Summary
Aquí presentamos, un método para visualizar la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas utilizando proteínas marcadas con fluorescentes mediante el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC. Este método es valioso para estudiar los complejos de interacción proteína-proteína in vivo.
Abstract
Las interacciones proteína-proteína son una parte integral de todos los procesos biológicos en las células, ya que desempeñan un papel crucial en la regulación, el mantenimiento y la modificación de las funciones celulares. Estas interacciones están involucradas en una amplia gama de fenómenos como la transducción de señales, la respuesta a patógenos, las interacciones célula-célula, los procesos metabólicos y de desarrollo. En el caso de los factores de transcripción, estas interacciones pueden conducir a la oligomerización de las subunidades, secuestrando en contextos subcelulares específicos como el núcleo, el citoplasma, etc., lo que, a su vez, podría tener un efecto más profundo en la expresión de los genes aguas abajo. Aquí, demostramos una metodología para visualizar la interacción tripartita in vivo utilizando la Transferencia de Energía de Resonancia de Förster (FRET) basada en la Complementación de Fluorescencia Bimolecular (BiFC) que involucra Imágenes de Por Vida de Fluorescencia (FLIM). Dos de las proteínas seleccionadas para esta demostración interactúan como socios biFC, y su actividad de fluorescencia reconstituida se utiliza para ensayar FRET-FLIM con el tercer socio. Se han utilizado plantas de Nicotiana benthamiana cultivadas en cámaras de crecimiento de cuatro a cinco semanas de edad como el sistema de planta modelo para esta demostración.
Introduction
Las interacciones proteína-proteína (IBP) forman la base del buen funcionamiento de las células eucariotas mediante la regulación de diversos procesos metabólicos y de desarrollo. Algunos IBP son estables, mientras que otros son de naturaleza transitoria. Las interacciones se pueden clasificar en función del número y tipo de miembros en la interacción, como diméricos, triméricos, tetrámeros homoméricos y heteroméricos1. La identificación y caracterización de las interacciones proteicas puede conducir a una mejor comprensión de las funciones proteicas y las redes reguladoras.
Los factores de transcripción son proteínas que están involucradas en las funciones reguladoras. Regulan la velocidad de transcripción de sus genes aguas abajo uniéndose al ADN. A veces, la oligomerización o formación de complejos de orden superior por proteínas es un requisito previo para llevar a cabo sus funciones2. Los factores de transcripción MADS-box de plantas son genes homeóticos que regulan diversos procesos como la transición floral, el desarrollo de órganos florales, la fertilización, el desarrollo de semillas, la senescencia y el desarrollo vegetativo. Se sabe que forman complejos de orden superior que se unen al ADN3,4. El estudio de las redes PPI entre los factores de transcripción y sus interactores proporciona información sobre la complejidad subyacente a la regulación transcripcional.
La expresión transitoria de proteínas en Nicotiana benthamiana ha sido un enfoque popular para estudiar la localización de proteínas o las interacciones proteína-proteína in vivo5. BiFC y FRET son métodos para estudiar las interacciones proteína-proteína in vivo utilizando sistemas de reportero fluorescente6. Se ha demostrado que una combinación de estas dos técnicas revela la interacción entre tres proteínas7. FreT se mide mediante fotoblanqueo aceptor, emisión sensibilizada y técnica de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM). El ensayo FRET basado en FLIM ha surgido como una herramienta que proporciona cuantificación precisa y especificidad espaciotemporal a las mediciones de transferencia de energía entre dos moléculas en función de sus vidas de fluorescencia8. FLIM mide el tiempo que un fluoróforo permanece en un estado excitado antes de emitir un fotón y es mejor que las técnicas que utilizan medidas de intensidad solas9,10. Además de los sistemas heterólogos como Nicotiana benthamiana y las cáscaras epidérmicas de cebolla, informes más recientes han demostrado el uso de raíces de Arabidopsis y plántulas de arroz jóvenes, etc., para el análisis in vivo de las interacciones proteína-proteína en condiciones nativas11,12.
Además de un sistema de expresión adecuado, la selección de socios que interactúan para los ensayos BiFC y FRET también es crucial para el éxito de este experimento. El PPI entre los socios utilizados en la configuración de BiFC debe validarse utilizando los controles apropiados antes de su uso como socio conjugado en el experimento FRET13. BiFC utiliza la complementación estructural de las partes N- y C-terminal de la proteína fluorescente. Una limitación común en la mayoría, si no en todas, las proteínas fluorescentes utilizadas en los ensayos de BiFC ha sido el autoensamblaje entre los dos fragmentos derivados no fluorescentes, lo que contribuye a la fluorescencia falsa positiva y disminuye la relación señal-ruido (S / N)14. Los desarrollos recientes, incluidas las mutaciones puntuales o la posición de división de la proteína fluorescente, han dado lugar a pares biFC con mayor intensidad, mayor especificidad, alta relación S / N15,16. Estas proteínas fluorescentes también se pueden utilizar para llevar a cabo BiFC dependiendo de la idoneidad del experimento.
Tradicionalmente, CFP y YFP se han utilizado como el par donante y aceptor en experimentos FRET17. Sin embargo, se encontró que YFP o m-citrino son mejores donantes de FRET (cuando se usan con RFP como aceptor) debido al alto rendimiento cuántico (QY) durante la expresión nativa de proteínas objetivo en el sistema radicular de Arabidopsis. La selección de promotores (constitutivos versus nativos/endógenos) y fluoróforos también juegan un papel crucial en el diseño de un exitoso experimento BiFC-FRET-FLIM. Es esencial tener en cuenta que la eficiencia de los donantes fret y la idoneidad de los pares FRET tienden a cambiar con el cambio en el promotor y el sistema biológico que se utiliza para la expresión. El QY del fluoróforo, que se relaciona con su brillo, depende del pH, la temperatura y el sistema biológico en uso. Sugerimos que estos criterios se consideren a fondo antes de elegir el par de fluoróforos para el experimento FRET. El sistema biológico, los promotores y las proteínas utilizadas para este protocolo funcionaron bien con los fluoróforos CFP-YFP para el experimento BiFC FRET-FLIM.
En el presente estudio, incorporamos la característica de FLIM para visualizar la interacción entre tres moléculas de proteína utilizando FRET basado en BiFC. En esta técnica, dos proteínas se etiquetan con proteína YFP dividida y la tercera proteína con PPC. Dado que estábamos interesados en estudiar la interacción de un homodímero de proteína MADS-box (M) con una proteína sensora de calcio (C), estas proteínas fueron marcadas con proteínas fluorescentes en vectores pSITE-1CA y pSITE-3CA18. Dos de los socios que interactúan, en este ensayo, fueron etiquetados con partes N- y C-terminales del YFP en los vectores pSPYNE-35S y pSPYCE-35S19, y su interacción da como resultado la reconstitución del YFP funcional que actúa como aceptor fret para el tercer socio que interactúa, que está etiquetado con CFP (actuando como donante FRET) (Figura 1 ). En este caso particular, el PPI entre dos monómeros M y entre M y C ha sido validado mediante la realización de BiFC en tres sistemas diferentes junto con el sistema de levadura-dos-híbrido. Estos vectores fueron movilizados en la cepa Agrobacterium tumifaciens GV3101 por electroporación. La cepa GV3101 tiene un plásmido Ti desarmado pMP90 (pTiC58DT-DNA) con resistencia a la gentamicina20. Se añadió una cepa p19 Agrobacterium junto con todas las infiltraciones para evitar el silenciamiento detransgenes 21. Recomendamos que las tres proteínas también se utilicen en conformaciones opuestas para validar las interacciones tripartitas.
En esta técnica, hemos empleado FLIM, donde en primer lugar, la vida útil de fluorescencia del donante (vida útil del donante no exprimida) se mide en ausencia de un aceptor. Después de eso, su vida útil se mide en presencia del aceptor (vida del donante apagado). Esta diferencia en las vidas de fluorescencia de los donantes se utiliza para calcular la eficiencia de FRET, que depende del número de fotones que exhiben una reducción en la vida útil de la fluorescencia. A continuación se menciona un protocolo detallado para determinar la formación de un complejo ternario entre tres proteínas cualesquiera expresando transitoriamente las proteínas marcadas con fluorescentes en Nicotiana benthamiana y ensayando su interacción por BiFC-FRET-FLIM.
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Protocol
1. Clonación de genes en vectores de entrada y destino (Figura2)
- Amplificar la secuencia codificante (CDS) de los genes de interés (genes M y C en nuestro caso) mediante PCR y clonarlos en vectores de entrada apropiados (por ejemplo, vector pENTR/D-TOPO; ver Tabla 1 para los vectores utilizados en este experimento).
- Cultive los clones en placas que contengan antibióticos. Validar clones que se seleccionan en los antibióticos por restricción de digestión y secuenciación de ADN22,23.
- Movilizar los CDS reconstituidos de los clones de entrada a los vectores de destino (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA y pSITE-3CA) y confirmar la transferencia de secuencias desde la entrada a los vectores de destino por digestión enzimática de restricción.
NOTA: Todos los vectores utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla 1. - Finalmente, transformar las celdas de Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR))con los vectores de destino por electroporación (Figura 3)24.
2. Condiciones de crecimiento para las plantas de Nicotiana benthamiana
NOTA: Cultive plantas de Nicotiana hasta la etapa de 4-6 hojas en condiciones de control.
- Para cultivar plantas de Nicotiana, prepare la mezcla de suelo mezclando mezclas de suelo disponibles comercialmente con cocopeat y compost en una proporción de 2: 1: 1.
- Extienda una capa de 1 pulgada de espesor de esta mezcla de suelo en una bandeja de plástico para hacer el lecho de suelo y saturarlo con agua desionizada. Espolvorea alrededor de 200 semillas en este lecho de suelo.
- Transfiéralo a una bandeja más grande que contenga 1 cm de agua estancada. Cubra esta bandeja con una envoltura de plástico para crear una cámara de humedad.
- Transfiera esta configuración a una cámara de crecimiento a 23 °C con 16 h de luz y 8 h de ciclo oscuro con 150-170 μmol/m2s de intensidad de luz.
- Después de dos semanas, transfiera las plántulas jóvenes a macetas pequeñas de 3-4 pulgadas que contengan una mezcla de suelo saturada de agua.
- Coloque estas macetas en bandejas de plástico y transfiéralas a la cámara de crecimiento durante cuatro semanas más.
3. Preparar cepas bacterianas para la agroinfiltración
NOTA: Para la agroinfiltración, las cepas bacterianas deben ser recién subcultivadas y mezcladas junto con la cepa p19 de Agrobacterium en proporciones apropiadas.
- Preparar placas de agar 2xYT que contengan rifampicina (100 μg/mL), gentamicina (25 μg/mL) y kanamicina (50 μg/mL) para Agrobacterium que albergue vector pSPYNE-35S y pSPYCE-35S. Para el vector pSITE que contiene cepa, use rifampicina (100 μg/ml), gentamicina (25 μg/ml) y espectinomicina (50 μg/ml).
- Rayar las cepas de Agrobacterium que contienen los plásmidos en estas placas utilizando bucles de inoculación estériles en una campana de flujo laminar.
- Incubarlos a 28 °C durante 48 h en la oscuridad.
- Comience este procedimiento inoculando la cepa Agrobacterium GV3101 que alberga construcciones BiFC y FRET (preparadas en vectores pSPYNE-35S, pSPYCE-35S y pSITE) a partir de placas rayadas en 10 mL de caldo 2xYT que contienen antibióticos apropiados (Rifampicina (100 μg / ml), gentamicina (25 μg / ml), kanamicina (50 μg / ml) o espectinomicina (50 μg / ml)).
- Además, iniciar un cultivo de cepa p19 de Agrobacteria inoculando 10 mL de caldo 2xYT que contenga rifampicina (100 μg/mL) y kanamicina (50 μg/mL).
NOTA: se añade la cepa p19 para evitar el silenciamiento de los transgénicos. - Cubra el matraz con un papel de aluminio y manténgalos en el agitador de la incubadora a 28 ° C y 170 rpm durante 16 h en la oscuridad.
- Después del crecimiento durante la noche, transfiera 1 ml de este cultivo a una cubeta desechable para medir la densidad óptica (O.D.) de los cultivos a 600 nm utilizando un espectrofotómetro.
- Mezclar los cultivos de las cepas apropiadas de BiFC y FRET partner que contengan cepas de modo que el O.D. final de cada cultivo sea de 0.5 y el de p19 sea de 0.3 en un volumen total de 2 mL.
- Para lograr estas proporciones, use la fórmula que se menciona a continuación:
ODobtenida = O.D. del cultivo medido a 600 nm
Vcultura = Volumen de la cultura requerida
ODfinal = 0,5 para constructos y 0,3 para p19
Vfinal = Volumen final para la infiltración, que es de 2 mL
NOTA: Las combinaciones de constructo utilizadas en este estudio se especifican en la Tabla 2. - Centrifugar los cultivos mixtos de Agrobacterium a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender el pellet en 2 mL de tampón de infiltración recién preparado (10 mM MES, 100 μM de acetosiringona y 10 mM MgCl2). Use un mezclador de vórtice para hacer una suspensión celular homogénea.
- Incubar los tubos que contienen células resuspendidas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 3 h.
- Mientras tanto, etiquete cada maceta con la mezcla de construcción con la que se va a infiltrar. Use dos plantas para cada mezcla de infiltración.
- Llene una jeringa sin aguja de 1 ml con la mezcla agrobacteriana. Presione suave pero firmemente la jeringa sobre el lado abaxial de la hoja completamente expandida mientras apoya la hoja desde el otro lado. Empuje suavemente el émbolo hasta que las soluciones se llenen en el área de la hoja equivalente a 2-3 veces la punta de la jeringa.
- Infiltrar hasta cuatro manchas en una hoja y 3-4 hojas por planta, como se muestra en la Figura 4.
NOTA: Cambie los guantes o limpie los guantes con alcohol al 70% entre las muestras para evitar la contaminación cruzada. - Transfiera todas las macetas a una bandeja e incube en una cámara de crecimiento en las mismas condiciones que se mencionan en el paso 2.
- Revise una pequeña parte de la hoja agroinfiltrada en diferentes puntos de tiempo utilizando un microscopio de fluorescencia. Cuando la fluorescencia de YFP y CFP sea detectable en las células, proceda al microscopio confocal para el ensayo BiFC-FRET FLIM. En este experimento, el análisis se llevó a cabo 3 días después de la agroinfiltración.
NOTA: Establezca el período de incubación posterior a la agroinfiltración individualmente para cada promotor y combinación de genes para evitar la sobreexpresión de proteínas quiméricas utilizadas en el ensayo BiFC-FRET FLIM. La sobreexpresión de las proteínas asociadas puede conducir a interacciones falsas positivas.
4. Prepare diapositivas para la visualización de fluorescencia
- Cuando las plantas estén listas para la visualización, corte muestras de hojas cuadradas, a 5-8 mm de distancia de la herida de infiltración, y móntelas en agua destilada en toboganes limpios.
NOTA: Para minimizar la fluorescencia de fondo, limpie las diapositivas con etanol al 80% seguido de agua destilada 3-4 veces, séquelas al aire y manténgalas en una lámina absorbente. - Cubra la muestra de la hoja con una funda limpia y selle con un esmalte de uñas.
- Visualice estas muestras bajo un microscopio de barrido láser confocal.
5. Análisis FRET-FLIM utilizando un microscopio de barrido láser confocal
NOTA: En este procedimiento, la base para determinar y cuantificar la interacción entre dos proteínas es la reducción de la vida útil de fluorescencia del socio donante de FRET sobre su interacción con el aceptor, que se utiliza para calcular la eficiencia de FRET. La complejidad en el caso de la interacción tripartita aumenta aún más porque el aceptor FRET, en este caso, no es una sola molécula sino un par YFP-BiFC dividido, que primero debe reconstituirse in vivo para convertirse en un fluoróforo aceptor FRET funcional. Para llevar a cabo FRET-FLIM, es necesario determinar la vida útil de fluorescencia de la molécula donante, primero solo y luego en presencia de un socio FRET.
- Abra la aplicación FLIM en el microscopio de barrido láser confocal, inicie la consola y utilice el conteo de fotones de reconocimiento de patrones para medir la vida útil de la fluorescencia. Seleccione el modo de medición estándar 'Conteo de todos los fotones'.
- Analizar muestras de dos tipos de plantas agroinfiltradas: una solo con el donante (C-CFP) y la otra con el donante y el aceptor (C-CFP, junto con M-YFP) ambos.
NOTA: Debido a que la interacción de la proteína M ya ha sido validada con la proteína C utilizando BiFC e Y2H, se espera una buena eficiencia FRET con este par que interactúa. - A continuación, escanee la hoja agroinfiltrada C-CFP y concéntrese en una célula que muestre buena fluorescencia CFP. Inicie el modo de escaneo láser y configure el sistema para la visualización CFP y las mediciones FLIM (láser de pulso λex 440 nm, λem 480-520 nm por detectores híbridos, velocidad de escaneo 512 x 512 píxeles a 400 Hz).
- Ajuste el enfoque, el zoom y la ganancia inteligente para enfocar el área que necesita ser capturada.
- Ilumine la muestra a suficiente potencia láser para lograr la captura de aproximadamente 0,1 fotones por pulso. Para muestras con intensidad de fluorescencia variable, capture 50 fotogramas para recolectar los fotones adecuados necesarios para la medición de la vida útil. La PPC exhibe dos vidas de fluorescencia debido a su adaptación conformacional; por lo tanto, ajuste los datos utilizando el modelo de reconvolución n-exponencial manteniendo el valor de n igual a 2.
- En estos ajustes, el CFP muestra dos vidas útiles de 1.0 y 3.2 ns. Aquí el más alto, 3.2 ns, la vida útil se utiliza para todos los cálculos posteriores25,26.
- Para calcular la eficiencia de FRET utilizando FLIM, que es la medida del grado de interacción entre dos proteínas, tome una muestra de hoja que ha sido coinfiltrada con C-CFP y M-YFP. Busque una célula que exprese tanto C-CFP como M-YFP y confirme sus respectivos patrones de emisión ex ex excitandolos usando láser de pulso λex 440 nm, λem 480-520 nm y láser de luz blanca λex 514 nm con λem 526-550 nm. Escanee e identifique secuencialmente una célula que muestre fluorescencia cfp y YFP.
- Después de confirmar la fluorescencia de ambas proteínas, cambie a la consola FLIM para medir la vida útil de CFP utilizando la misma configuración que usamos anteriormente para medir la vida útil de C-CFP (paso 5.5).
NOTA: Esta célula también está expresando M-YFP que potencialmente puede interactuar con C-CFP y causar una reducción en la vida útil de C-CFP. - Ajustar la gráfica obtenida utilizando el modelo de reconvolución n-exponencial, con n = 2. Se observó una disminución en la vida útil de la PPC de 3,2 a 2,6 ns, lo que indica la transferencia de energía de resonancia de Förster entre la PPC y la YFP(Figura 5A).
- Ahora inicie la consola FRET en el software y calcule la eficiencia FRET ingresando manualmente la vida útil del donante no exprimida en la ecuación proporcionada en el software. Y la eficiencia FRET observada es: 56%.
- Interacción tripartita
- Finalmente, para visualizar las interacciones entre tres socios, tome la muestra de hoja de una planta que fue coinfiltrada con C-CFP, M-YFPn y M-YFPc.
- Escanee el explante de la hoja en busca de una célula que muestre tanto CFP como fluorescencia YFP reconstituida que emana de la interacción BiFC entre dos proteínas M. Utilice el mismo láser y longitudes de onda de emisión que se usaron anteriormente.
- Posteriormente, apague el láser de 514 nm y muévase a la consola FLIM.
NOTA: Si el dímero M-YFP interactúa con C-CFP, se debe ver una reducción en la vida útil de C-CFP como se observa durante su interacción con M-YFP. Sin embargo, si el C-CFP no interactúa con el dímero M-YFP, su vida útil de fluorescencia debe permanecer en 3.2 ns. - Utilizando configuraciones similares a las mencionadas anteriormente, mida la vida útil de la PPC en presencia de YFP reconstituida. Ajuste el gráfico obtenido utilizando el modelo de reconvolución n-exponencial, con n = 2, y muévase a la consola FRET.
NOTA: Hay una disminución en la vida útil de la PPC de 3.2 a 2.3 ns. Calcule la eficiencia fret como se describió anteriormente. La eficiencia FRET calculada es del 55%. La reducción en la vida útil del donante y la buena eficiencia FRET del 55% confirma la interacción tripartita entre dos proteínas M y la proteína C in vivo (ver Figura 5B).
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Representative Results
Este protocolo representa un método optimizado para estudiar in vivo las interacciones tripartitas proteína-proteína en plantas. El principio básico del protocolo es combinar dos técnicas de interacción de proteínas marcadas con fluorescencia, es decir, BiFC y FRET, para crear un ensayo para medir la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas. Aquí, hemos utilizado FLIM para medir la vida útil de fluorescencia del socio donante fret en presencia y ausencia del aceptor FRET. Se esperaba una reducción en la vida útil de fluorescencia del donante si había una interacción positiva entre las dos proteínas. Comenzamos midiendo la vida útil de fluorescencia del donante, es decir, la proteína C-CFP. Hemos utilizado el modo de medición 'Conteo de todos los fotones', que crea una curva de desintegración de fluorescencia con todos los fotones en la región de interés (ROI) y da una vida útil medida con un error menor que el conteo tradicional de fotón único correlacionado en el tiempo. El filtro FLIM de alta velocidad garantiza el uso de eventos de un solo fotón entre los pulsos. A continuación, se eligió un modelo matemático adecuado para los cálculos píxel por píxel y el ajuste de la curva de desintegración27.
La variante CFP utilizada aquí (y también es la más comúnmente utilizada) tiene adaptación conformacional, lo que resulta en dos vidas de fluorescencia. Por lo tanto, elegimos ajustar la curva de desintegración de fluorescencia utilizando un modelo para el donante multiexponencial. Esto da como resultado la separación de las dos vidas de cfp, que en nuestro caso se observaron como 1.0 ns y 3.3 ns. Para calcular la eficiencia fret, utilizamos la vida útil de CFP más alta, es decir, 3,3 ns (vida útil media de fluorescencia, n = 10).
En el caso del control positivo (C-CFP y M-YFP), observamos una reducción en la vida útil de fluorescencia del donante (C-CFP) de 3,3 ns a 2,5 ns (Figura 6). Y la eficiencia fret usando la siguiente ecuación fue del 56%.
E = Eficiencia FRET
τD = Donante no saciado de por vida (muestra solo del donante, C-CFP)
τ AvAmp = Tiempo medio de decaimiento - Vida media ponderada por amplitud
Un ejercicio similar con YFP reconstituida resultante de la interacción entre dos monómeros M y la proteína C también resultó en una interacción positiva que condujo a la reducción de la vida útil de fluorescencia del aceptor (C-CFP) a 2.6 ns. La eficiencia FRET calculada fue de aproximadamente el 55% en este caso (Figura 6).
Si una variante de CFP o cualquier otro fluoróforo de donante tiene una vida útil de fluorescencia única, la curva de desintegración deberá ajustarse utilizando el modelo de donante monoexponencial. En ese caso, la eficiencia de FRET se puede calcular utilizando la fórmula:
τ es la vida útil de fluorescencia de la muestra que contiene únicamente el donante
τ quench se mide en presencia del aceptor (mientras se lleva a cabo FRET)
Las lecturas de la vida útil de la fluorescencia en bruto de al menos 10 celdas para cada configuración experimental se han recopilado como un gráfico de dispersión utilizando la herramienta en línea PlotsOfData (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, Figura 6C)28. La reducción en la vida útil de fluorescencia del donante de FRET proporciona una fuerte evidencia de una interacción tripartita entre estas tres proteínas.
Figura 1: Representación esquemática del principio del método BiFC y BiFC FRET-FLIM. La interacción entre dos proteínas M da como resultado la reconstitución de YFP, y este par puede actuar como una molécula aceptora. La tercera proteína C-CFP actúa como donante fret aquí. Por lo tanto, una señal FRET positiva demuestra la interacción tripartita entre dos proteínas M y una proteína C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Clonación de genes M y C en vectores de destino final. Las secuencias codificantes de los genes se amplifican y se clonan primero en el vector pENTR/D-TOPO seguido de la movilización de los constructos en los vectores de destino final pSITE-1CA, pSITE-3CA, pSPYNE-35S y pSPYCE-35S por reacción de recombinación LR Clonase II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Utilizando la electroporación, las combinaciones de vectores deseadas se entregan en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ilustración esquemática de la agroinfiltración de las plantas de Nicotiana y las combinaciones de constructo utilizadas para el experimento. (A) C-CFP que contiene cultivo agrobacteriano actúa como muestra de donante único (B) C-CFP y M-YFP sirven como control FRET positivo, (C) C-CFP y proteína M en conformación BiFC; M-YFPn y M-YFPc se utilizan para estudiar la interacción tripartita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Representación de las vidas de fluorescencia de las muestras en ausencia y presencia del aceptor. (A) La vida útil de C-CFP en presencia de M-YFP se reduce a 2,67 ns como se muestra en el gráfico de barras. Del mismo modo ,B) muestra la reducción de la vida útil de C-CFP a 2,3 ns en caso de interacción tripartita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Interacción tripartita entre dos monómeros M y una proteína C analizada mediante el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC. (A) Una célula que muestra sólo CFP (i) o tanto CFP como YFP (ii y iii) que emanan de proteínas donantes y aceptoras utilizando las respectivas longitudes de onda de excitación y emisión. (B) i, ii, iii representa la imagen FLIM que muestra la vida útil de fluorescencia de CFP en la célula. La barra de escala de color representa el pseudocolor correspondiente a la vida útil. Barra de escala = 50 μm. (C) Diagrama de dispersión que muestra la vida útil de fluorescencia de cfP cuando está presente solo o con los socios que interactúan donde n = 10. La gráfica se genera utilizando la herramienta en línea PlotsOfdata (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/); la vida media de fluorescencia se representa como la línea entre los puntos de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Experimento de control negativo para la validación de la interacción entre las proteínas M y C por BiFC. La interacción entre la forma mutada de la proteína M (MΔCBD), que carece de todas las regiones de unión a la proteína C, y la fusión proteína C-YFPc se intenta servir como un control negativo para el análisis de BiFC. Los paneles superiores muestran la expresión transitoria de MΔCBD-GFP en las células de cáscara de cebolla, y los resultados del intento de interacción entre MΔCBD-YFPn y C-YFPc se muestran en los paneles inferiores. La ausencia de fluorescencia de la YFP reconstituida es indicativa de la falta de interacción entre MΔCBD y la proteína C. N, núcleo; C, citoplasma; BF: campo brillante; FL: fluorescencia; OL, superposición digital, la región citoplasmática se muestra usando flechas blancas. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| S.No. | Vector | Selección de antibióticos |
| Vector de entrada | ||
| 1 | pENTR/D-TOPO | Kanamicina |
| Vectores de destino | ||
| 2 | pSPYNE-35S | Kanamicina |
| 3 | pSPYCE-35S | Kanamicina |
| 4 | pSITE-1CA | Espectinomicina |
| 5 | pSITE-3CA | Espectinomicina |
Tabla 1: Vectores utilizados en el estudio.
| S.No. | Interacción | Combinación de constructos |
| 1 | Interacción tripartita | C-CFP + M-YFPn: M-YFPc + p19 |
| 2 | Control positivo | C-CFP + M-YFP + p19 |
| 3 | Control negativo | C-CFP + Vacío-YFP + p19 |
| Opcional (conformaciones opuestas) | ||
| 4 | Interacción tripartita | M-CFP + M-YFPn:C-YFPc + p19 |
| 5 | Control positivo | M-CFP + C-YFP + p19 |
| 6 | Control negativo 1 | M-CFP + Vacío-YFP + p19 |
| 7 | Control negativo 2 | Vacío -CFP + C-YFP + p19 |
| 8 | Control negativo 3 | Vacío -CFP + M-YFP + p19 |
Tabla 2: Combinaciones de constructo utilizadas en el estudio.
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Discussion
El presente protocolo demuestra el uso del ensayo FRET-FLIM basado en BiFC para determinar la formación de un complejo ternario entre dos monómeros de una proteína MADS-box y una proteína sensora de calcio. El protocolo está adaptado de un informe de Y. John Shyu et al. donde han desarrollado un método FRET basado en BiFC para visualizar el complejo ternario formado entre heterodímeros de Fos-Jun y NFAT o p65 utilizando el método de emisión sensibilizada7. Anteriormente, galperin y sus compañeros de trabajo desarrollaron un sistema FRET de tres fluoróforos en el año 200429,pero requiere seis filtros que contengan una sofisticada configuración de microscopio. Además, el rápido movimiento de orgánulos, como los endosomas, durante la adquisición de imágenes impuso dificultades experimentales. Por otro lado, FRET-FLIM basado en BiFC utiliza filtros para solo dos fluoróforos y tiene una configuración de microscopio simplificada. Esta configuración permite la visualización directa del complejo ternario, a diferencia del sistema 3-FRET. Esto también tiene una ventaja sobre el sistema BiFC-FRET al ser más robusto y cuantitativo que las mediciones FRET que implican emisión sensibilizada7. En este ensayo, las vidas de fluorescencia de fotones individuales se miden para calcular las eficiencias fret, en lugar de los cambios generales en las intensidades relativas de fluorescencia de las moléculas donantes y aceptoras. Otra ventaja del método basado en FLIM sobre el método BiFC-FRET es que solo se debe medir la vida útil del donante; las cualidades de emisión de fluorescencia del aceptor no afectan al resultado de las mediciones FRET. Las ventajas y la simplicidad de este método hacen que FRET-FLIM basado en BiFC sea un método más fácil, directo y cuantitativo para estudiar las interacciones tripartitas. Sin embargo, uno necesita tener acceso a una configuración confocal con láseres de pulso, detectores rápidos capaces de contar un solo fotón y un software compatible.
Para el éxito de este experimento, es importante que la interacción entre los dos socios proteicos utilizados en la conformación de BiFC se valide mediante el uso de múltiples métodos y controles apropiados antes de usarlos como aceptor de FRET. Es recomendable utilizar controles negativos como una forma mutada de pareja interactuante o una proteína colocalizante no relacionada como pareja interactuante negativa16. Los controles negativos para validar las interacciones BiFC entre las proteínas M y C utilizadas en este protocolo incluyeron mutaciones en el dominio de unión putativa de estas proteínas, lo que abolió por completo la señal BiFC(Figura suplementaria 1). Además, esta interacción también fue validada por los métodos Y2H y FRET en diferentes sistemas.
Además, se recomienda la optimización temporal de la expresión de proteínas en Nicotiana para que se puedan minimizar los efectos adversos de la sobreexpresión de proteínas, que pueden conducir a resultados falsos positivos. También es necesario incluir la cepa p19 junto con las cepas agrobacterianas que contienen construcciones para evitar el silenciamiento génico post-transcripcional. p19 es un supresor del silenciamiento génico del virus del truco arbustivo del tomate y mejora la eficiencia de transformación hasta en un 90%30. Recientemente, se han desarrollado mejores versiones de los fluoróforos, a saber, m-turquesa-SYFP2, SYFP2-mRFP y SCFP3a-SYFP2. Estos se pueden utilizar como pares FRET dependiendo de su idoneidad para el sistema objetivo y el tipo de celda11. Las mediciones FRET-FLIM deben realizarse en un mínimo de diez celdas para obtener datos estadísticamente significativos. Siempre que sea posible, la adición de un mayor número de muestras en las mediciones mejorará aún más la calidad y la fiabilidad de los datos. Dependiendo del fluoróforo del donante, se debe elegir el modelo matemático para ajustar los datos con la curva de desintegración de la vida útil de la fluorescencia.
El protocolo descrito aquí es una herramienta poderosa para determinar las interacciones tripartitas en las células vivas. Ayuda a determinar la ubicación intracelular del complejo que interactúa, lo cual es importante para descifrar la función y el significado fisiológico de cualquier complejo de proteínas. También puede resolver las concentraciones relativas del socio que interactúa basándose en los datos fret-FLIM, que no pueden dilucidarse solo con métodos de medición de intensidad10. De manera concluyente, el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC brinda la oportunidad de estudiar y caracterizar aspectos importantes de las interacciones tripartitas de proteínas, que se pueden utilizar en sistemas animales y vegetales.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
NB, GG, SB, KC agradecen sinceramente a la Comisión de Becas Universitarias (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE y el Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) por sus becas de investigación. Afortunadamente, agradecemos al Departamento de Biotecnología (DBT), al Gobierno de la India, al Departamento de Ciencia y Tecnología (DST-FIST), al Gobierno de la India por su apoyo financiero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
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