Summary
Aqui apresentamos, um método para visualizar a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos usando proteínas com marca fluorescente pelo ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC. Este método é valioso para estudar complexos de interação proteína-proteína in vivo.
Abstract
As interações proteína-proteína são parte integrante de todos os processos biológicos das células, pois desempenham um papel crucial na regulação, manutenção e alteração das funções celulares. Essas interações estão envolvidas em uma ampla gama de fenômenos, como transdução de sinais, resposta de patógenos, interações célula-células, processos metabólicos e de desenvolvimento. No caso dos fatores de transcrição, essas interações podem levar à oligomerização de subunidades, sequestre em contextos subcelulares específicos como o núcleo, citoplasma, etc., que, por sua vez, podem ter um efeito mais profundo na expressão dos genes a jusante. Aqui, demonstramos uma metodologia para visualizar a interação tripartite in vivo usando a Complementação de Fluorescência Bimolecular (BiFC) baseada em Förster Resonance Energy Transfer (FRET) envolvendo Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Duas das proteínas selecionadas para esta demonstração interagem como parceiros do BiFC, e sua atividade de fluorescência reconstituída é usada para avaliar o FRET-FLIM com o terceiro parceiro. As plantas nicotiana benthamiana, cultivadas em quatro a cinco semanas, foram usadas como o sistema de plantas modelo para esta demonstração.
Introduction
As interações proteína-proteína (PPIs) formam a base do bom funcionamento das células eucarióticas regulando vários processos metabólicos e de desenvolvimento. Alguns PPIs são estáveis, enquanto outros são transitórios na natureza. As interações podem ser categorizadas com base no número e tipo de membros na interação, como dimeric, trimeric, tetramérrico homomédico e heteromérico1. A identificação e caracterização das interações proteicas pode levar a uma melhor compreensão das funções proteicas e das redes regulatórias.
Os fatores de transcrição são proteínas que estão envolvidas em funções regulatórias. Eles regulam a taxa de transcrição de seus genes a jusante ligando-se ao DNA. Às vezes, a oligomerização ou formação de complexos de alta ordem por proteínas é um pré-requisito para a realização de suas funções2. Os fatores de transcrição da caixa MADS são genes homeóticos que regulam vários processos como transição floral, desenvolvimento de órgãos florais, fertilização, desenvolvimento de sementes, senescência e desenvolvimento vegetativo. Eles são conhecidos por formar complexos de alta ordem que se ligam ao DNA3,4. Estudar as redes de PPI entre fatores de transcrição e seus interagirres fornece insights sobre a complexidade subjacente à regulação transcricional.
A expressão proteica transitória em Nicotiana benthamiana tem sido uma abordagem popular para estudar a localização de proteínas ou interações proteína-proteína in vivo5. BiFC e FRET são métodos para estudar interações proteína-proteína in vivo usando sistemas de repórteres fluorescentes6. Uma combinação dessas duas técnicas tem sido demonstrada para revelar a interação entre três proteínas7. O FRET é medido usando a técnica de fotobleaching aceitador, emissão sensibilizada e Fluorescência Lifetime Imaging (FLIM). O ensaio FRET baseado em FLIM surgiu como uma ferramenta que fornece quantificação precisa e especificidade espacial para medições de transferência de energia entre duas moléculas com base em suas vidas de fluorescência8. FLIM mede o tempo em que um fluorohore permanece em estado animado antes de emitir um fóton e é melhor do que técnicas que usam medidas de intensidadesozinhas 9,10. Além de sistemas heterologos como nicotiana benthamiana e cascas epidérmicas de cebola, relatórios mais recentes demonstraram o uso de raízes arabidopsis e mudas de arroz jovens, etc., para análise in vivo de interações proteína-proteína em condições nativas11,12.
Além de um sistema de expressão adequado, a seleção de parceiros interajantes para ensaios BiFC e FRET também é crucial para o sucesso deste experimento. O PPI entre os parceiros utilizados na configuração biFC deve ser validado utilizando controles apropriados antes de seu uso como parceiro conjugado no experimento FRET13. O BiFC utiliza a complementação estrutural das partes terminais N e C da proteína fluorescente. Uma limitação comum na maioria, se não todas as proteínas fluorescentes utilizadas nos ensaios biFC tem sido o auto-montagem entre os dois fragmentos não fluorescentes derivados, contribuindo para a fluorescência falso-positiva e diminui a razão sinal-ruído (S/N)razão 14. Desenvolvimentos recentes, incluindo mutações pontuais ou posição de divisão da proteína fluorescente, deram origem a pares de BiFC com maior intensidade, maior especificidade, alta razão S/N15,16. Essas proteínas fluorescentes também podem ser usadas para a realização de BiFC, dependendo da adequação do experimento.
Tradicionalmente, CFP e YFP têm sido usados como o doador e o par de aceitadores em experimentos FRET17. No entanto, YFP ou m-Citrine foram encontrados como melhores doadores de FRET (quando usados com RFP como aceitador) devido ao alto rendimento quântico (QY) durante a expressão nativa de proteínas-alvo no sistema raiz arabidopsis. A seleção de promotores (constitutivo versus nativo/endógeno) e fluorógono também desempenham um papel crucial na concepção de um experimento bifc-fret-flim bem sucedido. É essencial notar que a eficiência dos doadores de FRET e a adequação dos pares FRET tendem a mudar com a mudança no promotor e no sistema biológico que está sendo utilizado para a expressão. O QY do fluoróforo, que se relaciona com seu brilho, depende do pH, temperatura e do sistema biológico em uso. Sugerimos que esses critérios sejam cuidadosamente considerados antes de escolher o par fluoróforo para o experimento FRET. O sistema biológico, os promotores e as proteínas utilizadas para este protocolo funcionaram bem com fluoroforos CFP-YFP para o experimento BiFC FRET-FLIM.
No presente estudo, incorporamos a característica da FLIM para visualizar a interação entre três moléculas de proteínas utilizando FRET baseada em BiFC. Nesta técnica, duas proteínas são marcadas com proteína YFP dividida e a terceira proteína com PCP. Como estávamos interessados em estudar a interação de um homodimer de proteína mads-box (M) com uma proteína sensor de cálcio (C), essas proteínas foram marcadas com proteínas fluorescentes nos vetores pSITE-1CA e pSITE-3CA18. Dois dos parceiros interativos, neste ensaio, foram marcados com partes terminais N e C do YFP nos vetores pSPYNE-35S e pSPYCE-35S19, e sua interação resulta na reconstituição do YFP funcional que atua como um aceitador de FRET para o terceiro parceiro interagente, que é marcado com CFP (atuando como doador de FRET) (Figura 1 ). Neste caso específico, o PPI entre dois monômeros M e entre M e C foi validado realizando BiFC em três sistemas diferentes, juntamente com o sistema levedura-dois-híbridos. Esses vetores foram mobilizados na cepa Agrobacterium tumifaciens GV3101 por eletroporação. A cepa GV3101 tem um pMP90 de Ti plasmídeo desarmado (pTiC58DT-DNA) com resistência à gentamicina20. Uma cepa p19 Agrobacterium foi adicionada juntamente com todas as infiltrações para evitar o silenciamento transgene21. Recomendamos que as três proteínas também sejam usadas em conformações opostas para validar as interações tripartites.
Nesta técnica, utilizamos flim, onde primeiro, a vida fluorescência do doador (vida de doador nãonchado) é medida na ausência de um aceitor. Depois disso, sua vida útil é medida na presença do aceitador (extinto de vida do doador). Essa diferença na vida útil da fluorescência de doadores é usada para calcular a eficiência do FRET, que depende do número de fótons que apresentam uma redução na vida útil da fluorescência. Mencionado abaixo é um protocolo detalhado para determinar a formação de um complexo ternário entre quaisquer três proteínas expressando transitoriamente as proteínas fluorescentes marcadas em Nicotiana benthamiana e avaliando sua interação pelo BiFC-FRET-FLIM.
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Protocol
1. Clonagem de genes em vetores de entrada e destino (Figura2)
- Amplie a sequência de codificação (CDS) dos genes de interesse (genes M e C em nosso caso) por PCR e clone-os em vetores de entrada apropriados (por exemplo, vetor pENTR/D-TOPO; ver Tabela 1 para vetores usados neste experimento).
- Cresça os clones em placas contendo antibióticos. Validar clones selecionados nos antibióticos por restrição de digestão e sequenciamento de DNA22,23.
- Mobilize os CDS reconstituídos dos clones de entrada para os vetores de destino (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA e pSITE-3CA) e confirme a transferência de sequências da entrada para os vetores de destino por restrição de digestão enzimada.
NOTA: Todos os vetores utilizados neste experimento estão listados na Tabela 1. - Por fim, transforme as células Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR))com os vetores de destino por eletroporação(Figura 3)24.
2. Condições de crescimento para as plantas nicotiana benthamiana
NOTA: Cultivar plantas de Nicotiana até 4-6 estágio de folha em condições de controle.
- Para cultivar as plantas de Nicotiana, prepare a mistura do solo misturando misturas de solo comercialmente disponíveis com cocopeat e adubo em uma proporção de 2:1:1.
- Espalhe uma camada de 1 polegada de espessura desta mistura de solo em uma bandeja de plástico para fazer o leito do solo e satura-lo com água deionizada. Polvilhe cerca de 200 sementes neste leito de solo.
- Transfira para uma bandeja maior contendo 1 cm de água parada. Cubra esta bandeja com plástico para criar uma câmara de umidade.
- Transfira esta configuração para uma câmara de crescimento fixada em 23 °C com luz de 16 h e ciclo escuro de 8h com intensidade de luz de 150-170 μmol/m2.
- Após duas semanas, transfira mudas jovens para pequenos potes de 3-4 polegadas contendo mistura de solo saturada de água.
- Coloque esses potes em bandejas de plástico e transfira-os para a câmara de crescimento por mais quatro semanas.
3. Prepare cepas bacterianas para a agro-infiltração
NOTA: Para a agro-infiltração, as cepas bacterianas precisam ser recém-subculturadas e misturadas juntamente com a cepa p19 de Agrobacterium em razões apropriadas.
- Prepare placas de ágar 2xYT contendo rifampicina (100 μg/mL), gentamicina (25 μg/mL) e kanamicina (50 μg/mL) para agrobacterium abrigando pSPYNE-35S e vetor pSPYCE-35S. Para o vetor pSITE contendo cepa, use rifampicina (100 μg/mL), gentamicina (25 μg/mL) e espectinomicina (50 μg/mL).
- Listrar as cepas de Agrobacterium contendo os plasmídeos nestas placas usando laços de inoculação estéreis em uma capa de fluxo laminar.
- Incubar-os a 28 °C por 48 h no escuro.
- Inicie este procedimento inoculando a cepa Agrobacterium GV3101 que abriga construções BiFC e FRET (preparada em pSPYNE-35S, pSPYCE-35S e vetores pSITE) de placas listradas em 10 mL de caldo 2xYT contendo antibióticos apropriados (Rifampicina (100 μg/mL), gentamicina (25 μg/mL), kanamycin (50 μg/mL) ou espectinomicina (50 μg/mL)).
- Além disso, inicie uma cultura de cepa p19 de Agrobacteria inoculando 10 mL de caldo 2xYT contendo rifampicina (100 μg/mL) e kanamycina (50 μg/mL).
NOTA: a cepa p19 é adicionada para evitar o silenciamento transgênico. - Cubra o frasco com uma folha de alumínio e mantenha-os no agitador da incubadora a 28 °C e 170 rpm por 16 h no escuro.
- Após o crescimento da noite para o dia, transfira 1 mL desta cultura para um cuvette descartável para medir a densidade óptica (O.D.) das culturas a 600 nm usando um espectrômetro.
- Misture as culturas do parceiro BiFC e FRET apropriados contendo cepas para que a O.D. final de cada cultura seja 0,5 e a de p19 seja de 0,3 em um volume total de 2 mL.
- Para alcançar essas proporções, use a fórmula mencionada abaixo:
ODobtido = O.D. da cultura medida em 600 nm
Cultura V = Volume da cultura necessária
Final deOD = 0,5 para construções e 0,3 para p19
Vfinal = Volume final para a infiltração, que é de 2 mL
NOTA: As combinações de construção utilizadas neste estudo estão especificadas na Tabela 2. - Centrifugar as culturas de Agrobacterium mistas a 3.000 x g por 5 min à temperatura ambiente e descartar cuidadosamente o sobrenante. Resuspenque a pelota em 2 mL de tampão de infiltração recém-preparado (10 mM MES, 100 μM de Acetosyringona e 10 mM MgCl2). Use um misturador de vórtice para fazer uma suspensão celular homogênea.
- Incubar os tubos contendo células resuspended no escuro à temperatura ambiente por 3 h.
- Enquanto isso, rotule cada vaso de planta com a mistura de construção com a que ele vai ser infiltrado. Use duas plantas para cada mistura de infiltração.
- Encha uma seringa sem agulha de 1 mL com a mistura agrobacteriana. Pressione suavemente, mas firmemente, a seringa no lado abaxial da folha totalmente expandida enquanto apoia a folha do outro lado. Empurre suavemente o êmbolo até que as soluções se encham na área da folha equivalente a 2-3 vezes a ponta da seringa.
- Infiltrar-se em até quatro pontos em uma folha e 3-4 folhas por planta, como mostrado na Figura 4.
NOTA: Troque luvas ou limpe luvas com 70% de álcool entre as amostras para evitar contaminação cruzada. - Transfira todos os potes para uma bandeja e incubar em uma câmara de crescimento nas mesmas condições mencionadas na etapa 2.
- Verifique uma pequena parte da folha agroinfiltilhada em diferentes pontos de tempo usando um microscópio de fluorescência. Quando a fluorescência de YFP e CFP forem detectáveis em células, proceda ao microscópio confocal para o ensaio BiFC-FRET FLIM. Neste experimento, a análise foi realizada 3 dias após a agroindústria.
NOTA: Defina o período pós-agroinfiltração de incubação individualmente para cada promotor e combinação genética para evitar a superexpressão de proteínas quimricas utilizadas no ensaio BiFC-FRET FLIM. A superexpressão das proteínas parceiras pode levar a interações falso-positivas.
4. Prepare slides para visualização de fluorescência
- Quando as plantas estiverem prontas para visualização, corte amostras de folhas quadradas, 5-8 mm de distância da ferida de infiltração, e monte-as em água destilada em lâminas limpas.
NOTA: Para minimizar a fluorescência de fundo, limpe os slides com 80% de etanol seguido de água destilada 3-4 vezes, o ar seque-os e mantenha-os em uma folha absorvente. - Cubra a amostra da folha com uma mancha de cobertura limpa e vedação usando um esmalte de unha.
- Visualize essas amostras sob um microscópio de varredura a laser confocal.
5. Análise FRET-FLIM usando um microscópio de varredura a laser confocal
NOTA: Neste procedimento, a base de determinação e quantificação da interação entre duas proteínas é a redução da vida fluorescência do parceiro do doador de FRET após sua interação com o aceitador, que é usado para calcular a eficiência do FRET. A complexidade no caso da interação tripartite aumenta ainda mais porque o fret-acceptor, neste caso, não é uma única molécula, mas um par YFP-BiFC dividido, que deve primeiro ser reconstituído in vivo para se tornar um fluoróforo funcional que aceita FRET. Para realizar o FRET-FLIM, é preciso determinar a fluorescência da molécula do doador sozinho e, em seguida, na presença de um parceiro FRET.
- Abra o aplicativo FLIM no microscópio de varredura a laser confocal, inicie o console e use a contagem de fótons de reconhecimento de padrões para medir a vida útil da fluorescência. Selecione o modo de medição padrão 'Toda contagem de fótons'.
- Analisar amostras de dois tipos de plantas agroinduinadas: uma apenas com o doador (C-CFP) e outra com o doador e o aceitador (C-CFP, juntamente com M-YFP) ambas.
NOTA: Como a interação da proteína M já foi validada com a proteína C usando BiFC e Y2H, espera-se boa eficiência de FRET com este par de interação. - Em seguida, escaneie a folha agroindutorizada C-CFP e foque em uma célula que mostra boa fluorescência de CFP. Inicie o modo de varredura a laser e ajuste o sistema para visualização de CFP e medições FLIM (λex 440 nm laser de pulso, λem 480-520 nm por detectores híbridos, velocidade de varredura 512 x 512 pixels a 400 Hz).
- Ajuste o foco, o zoom e o ganho inteligente para focar na área que precisa ser capturada.
- Ilumine a amostra com potência laser suficiente para alcançar a captura de aproximadamente 0,1 fótons por pulso. Para amostras com intensidade variável de fluorescência, capture 50 quadros para coletar fótons adequados necessários para a medição vitalícia. O PCP exibe duas vidas de fluorescência devido à sua adaptação conformacional; portanto, encaixe os dados usando o modelo de reconvolução n-exponencial, mantendo o valor de n igual a 2.
- Nessas configurações, o PCP mostra duas vidas de 1,0 e 3,2 ns. Aqui o maior, 3,2 ns, a vida útil é utilizada para todos os cálculos subsequentes25,26.
- Para calcular a eficiência do FRET utilizando flim, que é a medida do grau de interação entre duas proteínas, pegue uma amostra de folha que foi co-infiltrada com C-CFP e M-YFP. Procure por uma célula que expresse tanto C-CFP quanto M-YFP e confirme seus respectivos padrões de emissão, excitando-os usando λex 440 nm laser de pulso, λem 480-520 nm e λex 514 nm laser de luz branca com λem 526-550 nm. Digitalizar e identificar sequencialmente uma célula que mostra fluorescência CFP e YFP.
- Depois de confirmar a fluorescência de ambas as proteínas, mude para o console FLIM para medir a vida útil do CFP usando as mesmas configurações que usamos anteriormente para medir a vida útil do C-CFP (etapa 5.5).
NOTA: Esta célula também está expressando M-YFP que pode potencialmente interagir com c-CFP e causar uma redução na vida útil do C-CFP. - Ajuste o gráfico obtido utilizando o modelo de reconvolução n-exponencial, com n = 2. Observou-se redução da vida útil do PCP de 3,2 para 2,6 ns, indicando a transferência de energia de ressonância förster entre CFP eYFP (Figura 5A).
- Agora inicie o console FRET no software e calcule a eficiência do FRET inserindo manualmente a vida útil do doador não saciado na equação fornecida no software. E a eficiência observada do FRET é de: 56%.
- Interação tripartite
- Finalmente, para visualizar as interações entre três parceiros, pegue a amostra de folha de uma planta que foi co-infiltrada com C-CFP, M-YFPn e M-YFPc.
- Escaneie a explanta da folha para uma célula que mostra tanto a fluorescência YFP reconstituída emanando da interação biFC entre duas proteínas M. Use os mesmos comprimentos de onda de laser e emissão usados anteriormente.
- Posteriormente, desligue o laser de 514 nm e mova-se para o console FLIM.
NOTA: Se o dimer M-YFP interagir com o C-CFP, deve-se ver uma redução na vida útil do C-CFP, como observado durante sua interação com o M-YFP. No entanto, se o C-CFP não interagir com o dimer M-YFP, sua vida útil de fluorescência deve permanecer em 3,2 ns. - Utilizando configurações semelhantes às mencionadas acima, meça a vida útil do CFP na presença de YFP reconstituído. Ajuste o gráfico obtido usando o modelo de reconvolução n-exponencial, com n = 2, e mova-se para o console FRET.
NOTA: Há um declínio na vida útil do CFP de 3,2 para 2,3 ns. Calcule a eficiência do FRET conforme descrito acima. A eficiência calculada do FRET é de 55%. A redução da vida útil do doador e a boa eficiência de FRET de 55% confirma a interação tripartite entre duas proteínas M e a proteína C in vivo (ver Figura 5B).
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Representative Results
Este protocolo representa um método otimizado para estudar interações proteína-proteína in vivo tripartite nas plantas. O princípio básico do protocolo é combinar duas técnicas de interação proteica marcadas por fluorescência, ou seja, BiFC e FRET, para criar um ensaio para medir a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos. Aqui, utilizamos a FLIM para medir a vida fluorescência do parceiro doador DA FRET na presença e ausência do aceitador da FRET. Esperava-se uma redução na vida de fluorescência do doador se houvesse uma interação positiva entre as duas proteínas. Começamos com a medição da vida fluorescência do doador, ou seja, a proteína C-CFP. Usamos o modo de medição 'Todos os fótons' de contagem, que cria uma curva de decadência fluorescência com todos os fótons da região de interesse (ROI) e dá uma vida útil medida com um erro menor do que a contagem tradicional de fótons correlacionados pelo tempo. O filtro FLIM de alta velocidade garante o uso de eventos de fótons únicos entre os pulsos. Um modelo matemático adequado foi então escolhido para cálculos pixel a pixel e encaixe da curva de decaimento27.
A variante CFP utilizada aqui (e também é a mais utilizada) tem adaptação conformacional, o que resulta em duas vidas de fluorescência. Por isso, optamos por encaixar na curva de decadência da fluorescência usando um modelo para o doador multinênencial. Isso resulta na separação das duas vidas de CFP, que no nosso caso foram observadas como 1,0 ns e 3,3 ns. Para calcular a eficiência do FRET, utilizamos a maior vida útil do PCP, ou seja, 3,3 ns (vida média de fluorescência, n = 10).
No caso do controle positivo (C-CFP e M-YFP), observa-se uma redução na vida de fluorescência do doador (C-CFP) de 3,3 ns para 2,5 ns(Figura 6). E a eficiência do FRET usando a seguinte equação foi de 56%.
E = Eficiência fret
τD = Doador não cerrado Lifetime (amostra apenas de doador, C-CFP)
τ AvAmp = Tempo médio de decaimento - Amplitude ponderada média de vida
Um exercício semelhante com YFP reconstituído resultante da interação entre dois monômeros M e proteína C também resultou em uma interação positiva levando à redução da vida fluorescência do aceitador (C-CFP) para 2,6 ns. A eficiência calculada do FRET foi de cerca de 55% neste caso(Figura 6).
Se uma variante CFP ou qualquer outro fluorohore doador tiver uma única fluorescência por toda a vida, a curva de decomposição precisará de encaixe usando o modelo de doador mono-exponencial. Nesse caso, a eficiência do FRET pode ser calculada usando a fórmula:
τ é a vida fluorescência da amostra contendo apenas doador
τ a saciar é medida na presença do aceitador (enquanto o FRET está ocorrendo)
As leituras de vida da fluorescência bruta de pelo menos 10 células para cada configuração experimental foram colhidas como um gráfico de dispersão usando a ferramenta on-line PlotsOfData (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, Figura 6C)28. A redução da vida fluorescência do doador DE FRET fornece fortes evidências para uma interação tripartite entre essas três proteínas.
Figura 1: Representação esquemática do princípio do método BiFC e BiFC FRET-FLIM. A interação entre duas proteínas M resulta na reconstituição do YFP, e este par pode então agir como uma molécula aceitadora. A terceira proteína C-CFP atua como um doador de FRET aqui. Assim, um sinal fret positivo comprova a interação tripartite entre duas proteínas M e uma proteína C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Clonagem de genes M e C em vetores de destino final. As sequências de codificação dos genes são amplificadas e primeiramente clonadas no vetor pENTR/D-TOPO seguido pela mobilização das construções nos vetores de destino final pSITE-1CA, pSITE-3CA, pSPYNE-35S e pSPYCE-35S pela reação de recombinação LRase Clon II. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Usando eletroporação, as combinações de vetores desejadas são entregues na cepa GV3101 de tumefaciens agrobacterium. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ilustração diagramática da agro-infiltração de plantas nicotiana e as combinações de construção utilizadas para o experimento. (A) C-CFP contendo cultura agrobacteriana atua como amostra única de doador (B) C-CFP e M-YFP servem como controle de FRET positivo, (C) C-CFP e proteína M na conformação biFC; M-YFPn e M-YFPc são usados para estudar interação tripartite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Representação de vida fluorescência das amostras na ausência e presença do aceitador. (A) A vida útil do C-CFP na presença de M-YFP é reduzida para 2,67 ns, como mostrado pelo gráfico da barra. Da mesma forma (B) mostra a redução na vida útil do C-CFP para 2,3 ns em caso de interação tripartite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Interação tripartite entre dois monômeros M e uma proteína C analisada utilizando ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC. (A) Uma célula que mostra apenas CFP (i) ou CFP e YFP (ii e iii) emanando de proteínas doadoras e aceitadoras utilizando seus respectivos comprimentos de onda de excitação e emissão. (B) i, ii, iii representa imagem FLIM mostrando fluorescência ao longo da vida de CFP na célula. A barra de escala de cores representa a pseudo-cor correspondente à vida útil. Barra de escala = 50 μm. (C) Dispersão Enredo mostrando fluorescência ao longo da vida do PCP quando presente sozinho ou com os parceiros interagidores onde n = 10. O enredo é gerado utilizando a ferramenta online PlotsOfdata (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/); a vida útil da fluorescência média é representada como a linha entre os pontos amostrais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Experimento de controle negativo para validação da interação entre proteínas M e C por BiFC. A interação entre a forma mutante de M Protein (MΔCBD), que não tem todas as regiões de ligação de proteína C, e a fusão C protein-YFPc é tentada para servir como um controle negativo para a análise de BiFC. Os painéis superiores mostram expressão transitória de MΔCBD-GFP em células de casca de cebola, e os resultados da tentativa de interação entre MΔCBD-YFPn e C-YFPc são mostrados nos painéis inferiores. A ausência de fluorescência da YFP reconstituída é um indicativo da falta de interação entre mδcbd e proteína C. N, núcleo; C, citoplasma; BF, campo brilhante; FL, fluorescência; OL, sobreposição digital, a região citoplasmática é mostrada usando setas brancas. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para baixar este Arquivo.
| S.No. | Vetor | Seleção de antibióticos |
| Vetor de entrada | ||
| 1 | pENTR/D-TOPO | Canamicina |
| Vetores de Destino | ||
| 2 | pSPYNE-35S | Canamicina |
| 3 | pSPYCE-35S | Canamicina |
| 4 | pSITE-1CA | Espectomicina |
| 5 | pSITE-3CA | Espectomicina |
Tabela 1: Vetores utilizados no estudo.
| S.No. | Interação | Combinação de construções |
| 1 | Interação tripartite | C-CFP + M-YFPn:M-YFPc + p19 |
| 2 | Controle positivo | C-CFP + M-YFP + p19 |
| 3 | Controle Negativo | C-CFP + Empty-YFP + p19 |
| Opcional (conformações opostas) | ||
| 4 | Interação tripartite | M-CFP + M-YFPn:C-YFPc + p19 |
| 5 | Controle positivo | M-CFP + C-YFP + p19 |
| 6 | Controle Negativo 1 | M-CFP + Empty-YFP + p19 |
| 7 | Controle Negativo 2 | Vazio -CFP + C-YFP + p19 |
| 8 | Controle Negativo 3 | Vazio -CFP + M-YFP + p19 |
Tabela 2: Construa combinações utilizadas no estudo.
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Discussion
O presente protocolo demonstra o uso de ensaios FRET-FLIM baseados em BiFC para verificar a formação de um complexo ternário entre dois monômeros de uma proteína de caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio. O protocolo é adaptado a partir de um relatório de Y. John Shyu et al. onde eles desenvolveram um método FRET baseado em BiFC para visualizar complexo ternário formado entre heterodimers Fos-Jun e NFAT ou p65 usando o método de emissão sensibilizado7. Anteriormente, um sistema FRET de três fluorforo foi desenvolvido pela Galperin e colegas de trabalho no ano de 200429,mas requer seis filtros contendo uma configuração sofisticada do microscópio. Além disso, o rápido movimento de organelas, como endossomos, durante a aquisição de imagens impôs dificuldades experimentais. Por outro lado, o FRET-FLIM baseado em BiFC usa filtros para apenas dois fluoroforos e tem uma configuração simplificada de microscópio. Esta configuração permite a visualização direta do complexo ternário, ao contrário do sistema 3-FRET. Isso também tem uma vantagem sobre o sistema BiFC-FRET em ser mais robusto e quantitativo do que as medidas de FRET envolvendo emissão sensibilizada7. Neste ensaio, as vidas de fluorescência de fótons individuais são medidas para calcular a eficiência do FRET, em vez de mudanças globais nas intensidades relativas de fluorescência das moléculas doadoras e aceitadoras. Outra vantagem do método baseado em FLIM sobre o método BiFC-FRET é que apenas a vida útil do doador deve ser medida; as qualidades da emissão de fluorescência do aceitador não afetam o resultado das medidas do FRET. As vantagens e a simplicidade deste método tornam o FRET-FLIM baseado em BiFC um método mais fácil, mais simples e quantitativo para estudar interações tripartites. No entanto, é preciso ter acesso a uma configuração confocal com lasers de pulso, detectores rápidos capazes de contagem de fótons únicos e um software compatível.
Para o sucesso deste experimento, é importante que a interação entre os dois parceiros proteicos utilizados na conformação do BiFC seja validada usando múltiplos métodos e controles apropriados antes de usá-los como aceitador de FRET. É aconselhável usar controles negativos, como uma forma mutante de parceiro de interação ou uma proteína de colocação não relacionada como parceiro de interação negativa16. Os controles negativos para validação das interações biFC entre proteínas M e C utilizadas neste protocolo incluíram mutações no domínio de ligação putativa dessas proteínas, que aboliram completamente o sinal BiFC (Figura Suplementar 1). Além disso, essa interação também foi validada pelos métodos Y2H e FRET em diferentes sistemas.
Além disso, recomenda-se a otimização temporal da expressão de proteínas em Nicotiana para que os efeitos adversos da superexpressão de proteínas, que podem levar a resultados falso-positivos, possam ser minimizados. Também é necessário incluir a cepa p19 junto com as cepas agrobacterianas contendo construções para evitar o silenciamento genético pós-transcricional. p19 é um supressor de silenciamento genético do vírus do dublê de tomate e aumenta a eficiência de transformação em até 90%30. Recentemente, foram desenvolvidas versões melhores dos fluoroforos, ou seja, m-turquesa-SYFP2, SYFP2-mRFP e SCFP3a-SYFP2. Estes podem ser usados como pares FRET, dependendo de sua adequação ao sistema de destino e ao tipo de célula11. As medições FRET-FLIM devem ser realizadas em um mínimo de dez células para obter dados estatisticamente significativos. Sempre que possível, a adição de um maior número de amostras nas medições melhorará ainda mais a qualidade e a confiabilidade dos dados. Dependendo do fluoróforo doador, deve ser escolhido o modelo matemático para encaixar os dados com a curva de decaimento da fluorescência ao longo da vida.
O protocolo descrito aqui é uma ferramenta poderosa para determinar as interações tripartites em células vivas. Ajuda a determinar a localização intracelular do complexo de interação, o que é importante para decifrar a função e o significado fisiológico de qualquer complexo proteico. Também pode resolver as concentrações relativas do parceiro interagindo com base nos dados FRET-FLIM, que não podem ser elucidadas apenas pelos métodos de medição de intensidade10. Conclusivamente, o ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC oferece uma oportunidade de estudar e caracterizar aspectos importantes das interações proteicas tripartites, que podem ser utilizados tanto em sistemas animais quanto vegetais.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
NB, GG, SB, KC agradecem sinceramente à Comissão de Subsídios Universitários (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE e Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR) por suas bolsas de pesquisa. Agradecemos, felizmente, o Departamento de Biotecnologia (DBT), o Governo da Índia, o Departamento de Ciência e Tecnologia (DST-FIST), o Governo da Índia pelo apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
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