Summary
Le test d’alimentation par microplaques offre une méthode économique et à haut débit pour quantifier la consommation d’aliments liquides chez la drosophile. Un dispositif imprimé en 3D relie une microplaque de 96 puits dans laquelle les mouches sont logées à une microplaque de 1536 puits à partir de laquelle les mouches consomment une solution d’alimentation avec un colorant traceur. La baisse du volume de la solution est mesurée spectrophotométriquement.
Abstract
La quantification de l’apport alimentaire chez la drosophile est utilisée pour étudier les fondements génétiques et physiologiques des traits associés à la consommation, leurs facteurs environnementaux et les effets toxicologiques et pharmacologiques de nombreuses substances. Peu de méthodes actuellement mises en œuvre se prêtent à la mesure à haut débit. Le microplate Feeder Assay (MFA) a été développé pour quantifier la consommation d’aliments liquides pour les mouches individuelles en utilisant l’absorbance. Dans ce test, les mouches consomment un milieu alimentaire liquide provenant de puits sélectionnés d’une microplaque de 1536 puits. En incorporant un colorant traceur dilué dans le milieu alimentaire liquide et en chargeant un volume connu dans chaque puits, les mesures d’absorbance du puits acquis avant et après la consommation reflètent le changement de volume qui en résulte (c.-à-d. le volume consommé). Pour permettre une analyse à haut débit avec cette méthode, un coupleur imprimé en 3D a été conçu pour permettre aux mouches d’être triées individuellement en microplaques de 96 puits. Cet appareil oriente avec précision des microplaques de 96 et 1536 puits pour donner à chaque mouche l’accès à jusqu’à 4 puits pour la consommation, permettant ainsi la quantification des préférences alimentaires en plus de la consommation régulière. De plus, l’appareil est doté de bandes barrières qui basculent entre les positions ouvertes et fermées pour permettre un confinement et une libération contrôlés d’une colonne d’échantillons à la fois. Cette méthode permet des mesures à haut débit de la consommation de solutions aqueuses par plusieurs mouches simultanément. Il a également le potentiel d’être adapté à d’autres insectes et de filtrer la consommation de nutriments, de toxines ou de produits pharmaceutiques.
Introduction
Drosophila melanogaster a été largement utilisé comme organisme modèle génétique pour étudier les fondements biologiques de l’apport alimentaire et les traits associés à la consommation1. On estime que 65% des gènes pathogènes humains ont des homologues fonctionnels chez les mouches, une proportion importante de ceux-ci étant exprimés dans des tissus fonctionnellement équivalents entre les mouches et les humains2. De plus, la taille de D. melanogaster, son temps intergénérationnel court, son entretien simple et sa tractabilité génétique en font un modèle attrayant pour les études sur la consommation de nutriments3,4 et les effets toxicologiques et pharmacologiques d’une variété de substances, y compris les insecticides5,les polluants6,les produits pharmaceutiques7et les drogues d’abus8,9,10.
Dans de nombreux cas, l’étude de tels traits nécessite une quantification précise de la consommation. Les méthodes de quantification de la consommation sont diverses et comprennent le test CApillary FEeder (CAFE)11,le test MAnual FEeding (MAFE)12,le test Proboscis Extension Response (PER)13,l’extraction de colorant traceur14,15, l’extraction de traceur d’oligonucléotides16et l’extraction de radio-isotopes5,17. Les efforts récents se sont concentrés sur l’amélioration du débit de ces essais, comme dans le test Expresso18 ou le système FLat d’alimentation animale entière sur plaque (WAFFL)19. Malgré leur utilité, ces tests peuvent être compliqués, coûteux ou exigeants en main-d’œuvre, ce qui entrave leur utilisation dans les études à haut débit.
Figure 1: Composants du test du chargeur de microplaques. (A) Rendu 3D du test du chargeur de microplaques assemblé. La microplaque de 1536 puits est orientée par le coupleur imprimé en 3D de telle sorte que chaque puits de la microplaque inférieure de 96 puits ait accès à quatre puits de la microplaque supérieure de 1536 puits. L’accès aux puits peut être contrôlé en ajustant la position des bandes de barrière insérées dans le coupleur. (B) Représentation graphique de chaque puits du test d’alimentation par microplaques. Les solutions de consommation sont retenues dans chaque puits à l’aide d’un film d’étanchéité qui a été perforé pour permettre l’accès par la mouche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Vue d’ensemble des procédures du test du chargeur de microplaques. La figure montre un organigramme qui correspond aux étapes 4.1 à 5.8 du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour surmonter ces obstacles, le microplate Feeder Assay (MFA; Figure 1) a été développé. Dans ce test, les mouches sont logées individuellement dans des microplaques de 96 puits. Chaque microplaque est couplée à une microplaque de 1536 puits à l’aide d’un dispositif personnalisé imprimé en 3D. L’appareil oriente précisément les deux plaques de telle sorte que chaque mouche dans son puits respectif de la plaque de 96 puits ait accès à 4 puits de la microplaque de 1536 puits. En utilisant une plaque sans fond de 1536 puits et des films d’étanchéité, les solutions sont distribuées dans des puits sélectionnés et perforées avec des aiguilles précises de 0,25 mm de diamètre pour permettre l’accès aux mouches. De manière critique, permettre la consommation directement à partir d’une microplaque permet des mesures immédiates basées sur l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques. Un colorant traceur dilué est incorporé dans le milieu de consommation, et le changement d’absorbance après exposition est utilisé pour déterminer le volume consommé(Figure 2 et Figure 3). Étant donné que le liquide dans chaque puits se rapproche d’une colonne de fluide, les différences volumétriques se manifesteront par des différences de hauteur de la colonne. (Figure 3A) Selon la loi Beer-Lambert20:
où A est l’absorbance, ε est le coefficient d’absorption molaire de l’analyte atténuant, l est la longueur du trajet optique et c est la concentration de l’analyte atténuant. Ainsi, avec un coefficient d’absorption molaire et une concentration constants, les changements d’absorbance sont dus uniquement à des changements dans le trajet optique de la lumière, c’est-à-dire le niveau de fluide dans un puits donné. En mesurant l’absorbance avant et après l’exposition, la variation proportionnelle de l’absorbance reflète la variation proportionnelle du volume(figure 3B).
Figure 3: Quantification du volume du puits basée sur l’absorbance. ( A )Unelumière incidente d’intensité d’entrée connue (I0) traverse chaque puits. L’atténuation de la lumière à différents volumes de remplissage donne différentes intensités de sortie (I), présentant une relation linéaire entre le volume et l’absorbance. (B) Mesure empirique de l’absorbance par rapport au volume. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Sur la base du changement de volume, la quantité de tout composé ingéré peut être calculée à partir de sa concentration connue dans la solution d’alimentation. Les pièces nécessaires à l’essai sont peu coûteuses et ont un degré élevé de réutilisation, ce qui réduit considérablement le coût récurrent de l’essai. Ainsi, cette procédure offre une méthode abordable et à haut débit pour quantifier précisément la consommation.
Protocol
1. Préparation de la plaque de famine
- Peser 1,5 g d’agarose dans un bécher en verre de 250 mL.
- Ajouter 100 mL deH2O distillé dans le bécher.
- Micro-ondes par intermittence jusqu’à ce que l’agarose soit complètement fondue.
REMARQUE: Observez le bécher car l’agarose est sujette à l’ébullition. - Verser l’agarose fondue dans un bac à réactif et distribuer 80 μL d’agarose fondue dans chaque puits d’une microplaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal. Laisser durcir les plaques lorsqu’ils sont couverts à température ambiante. Réfrigérer les restes d’agarose jusqu’à une semaine dans un sac scellé et les refondre pour en faire des assiettes supplémentaires.
2. Tri des mouches et famine
- Préparez les coupleurs en insérant des bandes de barrière dans les canaux de la bande de barrière. Si les bandes de barrière sont trop lâches, enroulez-les autour du doigt pour leur donner une courbure pour les maintenir dans les canaux.
- Apposez l’attelage sur une plaque de famine. N’utilisez pas l’attelage pour manipuler la plaque, car l’attelage pourrait glisser. Assurez-vous que les coupleurs sont correctement orientés (c.-à-d. assurez-vous que le coin incliné de l’attelage correspond au coin incliné de la microplaque).
- Sous anesthésie au CO2 (Table des matériaux), trier les mouches de 3 à 5 jours. Chargez les mouches individuelles par colonne dans la plaque de famine.
REMARQUE : Bien que les mouches soient chargées par colonne, il est recommandé de répartir des groupes d’échantillons sur les lignes de la plaque plutôt que dans les colonnes (voir la figure 4 pour un exemple de disposition de plaque). - Fermez chaque colonne au fur et à mesure qu’elle se remplit en ajustant sa bande de barrière à la position fermée.
Figure 4: Disposition représentative de la plaque de famine. Le diagramme montre l’organisation des contrôles d’évaporation et des mouches mâles et femelles dans une plaque de 96 puits utilisée dans cette étude. Des configurations alternatives, y compris des rangées alternées de mâles et de femelles avec des contrôles d’évaporation dans les rangées A et H, peuvent également être utilisées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Enregistrez soigneusement la disposition de l’échantillon dans la microplaque. Une fois la plaque de famine remplie, laissez les mouches récupérer spontanément après avoir retiré le CO2 et affamez-les pendant 6 h à partir de leur temps d’anesthésie initial.
3. Préparation des aliments liquides
REMARQUE: Faites des aliments liquides frais tous les jours.
- Préparer une solution mère de 10 mg/mL de COLORANT BLEU #1 dans du H2O distillé.
REMARQUE: Cela peut être conservé à température ambiante jusqu’à 6 mois. - Préparer 10 mL d’aliments liquides (4 % de saccharose, 1 % d’extrait de levure, 40 μg/mL de FD&C Blue #1) dans un tube conique de 15 mL en dissolvant 0,4 g de saccharose et 0,1 g d’extrait de levure dans 10 mL de H2O distillé. Tourbillon du tube jusqu’à dissolution complète des solides. Ajouter 40 μL de solution de colorant et inverser le tube à plusieurs reprises pour homogénéiser la solution.
- Transférer les aliments liquides dans une seringue de 10 mL avec un filtre de 0,45 μm. Filtrer environ 1,5 mL de la solution à la fois dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL. Mettez de côté la seringue contenant la solution et filtrez la solution supplémentaire au besoin pendant la préparation de la plaque d’alimentation.
4. Préparation de la plaque d’alimentation
REMARQUE: Manipulez doucement les plaques d’alimentation après le remplissage pour éviter la formation de bulles ou de gouttelettes dans le puits qui pourraient influencer les lectures d’absorbance.
- Préparez une plaque d’alimentation en scellant le fond d’une microplaque de 1536 puits avec un film d’étanchéité. Utilisez une palette d’étanchéité pour bien adhérer au film. Coupez l’excès de film sur les bords gauche et droit avec une lame de rasoir.
- Distribuer 10 μL de l’aliment liquide filtré par colonne (voir la figure 5 pour l’illustration) dans les puits appropriés de la microplaque de 1536 puits. Distribuer dans le puits supérieur gauche pour chaque groupe de quatre puits (voir la figure 5 pour l’illustration).
Figure 5: Ordre de remplissage et emplacement du puits pour la plaque d’alimentation de 1536 puits. Le diagramme illustre l’étape 4.2 du protocole. Les flèches indiquent l’ordre dans lequel la solution d’alimentation est introduite dans la plaque d’alimentation une colonne à la fois de la colonne 1 à la colonne 12. L’échantillon B1 est agrandi pour montrer un exemple de l’emplacement des solutions d’alimentation pour les tests à 1 choix et à 2 choix. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Une fois tous les puits remplis, appliquez un film d’étanchéité sur le dessus de la plaque. Utilisez une palette d’étanchéité pour bien adhérer au film. Coupez l’excès de film sur les bords gauche et droit avec une lame de rasoir. Répétez l’opération pour le nombre de plaques souhaité.
- Centrifuger les plaques à 200 x g pendant 10 s pour déposer le fluide. Ne laissez pas la plaque refroidir, car cela pourrait provoquer une accumulation de condensation dans les puits, obscurcissant les lectures d’absorbance.
5. Exposition
- Une fois que les mouches sont prêtes pour le test de consommation, perforez les puits sur la surface supérieure de la plaque avec l’outil de sonde à aiguille équipé d’une aiguille de 0,25 mm de diamètre. Utilisez le même ordre de perforation que celui utilisé lors de la distribution des solutions. Retournez la plaque et perforez les puits sur le fond. Essuyez l’aiguille entre les solutions pour éviter toute contamination croisée. Veillez à ne pas toucher les perforations car cela évacue la solution des puits.
- Lisez l’absorbance de la plaque à 630 nm sans couvercle.
- Placez un couvercle interne sur le film d’étanchéité supérieur pour vous assurer que les anneaux de condensation entourent les puits perforés. Placez le couvercle externe sur la plaque.
- Placez la plaque d’alimentation face vers le haut sur l’attelage de manière à ce que les guides alignent les trous appropriés de la plaque d’alimentation et de la plaque de famine. Assurez-vous que l’attelage et les plaques sont correctement orientés (c.-à-d. assurez-vous que le coin incliné de l’attelage et les plaques correspondent). Enroulez des bandes élastiques autour des plaques supérieure et inférieure pour maintenir le coupleur ensemble. Vérifiez l’alignement et les espaces entre la plaque d’alimentation et l’attelage.
- Une fois que toutes les plaques d’alimentation sont chargées sur les coupleurs, ouvrez les puits pour les plaques en ajustant les bandes de barrière sur l’attelage. Placez les assemblages coupleur/plaque dans le récipient secondaire. Chaque conteneur secondaire peut accueillir jusqu’à six assemblages.
- Placez la moitié inférieure d’une pipette contenant des serviettes en papier trempées dans chaque récipient secondaire pour fournir de l’humidité. Fermez le couvercle des récipients secondaires et transférez-les dans un environnement contrôlé (25 °C, humidité contrôlée, 12 h de cycles lumière:obscurité). Laisser les mouches consommer pendant 22 h.
- Après l’exposition de 22 heures, vérifiez chaque plaque pour les mouches mortes et mettez à jour la disposition de la plaque en conséquence. Après avoir vérifié toutes les plaques, anesthésiez les mouches en masse en pompant du CO2 à l’intérieur du récipient secondaire. Après ~60 s, assurez-vous que toutes les mouches sont immobilisées. Tassez doucement les mouches dans la plaque de famine et remplacez les bandes de barrière en plastique. Retirez les plaques d’alimentation pour la lecture.
- Relisez l’absorbance de la plaque à 630 nm. Répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les plaques aient été lues.
6. Analyse des données
REMARQUE : L’analyse peut être effectuée avec le progiciel préféré de l’investigateur.
- Omettez toutes les mouches qui sont mortes au cours de l’exposition de 22 heures.
- Pour chaque puits, calculez le volume consommé comme :
C - Volume consommé (μL)
V - Volume initial du puits (c.-à-d. 10 μL)
ABS0 - Absorbance pré-exposition
ABS1 - Absorbance post-exposition
REMARQUE: La consommation est indiquée comme un volume positif dans le calcul. - Pour tenir compte de l’évaporation, soustrayez le volume moyen d’évaporation des valeurs de consommation de mouches dans les plaques respectives. Pour les tests à 2 choix/préférences, ajustez chaque puits en fonction de sa solution respective, parexemple,ajustez les puits du « choix 1 » par le « choix 1 » dans les commandes d’évaporation.
- Après ajustement pour l’évaporation, laissez tomber tous les échantillons dont la valeur de consommation est inférieure à zéro.
- Pour les tests à 2 choix, calculez la préférence pour chaque puits comme :
P - Indice de préférence (la direction positive indique la préférence)
FA - Volume d’aliments liquides consommés contenant un additif (Choix 2)
FN - Volume d’aliments liquides normaux consommés (Choix 1)
7. Protocole de lavage des microplaques et des coupleurs.
REMARQUE: Prenez soin d’éviter d’endommager le fond des microplaques, car les dommages peuvent affecter l’étanchéité.
- Retirez les films et les étiquettes des microplaques à 1536 puits. Séparez les attelages et les bandes de barrière. Placez les bandes de barrière dans un récipient hermétique, tel qu’une bouteille. Lavez les bandes de barrière en agitant vigoureusement dans une série d’eau chaude du robinet, de solution détergente douce, d’eau chaude du robinet, puis distillez H2O.
- Rincer les microplaques et les coupleurs de 1536 puits sous l’eau tiède du robinet. Pour les microplaques, faire couler l’eau du robinet dans les puits de chaque microplaque pour éliminer autant de solution et de débris que possible. Si nécessaire, utilisez une pointe de pipette pour déloger les débris; n’utilisez pas d’ustensiles en métal ou en verre sur les assiettes.
- Couvrir chaque plaque et coupleur avec une solution de détergent doux (p. ex., 1 % v/v Aquet). Pour les assiettes, frottez les surfaces avec une main gantée. Pour les coupleurs, utilisez une brosse.
- Rincez soigneusement chaque plaque à l’eau du robinet, puis avec du H2O distillé. Assurez-vous que les puits sont spécifiquement rincés sous le débit d’eau.
- Laissez les plaques et les coupleurs sécher à l’air libre couverts à température ambiante. Conserver dans un bac de rangement propre jusqu’à utilisation.
REMARQUE: Ne manipulez jamais les microplaques de 1536 puits sans gants. Les huiles résiduelles de la peau peuvent entraver l’étanchéité, entraînant des fuites et une évaporation du puits.
Representative Results
Pour déterminer s’il existe des corrélations entre les puits de plaques individuelles, l’évaporation a été quantifiée pour chaque puits (n = 96 puits/plaque pour trois plaques). L’évaporation s’est avérée être de -0,036 μL ± de 0,003 μL (moyenne ± SEM tout au long). (Figure 6A) Les corrélations de Pearson ont été calculées pour évaluer les tendances entre l’évaporation et l’emplacement des puits. Le coefficient de corrélation(Figure 6B,C) pourl’évaporationpar rapport aux lignes était de -0,04 (p = 0,4949) et pour l’évaporation par rapport aux colonnes était de -0,23 (p = 0,0001). Les groupes ont ensuite été répartis entre les colonnes afin d’atténuer les corrélations légères mais statistiquement significatives entre les colonnes.
Figure 6: Évaporation dans l’AMF. (A) La distribution volumique de l’évaporation change avec la moyenne ± SD indiquée par la ligne pointillée. Corrélations entre l’évaporation et les lignes (B) ou les colonnes (C) avec le coefficient de corrélation de Pearson et la valeur p comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour établir la validité du protocole, la consommation a été quantifiée pour les mouches Canton-S B âgées de 3 à 5 jours (n = 36/sexe/plaque et n = 24 témoins d’évaporation/plaque pour trois plaques) (Figure 7). L’évaporation entre les puits témoins était significativement différente de zéro (-0,030 μL ± 0,006 μL, p = 4,81 x 10-6; un échantillon t-test vs zéro). Deux échantillons ont été omis (tous deux de sexe masculin) de l’ensemble de données, l’un en raison d’un décès pendant la nuit et l’autre en raison d’une valeur de consommation négative après ajustement pour l’évaporation. Cela a donné un taux de rétention de l’échantillon > de 99 %.
Figure 7: Quantification de la consommation à l’aide de l’AMF. (A) La consommation a été visualisée à l’aide d’une chambre en verre fabriquée sur mesure. Des mouches ont été observées en train de boire dans des puits perforés et présentaient une coloration abdominale bleue après l’ingestion de la solution teintée. Voir aussi la vidéo supplémentaire S.1. (B) Valeurs de consommation (moyenne ± SEM) parmi les témoins de l’évaporation, les mouches mâles et les mouches femelles. Un test t post-hoc parpaires avec une variance inégale a été effectué pour les comparaisons statistiques, la signification pouvant être indiquée par des barres. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Par la suite, un modèle d’analyse de variance (ANOVA) a été construit comme décrit par Y = μ + S + P + SxP + e, avec Y comme moyenne de groupe, μ comme moyenne globale, S comme effet fixe du sexe, P comme effet fixe de la plaque, SxP comme interaction entre le sexe et la plaque, et e comme variabilité résiduelle. L’ANOVA n’a montré aucune variabilité significative de plaque à plaque (p = 0,671) ou d’interactions spécifiques au sexe avec les plaques (p = 0,104) pour la consommation, tandis que le sexe seul a contribué de manière significative à la variation observée de la consommation (p = 4,17 x 10-18). Un test t post hoca montré que les mâles consommaient significativement moins que les femelles (0,500 μL ± 0,017 μL vs 0,811 μL ± 0,028 μL, p = 1,13 x 10-17,deux échantillons t-testavec une variance inégale).
Pour démontrer que le test peut être utilisé pour la quantification à deux choix, les mouches ont eu le choix entre une solution de saccharose à 4% avec 1% d’extrait de levure et une solution de saccharose à 4% complétée par 15% d’éthanol et 1% d’extrait de levure. Les mâles et les femelles ont montré une préférence écrasante pour la solution à l’éthanol et à l’extrait de levure avec des indices de préférence de 0,974 ± 0,026 pour les mâles et de 0,876 ± 0,06 pour les femelles (moyenne ± SEM)(Figure 8).
Figure 8: Quantification des préférences à l’aide de l’AMF. Consommation de 4 % de saccharose contre 4 % de saccharose complétée par 15 % d’éthanol et d’extrait de levure pour les mouches mâles et femelles (n = 33 pour chaque sexe). Les mouches mâles ont consommé plus de la solution d’éthanol que la solution témoin de saccharose (0,511 μL ± 0,029 μL contre 0,00 μL ± 0,017 μL; p = 4,06e-10; essai tà deux échantillons). Les mouches femelles ont également consommé plus de solution d’éthanol que la solution de saccharose témoin (0,939 μL ± 0,044 μL contre 0,132 μL ± 0,044 μL; p = 7,38e-17; test tà deux échantillons). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo supplémentaire S.1: La vidéo montre une mouche se nourrissant du puits perforé et accumulant des taches abdominales bleues lors de l’ingestion de la solution teintée. Une image fixe est illustrée à la Figure 7A. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Dossier supplémentaire S.2: Coupleur d’essai d’alimentation de microplaques. Il s’agit d’une construction imprimable en 3D du coupleur utilisé dans le MFA. Le matériau d’impression Nylon PA12 a été utilisé pour le MFA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire S.3 : Bande de barrière d’essai d’alimentation de microplaques. Celui-ci contient la conception des bandes de barrière en plastique utilisées pour basculer l’exposition des mouches à la plaque d’alimentation. Un seul coupleur peut utiliser jusqu’à douze bandes de barrière. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire S.4 : Instructions de déballage et de fabrication pour le test du chargeur de microplaques. Des instructions sont incluses pour déballer l’attelage et les bandes de barrière. Des instructions de fabrication sont incluses pour le couvercle intérieur, le couvercle extérieur et le récipient secondaire utilisés pour limiter l’évaporation pendant l’exposition. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire S.5 :Comparaison des coûts du test d’alimentation par microplaques (MFA) et d’un test CAFE (CApillary FEeder) à une seule mouche à 1 choix. Tester 72 mouches / sexe pour une seule ligne nécessiterait deux ensembles d’équipement MFA (coupleurs + plaques + bandes barrières), tandis que le CAFE n’aurait besoin que de 1 capillaire pour chaque flacon de culture. Malgré la grande différence dans l’investissement initial pour l’AMF, la grande différence dans les coûts récurrents (14,80 $ contre 46,08 $, respectivement) permettrait de recouvrer les coûts initiaux après avoir testé seulement 4 lignes (seuil de rentabilité). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
L’étude décrit un nouveau protocole de quantification de la consommation chez la drosophile: le Microplate Feeder Assay (MFA). Dans ce test, les mouches consomment à partir de puits scellés d’une microplaque de 1536 puits à travers des perforations de taille contrôlée (Figure 1, Figure 2; Vidéo supplémentaire S.1). Étant donné que les aliments liquides sont teints et fournis par microplaque, des mesures de l’absorbance optique de l’aliment peuvent être obtenues à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques (Figure 3). De cette manière, la consommation est déterminée en comparant l’absorbance avant et après consommation, puis en appliquant cette proportion au volume connu distribué avant la consommation. Ceci a été vérifié empiriquement en mesurant l’absorbance de différents volumes du milieu teint (Figure 3B).
Pour développer ce test, il fallait un dispositif capable de tirer parti de la quantification de la consommation basée sur l’absorbance. Tester les mouches dans un format de microplaque est attrayant car il complète la microplaque utilisée pour distribuer les aliments et permet une flexibilité dans la sélection parmi plusieurs formats de plaques (par exemple, formats 6, 12, 48 ou 96 puits) en ajustant la géométrie du coupleur. Un format de microplaque de 96 puits a été choisi pour permettre la culture individuelle des mouches.
Le dispositif imprimé en 3D(Figure 1)oriente avec précision la plaque d’alimentation de 1536 puits avec la plaque de culture de 96 puits, donnant à chaque mouche l’accès à jusqu’à 4 puits de la plaque d’alimentation pour la consommation. En outre, afin de prévoir suffisamment de temps pour distribuer les mouches dans la plaque de logement et pour contrôler le déclenchement du test, le dispositif comprend des bandes de barrière basculantes contenant les mouches dans leurs puits respectifs et empêchant les brèches. Les fichiers nécessaires à l’acquisition ou à la modification de ces pièces sont fournis (Dossiers supplémentaires S.2-S.3), ainsi que les instructions de fabrication nécessaires pour les pièces concernées ( Dossier supplémentaireS.4).
Le MFA fournit une méthode simple à haut débit qui complète des méthodes plus élaborées pour surveiller le comportement alimentaire des drosophiles18,21,22. L’AMF offre de multiples avantages par rapport aux autres méthodes utilisées pour quantifier l’apport alimentaire. Le débit est augmenté en quantifiant la consommation à l’aide d’un lecteur de plaques. Cela élimine les mesures manuelles et évite la saisie manuelle des données. Les données se prêtent également à l’extraction et au traitement programmatiques. En outre, le débit plus élevé augmente le nombre possible de répliques biologiques, en particulier par rapport aux conceptions d’alimentation communales, ce qui augmente considérablement la puissance pour détecter de petites différences de consommation. En utilisant le MFA, un seul expérimentateur peut quantifier la consommation ou la préférence de plus de 500 mouches par nuit de l’essai. En chevauchant les essais, plus de 2 000 mouches peuvent être testées sur une période de 5 jours. Enfin, il existe des économies de coûts à long terme grâce à la réutilisation des microplaques et des coupleurs (Fichier supplémentaire S.5). En utilisant l’AMF, le coût estimé par essai peut être aussi bas que 14,80 $, avec un coût d’avance de 127,60 $ pour l’équipement. En utilisant le test classique CApillary FEeder (CAFE), qui nécessite des microcapillaires de précision coûteux, le coût estimé par test pour un nombre comparable de répliques est de 46,08 $. Ainsi, bien qu’il y ait un investissement initial dans l’acquisition de l’équipement nécessaire, la réduction des coûts récurrents peut entraîner des économies substantielles, en particulier dans les cas où des tests répétés sont effectués.
Comme pour tous les essais, l’AMF présente certaines limites. Principalement, il nécessite l’accès à un spectrophotomètre à microplaques capable de lire des microplaques de 1536 puits. De plus, le recours aux mesures d’absorbance pour la quantification rend la méthode sensible aux interférences optiques. Cela se manifeste par des valeurs de consommation négatives pour un petit sous-ensemble d’échantillons testés. Les nutriments, les médicaments, les produits pharmaceutiques ou les toxines d’intérêt doivent également être solubles dans l’eau pour être compatibles avec le test.
Malgré ses limites, cette méthode offre une méthode à haut débit pour quantifier les comportements de consommation chez la drosophile. De plus, le dispositif de couplage pourrait être facilement modifié pour accepter de nombreux formats de plaques, ce qui lui permettrait d’accueillir une variété d’espèces d’insectes.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute on Drug Abuse (U01 DA041613) à TFCM et RRHA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm Diameter Needles | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
| 0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
| 10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | - | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
| FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
| Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
| Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | - | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
| Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
| Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | - | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
| Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
| Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
| Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
| Rubber Bands | |||
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
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