Summary
Mikroplåtmataranalysen erbjuder en ekonomisk, hög genomströmningsmetod för kvantifiering av flytande livsmedelskonsumtion i Drosophila. En 3D-utskriven enhet ansluter en 96-brunns mikroplatta där flugor är inrymda i en 1536-brunns mikroplatta från vilken flugor konsumerar en matningslösning med ett spårämne. Lösningsvolymnedgången mäts spektralmässigt.
Abstract
Kvantifiering av födointaget i Drosophila används för att studera de genetiska och fysiologiska grunderna för konsumtionsrelaterade egenskaper, deras miljöfaktorer och de toxikologiska och farmakologiska effekterna av många ämnen. Få metoder som för närvarande implementeras är mottagliga för mätning av hög data flöde. Microplate Feeder Assay (MFA) utvecklades för att kvantifiera konsumtionen av flytande mat för enskilda flugor med hjälp av absorbans. I denna analys konsumerar flugor flytande matmedium från utvalda brunnar i en 1536-brunns mikroplatta. Genom att införliva ett utspädt spårämne i det flytande livsmedelsmediet och lasta en känd volym i varje brunn återspeglar absorbansmätningarna av den brunn som förvärvats före och efter konsumtionen den resulterande volymförändringen (dvs. förbrukad volym). För att möjliggöra analys av hög genomströmning med den här metoden utformades en 3D-printad mankpar som gör att flugor kan sorteras individuellt i 96-brunns mikroplattor. Denna enhet orienterar exakt mikroplattor med 96 och 1536 brunnar för att ge varje fluga tillgång till upp till 4 brunnar för konsumtion, vilket möjliggör kvantifiering av livsmedelspreferenser utöver regelbunden konsumtion. Dessutom har anordningen barriärremsor som växlar mellan öppna och stängda lägen för att möjliggöra kontrollerad inneslutning och utsättning av en kolonn med prover åt gången. Denna metod möjliggör höga genomströmningsmätningar av förbrukning av vattenlösningar av många flugor samtidigt. Det har också potential att anpassas till andra insekter och att screena konsumtion av näringsämnen, toxiner eller läkemedel.
Introduction
Drosophila melanogaster har sett bred användning som en genetisk modellorganism för att studera de biologiska grunderna för matintag och egenskaper i samband med konsumtion1. Det uppskattas att 65% av människans sjukdomsframkallande gener har funktionella homologer i flugor, med en betydande andel av dem som uttrycks i funktionellt likvärdiga vävnader mellan flugor och människor2. Dessutom gör D. melanogasters storlek, korta intergenerationell tid, enkelt underhåll och genetisk tractability det till en attraktiv modell för studier om konsumtion av näringsämnen3,4 ochtoxikologiska och farmakologiska effekter av en mängd olika ämnen, inklusive insekticider5, föroreningar6, läkemedel7, och läkemedel av missbruk8,9,10.
I många fall kräver studien av sådana egenskaper exakt kvantifiering av konsumtionen. Metoder för kvantifiering av förbrukningen är olika och inkluderar CApillary FEeder (CAFE) analys11, MAnual FEeding (MAFE) analys12,Proboscis Extension Response (PER) analys13,tracer färgämneextraktion 14,15,oligonukleotid spårämneextraktion 16, och radio-isotopextraktion 5,17. De senaste ansträngningarna har fokuserat på att förbättra genomströmningen av dessa analyser, som i Expresso-analysen18 eller det tallriksbaserade Hela djurfoder FLat (WAFFL) -systemet19. Trots deras nytta kan dessa analyser vara komplicerade, kostsamma eller arbetsintensiva, vilket hindrar deras användning i studier med hög genomströmning.
Figur 1:Komponenter i mikroplåtmataranalysen. Mikroplattan med 1536 brunnar är orienterad av det 3D-printade ihopkopplingen så att varje brunn i den nedre 96-brunnsmikroplattan har tillgång till fyra brunnar i den övre mikroplattan på 1536 brunnar. Tillträdet till brunnarna kan styras genom att justera positionen för barriärremsor som slitsas genom ihopkopplingen. B)En grafisk återgivning av varje brunn i mikroplattans mataranalys. Förbrukningslösningar behålls i varje brunn med hjälp av en tätningsfilm som har perforerats för att ge tillgång till flugan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Översikt över procedurerna i mikroplåtmataranalysen. Figuren visar ett flödesdiagram som motsvarar steg 4.1-5.8 i protokollet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
För att övervinna dessa hinder, Microplate Feeder Assay (MFA; Figur 1) utvecklades. I denna analys inrymts flugor individuellt i 96-brunns mikroplattor. Varje mikroplatta är kopplat till en 1536-brunns mikroplatta med en anpassad 3D-utskriven enhet. Enheten orienterar exakt de två plattorna så att var och en flyger i sin respektive brunn på 96-brunnsplattan har tillgång till 4 brunnar i 1536-brunnsmikroplattan. Genom att använda en bottenlös 1536-brunnsplatta och tätningsfilmer doseras lösningar i utvalda brunnar och perforeras med exakta nålar med diametern 0,25 mm för att ge tillgång till flugorna. Att tillåta förbrukning direkt från en mikroplatta möjliggör kritiska absorbansbaserade mätningar med hjälp av en mikroplatta. Ett utspädt spårämne ingår i konsumtionsmediet, och förändringen i absorbansen efter exponering används för att bestämma den förbrukade volymen (figur 2 och figur 3). Eftersom vätskan i varje brunn approximerar en kolonn av vätska, kommer volymetriska skillnader att manifesteras som skillnader i kolumnens höjd. (Figur 3A) Enligt Beer-Lambert lag20:
där A är absorbansen är ε molarabsorptionskoefficienten för den försvagande analyten, l är den optiska banans längd och c är koncentrationen av den dämpande analyten. Med konstant molarabsorptionskoefficient och koncentration beror således förändringar i absorbansen enbart på förändringar i den optiska ljusvägen, dvs. vätskenivån inom en viss brunn. Genom att mäta absorbansen före och efter exponeringen återspeglar den proportionella förändringen i absorbans den proportionella volymförändringen(figur 3B).
Figur 3:Absorbansbaserad kvantifiering av brunnsvolym. (A) Inincidentsljus med känd ingångsintensitet (I0) korsar varje brunn. Dämpning av ljus vid olika fyllnadsvolymer ger olika effektintensiteter (I), som uppvisar ett linjärt förhållande mellan volym och absorbans. B)Empirisk mätning av absorbans kontra volym. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Baserat på volymförändringen kan mängden intag av föreningar beräknas utifrån dess kända koncentration i utfodringslösningen. De delar som behövs för analysen är låga i kostnad och har en hög grad av återanvändbarhet, vilket avsevärt minskar de återkommande kostnaderna för analysen. Således erbjuder detta förfarande en prisvärd, hög genomströmningsmetod för exakt kvantifiering av förbrukningen.
Protocol
1. Förberedelse av svältplatta
- Väg ut 1,5 g agarose i en 250 ml glasbägare.
- Tillsätt 100 ml destillerat H2O till bägaren.
- Mikrovågsugn intermittent tills agarose är helt smält.
OBSERVERA: Observera bägaren eftersom agarosen är benägen att koka över. - Häll den smälta agarosen i ett reagenstråg och dela ut 80 μL smält agarosa i varje brunn av en 96-brunns mikroplatta med en flerkanalspipett. Låt plattorna härda medan de är täckta i rumstemperatur. Kyl den överblivna agarosen i upp till en vecka i en förseglad påse och smält den igen för att göra ytterligare plattor.
2. Flygsortering och svält
- Förbered stickbanden genom att föra in barriärremsor i barriärremsornas kanaler. Om barriärremsorna är för lösa, spola dem runt fingret för att ge dem krökning för att hålla dem i kanalerna.
- Fäst fästet på en svältplatta. Använd inte mankparet för att manipulera plattan eftersom manparet kan glida av. Se till att ihopsnäckarna är korrekt orienterade (dvs. se till att det vinklade hörnet på ihopsplåten matchar mikroplattans vinklade hörn).
- Under CO2 anestesi (Table of Materials), sortera 3-5-dagars gamla flugor. Ladda enskilda flugor med kolonn i svältplattan.
OBS: Även om flugor laddas med kolumn, rekommenderas att distribuera grupper av prover nedåt rader på plattan snarare än nedåt kolumner (se figur 4 för tallrik layout exempel). - Stäng varje kolumn när den fylls genom att justera barriärremsan till stängt läge.
Figur 4: Representativ svältplatta. Diagrammet visar organisationen av avdunstningskontroller och manliga och kvinnliga flugor i en 96-brunnsplatta som används i denna studie. Alternativa konfigurationer, inklusive alternerande rader av män och kvinnor med avdunstningskontroller i raderna A och H, kan också användas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Registrera provlayouten noggrant i mikroplattan. När svältplattan är fylld, låt flugorna återhämta sig spontant efter att ha tagit bort CO2 och svälta dem i 6 timmar från och med deras första bedövningstid.
3. Beredning av flytande livsmedel
OBS: Gör flytande mat färsk varje dag.
- Förbered en 10 mg/ml färglagerlösning av FD&C Blue #1 i destillerad H2O.
OBS: Detta kan förvaras i rumstemperatur i upp till 6 månader. - Förbered 10 ml flytande mat (4% sackaros, 1% jästextrakt, 40 μg/ml FD&C Blå #1) i ett 15 ml koniskt rör genom att lösa upp 0,4 g sackaros och 0,1 g jästextrakt i 10 ml destillerat H2O. Virvelröret tills fasta ämnen är helt upplösta. Tillsätt 40 μL färglagerlösning och vänd röret upprepade gånger för att homogenisera lösningen.
- Överför flytande mat till en 10 ml spruta tippad med ett filter på 0,45 μm. Filtrera ~1,5 ml av lösningen åt gången till ett 1,7 ml mikrocentrifugrör. Ställ undan sprutan som innehåller lösningen och filtrera den extra lösningen efter behov under beredningen av matarplattan.
4. Beredning av matarplatta
OBS: Hantera matarplattorna försiktigt efter påfyllning för att förhindra bildandet av bubblor eller droppar i brunnen som kan påverka absorbansavläsningarna.
- Förbered en matarplatta genom att försegla botten av en 1536-brunns mikroplatta med en tätningsfilm. Använd en tätningspaddel för att hålla fast vid filmen noggrant. Trimma överflödig film från vänster och höger kanter med ett rakblad.
- Fördela 10 μL av den filtrerade flytande matkolonnen (se figur 5 för illustration) i lämpliga brunnar i mikroplattan på 1536 brunnar. Dispensera i den övre vänstra brunnen för varje kluster med fyra brunnar (se figur 5 för illustration).
Bild 5:Fyll ordning och bra läge för matarplattan med 1536 brunnar. Diagrammet illustrerar steg 4.2 i protokollet. Pilarna visar i vilken ordning matningslösningen förs in i matarplattan en kolumn i taget från kolumn 1 till 12. Prov B1 förstoras för att visa ett exempel på platsen för utfodringslösningar för 1-val och 2-valsanalyser. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- När alla brunnar är fyllda, applicera en tätningsfilm på toppen av plattan. Använd en tätningspaddel för att hålla fast vid filmen noggrant. Trimma överflödig film från vänster och höger kanter med ett rakblad. Upprepa för önskat antal plattor.
- Centrifugera plattorna vid 200 x g i 10 s för att lösa vätskan. Låt inte plattan kylas eftersom detta kan orsaka kondens i brunnarna, vilket skymmer absorbansavläsningarna.
5. Exponering
- När flugorna är redo för konsumtionsanalysen, perforera brunnarna på plattans övre yta med nålsondverktyget utrustat med en 0,25 mm diameter nål. Använd samma order för att perforera som användes vid dispensering av lösningarna. Vänd plattan och perforera brunnarna på botten. Torka av nålen mellan lösningarna för att förhindra korskontaminering. Var försiktig så att du inte rör perforeringarna eftersom detta transporterar lösningen från brunnarna.
- Läs av plattans absorbans vid 630 nm utan lock.
- Placera ett internt lock på den övre tätningsfilmen för att säkerställa att kondensringarna omger de perforerade brunnarna. Placera det yttre locket på plattan.
- Placera matarplattan med uppåtriktade ringar på sågen så att styrningarna justerar lämpliga hål på matarplattan och svältplattan. Se till att ihop- och plattorna är korrekt orienterade (dvs. se till att det vinklade hörnet på ihopparet och plattorna matchar). Linda elastiska band runt de övre och nedre plattorna för att hålla ihop fästet. Kontrollera om matarplattan och kopplingsplåten är i linje och mellanrum.
- När alla matarplattor är laddade på manpparna öppnar du brunnarna för plattorna genom att justera barriärremsorna på manparet. Placera ihopsyre/plåtenheterna i den sekundära behållaren. Varje sekundär behållare rymmer upp till sex enheter.
- Placera den nedre halvan av en pipettlåda som innehåller blötlagda pappershanddukar i varje sekundär behållare för att ge fuktighet. Stäng locket på de sekundära behållarna och överför dem till en kontrollerad miljö (25 °C, fuktstyrd, 12 h ljus: mörka cykler). Låt flugorna konsumera i 22 timmar.
- Efter 22 h exponering, kontrollera varje platta för döda flugor och uppdatera plattlayouten i enlighet därmed. När alla plattor har kontrollerats, bedöva flugorna en masse genom att pumpa CO2 inuti den sekundära behållaren. Efter ~60 s, se till att alla flugor är immobiliserade. Tämj försiktigt flugorna i svältplattan och sätt tillbaka plastbarriärremsorna. Ta bort matarplattorna för avläsning.
- Läs om plattans absorbans vid 630 nm. Upprepa tills alla plattor har lästs.
6. Dataanalys
OBS: Analys kan utföras med prövarens föredragna mjukvarupaket.
- Utelämna eventuella flugor som dog under 22 h exponeringen.
- För varje brunn beräknar du volymen som förbrukas som:
C - Förbrukad volym (μL)
V - Initial brunnsvolym (dvs. 10 μL)
ABS0 - Absorberande före exponering
ABS1 - Absorberande efter exponering
OBS: Förbrukningen betecknas som en positiv volym i beräkningen. - För att ta hänsyn till avdunstning, subtrahera den genomsnittliga avdunstningsvolymen från flugförbrukningsvärdena inom respektive plattor. För 2-val/preferenstestning, justera varje brunn medrespektive lösning, t.ex. justera "val 1" brunnar genom "val 1" i avdunstningsreglagen.
- Efter justering för avdunstning, släpp alla prover med ett förbrukningsvärde som är mindre än noll.
- För 2-valstestning, beräkna preferensen för varje brunn samt:
P - Inställningsindex (positiv riktning anger preferens)
FA - Volym flytande livsmedel som konsumeras innehållande tillsats (val 2)
FN - Volym av normal flytande mat som konsumeras (val 1)
7. Mikroplatta och kopplade tvättprotokoll.
OBS: Var noga med att förhindra skador på mikroplattorna, eftersom skador kan påverka tätningen.
- Ta bort filmerna och etiketterna från mikroplattorna på 1536 brunnar. Separera paren och barriärremsorna. Placera barriärremsorna i en förseglingsbar behållare, till exempel en flaska. Tvätta barriärremsorna genom att kraftigt skaka i en serie varmt kranvatten, mild tvättmedelslösning, varmt kranvatten och destillerat H2O.
- Skölj 1536-brunns mikroplattor och mankar under varmt kranvatten. För mikroplattor, kör kranvatten genom varje mikroplattas brunnar för att rensa så mycket lösning och skräp som möjligt. Om det behövs, använd en pipettspets för att lossa skräp; Använd inte metall- eller glasredskap på plattorna.
- Täck varje tallrik och kåpa med en mild tvättmedelslösning (t.ex. 1% v/v Aquet). För plattorna, skrubba ytorna med en handskehand. För pararna, använd en borste.
- Skölj varje tallrik noggrant med kranvatten och sedan med destillerat H2O. Se till att brunnarna sköljs ut specifikt under vattenflödet.
- Låt plattorna och förarföndarna lufttorka täckta vid rumstemperatur. Förvara i en ren förvaringsplats tills den används.
OBS: Hantera aldrig mikroplattorna med 1536 brunnar utan handskar. Restoljor från huden kan hindra tätning, vilket leder till brunnsläckage och avdunstning.
Representative Results
För att avgöra om det finns några korrelationer mellan brunnarna på enskilda plattor kvantifierades avdunstningen för varje brunn (n = 96 brunnar/platta för tre plattor). Avdunstning konstaterades vara -0,036 μL ± 0,003 μL (medelvärde ± SEM hela tiden). (Figur 6A) Pearson korrelationer beräknades för att utvärdera trender mellan avdunstning och brunnsplatser. Korrelationskoefficienten (figur 6B, C) för avdunstning kontra rader var -0,04 (p = 0,4949) och för avdunstning kontra kolumner var -0,23 (p = 0,0001). Grupper fördelades därefter mellan kolumner för att mildra de milda men statistiskt signifikanta korrelationerna mellan kolumner.
Figur 6:Avdunstning i MFA. (A) Densitetsfördelningen av avdunstningsförändringar med medelvärdet ± SD indikeras av den streckade linjen. Korrelationer mellan avdunstning och rader (B) eller kolumner (C) med Pearson korrelationskoefficienten och p-värdet som anges. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
För att fastställa protokollets giltighet kvantifierades förbrukningen för 3-5-dagars gamla Canton-S B-flugor (n = 36/kön/tallrik och n = 24 avdunstningskontroller/platta för tre plattor) (figur 7). Avdunstning bland kontrollbrunnarna var signifikant annorlunda än noll (-0,030 μL ± 0,006 μL, p = 4,81 x 10-6; ett prov t-test vs noll). Två prover utelämnades (båda hanarna) från datamängden, ett på grund av dödsfall under exponeringen över natten och det andra på grund av negativt konsumtionsvärde efter justering för avdunstning. Detta gav en > 99% provretentionsgrad.
Figur 7:Förbrukningsk kvantifiering med hjälp av MFA. (A) Förbrukningen visualiserades med hjälp av en specialtillverkad glaskammare. Flugor observerades dricka från perforerade brunnar och uppvisade blå buken färgning efter intag av den färgade lösningen. Se även Kompletterande video S.1. ( B )Konsumtionsvärden(medelvärde ± SEM) bland avdunstningskontroller, hanflugor och honflugor. Parvis post hoc t-test med ojämlik varians utfördes för statistiska jämförelser, med signifikans anges av staplar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Därefter konstruerades en ANOVA-modell (Analysis of Variance) enligt beskrivningen av Y = μ + S + P + SxP + e, med Y som grupp betyder, μ som det övergripande medelvärdet, S som den fasta effekten av kön, P som den fasta effekten av plattan, SxP som interaktion mellan Kön och platta, och e som restvariation. ANOVA visade ingen signifikant variabilitet mellan tallrikar (p = 0, 671) eller könsspecifika interaktioner med tallrikar (p = 0,104) för konsumtion, medan enbart kön avsevärt bidrog till den observerade variationen i konsumtion (p = 4, 17 x 10-18). Ett post hoc t-testvisade att hanar konsumerade betydligt mindre än kvinnor (0,500 μL ± 0,017 μL jämfört med 0,811 μL ± 0,028 μL, p = 1, 13 x 10-17, två prov t-test med ojämlik varians).
För att visa att analysen kan användas för tvåvals preferens kvantifiering, flugor fick ett val mellan en 4% sackaroslösning med 1% jästextrakt och en 4% sackaroslösning kompletterad med 15% etanol och 1% jästextrakt. Både män och kvinnor visade överväldigande preferens för lösningen med etanol och jästextrakt med preferensindex på 0,974 ± 0,026 för män och 0,876 ± 0,06 för kvinnor (genomsnittlig ± SEM) (Figur 8).
Figur 8: Inställningsk kvantifiering med hjälp av MFA. Konsumtion av 4% sackaros jämfört med 4% sackaros kompletterad med 15% etanol och jästextrakt för manliga och kvinnliga flugor (n = 33 för varje kön). Hanflugor förbrukade mer av etanollösningen än kontrollsevalelösningen (0,511 μL ± 0,029 μL jämfört med 0,00 μL ± 0,017 μL; p = 4,06e-10; tvåprov t-test). Honflugor förbrukade också mer etanollösning än kontrollsegelaroslösningen (0,939 μL ± 0,044 μL jämfört med 0,132 μL ± 0,044 μL; p = 7,38e-17; tvåprov t-test). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande video S.1: Videon visar en flugmatning från den perforerade brunnen och ackumulerar blå bukfärgning medan du intar den färgade lösningen. En stillbild visas i figur 7A. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande fil S.2: Microplate Feeder Assay Coupler. Detta är en 3D-utskrivbar konstruktion av paren som används i MFA. Tryckmaterial Nylon PA12 användes för MFA. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil S.3: Mikroplåtmatartestbarriärremsa. Detta innehåller utformningen av de plastbarriärremsor som används för att växla exponering av flugor till matarplattan. Ett enda par kan använda upp till tolv barriärremsor. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil S.4: Uppacknings- och tillverkningsinstruktioner för mikroplåtmataranalysen. Instruktioner ingår för uppackning av fästen och barriärremsorna. Tillverkningsinstruktioner ingår för innerlocket, ytterlocket och sekundärbehållaren som används för att begränsa avdunstning under exponering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil S.5:Kostnadsjämförelse av Microplate Feeder Assay (MFA) och en 1-val enkelfluga CApillary FEeder (CAFE) analys. Att testa 72 flugor /kön för en enda linje skulle kräva två uppsättningar MFA-utrustning (couplers + tallrikar + barriärremsor), medan CAFE bara skulle behöva 1 kapillär för varje odlingsflaska. Trots den stora skillnaden i initiala investeringar för MFA skulle den stora skillnaden i återkommande kostnader ($ 14.80 respektive $ 46.08) göra det möjligt att återvinna de initiala kostnaderna efter att ha testat endast 4 linjer (break-even point). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Studien beskriver ett nytt protokoll för kvantifiering av konsumtion i Drosophila: Microplate Feeder Assay (MFA). I denna analys förbrukar flugor från förseglade brunnar av en 1536-brunns mikroplatta genom kontrollerade perforeringar(figur 1, figur 2; Kompletterande video S.1). Eftersom flytande livsmedel färgas och tillhandahålls via mikroplatta kan mätningar av matens optiska absorbans erhållas med hjälp av en mikroplåtspektrofotometer (figur 3). På detta sätt bestäms förbrukningen genom att absorbera före och efter förbrukningen och sedan tillämpa denna andel på den kända volym som dispenserats före konsumtionen. Detta kontrollerades empiriskt genom att man mätte absorbansen av olika volymer av det färgade mediet(figur 3B).
För att utveckla denna analys behövdes en enhet som kunde utnyttja den absorbansbaserade kvantifieringen av förbrukningen. Att testa flugor i mikroplåtformat är tilltalande eftersom det kompletterar mikroplattan som används för att dela ut mat och möjliggör flexibilitet vid val av flera tallriksformat (t.ex. 6-, 12-, 48- eller 96-brunnsformat) genom att justera kopplade geometrin. Ett 96-brunns mikroplåtformat valdes för att möjliggöra individuell flugkultur.
Den 3D-utskrivna anordningen (figur 1) orienterar exakt matarplattan med 1536 brunnar med 96-brunns odlingsplattan, vilket ger varje fluga tillgång till upp till 4 brunnar på matarplattan för konsumtion. För att ge tillräckligt med tid för att distribuera flugor till höljesplattan och för att kontrollera analysinitiering, inkluderar enheten växlande barriärremsor som innehåller flugorna i sina respektive brunnar och förhindrar överträdelser. De filer som behövs för att skaffa eller modifiera dessa delar tillhandahålls (Kompletterande filer S.2-S.3), liksom de nödvändiga tillverkningsinstruktionerna för de relevanta delarna(kompletterande fil S.4).
MFA ger en enkel hög genomströmningsmetod som kompletterar mer utarbetade metoder för att övervaka Drosophilautfodringsbeteende 18,21,22. MFA erbjuder flera fördelar jämfört med andra metoder som används för att kvantifiera matintag. Dataflödet ökas genom att kvantifiera förbrukningen med hjälp av en plåtläsare. Detta eliminerar manuella mätningar och undanröjer manuell datainmatning. Data är också mottagliga för programmatisk extraktion och bearbetning. Dessutom ökar det högre genomströmningen det möjliga antalet biologiska replikat, särskilt jämfört med kommunala matardesigner, vilket avsevärt ökar kraften att upptäcka små skillnader i konsumtion. Med hjälp av MFA kan en enda experimenterare kvantifiera förbrukningen eller preferensen för över 500 flugor per nattkörning av analysen. Genom överlappande körningar av analysen kan över 2 000 flugor testas under en 5-dagarsperiod. Slutligen finns det långsiktiga kostnadsbesparingar på grund av återanvändbarheten av mikroplattor och kopplade(kompletterande fil S.5). Med hjälp av MFA kan den uppskattade kostnaden per analys vara så låg som $ 14.80, med en $ 127.60 i förskottskostnad för utrustningen. Med hjälp av den klassiska CApillary FEeder (CAFE) -analysen, som kräver kostsamma precisionsmikrokalyer, är den uppskattade kostnaden per analys för ett jämförbart antal replikat $ 46.08. Även om det finns en förskottsinvestering i förvärvet av nödvändig utrustning kan minskningen av återkommande kostnader leda till betydande besparingar, särskilt i fall där upprepade tester utförs.
Som med alla analyser har MFA vissa begränsningar. Framför allt kräver det tillgång till en mikroplatta spektrofotometer som kan avläsa 1536-brunns mikroplattor. Dessutom gör beroendet av absorbansmätningar för kvantifiering metoden mottaglig för optisk interferens. Detta visar sig som negativa förbrukningsvärden för en liten delmängd av de prover som testats. Näringsämnen, läkemedel, läkemedel eller toxiner av intresse måste också vara vattenlösliga för att vara förenliga med analysen.
Trots sina begränsningar erbjuder denna metod en hög genomströmningsmetod för att kvantifiera konsumtionsbeteenden i Drosophila. Dessutom kan kopplingsanordningen enkelt modifieras för att acceptera många plåtformat, så att den rymmer en mängd olika insektsarter.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institute on Drug Abuse (U01 DA041613) till TFCM och RRHA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm Diameter Needles | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
| 0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
| 10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | - | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
| FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
| Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
| Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | - | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
| Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
| Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | - | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
| Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
| Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
| Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
| Rubber Bands | |||
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
- Wong, R., Piper, M. D. W., Wertheim, B., Partridge, L.
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Spitaler, U., et al. Yeast species affects feeding and fitness of Drosophila suzukii adults. Journal of Pest Science. 93 (4), 1295-1309 (2020).
- Wang, Q. P., et al. PGC1α controls sucrose taste sensitization in Drosophila. Cell Reports. 31 (1), 107480 (2020).
- Valtierra-de-Luis, D., et al. Quantification of dose-mortality responses in adult Diptera: Validation using Ceratitis capitata and Drosophila suzukii responses to spinosad. PLoS ONE. 14 (2), 1-11 (2019).
- Williams, M. J., et al. Exposure to bisphenol A affects lipid metabolism in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 114 (5), 414-420 (2014).
- Jajoo, A., Donlon, C., Shnayder, S., Levin, M., McVey, M. Sertraline induces DNA damage and cellular toxicity in Drosophila that can be ameliorated by antioxidants. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Fochler, S., et al. Genetics of alcohol consumption in Drosophila melanogaster. Genes, Brain and Behavior. 16 (7), 675-685 (2017).
- Highfill, C. A., Baker, B. M., Stevens, S. D., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Genetics of cocaine and methamphetamine consumption and preference in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 15 (5), 1007834 (2019).
- Keebaugh, E. S., Park, J. H., Su, C., Yamada, R., Ja, W. W. Nutrition Influences caffeine-mediated sleep loss in Drosophila. Sleep. 40 (11), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8 (1), 87 (2015).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Shell, B. C., et al. Measurement of solid food intake in Drosophila via consumption-excretion of a dye tracer. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Wu, Q., et al. Excreta quantification (EX-Q) for longitudinal measurements of food intake in Drosophila. iScience. 23 (1), 100776 (2020).
- Park, A., Tran, T., Atkinson, N. S. Monitoring food preference in Drosophila by oligonucleotide tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9020-9025 (2018).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jaime, M. D. L. A., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
- IUPAC. Compendium of Chemical Terminology (The "Gold Book"). , Blackwell Scientific Publications. Research Triangle Park, NC. (1997).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
