricorrente del test. Pertanto, questa procedura offre un metodo economico e ad alta produttività per quantificare con precisione il consumo.
Protocol
1. Preparazione della piastra di fame
- Pesare 1,5 g di agarose in un becher di vetro da 250 ml.
- Aggiungere 100 ml di H2O distillato al becher.
- Microonde a intermittenza fino a quando l'acarosio è completamente fuso.
NOTA: Osservare il becher poiché l'agarose è incline a bollire. - Versare l'agarosio fuso in una depressione di reagente ed erogare 80 μL di agarosio fuso in ciascun pozzera di una micropiastra a 96 pozzelli utilizzando una pipetta multicanale. Lasciare polimerizzare le piastre mentre sono coperte a temperatura ambiente. Conservare in frigorifero l'agarose avanzato per un massimo di una settimana in un sacchetto sigillato e rifiorlo per creare piastre aggiuntive.
2. Smistamento delle mosche e fame
- Preparare gli accoppiatori inserendo strisce barriera nei canali delle strisce barriera. Se le strisce barriera sono troppo larghi, arrotolarle attorno al dito per dare loro la curvatura per tenerle nei canali.
- Applicare l'accoppiatore a una piastra di fame. Non utilizzare l'accoppiatore per manipolare la piastra poiché l'accoppiatore potrebbe scivolare via. Assicurarsi che gli accoppiatori siano orientati correttamente (ad esempio, assicurarsi che l'angolo angolato dell'accoppiatore corrisponda all'angolo angolato della micropiastra).
- Sotto anestesia CO2 (Tabella dei materiali), ordinare mosche di 3-5 giorni. Carica le singole mosche per colonna nella piastra di fame.
NOTA: sebbene le mosche vengano caricate per colonna, si consiglia di distribuire gruppi di campioni in righe della piastra anziché in colonne verso il basso (vedere la Figura 4 per l'esempio di layout della piastra). - Chiudi ogni colonna mentre si riempie regolando la sua striscia barriera in posizione chiusa.
Figura 4: Layout rappresentativo della piastra di fame. Il diagramma mostra l'organizzazione dei controlli di evaporazione e delle mosche maschili e femminili in una piastra a 96 pozzetti utilizzata in questo studio. Possono essere utilizzate anche configurazioni alternative, tra cui file alternate di maschi e femmine con controlli di evaporazione nelle file A e H. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Registrare con attenzione il layout del campione all'interno della micropiastra. Una volta riempita la piastra di fame, lasciare che le mosche si riprendano spontaneamente dopo aver rimosso il CO2 e affamarle per 6 ore a partire dal loro tempo di anestesia iniziale.
3. Preparazione di alimenti liquidi
NOTA: Preparare cibi liquidi freschi ogni giorno.
- Preparare una soluzione stock colorante da 10 mg/mL di FD&C Blue #1 in H2O distillato.
NOTA: Questo può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 6 mesi. - Preparare 10 ml di cibo liquido (4% saccarosio, 1% estratto di lievito, 40 μg/mL di FD&C Blue #1) in un tubo conico da 15 mL sciogliendo 0,4 g di saccarosio e 0,1 g di estratto di lievito in 10 ml di H2O distillato. Vortex il tubo fino a completa dissoluzione dei solidi. Aggiungere 40 μL di soluzione stock colorante e invertire ripetutamente il tubo per omogeneizzare la soluzione.
- Trasferire il cibo liquido in una siringa da 10 mL con un filtro da 0,45 μm. Filtrare ~ 1,5 mL della soluzione alla volta in un tubo microcentrifuga da 1,7 mL. Mettere da parte la siringa contenente la soluzione e filtrare la soluzione aggiuntiva secondo necessità durante la preparazione della piastra di alimentazione.
4. Preparazione della piastra di alimentazione
NOTA: Maneggiare delicatamente le piastre di alimentazione dopo il riempimento per evitare la formazione di bolle o goccioline nel pozzetto che potrebbero influenzare le letture di assorbanza.
- Preparare una piastra di alimentazione sigillando il fondo di una micropiastra a 1536 pozzetti con un film sigillante. Utilizzare una paletta di tenuta per aderire completamente al film. Tagliare la pellicola in eccesso dai bordi sinistro e destro con una lama di rasoio.
- Erogare 10 μL del cibo liquido filtrato a livello di colonna (vedere la Figura 5 per l'illustrazione) nei pozzetto appropriati della micropiastra da 1536 pozzetto. Erogare nel pozzedito in alto a sinistra per ogni gruppo di quattro pozzedi (vedere la Figura 5 per l'illustrazione).
Figura 5: Ordine di riempimento e posizione del pozzo per la piastra di alimentazione a 1536 pozzetti. Il diagramma illustra il passaggio 4.2 del protocollo. Le frecce mostrano l'ordine in cui la soluzione di alimentazione viene introdotta nella piastra di alimentazione una colonna alla volta dalla colonna 1 alla 12. Il campione B1 viene ingrandito per mostrare un esempio della posizione delle soluzioni di alimentazione per i saggi a 1 e 2 scelte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Una volta riempiti tutti i pozzetti, applicare un film sigillante sulla parte superiore della piastra. Utilizzare una paletta di tenuta per aderire completamente al film. Tagliare la pellicola in eccesso dai bordi sinistro e destro con una lama di rasoio. Ripetere per il numero desiderato di piastre.
- Centrifugare le piastre a 200 x g per 10 s per depositare il fluido. Non lasciare raffreddare la piastra poiché ciò può causare l'accumulo di condensa nei pozzetti, oscurando le letture di assorbanza.
5. Esposizione
- Una volta che le mosche sono pronte per il test di consumo, perforare i pozzetti sulla superficie superiore della piastra con lo strumento sonda ad ago dotato di un ago da 0,25 mm di diametro. Utilizzare lo stesso ordine perforare come è stato utilizzato durante l'erogazione delle soluzioni. Capovolgere la piastra e perforare i fori sul fondo. Pulire l'ago tra le soluzioni per evitare la contaminazione incrociata. Fare attenzione a non toccare le perforazioni in quanto ciò espelle la soluzione dai pozzelli.
- Leggere l'assorbanza della piastra a 630 nm senza coperchio.
- Posizionare un coperchio interno sul film di tenuta superiore per assicurarsi che gli anelli di condensazione circondono i pozzi perforati. Posizionare il coperchio esterno sulla piastra.
- Posizionare la piastra di alimentazione a faccia in su sull'accoppiatore in modo che le guide allineino i fori appropriati della piastra di alimentazione e della piastra di fame. Assicurarsi che l'accoppiatore e le piastre siano orientati correttamente (ad esempio, assicurarsi che l'angolo angolato dell'accoppiatore e le piastre corrispondano). Avvolgere gli elastici attorno alle piastre superiore e inferiore per tenere insieme l'accoppiatore. Verificare l'allineamento e gli spazi tra la piastra di alimentazione e l'accoppiatore.
- Una volta caricate tutte le piastre di alimentazione sugli accoppiatori, aprire i fori per le piastre regolando le strisce di barriera sull'accoppiatore. Posizionare i gruppi accoppiatore/piastra nel contenitore secondario. Ogni contenitore secondario può ospitare fino a sei assiemi.
- Posizionare la metà inferiore di una scatola di pipetta contenente asciugamani di carta imbevuti in ciascun contenitore secondario per fornire umidità. Chiudere il coperchio dei contenitori secondari e trasferirli in un ambiente controllato (25 °C, umidità controllata, 12 ore luce:cicli bui). Lasciare che le mosche consumino per 22 ore.
- Dopo l'esposizione di 22 ore, controllare ogni piastra per le mosche morte e aggiornare il layout della piastra di conseguenza. Dopo aver controllato tutte le piastre, anestetizzare le mosche in massa pompando CO2 all'interno del contenitore secondario. Dopo ~ 60 s, assicurarsi che tutte le mosche siano immobilizzate. Tamponare delicatamente le mosche nella piastra di fame e sostituire le strisce di barriera di plastica. Rimuovere le piastre di alimentazione per la lettura.
- Rileggere l'assorbanza della piastra a 630 nm. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le tavole non sono state lette.
6. Analisi dei dati
NOTA: L'analisi può essere eseguita con il pacchetto software preferito dallo sperimentatore.
- Omettere eventuali mosche morte durante l'esposizione di 22 ore.
- Per ogni pozzo, calcolare il volume consumato come:
C - Volume consumato (μL)
V - Volume iniziale del pozzo (cioè 10 μL)
ABS0 - Assorbanza pre-esposizione
ABS1 - Assorbanza post-esposizione
NOTA: il consumo è indicato come un volume positivo nel calcolo. - Per tenere conto dell'evaporazione, sottrarre il volume medio di evaporazione dai valori di consumo di mosca all'interno delle rispettive piastre. Per i test a 2 scelte/preferenze, regolareogni pozzo in modo che la rispettiva soluzione, ad esempio, regolare i pozzi "scelta 1" con "scelta 1" nei controlli di evaporazione.
- Dopo aver regolato per l'evaporazione, eliminare tutti i campioni con un valore di consumo inferiore a zero.
- Per i test a 2 scelte, calcolare la preferenza per ciascun pozzo come:
P - Indice delle preferenze (la direzione positiva indica la preferenza)
FA - Volume di alimenti liquidi consumati contenenti additivo (scelta 2)
FN - Volume di cibo liquido normale consumato (scelta 1)
7. Protocollo di lavaggio micropiastra e accoppiatore.
NOTA: Fare attenzione a prevenire danni al fondo delle micropiasche, poiché i danni possono influire sulla tenuta.
- Rimuovere le pellicole e le etichette dalle micropiasche a 1536 pozzi. Separare gli accoppiatori e le strisce barriera. Posizionare le strisce barriera in un contenitore sigillabile, ad esempio una bottiglia. Lavare le strisce barriera agitando vigorosamente in una serie di acqua calda del rubinetto, soluzione detergente delicata, acqua calda del rubinetto e quindi distillato H2O.
- Risciacquare micropiasche e accoppiatori da 1536 pozzi sotto l'acqua tiepida del rubinetto. Per le micropiasche, far scorrere l'acqua del rubinetto attraverso i pozzi di ciascuna micropiastra per eliminare quanta più soluzione e detriti possibile. Se necessario, utilizzare una punta della pipetta per rimuovere i detriti; non utilizzare utensili in metallo o vetro sui piatti.
- Coprire ogni piastra e accoppiatore con una soluzione detergente delicata (ad esempio, 1% v/v Aquet). Per i piatti, strofinare le superfici con una mano guantata. Per gli accoppiatori, utilizzare un pennello.
- Risciacquare accuratamente ogni piastra con acqua del rubinetto e quindi con H2O distillato. Assicurarsi che i pozzi siano specificamente risciacquati sotto il flusso d'acqua.
- Lasciare asciugare all'aria le piastre e gli accoppiatori coperti a temperatura ambiente. Conservare in un contenitore pulito fino all'uso.
NOTA: non maneggiare mai le micropiasse da 1536 pozzi senza guanti. Gli oli residui della pelle possono ostacolare la sigillatura, portando a perdite ed evaporazione del pozzo.
Representative Results
Per determinare se esistono correlazioni tra i pozzi delle singole piastre, l'evaporazione è stata quantificata per ogni pozzo (n = 96 pozzi/ piastra per tre piastre). L'evaporazione è risultata essere di -0,036 μL ± 0,003 μL (media ± SEM in tutto). (Figura 6A) Le correlazioni di Pearson sono state calcolate per valutare le tendenze tra evaporazione e posizioni dei pozzi. Il coefficiente di correlazione (Figura 6B,C) per l'evaporazione rispetto alle righe era -0,04 (p = 0,4949) e per l'evaporazione vs colonne era -0,23 (p = 0,0001). I gruppi sono stati successivamente distribuiti tra le colonne per mitigare le correlazioni lievi ma statisticamente significative tra le colonne.
Figura 6: Evaporazione nell'AMF. (A) La distribuzione della densità dell'evaporazione cambia con ± SD media indicata dalla linea tratteggiata. Correlazioni tra evaporazione e righe (B) o colonne (C) con il coefficiente di correlazione di Pearson e il valore p come indicato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per stabilire la validità del protocollo, il consumo è stato quantificato per le mosche Canton-S B di 3-5 giorni (n = 36/sesso/piastra e n = 24 controlli di evaporazione/piastra per tre piastre) (Figura 7). L'evaporazione tra i pozzi di controllo era significativamente diversa da zero (-0,030 μL ± 0,006 μL, p = 4,81 x 10-6; un campione t-test vs zero). Due campioni sono stati omessi (entrambi maschi) dal set di dati, uno a causa della morte durante l'esposizione notturna e l'altro a causa del valore di consumo negativo a seguito dell'aggiustamento per evaporazione. Ciò ha prodotto un tasso di ritenzione del campione > del 99%.
Figura 7: Quantificazione del consumo mediante l'AMF. (A) Il consumo è stato visualizzato utilizzando una camera di vetro fabbricata su misura. Le mosche sono state osservate bere da pozzi perforati e hanno mostrato colorazione addominale blu dopo l'ingestione della soluzione tinta. Vedere anche Video supplementare S.1. (B) Valori di consumo (± medi SEM) tra i controlli di evaporazione, le mosche maschi e le mosche femmine. Il t-test post hoc acoppie con varianza disuguale è stato eseguito per confronti statistici, con significatività indicata da barre. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Successivamente, è stato costruito un modello di analisi della varianza (ANOVA) come descritto da Y = μ + S + P + SxP + e, con Y come media di gruppo, μ come media complessiva, S come effetto fisso del sesso, P come effetto fisso della piastra, SxP come interazione tra sesso e piastra ed e come variabilità residua. ANOVA non ha mostrato una significativa variabilità da piastra a piastra (p = 0,671) o interazioni specifiche per sesso con piastre (p = 0,104) per il consumo, mentre il sesso da solo ha contribuito in modo significativo alla variazione osservata nel consumo (p = 4,17 x 10-18). Un t-test post hocha mostrato che i maschi consumavano significativamente meno delle femmine (0,500 μL ± 0,017 μL vs 0,811 μL ± 0,028 μL, p = 1,13 x 10-17,due campioni t-testcon varianza disuguale).
Per dimostrare che il saggio può essere utilizzato per la quantificazione delle preferenze a due scelte, alle mosche è stata data la scelta tra una soluzione di saccarosio al 4% con estratto di lievito all'1% e una soluzione di saccarosio al 4% integrata con etanolo al 15% ed estratto di lievito all'1%. Sia i maschi che le femmine hanno mostrato una preferenza schiacciante per la soluzione con etanolo ed estratto di lievito con indici di preferenza di 0,974 ± 0,026 per i maschi e 0,876 ± 0,06 per le femmine (± medi SEM) (Figura 8).
Figura 8: Quantificazione delle preferenze mediante l'AMF. Consumo di saccarosio al 4% contro il 4% di saccarosio integrato con etanolo al 15% ed estratto di lievito per mosche maschili e femminili (n = 33 per ogni sesso). Le mosche maschio consumavano più della soluzione di etanolo rispetto alla soluzione di saccarosio di controllo (0,511 μL ± 0,029 μL contro 0,00 μL ± 0,017 μL; p = 4,06e-10;due campioni t-test). Le mosche femmine hanno anche consumato più soluzione di etanolo rispetto alla soluzione di saccarosio di controllo (0,939 μL ± 0,044 μL contro 0,132 μL ± 0,044 μL; p = 7,38e-17; test ta due campioni). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare S.1: Il video mostra una mosca che si nutre dal pozzo perforato e accumula macchie addominali blu mentre ingerisce la soluzione tinta. Un'immagine fissa è mostrata nella Figura 7A. Clicca qui per scaricare questo video.
File supplementare S.2: Accoppiatore per analisi dell'alimentatore micropiastra. Questo è un costrutto stampabile in 3D dell'accoppiatore utilizzato nel MFA. Materiale di stampa Nylon PA12 è stato utilizzato per il MFA. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare S.3: Microplate Feeder Assay Barrier Strip. Questo contiene il design delle strisce barriera di plastica utilizzate per alternare l'esposizione delle mosche alla piastra di alimentazione. Un singolo accoppiatore può utilizzare fino a dodici strisce barriera. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare S.4: Istruzioni per il disimballaggio e la fabbricazione per il test dell'alimentatore di micropiasche. Le istruzioni sono incluse per disimballare l'accoppiatore e le strisce barriera. Le istruzioni di fabbricazione sono incluse per il coperchio interno, il coperchio esterno e il contenitore secondario utilizzato per limitare l'evaporazione durante l'esposizione. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare S.5:Confronto dei costi del Test dell'alimentatore a micropiasche (MFA) e di un test CApillary FEeder (CAFE) a mosca singola a 1 scelta. Testare 72 mosche / sesso per una singola linea richiederebbe due set di apparecchiature MFA (accoppiatori + piastre + strisce barriera), mentre il CAFE avrebbe bisogno solo di 1 capillare per ogni fiala di coltura. Nonostante la grande differenza nell'investimento iniziale per l'MFA, la grande differenza nei costi ricorrenti ($ 14,80 vs $ 46,08, rispettivamente) consentirebbe di recuperare i costi iniziali dopo aver testato solo 4 linee (punto di pareggio). Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
Lo studio descrive un nuovo protocollo per quantificare il consumo in Drosophila:il Microplate Feeder Assay (MFA). In questo test, le mosche consumano da pozzi sigillati di una micropiastra a 1536 pozzette attraverso perforazioni di dimensioni controllate (Figura 1, Figura 2; Video supplementare S.1). Poiché il cibo liquido viene tinto e fornito tramite micropiastra, le misurazioni dell'assorbanza ottica del cibo possono essere ottenute utilizzando uno spettrofotometro a micropiasche (Figura 3). In questo modo, il consumo viene determinato confrontando l'assorbanza prima e dopo il consumo e quindi applicando questa proporzione al volume noto erogato prima del consumo. Ciò è stato verificato empiricamente misurando l'assorbanza di diversi volumi del mezzo tinto (Figura 3B).
Per sviluppare questo test, era necessario un dispositivo che potesse sfruttare la quantificazione del consumo basata sull'assorbanza. Testare le mosche in un formato micropiastra è interessante perché integra la micropiastra utilizzata per erogare il cibo e consente flessibilità nella scelta tra più formati di piastre (ad esempio, formati a 6, 12, 48 o 96 pozzetti) regolando la geometria dell'accoppiatore. È stato scelto un formato di micropiasso a 96 pozzette per consentire la coltura individuale della mosca.
Il dispositivo stampato in 3D (Figura 1) orienta con precisione la piastra di alimentazione a 1536 pozzetti con la piastra di coltura a 96 pozzetti, dando a ciascuna mosca l'accesso a un massimo di 4 pozzetti della piastra di alimentazione per il consumo. Inoltre, per fornire un tempo adeguato per la distribuzione delle mosche nella piastra di alloggiamento e per controllare l'avvio del test, il dispositivo include strisce di barriera a commutazione contenenti le mosche nei rispettivi pozzi e prevenire le violazioni. Vengono forniti i file necessari per procurarsi o modificare queste parti (File supplementari S.2-S.3), nonché le istruzioni di fabbricazione necessarie per i pezzi pertinenti ( Filesupplementare S.4).
L'MFA fornisce un semplice metodo ad alto rendimento che integra metodi più elaborati per monitorare il comportamento di alimentazione di Drosophila18,21,22. L'MFA offre molteplici vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per quantificare l'assunzione di cibo. La produttività viene aumentata quantificando il consumo utilizzando un lettore di lastre. Ciò elimina le misurazioni manuali e ovvia all'immissione manuale dei dati. I dati sono anche suscettibili di estrazione ed elaborazione programmatica. Inoltre, la maggiore produttività aumenta il numero fattibile di repliche biologiche, in particolare rispetto ai progetti di alimentatori comunali, il che aumenta sostanzialmente la potenza di rilevare piccole differenze di consumo. Utilizzando l'MFA, un singolo sperimentatore può quantificare il consumo o la preferenza di oltre 500 mosche per ogni corsa notturna del test. Sovrapponendo le corse del test, oltre 2.000 mosche possono essere testate in un periodo di 5 giorni. Infine, si sono risparmiati sui costi a lungo termine grazie alla riutilizzabilità di micropiasse e accoppiatori (File supplementare S.5). Utilizzando l'MFA, il costo stimato per test può essere a partire da $ 14,80, con un costo iniziale di $ 127,60 per l'apparecchiatura. Utilizzando il classico test CApillary FEeder (CAFE), che richiede costose microcapillari di precisione, il costo stimato per test per un numero comparabile di repliche è di $ 46,08. Pertanto, mentre esiste un investimento iniziale nell'acquisizione delle attrezzature necessarie, la riduzione dei costi ricorrenti può portare a risparmi sostanziali, in particolare nei casi in cui vengono eseguiti test ripetuti.
Come per tutti i test, l'AMF presenta alcune limitazioni. Principalmente, richiede l'accesso a uno spettrofotometro a micropiasche in grado di leggere micropiasche a 1536 pozze. Inoltre, la dipendenza dalle misure di assorbanza per la quantificazione rende il metodo suscettibile di interferenze ottiche. Ciò si manifesta come valori di consumo negativi per un piccolo sottoinsieme di campioni testati. Anche i nutrienti, i farmaci, i prodotti farmaceutici o le tossine di interesse devono essere solubili in acqua per essere compatibili con il test.
Nonostante i suoi limiti, questo metodo offre un metodo ad alto rendimento per quantificare i comportamenti di consumo in Drosophila. Inoltre, il dispositivo di accoppiamento potrebbe essere facilmente modificato per accettare molti formati di piastre, consentendogli di ospitare una varietà di specie di insetti.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del National Institute on Drug Abuse (U01 DA041613) a TFCM e RRHA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm Diameter Needles | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
| 0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
| 10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | - | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
| FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
| Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
| Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | - | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
| Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
| Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | - | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
| Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
| Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
| Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
| Rubber Bands | |||
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
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