Summary
Hier presenteren we een methode om de vorming van ternaire complexen tussen drie eiwitpartners te visualiseren met behulp van fluorescerende gelabelde eiwitten door biFC-gebaseerde FRET-FLIM-assay. Deze methode is waardevol voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteractiecomplexen in vivo.
Abstract
Eiwit-eiwit interacties zijn een integraal onderdeel van alle biologische processen in de cellen, omdat ze een cruciale rol spelen bij het reguleren, onderhouden en wijzigen van cellulaire functies. Deze interacties zijn betrokken bij een breed scala aan verschijnselen zoals signaaltransductie, pathogene respons, cel-cel interacties, metabole en ontwikkelingsprocessen. In het geval van transcriptiefactoren kunnen deze interacties leiden tot oligomerisatie van subeenheden, sekwestering in specifieke subcellulaire contexten zoals de kern, cytoplasma, enz., Wat op zijn beurt een diepgaander effect kan hebben op de expressie van de stroomafwaartse genen. Hier demonstreren we een methodologie om in vivo tripartite interactie te visualiseren met behulp van Bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC) op basis van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) met fluorescentie lifetime imaging (FLIM). Twee van de eiwitten die voor deze demonstratie zijn geselecteerd, interageren als BiFC-partners en hun gereconstitueerde fluorescentieactiviteit wordt gebruikt om FRET-FLIM te testen met de derde partner. Vier tot vijf weken oude groeikamergekweekte Nicotiana benthamiana-planten zijn gebruikt als modelplantensysteem voor deze demonstratie.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties (PPI's) vormen de basis van de goede werking van de eukaryote cellen door het reguleren van verschillende metabole en ontwikkelingsprocessen. Sommige PPI's zijn stabiel, terwijl andere van voorbijgaande aard zijn. De interacties kunnen worden gecategoriseerd op basis van het aantal en type leden in de interactie, zoals dimerisch, trimerisch, tetrameer homomerisch en heteromeer1. De identificatie en karakterisering van eiwitinteracties kan leiden tot een beter begrip van eiwitfuncties en regulerende netwerken.
Transcriptiefactoren zijn eiwitten die betrokken zijn bij regulerende functies. Ze reguleren de snelheid van transcriptie van hun stroomafwaartse genen door zich aan het DNA te binden. Soms is oligomerisatie of vorming van hogere-orde complexen door eiwitten een voorwaarde voor het uitvoeren van hun functies2. Plant MADS-box transcriptiefactoren zijn homeotische genen die verschillende processen reguleren, zoals bloemovergang, ontwikkeling van bloemorganen, bevruchting, zaadontwikkeling, senescentie en vegetatieve ontwikkeling. Het is bekend dat ze complexen van hogere orde vormen die binden aan het DNA3,4. Het bestuderen van PPI-netwerken tussen transcriptiefactoren en hun interactoren biedt inzicht in de complexiteit die ten grondslag ligt aan transcriptionele regulatie.
Voorbijgaande eiwitexpressie in Nicotiana benthamiana is een populaire benadering geweest om eiwitlokalisatie of eiwit-eiwitinteracties in vivotebestuderen 5. BiFC en FRET zijn methoden voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in vivo met behulp van fluorescerende reporter systemen6. Van een combinatie van deze twee technieken is aangetoond dat ze de interactie tussen drie eiwitten onthullen7. FRET wordt gemeten met behulp van acceptor photobleaching, sensitized emission en Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) techniek. FLIM-gebaseerde FRET-assay is naar voren gekomen als een hulpmiddel dat nauwkeurige kwantificering en spatiotemporale specificiteit biedt voor energieoverdrachtmetingen tussen twee moleculen op basis van hun fluorescentielevensduur8. FLIM meet de tijd dat een fluorofoor in een aangeslagen toestand blijft voordat een foton wordt uitgezonden en is beter dan technieken die alleen intensiteitsmetingen gebruiken9,10. Naast heterologe systemen zoals Nicotiana benthamiana en uienepidermale schillen, hebben recentere rapporten het gebruik van Arabidopsis-wortels en jonge rijstzaailingen, enz., Aangetoond voor in vivo analyse van eiwit-eiwitinteracties onder inheemse omstandigheden11,12.
Naast een geschikt expressiesysteem is ook de selectie van interacterende partners voor BiFC- en FRET-assays cruciaal voor het succes van dit experiment. De PPI onder partners die in biFC-configuratie worden gebruikt, moet worden gevalideerd met behulp van passende controles voordat ze als geconjugeerde partner in het FRET-experiment worden gebruikt13. BiFC maakt gebruik van de structurele complementatie van N- en C-terminale delen van het fluorescerende eiwit. Een veel voorkomende beperking in de meeste, zo niet alle fluorescerende eiwitten die in BiFC-assays worden gebruikt, is de zelfassemblage tussen de twee afgeleide niet-fluorescerende fragmenten, die bijdragen aan vals-positieve fluorescentie en de signaal-ruisverhouding (S / N) verminderen14. Recente ontwikkelingen, waaronder puntmutaties of positie van het splitsen van het fluorescerende eiwit, hebben geleid tot BiFC-paren met verhoogde intensiteit, hogere specificiteit, hoge S / N-verhouding15,16. Deze fluorescerende eiwitten kunnen ook worden gebruikt voor het uitvoeren van BiFC, afhankelijk van de geschiktheid van het experiment.
Traditioneel worden CFP en YFP gebruikt als donor- en acceptorpaar in FRET-experimenten17. YFP of m-Citrien bleken echter betere FRET-donoren te zijn (bij gebruik met RFP als acceptor) vanwege de hoge kwantumopbrengst (QY) tijdens de inheemse expressie van doeleiwitten in het Arabidopsis-wortelstelsel. De selectie van promotors (constitutief versus inheems/endogene) en fluorofoor spelen ook een cruciale rol bij het ontwerpen van een succesvol BiFC-FRET-FLIM-experiment. Het is essentieel om op te merken dat de efficiëntie van FRET-donoren en de geschiktheid van FRET-paren de neiging hebben om te veranderen met de verandering in de promotor en het biologische systeem dat wordt gebruikt voor expressie. De QY van de fluorofoor, die betrekking heeft op de helderheid, hangt af van de pH, temperatuur en het biologische systeem dat in gebruik is. We stellen voor dat deze criteria grondig worden overwogen voordat het fluorofoorpaar voor het FRET-experiment wordt gekozen. Het biologische systeem, promotors en de eiwitten die voor dit protocol werden gebruikt, werkten goed samen met CFP-YFP fluoroforen voor het BiFC FRET-FLIM-experiment.
In de huidige studie nemen we het kenmerk van FLIM op om de interactie tussen drie eiwitmoleculen te visualiseren met behulp van biFC-gebaseerde FRET. Bij deze techniek worden twee eiwitten gelabeld met gesplitst YFP-eiwit en het derde eiwit met CFP. Omdat we geïnteresseerd waren in het bestuderen van de interactie van een MADS-box eiwit (M) homodimeer met een Calcium sensor eiwit (C), werden deze eiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten in pSITE-1CA en pSITE-3CA vectoren18. Twee van de interacterende partners, in deze test, werden getagd met N- en C-terminale delen van de YFP in pSPYNE-35S en pSPYCE-35S vectoren19, en hun interactie resulteert in de reconstitutie van de functionele YFP die fungeert als een FRET-acceptor voor de derde interagerende partner, die is getagd met CFP (optredend als FRET-donor) (Figuur 1 ). In dit specifieke geval is de PPI tussen twee M-monomeren en tussen M en C gevalideerd door BiFC in drie verschillende systemen uit te voeren, samen met het gist-twee-hybride systeem. Deze vectoren werden gemobiliseerd in Agrobacterium tumifaciens GV3101 stam door elektroporatie. De GV3101 stam heeft een ontwapend Ti plasmide pMP90 (pTiC58DT-DNA) met gentamicineresistentie20. Een p19 Agrobacterium stam werd toegevoegd samen met alle infiltraties om transgene silencing te voorkomen21. We raden aan dat de drie eiwitten ook in tegengestelde conformaties worden gebruikt om de tripartiete interacties te valideren.
In deze techniek hebben we FLIM gebruikt, waarbij eerst de fluorescentielevensduur van de donor (niet-uitgebloogde donorlevensduur) wordt gemeten in afwezigheid van een acceptor. Daarna wordt de levensduur gemeten in aanwezigheid van de acceptor (gebluste donorlevensduur). Dit verschil in donorfluorescentielevensduur wordt gebruikt om de FRET-efficiëntie te berekenen, die afhankelijk is van het aantal fotonen dat een vermindering van de fluorescentielevensduur vertoont. Hieronder wordt een gedetailleerd protocol genoemd om de vorming van een ternair complex tussen drie eiwitten te bepalen door de fluorescerend gelabelde eiwitten in Nicotiana benthamiana tijdelijk tot expressie te brengen en hun interactie te testen door BiFC-FRET-FLIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonen van genen in entry- en bestemmingsvectoren (Figuur 2)
- Amplify de coderende sequentie (CDS) van de genen van belang (M- en C-genen in ons geval) door PCR en kloon ze in geschikte entryvectoren (bijv. pENTR / D-TOPO-vector; zie tabel 1 voor vectoren die in dit experiment zijn gebruikt).
- Kweek de klonen op platen met antibiotica. Valideer klonen die zijn geselecteerd op de antibiotica door beperking van de spijsvertering en DNA-sequencing22,23.
- Mobiliseer de gereconstitueerde CDS'en van invoerklonen naar de doelvectoren (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA en pSITE-3CA) en bevestig de overdracht van sequenties van de ingang naar de doelvectoren door restrictie-enzymvertering.
OPMERKING: Alle vectoren die in dit experiment worden gebruikt, zijn vermeld in tabel 1. - Transformeer ten slotte Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR)) cellen met de bestemmingsvectoren door elektroporatie (Figuur 3)24.
2. Groeicondities voor Nicotiana benthamiana planten
OPMERKING: Kweek Nicotiana planten tot 4-6 bladstadium in controleomstandigheden.
- Om Nicotiana-planten te kweken, bereidt u de grondmix voor door in de handel verkrijgbare grondmengsels te mengen met cocopeat en compost in een verhouding van 2: 1: 1.
- Verspreid een 1-inch dikke laag van dit grondmengsel in een plastic bak om het bodembed te maken en te verzadigen met gedeïoniseerd water. Strooi ongeveer 200 zaden in dit bodembed.
- Breng het over in een grotere bak met 1 cm stilstaand water. Bedek dit bakje met plasticfolie om een vochtkamer te creëren.
- Breng deze opstelling over naar een groeikamer ingesteld op 23 °C met 16 uur licht en 8 uur donkere cyclus met 150-170 μmol/m2s lichtintensiteit.
- Breng na twee weken jonge zaailingen over naar kleine, 3-4-inch potten met waterverzadigde grondmix.
- Plaats deze potten in plastic bakjes en breng ze nog vier weken over naar de groeikamer.
3. Bereid bacteriestammen voor agro-infiltratie
OPMERKING: Voor agro-infiltratie moeten bacteriestammen vers worden gesubcultureerd en gemengd samen met de p19-stam van Agrobacterium in geschikte verhoudingen.
- Bereid 2xYT agarplaten met rifampicine (100 μg / ml), gentamicine (25 μg / ml) en kanamycine (50 μg / ml) voor Agrobacterium met pSPYNE-35S en pSPYCE-35S vector. Gebruik voor pSITE vector bevattende stam rifampicine (100 μg/ml), gentamicine (25 μg/ml) en spectinomycine (50 μg/ml).
- Streak de Agrobacterium-stammen die de plasmiden op deze platen bevatten met behulp van steriele inentingslussen in een laminaire stroomkap.
- Incubeer deze bij 28 °C gedurende 48 uur in het donker.
- Start deze procedure door Agrobacterium GV3101-stam met BiFC- en FRET-constructies (bereid in pSPYNE-35S, pSPYCE-35S en pSITE-vectoren) te enten uit gestreepte platen in 10 ml 2xYT-bouillon met geschikte antibiotica (Rifampicine (100 μg / ml), gentamicine (25 μg / ml), kanamycine (50 μg / ml) of spectinomycine (50 μg / ml)).
- Start bovendien een cultuur van p19-stam van Agrobacteriën door 10 ml 2xYT-bouillon met rifampicine (100 μg / ml) en kanamycine (50 μg / ml) te inenten.
OPMERKING: p19-stam wordt toegevoegd om transgene silencing te voorkomen. - Dek de kolf af met een aluminiumfolie en bewaar ze in de incubator shaker ingesteld op 28 °C en 170 rpm gedurende 16 uur in het donker.
- Breng na de nachtelijke groei 1 ml van deze cultuur over op een wegwerpcuvet om de optische dichtheid (O.D.) van de culturen bij 600 nm te meten met behulp van een spectrofotometer.
- Meng de culturen van geschikte BiFC- en FRET-partnerbevattende stammen zodat de uiteindelijke O.D. van elke cultuur 0,5 is en die van p19 0,3 in een totaal volume van 2 ml.
- Om deze verhoudingen te bereiken, gebruikt u de onderstaande formule:
VERKREGEN OD = O.D. van de cultuur gemeten bij 600 nm
V-cultuur = Volume van de vereiste cultuur
ODfinal = 0,5 voor constructen en 0,3 voor p19
Vfinal = Eindvolume voor de infiltratie, dat 2 ml is
OPMERKING: De in dit onderzoek gebruikte constructcombinaties zijn gespecificeerd in tabel 2. - Centrifugeer de gemengde Agrobacterium-culturen bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant voorzichtig weg. Resuspend de pellet in 2 ml vers bereide infiltratiebuffer (10 mM MES, 100 μM acetosyringon en 10 mM MgCl2). Gebruik een vortexmenger om een homogene celsuspensie te maken.
- Incubeer de buisjes met geresuspendeerde cellen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
- Label ondertussen elke plantenpot met het constructmengsel waarmee het zal worden geïnfiltreerd. Gebruik twee planten voor elk infiltratiemengsel.
- Vul een naaldloze spuit van 1 ml met de agrobacteriële mix. Druk de spuit voorzichtig maar stevig op de abaxiale kant van het volledig geëxpandeerde blad terwijl u het blad vanaf de andere kant ondersteunt. Duw voorzichtig op de zuiger totdat de oplossingen zich vullen in het bladoppervlak dat overeenkomt met 2-3 keer de punt van de spuit.
- Infiltreer tot vier plekken op een blad en 3-4 bladeren per plant, zoals weergegeven in figuur 4.
OPMERKING: Vervang handschoenen of veeg handschoenen af met 70% alcohol tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen. - Breng alle potten over in een bak en incubeer in een groeikamer onder dezelfde omstandigheden als vermeld in stap 2.
- Controleer een klein deel van het agro-geïnfiltreerde blad op verschillende tijdstippen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Wanneer de fluorescentie van zowel YFP als CFP detecteerbaar is in cellen, gaat u verder met de confocale microscoop voor BiFC-FRET FLIM-assay. In dit experiment werd de analyse 3 dagen na agro-infiltratie uitgevoerd.
OPMERKING: Stel de post-agro-infiltratieperiode van incubatie individueel in voor elke promotor- en gencombinatie om overexpressie van chimere eiwitten te voorkomen die worden gebruikt in de BiFC-FRET FLIM-test. De overexpressie van de partnereiwitten kan leiden tot vals-positieve interacties.
4. Dia's voorbereiden voor fluorescentievisualisatie
- Wanneer planten klaar zijn voor visualisatie, snijdt u vierkante bladmonsters, 5-8 mm verwijderd van de infiltratiewond, en monteert u ze in gedestilleerd water op schone dia's.
OPMERKING: Om achtergrondfluorescentie te minimaliseren, reinigt u de dia's met 80% ethanol gevolgd door gedestilleerd water 3-4 keer, droogt u ze aan de lucht en bewaart u ze op een absorberend vel. - Bedek het bladmonster met een schone dekplaat en sluit af met een nagelglazuur.
- Visualiseer deze monsters onder een confocale laserscanmicroscoop.
5. FRET-FLIM-analyse met behulp van een confocale laserscanmicroscoop
OPMERKING: In deze procedure is de basis voor het bepalen en kwantificeren van de interactie tussen twee eiwitten de vermindering van de fluorescentielevensduur van de FRET-donorpartner bij zijn interactie met de acceptor, die wordt gebruikt om de efficiëntie van FRET te berekenen. De complexiteit in het geval van tripartiete interactie neemt verder toe omdat de FRET-acceptor in dit geval geen enkel molecuul is, maar een gesplitst YFP-BiFC-paar, dat eerst in vivo moet worden gereconstitueerd om een functionele FRET-acceptorfluoofoor te worden. Om FRET-FLIM uit te voeren, moet men de fluorescentielevensduur van het donormolecuul bepalen - eerst alleen en vervolgens in aanwezigheid van een FRET-partner.
- Open de FLIM-toepassing in de confocale laserscanmicroscoop, start de console en gebruik patroonherkenning fotonentelling om de levensduur van fluorescentie te meten. Selecteer de standaard meetmodus 'Alle fotonen tellen'.
- Analyseer monsters van twee soorten agro-geïnfiltreerde planten: een met alleen de donor (C-CFP) en de andere met de donor en de acceptor (C-CFP, samen met M-YFP) beide.
OPMERKING: Omdat de interactie van M-eiwit al is gevalideerd met C-eiwit met behulp van BiFC en Y2H, wordt een goede FRET-efficiëntie verwacht met dit interagerende paar. - Scan vervolgens het C-CFP agro-geïnfiltreerde blad en concentreer je op een cel die goede CFP-fluorescentie vertoont. Start de laserscanmodus en stel het systeem in voor CFP-visualisatie en FLIM-metingen (λex 440 nm pulslaser, λem 480-520 nm door hybride detectoren, scansnelheid 512 x 512 pixels bij 400 Hz).
- Pas de focus, zoom en slimme versterking aan om scherp te stellen op het gebied dat moet worden vastgelegd.
- Verlicht het monster met voldoende laservermogen om de opname van ongeveer 0,1 fotonen per puls te bereiken. Voor monsters met variabele fluorescentie-intensiteit legt u 50 frames vast om voldoende fotonen te verzamelen die nodig zijn voor de levensduurmeting. CFP vertoont twee fluorescentielevensduur vanwege de conformatie-aanpassing; pas daarom de gegevens aan met behulp van het n-exponentiële reconvolutiemodel met behoud van de waarde van n gelijk aan 2.
- Bij deze instellingen toont het GVB twee levens van 1,0 en 3,2 ns. Hier wordt de hogere, 3,2 ns, levensduur gebruikt voor alle vervolgberekeningen25,26.
- Om de FRET-efficiëntie te berekenen met behulp van FLIM, de maat voor de mate van interactie tussen twee eiwitten, neemt u een bladmonster dat is gecoïnfiltreerd met C-CFP en M-YFP. Zoek naar een cel die zowel C-CFP als M-YFP tot expressie brengt en bevestig hun respectieve emissiepatronen door ze te prikkelen met behulp van λex 440 nm pulslaser, λem 480-520 nm en λex 514 nm witlichtlaser met λem 526-550 nm. Scan en identificeer achtereenvolgens een cel die zowel CFP- als YFP-fluorescentie vertoont.
- Nadat u de fluorescentie van beide eiwitten hebt bevestigd, schakelt u over naar de FLIM-console om de levensduur van CFP te meten met dezelfde instellingen die we eerder gebruikten voor het meten van de levensduur van C-CFP (stap 5.5).
OPMERKING: Deze cel drukt ook M-YFP uit die mogelijk kan interageren met C-CFP en een verkorting van de levensduur van C-CFP kan veroorzaken. - Pas de grafiek aan die is verkregen met behulp van het n-exponentiële reconvolutiemodel, met n = 2. Er werd een afname van de GVB-levensduur waargenomen van 3,2 tot 2,6 ns, wat wijst op Förster-resonantie-energieoverdracht tussen CFP en YFP (figuur 5A).
- Start nu de FRET-console in de software en bereken de FRET-efficiëntie door handmatig de niet-gecomprimeerde donorlevensduur in te voeren in de vergelijking in de software. En de waargenomen FRET-efficiëntie is: 56%.
- Tripartiete interactie
- Ten slotte, om de interacties tussen drie partners te visualiseren, neemt u het bladmonster van een plant die mede-geïnfiltreerd was met C-CFP, M-YFPn en M-YFPc.
- Scan de bladexplantatie op een cel die zowel CFP- als gereconstitueerde YFP-fluorescentie vertoont die afkomstig is van BiFC-interactie tussen twee M-eiwitten. Gebruik dezelfde laser- en emissiegolflengten als eerder gebruikt.
- Schakel vervolgens de 514 nm laser uit en ga naar de FLIM-console.
OPMERKING: Als het M-YFP-dimeer interageert met C-CFP, zou men een vermindering van de levensduur van C-CFP moeten zien zoals waargenomen tijdens de interactie met M-YFP. Als de C-CFP echter geen interactie heeft met het M-YFP-dimeer, moet de fluorescentielevensduur op 3,2 ns blijven. - Gebruik vergelijkbare instellingen als hierboven vermeld, meet de GVB-levensduur in aanwezigheid van gereconstitueerde YFP. Plaats de grafiek die is verkregen met behulp van het n-exponentiële reconvolutiemodel, met n = 2, en ga naar de FRET-console.
OPMERKING: Er is een daling van de levensduur van het GVB van 3,2 naar 2,3 ns. Bereken de FRET-efficiëntie zoals hierboven beschreven. Het berekende FRET-rendement is 55%. De vermindering van de levensduur van de donor en de goede FRET-efficiëntie van 55% bevestigt de tripartiete interactie tussen twee M-eiwitten en het C-eiwit in vivo (zie figuur 5B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol vertegenwoordigt een geoptimaliseerde methode om in vivo tripartiete eiwit-eiwitinteracties in planten te bestuderen. Het basisprincipe van het protocol is om twee fluorescentie-gelabelde eiwitinteractietechnieken, d.w.z. BiFC en FRET, te combineren om een test te maken om de vorming van ternaire complexen tussen drie eiwitpartners te meten. Hier hebben we FLIM gebruikt om de fluorescentielevensduur van de FRET-donorpartner te meten in de aan- en afwezigheid van de FRET-acceptor. Een vermindering van de fluorescentielevensduur van de donor werd verwacht als er een positieve interactie tussen de twee eiwitten was. We zijn begonnen met het meten van de fluorescentielevensduur van de donor, d.w.z. het C-CFP-eiwit. We hebben de meetmodus 'Alle fotonen tellen' gebruikt, die een fluorescentievervalcurve creëert met alle fotonen in het interessegebied (ROI) en een gemeten levensduur geeft met een kleinere fout dan de traditionele tijdgecorreleerde telling van één foton. Het snelle FLIM-filter zorgt voor het gebruik van single-photon events tussen de pulsen. Vervolgens werd een geschikt wiskundig model gekozen voor pixel-voor-pixel berekeningen en aanpassing van de vervalcurve27.
De CFP-variant die hier wordt gebruikt (en ook de meest gebruikte is) heeft conformatie-aanpassing, wat resulteert in twee fluorescentielevens. Daarom hebben we ervoor gekozen om de fluorescentievervalcurve te passen met behulp van een model voor de multi-exponentiële donor. Dit resulteert in de scheiding van de twee levensduur van GVB, die in ons geval werden waargenomen als 1,0 ns en 3,3 ns. Voor het berekenen van de FRET-efficiëntie hebben we de hogere GVB-levensduur gebruikt, d.w.z. 3,3 ns (gemiddelde fluorescentielevensduur, n = 10).
In het geval van positieve controle (C-CFP en M-YFP) zien we een vermindering van de fluorescentielevensduur van de donor (C-CFP) van 3,3 ns naar 2,5 ns(figuur 6). En de FRET-efficiëntie met behulp van de volgende vergelijking was 56%.
E = FRET Efficiëntie
τD = Levenslange niet-uitgebloogde donor (alleen donormonster, C-CFP)
τ AvAmp = Gemiddelde vervaltijd - Amplitudegewogen gemiddelde levensduur
Een vergelijkbare oefening met gereconstitueerde YFP als gevolg van de interactie tussen twee M-monomeren en C-eiwit resulteerde ook in een positieve interactie die leidde tot de vermindering van de fluorescentielevensduur van de acceptor (C-CFP) tot 2,6 ns. De berekende FRET-efficiëntie was in dit geval ongeveer 55%(figuur 6).
Als een CFP-variant of een andere donorfluoofoor een enkele fluorescentielevensduur heeft, moet de vervalcurve worden aangepast met behulp van het mono-exponentiële donormodel. In dat geval kan de efficiëntie van FRET worden berekend met behulp van de formule:
τ = de fluorescentielevensduur van het monster dat alleen donor bevat
τ quench wordt gemeten in aanwezigheid van de acceptor (terwijl FRET plaatsvindt)
De ruwe fluorescentielevensduurmetingen van ten minste 10 cellen voor elke experimentele opstelling zijn verzameld als een spreidingsdiagram met behulp van de online tool PlotsOfData (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, Figuur 6C)28. De vermindering van de fluorescentielevensduur van de FRET-donor levert sterk bewijs voor een tripartiete interactie tussen deze drie eiwitten.
Figuur 1: Schematische weergave van het principe van biFC en bifc fret-flim methode. Interactie tussen twee M-eiwitten resulteert in reconstitutie van YFP, en dit paar kan dan fungeren als een acceptormolecuul. Het derde eiwit C-CFP fungeert hier als FRET-donor. Een positief FRET-signaal bewijst dus een tripartiete interactie tussen twee M-eiwitten en één C-eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Klonen van M- en C-genen in eindbestemmingsvectoren. De coderende sequenties van de genen worden versterkt en eerst gekloond in pENTR /D-TOPO vector gevolgd door mobilisatie van de constructen in eindbestemmingsvectoren pSITE-1CA, pSITE-3CA, pSPYNE-35S en pSPYCE-35S door LR Clonase II recombinatiereactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Met behulp van elektroporatie worden de gewenste vectorcombinaties geleverd in GV3101 stam van Agrobacterium tumefaciens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematische illustratie van agro-infiltratie van Nicotiana-planten en de voor het experiment gebruikte constructcombinaties. (A) C-CFP met agrobacteriële cultuur fungeert als donormonster (B) C-CFP en M-YFP dienen als positieve FRET-controle, (C) C-CFP en M-eiwit in BiFC-conformatie; M-YFPn en M-YFPc worden gebruikt voor het bestuderen van tripartiete interactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Weergave van de fluorescentielevensduur van de monsters in afwezigheid en aanwezigheid van de acceptor. (A) De levensduur van C-CFP in aanwezigheid van M-YFP wordt teruggebracht tot 2,67 ns zoals weergegeven in het staafdiagram. Evenzo toont (B) de vermindering van de levensduur van C-CFP tot 2,3 ns in geval van tripartiete interactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Tripartiete interactie tussen twee M-monomeren en een C-eiwit geanalyseerd met behulp van biFC-gebaseerde FRET-FLIM-test. (A) Een cel met alleen CFP (i) of zowel CFP als YFP (ii en iii) afkomstig van donor- en acceptoreiwitten met behulp van respectievelijke excitatie- en emissiegolflengten. (B) i, ii, iii vertegenwoordigt FLIM-afbeelding met fluorescentielevensduur van CFP in de cel. De kleurenschaalbalk vertegenwoordigt de pseudokleur die overeenkomt met de levensduur. Schaalbalk = 50 μm. (C) Spreidingsdiagram met fluorescentielevensduur van GVB wanneer aanwezig alleen of met de interagerende partners waarbij n = 10. De plot wordt gegenereerd met behulp van de online tool PlotsOfdata (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/); de gemiddelde fluorescentielevensduur wordt weergegeven als de lijn tussen de monsterpunten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Negatief controle-experiment voor de validatie van interactie tussen eiwitten M en C door BiFC. Interactie tussen de gemuteerde vorm van M-eiwit (MΔCBD), die alle C-eiwitbindende regio's mist, en de C-eiwit-YFPc-fusie wordt geprobeerd te dienen als een negatieve controle voor BiFC-analyse. Bovenste panelen tonen voorbijgaande expressie van MΔCBD-GFP in uienschilcellen en de resultaten van pogingen tot interactie tussen MΔCBD-YFPn en C-YFPc worden weergegeven in de onderste panelen. De afwezigheid van fluorescentie van gereconstitueerde YFP is indicatief voor het gebrek aan interactie tussen MΔCBD en C-eiwit. N, kern; C, cytoplasma; BF, helder veld; FL, fluorescentie; OL, digitale overlay, het cytoplasmatische gebied wordt weergegeven met behulp van witte pijlen. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| S.No. | Vector | Antibiotica selectie |
| Invoer vector | ||
| 1 | pENTR/D-TOPO | Kanamycine |
| Bestemming Vectoren | ||
| 2 | PSPYNE-35S | Kanamycine |
| 3 | PSPYCE-35S | Kanamycine |
| 4 | pSITE-1CA | Spectinomycine |
| 5 | pSITE-3CA | Spectinomycine |
Tabel 1: Vectoren die in het onderzoek zijn gebruikt.
| S.No. | Interactie | Combinatie van constructies |
| 1 | Tripartiete interactie | C-CFP + M-YFPn: M-YFPc + p19 |
| 2 | Positieve controle | C-CFP + M-YFP + p19 |
| 3 | Negatieve controle | C-CFP + Leeg-YFP + p19 |
| Optioneel (tegengestelde conformaties) | ||
| 4 | Tripartiete interactie | M-CFP + M-YFPn: C-YFPc + p19 |
| 5 | Positieve controle | M-CFP + C-YFP + p19 |
| 6 | Negatieve controle 1 | M-CFP + Leeg-YFP + p19 |
| 7 | Negatieve controle 2 | Leeg -CFP + C-YFP + p19 |
| 8 | Negatieve controle 3 | Leeg -CFP + M-YFP + p19 |
Tabel 2: Construct combinaties die in het onderzoek zijn gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol demonstreert het gebruik van biFC-gebaseerde FRET-FLIM-assay om de vorming van een ternair complex tussen twee monomeren van een MADS-box eiwit en een calciumsensoreiwit vast te stellen. Het protocol is aangepast van een rapport van Y. John Shyu et al. waar ze een op BiFC gebaseerde FRET-methode hebben ontwikkeld om ternair complex gevormd tussen Fos-Jun heterodimeren en NFAT of p65 te visualiseren met behulp van de gesensibiliseerde emissiemethode7. Eerder werd een fret-systeem met drie fluoroforen ontwikkeld door Galperin en collega's in het jaar 200429, maar het vereist zes filters met een geavanceerde microscoopopstelling. Ook de snelle beweging van organellen, zoals endosomen, tijdens beeldverwerving legde experimentele problemen op. Aan de andere kant gebruikt fret-flim op basis van BiFC filters voor slechts twee fluoroforen en heeft het een vereenvoudigde microscoopstelling. Deze opstelling maakt directe visualisatie van het ternaire complex mogelijk, in tegenstelling tot het 3-FRET-systeem. Dit heeft ook een voordeel ten opzichte van het BiFC-FRET-systeem omdat het robuuster en kwantitatiever is dan de FRET-metingen met gesensibiliseerde emissie7. In deze test worden fluorescentielevensduur van individuele fotonen gemeten voor het berekenen van de FRET-efficiëntie, in plaats van algemene veranderingen in de relatieve fluorescentie-intensiteiten van donor- en acceptormoleculen. Een ander voordeel van de op FLIM gebaseerde methode ten opzichte van de BiFC-FRET-methode is dat alleen de levensduur van de donor hoeft te worden gemeten; de eigenschappen van fluorescentie-emissie van de acceptor hebben geen invloed op de uitkomst van de FRET-metingen. De voordelen en eenvoud van deze methode maken BiFC-gebaseerde FRET-FLIM een eenvoudigere, eenvoudigere en meer kwantitatieve methode voor het bestuderen van tripartiete interacties. Men moet echter toegang hebben tot een confocale opstelling met pulslasers, snelle detectoren die in staat zijn om enkele fotonen te tellen en een compatibele software.
Voor het succes van dit experiment is het belangrijk dat de interactie tussen de twee eiwitpartners die worden gebruikt in BiFC-conformatie wordt gevalideerd door meerdere methoden en geschikte controles te gebruiken voordat ze als FRET-acceptor worden gebruikt. Het is raadzaam om negatieve controles te gebruiken, zoals een gemuteerde vorm van interagerende partner of een niet-gerelateerd colocaliserend eiwit als een negatieve interagerende partner16. De negatieve controles voor het valideren van de BiFC-interacties tussen M- en C-eiwitten die in dit protocol worden gebruikt, omvatten mutaties in het vermeende bindingsdomein van deze eiwitten, waardoor het BiFC-signaal volledig werd afgeschaft (aanvullende figuur 1). Bovendien werd deze interactie ook gevalideerd door Y2H- en FRET-methoden in verschillende systemen.
Ook wordt temporele optimalisatie van de expressie van eiwitten in Nicotiana aanbevolen, zodat de nadelige effecten van overexpressie van eiwitten, die kunnen leiden tot vals-positieve resultaten, kunnen worden geminimaliseerd. Het is ook noodzakelijk om de p19-stam op te nemen, samen met de agrobacteriële stammen die constructies bevatten om post-transcriptionele genuitschakeling te voorkomen. p19 is een onderdrukker van gen-uitschakeling van tomaten bossy stuntvirus en verbetert de transformatie-efficiëntie tot 90%30. Onlangs zijn betere versies van de fluoroforen ontwikkeld, namelijk m-turquoise-SYFP2, SYFP2-mRFP en SCFP3a-SYFP2. Deze kunnen worden gebruikt als FRET-paren, afhankelijk van hun geschiktheid voor het doelsysteem en celtype11. De FRET-FLIM-metingen moeten in minimaal tien cellen worden uitgevoerd om statistisch significante gegevens te verkrijgen. Waar mogelijk zal het toevoegen van een groter aantal monsters in de metingen de kwaliteit en betrouwbaarheid van de gegevens verder verbeteren. Afhankelijk van de donorfluorofoor moet het wiskundige model worden gekozen om de gegevens aan te passen aan de fluorescentielevensduurvervalcurve.
Het hier beschreven protocol is een krachtig hulpmiddel om de tripartiete interacties in levende cellen te bepalen. Het helpt bij het bepalen van de intracellulaire locatie van het interagerende complex, wat belangrijk is bij het ontcijferen van de functie en fysiologische betekenis van elk eiwitcomplex. Het kan ook de relatieve concentraties van de interagerende partner oplossen op basis van de FRET-FLIM-gegevens, die niet kunnen worden opgehelderd door intensiteitsmetingsmethoden alleen10. Concluderend biedt de op BiFC gebaseerde FRET-FLIM-test de mogelijkheid om belangrijke aspecten van tripartiete eiwitinteracties te bestuderen en te karakteriseren, die kunnen worden gebruikt in zowel dierlijke als plantaardige systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
NB, GG, SB, KC bedanken de University Grants Commission (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE en Council for Scientific and Industrial Research (CSIR) oprecht voor hun onderzoeksbeurzen. We erkennen gelukkig het Department of Biotechnology (DBT), government of India, het department of Science and Technology (DST-FIST), government of India voor financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
References
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
