Summary

Determinação da interação tripartite entre dois monômeros de um fator de transcrição da caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio por Ensaio BiFC-FRET-FLIM

Published: December 25, 2021
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Summary

Aqui apresentamos, um método para visualizar a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos usando proteínas com marca fluorescente pelo ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC. Este método é valioso para estudar complexos de interação proteína-proteína in vivo.

Abstract

As interações proteína-proteína são parte integrante de todos os processos biológicos das células, pois desempenham um papel crucial na regulação, manutenção e alteração das funções celulares. Essas interações estão envolvidas em uma ampla gama de fenômenos, como transdução de sinais, resposta de patógenos, interações célula-células, processos metabólicos e de desenvolvimento. No caso dos fatores de transcrição, essas interações podem levar à oligomerização de subunidades, sequestre em contextos subcelulares específicos como o núcleo, citoplasma, etc., que, por sua vez, podem ter um efeito mais profundo na expressão dos genes a jusante. Aqui, demonstramos uma metodologia para visualizar a interação tripartite in vivo usando a Complementação de Fluorescência Bimolecular (BiFC) baseada em Förster Resonance Energy Transfer (FRET) envolvendo Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Duas das proteínas selecionadas para esta demonstração interagem como parceiros do BiFC, e sua atividade de fluorescência reconstituída é usada para avaliar o FRET-FLIM com o terceiro parceiro. As plantas nicotiana benthamiana, cultivadas em quatro a cinco semanas, foram usadas como o sistema de plantas modelo para esta demonstração.

Introduction

As interações proteína-proteína (PPIs) formam a base do bom funcionamento das células eucarióticas regulando vários processos metabólicos e de desenvolvimento. Alguns PPIs são estáveis, enquanto outros são transitórios na natureza. As interações podem ser categorizadas com base no número e tipo de membros na interação, como dimeric, trimeric, tetramérrico homomédico e heteromérico1. A identificação e caracterização das interações proteicas pode levar a uma melhor compreensão das funções proteicas e das redes regulatórias.

Os fatores de transcrição são proteínas que estão envolvidas em funções regulatórias. Eles regulam a taxa de transcrição de seus genes a jusante ligando-se ao DNA. Às vezes, a oligomerização ou formação de complexos de alta ordem por proteínas é um pré-requisito para a realização de suas funções2. Os fatores de transcrição da caixa MADS são genes homeóticos que regulam vários processos como transição floral, desenvolvimento de órgãos florais, fertilização, desenvolvimento de sementes, senescência e desenvolvimento vegetativo. Eles são conhecidos por formar complexos de alta ordem que se ligam ao DNA3,4. Estudar as redes de PPI entre fatores de transcrição e seus interagirres fornece insights sobre a complexidade subjacente à regulação transcricional.

A expressão proteica transitória em Nicotiana benthamiana tem sido uma abordagem popular para estudar a localização de proteínas ou interações proteína-proteína in vivo5. BiFC e FRET são métodos para estudar interações proteína-proteína in vivo usando sistemas de repórteres fluorescentes6. Uma combinação dessas duas técnicas tem sido demonstrada para revelar a interação entre três proteínas7. O FRET é medido usando a técnica de fotobleaching aceitador, emissão sensibilizada e Fluorescência Lifetime Imaging (FLIM). O ensaio FRET baseado em FLIM surgiu como uma ferramenta que fornece quantificação precisa e especificidade espacial para medições de transferência de energia entre duas moléculas com base em suas vidas de fluorescência8. FLIM mede o tempo em que um fluorohore permanece em estado animado antes de emitir um fóton e é melhor do que técnicas que usam medidas de intensidadesozinhas 9,10. Além de sistemas heterologos como nicotiana benthamiana e cascas epidérmicas de cebola, relatórios mais recentes demonstraram o uso de raízes arabidopsis e mudas de arroz jovens, etc., para análise in vivo de interações proteína-proteína em condições nativas11,12.

Além de um sistema de expressão adequado, a seleção de parceiros interajantes para ensaios BiFC e FRET também é crucial para o sucesso deste experimento. O PPI entre os parceiros utilizados na configuração biFC deve ser validado utilizando controles apropriados antes de seu uso como parceiro conjugado no experimento FRET13. O BiFC utiliza a complementação estrutural das partes terminais N e C da proteína fluorescente. Uma limitação comum na maioria, se não todas as proteínas fluorescentes utilizadas nos ensaios biFC tem sido o auto-montagem entre os dois fragmentos não fluorescentes derivados, contribuindo para a fluorescência falso-positiva e diminui a razão sinal-ruído (S/N)razão 14. Desenvolvimentos recentes, incluindo mutações pontuais ou posição de divisão da proteína fluorescente, deram origem a pares de BiFC com maior intensidade, maior especificidade, alta razão S/N15,16. Essas proteínas fluorescentes também podem ser usadas para a realização de BiFC, dependendo da adequação do experimento.

Tradicionalmente, CFP e YFP têm sido usados como o doador e o par de aceitadores em experimentos FRET17. No entanto, YFP ou m-Citrine foram encontrados como melhores doadores de FRET (quando usados com RFP como aceitador) devido ao alto rendimento quântico (QY) durante a expressão nativa de proteínas-alvo no sistema raiz arabidopsis. A seleção de promotores (constitutivo versus nativo/endógeno) e fluorógono também desempenham um papel crucial na concepção de um experimento bifc-fret-flim bem sucedido. É essencial notar que a eficiência dos doadores de FRET e a adequação dos pares FRET tendem a mudar com a mudança no promotor e no sistema biológico que está sendo utilizado para a expressão. O QY do fluoróforo, que se relaciona com seu brilho, depende do pH, temperatura e do sistema biológico em uso. Sugerimos que esses critérios sejam cuidadosamente considerados antes de escolher o par fluoróforo para o experimento FRET. O sistema biológico, os promotores e as proteínas utilizadas para este protocolo funcionaram bem com fluoroforos CFP-YFP para o experimento BiFC FRET-FLIM.

No presente estudo, incorporamos a característica da FLIM para visualizar a interação entre três moléculas de proteínas utilizando FRET baseada em BiFC. Nesta técnica, duas proteínas são marcadas com proteína YFP dividida e a terceira proteína com PCP. Como estávamos interessados em estudar a interação de um homodimer de proteína mads-box (M) com uma proteína sensor de cálcio (C), essas proteínas foram marcadas com proteínas fluorescentes nos vetores pSITE-1CA e pSITE-3CA18. Dois dos parceiros interativos, neste ensaio, foram marcados com partes terminais N e C do YFP nos vetores pSPYNE-35S e pSPYCE-35S19, e sua interação resulta na reconstituição do YFP funcional que atua como um aceitador de FRET para o terceiro parceiro interagente, que é marcado com CFP (atuando como doador de FRET) (Figura 1 ). Neste caso específico, o PPI entre dois monômeros M e entre M e C foi validado realizando BiFC em três sistemas diferentes, juntamente com o sistema levedura-dois-híbridos. Esses vetores foram mobilizados na cepa Agrobacterium tumifaciens GV3101 por eletroporação. A cepa GV3101 tem um pMP90 de Ti plasmídeo desarmado (pTiC58DT-DNA) com resistência à gentamicina20. Uma cepa p19 Agrobacterium foi adicionada juntamente com todas as infiltrações para evitar o silenciamento transgene21. Recomendamos que as três proteínas também sejam usadas em conformações opostas para validar as interações tripartites.

Nesta técnica, utilizamos flim, onde primeiro, a vida fluorescência do doador (vida de doador nãonchado) é medida na ausência de um aceitor. Depois disso, sua vida útil é medida na presença do aceitador (extinto de vida do doador). Essa diferença na vida útil da fluorescência de doadores é usada para calcular a eficiência do FRET, que depende do número de fótons que apresentam uma redução na vida útil da fluorescência. Mencionado abaixo é um protocolo detalhado para determinar a formação de um complexo ternário entre quaisquer três proteínas expressando transitoriamente as proteínas fluorescentes marcadas em Nicotiana benthamiana e avaliando sua interação pelo BiFC-FRET-FLIM.

Protocol

1. Clonagem de genes em vetores de entrada e destino (Figura2) Amplie a sequência de codificação (CDS) dos genes de interesse (genes M e C em nosso caso) por PCR e clone-os em vetores de entrada apropriados (por exemplo, vetor pENTR/D-TOPO; ver Tabela 1 para vetores usados neste experimento). Cresça os clones em placas contendo antibióticos. Validar clones selecionados nos antibióticos por restrição de di…

Representative Results

Este protocolo representa um método otimizado para estudar interações proteína-proteína in vivo tripartite nas plantas. O princípio básico do protocolo é combinar duas técnicas de interação proteica marcadas por fluorescência, ou seja, BiFC e FRET, para criar um ensaio para medir a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos. Aqui, utilizamos a FLIM para medir a vida fluorescência do parceiro doador DA FRET na presença e ausência do aceitador da FRET. Esperava-se uma redução…

Discussion

O presente protocolo demonstra o uso de ensaios FRET-FLIM baseados em BiFC para verificar a formação de um complexo ternário entre dois monômeros de uma proteína de caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio. O protocolo é adaptado a partir de um relatório de Y. John Shyu et al. onde eles desenvolveram um método FRET baseado em BiFC para visualizar complexo ternário formado entre heterodimers Fos-Jun e NFAT ou p65 usando o método de emissão sensibilizado7. Anteriormente, um sistema…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NB, GG, SB, KC agradecem sinceramente à Comissão de Subsídios Universitários (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE e Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR) por suas bolsas de pesquisa. Agradecemos, felizmente, o Departamento de Biotecnologia (DBT), o Governo da Índia, o Departamento de Ciência e Tecnologia (DST-FIST), o Governo da Índia pelo apoio financeiro.

Materials

1 ml Syringes without needles Dispovan  -
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
Gateway  LR Clonase II Enzyme mix Thermo Fischer Scientific 11791020 The vectors used in the study are Gateway based
Gentamycin Sulphate Himedia CMS461
Kanamycin Sulphate Himedia MB105
MES hydrate Sigma-Aldrich M2933
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Thermo Fischer Scientific K240020 The vectors used in the study are Gateway based
Phusion high fidelity Taq DNA polymerase Thermo Fischer Scientific F530-S Any High fidelity Polymerase can work
Rifampicin Himedia CMS1889
SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope Leica SP8 FALCON Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Himedia TC034

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Cite This Article
Boora, N., Verma, V., Khurana, R., Gawande, G., Bhimrajka, S., Chaprana, K., Kapoor, M., Kapoor, S. Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay. J. Vis. Exp. (178), e62791, doi:10.3791/62791 (2021).

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