Summary
כאן אנו מציגים, שיטה לדמיין היווצרות מורכבת טרנרית בין שלושה שותפי חלבון באמצעות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית על ידי BiFC מבוסס FRET-FLIM assay. שיטה זו היא בעלת ערך לחקר מתחמי אינטראקציה בין חלבון חלבון ב- vivo.
Abstract
אינטראקציות בין חלבונים לחלבון הן חלק בלתי נפרד מכל התהליכים הביולוגיים בתאים, שכן הן ממלאות תפקיד מכריע בוויסות, תחזוקה ותיקון של תפקודי התא. אינטראקציות אלה מעורבות במגוון רחב של תופעות כגון העברת אותות, תגובת פתוגן, אינטראקציות בין תאים, תהליכים מטבוליים והתפתחותיים. במקרה של גורמי שעתוק, אינטראקציות אלה עשויות להוביל אוליגומריזציה של subunits, הפרדה בהקשרים תת-תאיים ספציפיים כגון הגרעין, ציטופלסמה, וכו ', אשר, בתורו, עשוי להיות השפעה עמוקה יותר על הביטוי של הגנים במורד הזרם. כאן, אנו מדגימים מתודולוגיה כדי לדמיין אינטראקציה משולשת vivo באמצעות השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) מבוסס Förster העברת אנרגיה תהודה (FRET) מעורבים הדמיה לכל החיים פלואורסצנטי (FLIM). שניים מהחלבונים שנבחרו להדגמה זו מתקשרים כשותפים של BiFC, ופעילות הפלואורסצנטיות המחודשת שלהם משמשת לבדיקת FRET-FLIM עם השותף השלישי. צמחים בני ארבעה עד חמישה שבועות בני 4 עד 5 שבועות של צמחים מגידול תאית ניקוטיאנה בנתמיאנה שימשו כמערכת הצמחים לדוגמה להדגמה זו.
Introduction
אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) מהווים את הבסיס לתפקוד תקין של התאים האוקריוטים על ידי ויסות תהליכים מטבוליים והתפתחותיים שונים. חלק מה- PPIs יציבים, בעוד שאחרים ארעיים בטבע. האינטראקציות עשויות להיות מסווגות בהתבסס על מספר וסוג החברים באינטראקציה כגון דימריק, טרימרי, הומומרי טטרמרי והטרומרי1. זיהוי ואפיון של אינטראקציות חלבון עשוי להוביל להבנה טובה יותר של פונקציות חלבון ורשתות רגולטוריות.
גורמי שעתוק הם חלבונים המעורבים בתפקודים רגולטוריים. הם מווסתים את קצב התמלול של הגנים במורד הזרם שלהם על ידי קשירה לדנ"א. לפעמים אוליגומריזציה או היווצרות של מתחמים מסדר גבוה יותר על ידי חלבונים הוא תנאי מוקדם לביצוע הפונקציות שלהם2. גורמי שעתוק של קופסת MADS הם גנים הומיאוטיים המווסתים תהליכים שונים כגון מעבר פרחוני, פיתוח איברים פרחוניים, הפריה, התפתחות זרעים, סנסנס והתפתחות וגטטיבית. הם ידועים ליצור מתחמים מסדר גבוה יותר אשר נקשרים ל- DNA3,4. לימוד רשתות PPI בין גורמי תמלול והאינטראקטיביות שלהם מספק תובנות לגבי המורכבות שבבסיס רגולציית התמלול.
ביטוי חלבון חולף בניקוטיאנה בנתמיאנה היה גישה פופולרית לחקר לוקליזציה של חלבונים או אינטראקציות חלבון-חלבון ב- vivo5. BiFC ו- FRET הן שיטות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ב- vivo באמצעות מערכות עיתונאי פלואורסצנטיות6. שילוב של שתי טכניקות אלה הוכח לחשוף את האינטראקציה בין שלושה חלבונים7. FRET נמדד באמצעות הדמיה מקבלת, פליטה רגישה וטכניקת הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטיות (FLIM). בדיקת FRET מבוססת FLIM התפתחה ככלי המספק כימות מדויק וספציפיות מרחבית למדידות העברת אנרגיה בין שתי מולקולות המבוססות על אורך החיים הפלואורסצנטי שלהם8. FLIM מודד את הזמן פלואורופור נשאר במצב נרגש לפני פולט פוטון והוא טוב יותר מאשר טכניקות המשתמשות מדידות אינטנסיביות לבד9,10. מלבד מערכות הטרולוגיות כגון Nicotiana benthamiana וקליפות אפידרמיס בצל, דיווחים אחרונים הראו את השימוש בשורשים Arabidopsis ושתילי אורז צעירים, וכו ', לניתוח ויוו של אינטראקציות חלבון חלבון בתנאים מקומיים11,12.
מלבד מערכת ביטוי מתאימה, הבחירה של שותפים אינטראקציה עבור BiFC ו FRET גיוסים הוא גם חיוני להצלחת הניסוי הזה. יש לאמת את ה- PPI בין השותפים המשמשים בתצורת BiFC באמצעות פקדים מתאימים לפני השימוש בהם כשותף מצומד בניסוי FRET13. BiFC מנצל את ההשלמה המבנית של חלקים N-ו- C-מסוף של חלבון פלורסנט. מגבלה נפוצה ברוב החלבונים הפלואורסצנטיים המשמשים בבוחות BiFC הייתה ההרכבה העצמית בין שני שברים נגזרים שאינם פלואורסצנטיים, מה שתרם לפלורסצנטיות חיובית כוזבת ומקטין את יחס האות לרעש (S/N)14. התפתחויות אחרונות, כולל מוטציות נקודתיות או מיקום של פיצול חלבון פלואורסצנטי, הולידו זוגות BiFC עם עוצמה מוגברת, ספציפיות גבוהה יותר, יחס S / N גבוה15,16. חלבונים פלואורסצנטיים אלה יכולים לשמש גם לביצוע BiFC בהתאם להתאמת הניסוי.
באופן מסורתי, CFP ו- YFP שימשו כזוג התורם והמקבל בניסויי FRET17. עם זאת, YFP או m-Citrine נמצאו תורמי FRET טובים יותר (כאשר נעשה שימוש עם RFP כמקובל) בגלל התשואה הקוונטית הגבוהה (QY) במהלך הביטוי הטבעי של חלבוני היעד במערכת השורש Arabidopsis. הבחירה של מקדמים (מרכיב לעומת יליד / אנדוגני) פלואורופור גם לשחק תפקיד מכריע בעיצוב ניסוי BiFC-FRET-FLIM מוצלח. חשוב לציין כי היעילות של תורמי FRET והתאמתם של זוגות FRET נוטים להשתנות עם השינוי במקדם ובמערכת הביולוגית המשמשת לביטוי. ה- QY של הפלורופור, המתייחס לבהירותו, תלוי ב- pH, בטמפרטורה ובמערכת הביולוגית הנמצאת בשימוש. אנו מציעים כי קריטריונים אלה ישקלו ביסודיות לפני בחירת זוג פלואורופור לניסוי FRET. המערכת הביולוגית, היזמים והחלבונים המשמשים לפרוטוקול זה עבדו היטב עם פלואורופורים CFP-YFP לניסוי BiFC FRET-FLIM.
במחקר הנוכחי, אנו משלבים את התכונה של FLIM כדי לדמיין את האינטראקציה בין שלוש מולקולות חלבון באמצעות FRET מבוסס BiFC. בטכניקה זו, שני חלבונים מתויגים עם חלבון YFP מפוצל ואת החלבון השלישי עם CFP. מכיוון שהתעניינו בחקר האינטראקציה של הומודימר חלבון תיבת MADS (M) עם חלבון חיישן סידן (C), חלבונים אלה תויגו עם חלבונים פלואורסצנטיים בווקטורים pSITE-1CA ו- pSITE-3CA18. שניים מהשותפים לאינטראקציה, ב-assay זה, תויגו עם חלקים N-ו- C-terminal של YFP ב pSPYNE-35S ו- pSPYCE-35S וקטורים19, והאינטראקציה שלהם גורמת לחזרה של YFP פונקציונלי הפועל כקבל FRET לשותף האינטראקציה השלישי, אשר מתויג עם CFP (מתנהג כתורם FRET) (איור 1 ). במקרה מסוים זה, ה- PPI בין שני מונומרים M ובין M ו- C אומת על ידי ביצוע BiFC בשלוש מערכות שונות יחד עם מערכת שמרים-שתיים-היברידית. וקטורים אלה גויסו לתוך זן אגרובקטריום tumifaciens GV3101 על ידי אלקטרופורציה. זן GV3101 יש pMP90 טי מנוטרל (pTiC58DT-DNA) עם התנגדות גנטמיצין20. זן אגרובקטריום p19 נוסף יחד עם כל ההסתננויות כדי למנוע השתקת transgene21. אנו ממליצים כי שלושת החלבונים ישמשו גם בקונפורמציות הפוכות כדי לאמת את האינטראקציות המשולשות.
בטכניקה זו, השתמשנו FLIM, שבו הראשון, חיי הפלואורסצנטיות של התורם (חיים תורם ללא יראתי) נמדד בהיעדר מקבל. לאחר מכן, חייו נמדדים בנוכחות המקבל (אורך חיים של תורם מרווה). הבדל זה במאסרי החיים של פלואורסצנטיות התורם משמש לחישוב יעילות FRET, אשר תלוי במספר הפוטונים המציגים ירידה בחיי הפלואורסצנטיות. להלן פרוטוקול מפורט כדי לקבוע את היווצרותו של קומפלקס טרנרי בין כל שלושה חלבונים על ידי ביטוי חולף של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית ב- Nicotiana benthamiana ו- assaying האינטראקציה שלהם על ידי BiFC-FRET-FLIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שיבוט גנים בווקטורים של כניסה ויעד (איור 2)
- להגביר את רצף הקידוד (CDS) של הגנים מעניינים (גנים M ו- C במקרה שלנו) על ידי PCR ולשכפל אותם בווקטורים כניסה מתאימים (למשל, וקטור pENTR / D-TOPO; ראה טבלה 1 עבור וקטורים המשמשים בניסוי זה).
- לגדל את השיבוטים על צלחות המכילות אנטיביוטיקה. לאמת שיבוטים שנבחרו על אנטיביוטיקה על ידי הגבלת העיכול ורצף DNA22,23.
- גייסו את התקליטורים המשוחזרים משיבוטי כניסה לווקטורים המשמשים כיעד (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA ו-pSITE-3CA) ואשרו את העברת הרצפים מהכניסה לווקטורים היעד על ידי הגבלת עיכול אנזימים.
הערה: כל הווקטורים המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלה 1. - לבסוף, להפוך את התאים אגרובקטריום GV3101 (pMP90 (GentR))עם וקטור היעד על ידי אלקטרופורציה (איור 3)24.
2. תנאי צמיחה לצמחים של ניקוטיאנה בנתמיאנה
הערה: לגדל צמחי Nicotiana עד שלב 4-6 עלים בתנאי בקרה.
- כדי לגדל צמחי Nicotiana, להכין את תערובת הקרקע על ידי ערבוב אדמה זמין מסחרית מתערבב עם cocopeat וקומפוסט ביחס של 2:1:1.
- מורחים שכבה בעובי 1 אינץ' של תערובת אדמה זו במגש פלסטיק כדי להפוך את מיטת הקרקע ולהרוות אותה במים דה-יוניים. מפזרים כ -200 זרעים במיטת האדמה הזו.
- מעבירים אותו למגש גדול יותר המכיל 1 ס"מ של מים עומדים. מכסים מגש זה בניילון נצמד ליצירת תא לחות.
- העבר את זה להגדיר לתא צמיחה להגדיר ב 23 °C (50 °F) עם 16 שעות אור 8 שעות מחזור כהה עם 150-170 מיקרומול / מ'2עוצמת האור.
- לאחר שבועיים, מעבירים שתילים צעירים לסירים קטנים בגודל 3-4 אינץ' המכילים תערובת אדמה רוויה במים.
- מניחים את הסירים האלה במגשי פלסטיק ומעבירים אותם לתא הצמיחה לארבעה שבועות נוספים.
3. הכן זני חיידקים לחדירת אגרו
הערה: עבור חדירות חקלאית, זנים חיידקיים צריכים להיות טריים תת תרבותית מעורבב יחד עם זן p19 של אגרובקטריום ביחסים מתאימים.
- הכן 2xYT צלחות אגר המכילות ריפים (100 מיקרוגרם / מ"ל), גנטמיצין (25 מיקרוגרם / מ"ל) וקנמיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל) עבור אגרובקטריום מחסה pSPYNE-35S ו וקטור pSPYCE-35S. עבור וקטור pSITE המכיל זן, השתמש רימפיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), גנטמיצין (25 מיקרוגרם / מ"ל) ו spectinomycin (50 מיקרוגרם / מ"ל).
- פס זני אגרובקטריום המכילים את plasmids על לוחות אלה באמצעות לולאות חיסון סטריליות במכסה המנוע זרימה למינאר.
- לדגור אלה ב 28 °C (55 °F) עבור 48 שעות בחושך.
- התחל הליך זה על ידי חיסון אגרובקטריום GV3101 זן מחסה BiFC ו- FRET מבנים (מוכן pSPYNE-35S, pSPYCE-35S ו ו- pSITE וקטורים) מלוחות מפוספסים ב 10 מ"ל של מרק 2xYT המכיל אנטיביוטיקה מתאימה (רימפיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), גנטמיצין (25 מיקרוגרם / מ"ל), kanamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) או spectinomyצין (50 מיקרוגרם / מ"ל)).
- בנוסף, ליזום תרבות של זן p19 של אגרובקטריה על ידי חיסון 10 מ"ל של מרק 2xYT המכיל ריפהמפיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) וקנמיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
הערה: זן p19 מתווסף כדי למנוע השתקה transgene. - מכסים את הבקבוקון בנייר אלומיניום ושומרים אותם בשייקר האינקובטור שנקבע ב-28 מעלות צלזיוס ו-170 סל"ד ל-16 שעות בחושך.
- לאחר הצמיחה הלילית, העבר 1 מ"ל של תרבות זו ל cuvette חד פעמי כדי למדוד את הצפיפות האופטית (O.D.) של התרבויות ב 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
- ערבבו את התרבויות של שותף BiFC ו- FRET מתאים המכיל זנים כך שה- O.D. הסופי של כל תרבות הוא 0.5 וזה של p19 הוא 0.3 בנפח כולל של 2 מ"ל.
- כדי להשיג יחסים אלה, השתמש בנוסחה המוזכרת להלן:
ODשהושג = מנת יתר של התרבות נמדדת ב 600 ננומטר
תרבות V = נפח התרבות הנדרשת
ODסופי = 0.5 למבנים ו- 0.3 עבור עמ ' 19
V סופי = נפח סופי עבור החדירה, שהוא 2 מ"ל
הערה: שילובי הבנייה המשמשים במחקר זה מצוינים בטבלה 2. - צנטריפוגות תרביות אגרובקטריום מעורבות ב 3,000 x ז במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בזהירות להשליך את supernatant. resuspend הכדור ב 2 מ"ל של חיץ חדירה טרי מוכן (10 mM MES, 100 מיקרומטר של Acetosyringone, ו 10 מ"מ MgCl2). השתמש מערבל מערבולת כדי להפוך השעיית תא הומוגני.
- לדגור על הצינורות המכילים תאים resuspended בחושך בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות.
- בינתיים, לתייג כל סיר צמח עם תערובת המבנה זה הולך להיות הסתנן עם. השתמש בשני צמחים עבור כל תערובת חדירה.
- מלא מזרק 1 מ"ל ללא מחט עם תערובת אגרובקטריאלית. לחץ בעדינות אך בחוזקה את המזרק על הצד האבקסיאלי של העלה המורחב במלואו תוך תמיכה בעליה מהצד השני. דוחפים בעדינות את הבוכנה עד שהפתרונות מתמלאים באזור העלה שווה ערך לפי 2-3 מקצה המזרק.
- הסתננו עד ארבעה כתמים על עלה ו-3-4 עלים לצמח, כפי שמוצג באיור 4.
הערה: החליפו כפפות או ניגנו כפפות עם 70% אלכוהול בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב. - מעבירים את כל הסירים למגש ודגרה בתא צמיחה באותם תנאים שהוזכרו בשלב 2.
- בדוק חלק קטן של העלה agroinfiltrated בנקודות זמן שונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאשר הפלואורסצנטיות הן מ- YFP והן מ- CFP ניתנות לזיהוי בתאים, המשך למיקרוסקופ הקונפוקליבי לבדיקת BiFC-FRET FLIM. בניסוי זה, הניתוח בוצע 3 ימים לאחר הסתננות אגרו.
הערה: הגדר את תקופת ההדירה שלאחר אגרואין בנפרד עבור כל מקדם ושילוב גנים כדי למנוע ביטוי יתר של חלבונים כימריים המשמשים ב- BiFC-FRET FLIM. ביטוי יתר של חלבוני השותף עלול להוביל לאינטראקציות שווא-חיוביות.
4. הכן שקופיות להדמיה פלואורסצנטית
- כאשר הצמחים מוכנים להדמיה, לחתוך דגימות עלים מרובעים, 5-8 מ"מ מן פצע החדירה, ולהרכיב אותם במים מזוקקים על מגלשות נקיות.
הערה: כדי למזער פלואורסצנטיות ברקע, לנקות את השקופיות עם 80% אתנול ואחריו מים מזוקקים 3-4 פעמים, אוויר לייבש אותם, ולשמור אותם על סדין סופג. - מכסים את דגימת העלים בכיסוי נקי וחותמים באמצעות אמייל ציפורניים.
- דמיינו את הדגימות האלה תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
5. ניתוח FRET-FLIM באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי
הערה: בהליך זה, הבסיס של קביעת וכימות אינטראקציה בין שני חלבונים הוא הירידה אורך החיים פלואורסצנטי של השותף תורם FRET על האינטראקציה שלה עם הקבלה, אשר משמש לחישוב היעילות של FRET. המורכבות במקרה של אינטראקציה משולשת גדלה עוד יותר מכיוון ש- FRET-acceptor, במקרה זה, אינו מולקולה אחת אלא זוג YFP-BiFC מפוצל, אשר צריך תחילה לקבל מחדש ב vivo כדי להפוך פלואורופור FRET-acceptor פונקציונלי. כדי לבצע FRET-FLIM, יש לקבוע את הפלואורסצנטיות של מולקולת התורם לכל החיים לבדה ולאחר מכן בנוכחות שותף FRET.
- פתח את יישום FLIM במיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי, הפעל את הקונסולה והשתמש בספירת פוטונים לזיהוי דפוסים כדי למדוד את משך החיים של פלואורסצנטיות. בחרו במצב המדידה הסטנדרטי 'כל ספירת הפוטים'.
- לנתח דגימות משני סוגים של צמחים אגרו-הסתננו: אחד עם התורם בלבד (C-CFP) והשני עם התורם ואת הקבלה (C-CFP, יחד עם M-YFP) שניהם.
הערה: מכיוון שהאינטראקציה של חלבון M כבר אומתה עם חלבון C באמצעות BiFC ו- Y2H, צפויה יעילות FRET טובה עם זוג אינטראקציה זה. - לאחר מכן, סרוק את העלה החקלאי C-CFP הסתנן ולהתמקד בתא מראה פלואורסצנטיות CFP טובה. הפעל את מצב סריקת הלייזר והגדר את המערכת להדמיה של CFP ומדידות FLIM (לייזר דופק λex 440 ננומטר, λem 480-520 ננומטר על ידי גלאים היברידיים, מהירות סריקה 512 x 512 פיקסלים ב 400 הרץ).
- התאם את המיקוד, הזום והרווח החכם כדי להתמקד באזור שיש ללכוד.
- האר את הדגימה בעוצמה לייזר מספקת כדי להשיג לכידה של כ 0.1 פוטונים לכל פעימה. עבור דגימות עם עוצמת פלואורסצנטיות משתנה, לכוד 50 מסגרות כדי לאסוף פוטונים נאותים הנדרשים למדידה לכל החיים. CFP מציגה שתי תקופות חיים פלואורסצנטיות בשל ההסתגלות הקונפורמציה שלה; לכן, התאם את הנתונים באמצעות מודל reconvolution n-מעריכי תוך שמירה על הערך של n שווה ל- 2.
- בהגדרות אלה, CFP מציג שתי תקופות חיים של 1.0 ו- 3.2 ns. כאן גבוה יותר, 3.2 ns, משך חיים משמש עבור כל החישובים הבאים25,26.
- כדי לחשב את יעילות FRET באמצעות FLIM, שהוא המדד של מידת האינטראקציה בין שני חלבונים, לקחת דגימת עלים כי כבר בשיתוף עם C-CFP ו- M-YFP. חפש תא שמבטא הן C-CFP והן M-YFP ולאשר את דפוסי הפליטה שלהם בהתאמה על ידי מרגש אותם באמצעות לייזר דופק λex 440 ננומטר, λem 480-520 ננומטר ו λex 514 ננומטר לייזר אור לבן עם λem 526-550 ננומטר. סרוק וזיהה ברצף תא המציג הן פלואורסצנטיות של CFP והן פלואורסצנטיות YFP.
- לאחר אישור הפלואורסצנטיות משני החלבונים, עבור לקונסולת FLIM כדי למדוד את משך החיים של CFP באמצעות אותן הגדרות בהן השתמשנו קודם לכן למדידת משך החיים של C-CFP (שלב 5.5).
הערה: תא זה מבטא גם M-YFP שיכול לקיים אינטראקציה פוטנציאלית עם C-CFP ולגרום לירידה לאורך החיים של C-CFP. - התאם את הגרף המתקבל באמצעות מודל ההתיישבות המעריכית n, עם n = 2. נצפתה ירידה בתוחלת החיים של CFP מ- 3.2 ל- 2.6 ns, המציינת העברת אנרגיית תהודה של Förster בין CFP ל- YFP (איור 5A).
- כעת הפעל את מסוף FRET בתוכנה וחשב את יעילות FRET על-ידי הזנת משך חיים של תורם ללא רצף באופן ידני במשוואה המסופקת בתוכנה. ויעילות FRET הנצפית היא: 56%.
- אינטראקציה משולשת
- לבסוף, כדי לדמיין את האינטראקציות בין שלושה שותפים, לקחת את דגימת העלה מצמח כי היה בשיתוף עם C-CFP, M-YFPn, ו- M-YFPc.
- סרוק את מסלק העלים עבור תא המציג הן CFP והן פלואורסצנטיות YFP משוחזרת הנובעת מאינטראקציה של BiFC בין שני חלבוני M. השתמש באותם אורכי גל לייזר ופליטה כפי שהיה בשימוש קודם לכן.
- לאחר מכן, כבה את הלייזר 514 ננומטר ועבר לקונסולת FLIM.
הערה: אם עמעום M-YFP אינטראקציה עם C-CFP, יש לראות ירידה לאורך החיים של C-CFP כפי שנצפה במהלך האינטראקציה שלה עם M-YFP. עם זאת, אם C-CFP נכשל אינטראקציה עם M-YFP dimer, אורך החיים פלואורסצנטי שלה צריך להישאר ב 3.2 ns. - באמצעות הגדרות דומות כאמור לעיל, למדוד את משך החיים CFP בנוכחות YFP מחדש. התאם את הגרף המתקבל באמצעות מודל ההתיישבות המעריכית n, עם n = 2, ועבר למסוף FRET.
הערה: יש ירידה לאורך החיים של CFP מ 3.2 ל 2.3 ns. חשב את יעילות FRET כמתואר לעיל. יעילות FRET המחושבת היא 55%. הירידה בחיי התורם ויעילות FRET טובה של 55% מאשרת אינטראקציה משולשת בין שני חלבוני M לבין חלבון C ב-vivo (ראו איור 5B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מייצג שיטה ממוטבת לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון משולש vivo בצמחים. העיקרון הבסיסי של הפרוטוקול הוא לשלב שתי טכניקות אינטראקציה חלבון מתויג פלואורסצנטית, כלומר, BiFC ו FRET, כדי ליצור בדיקת כדי למדוד היווצרות מורכבת טרנרית בין שלושה שותפי חלבון. כאן, השתמשנו FLIM כדי למדוד את חיי הפלואורסצנטיות של השותף התורם FRET בנוכחות ובהיעדר מקבל FRET. ירידה בחיי הפלואורסצנטיות של התורם הייתה צפויה אם הייתה אינטראקציה חיובית בין שני החלבונים. התחלנו עם מדידת אורך החיים פלואורסצנטי של התורם, כלומר, חלבון C-CFP. השתמשנו במצב המדידה 'כל ספירת הפוטונים', שיוצר עקומת ריקבון פלואורסצנטית עם כל הפוטונים באזור העניין (ROI) ונותן אורך חיים מדוד עם שגיאה קטנה יותר מאשר ספירת פוטון אחת מתואמת הזמן המסורתית. מסנן FLIM במהירות גבוהה מבטיח שימוש באירועי פוטון יחיד בין הפולסים. מודל מתמטי מתאים נבחר אז לחישובי פיקסל אחר פיקסל והתאמה של עקומת הריקבון27.
וריאנט CFP המשמש כאן (והוא גם הנפוץ ביותר) יש הסתגלות קונפורמציה, אשר התוצאה שתי תקופות חיים פלואורסצנטיות. לכן, בחרנו להתאים את עקומת הריקבון הפלואורסצנטית באמצעות מודל לתורם הרב-מעריכי. התוצאה היא ההפרדה של שני תקופות החיים של CFP, אשר במקרה שלנו נצפו כמו 1.0 ns ו 3.3 ns. לחישוב יעילות FRET, השתמשנו באורך החיים הגבוה יותר של CFP, כלומר, 3.3 ns (משך חיים פלואורסצנטי ממוצע, n = 10).
במקרה של שליטה חיובית (C-CFP ו- M-YFP), אנו צופים ירידה בחיי הפלואורסצנטיות של התורם (C-CFP) מ- 3.3 ns ל- 2.5 ns (איור 6). ויעילות FRET באמצעות המשוואה הבאה הייתה 56%.
E = יעילות FRET
τD = משך חיים של תורם ללא יראת תורם (מדגם תורם בלבד, C-CFP)
τ AvAmp = זמן ריקבון ממוצע - משרעת משוקללת משך חיים ממוצע
תרגיל דומה עם YFP מחודש הנובע מהאינטראקציה בין שני מונומרים M וחלבון C הביא גם אינטראקציה חיובית המובילה להפחתת אורך החיים פלואורסצנטי של הקבלה (C-CFP) ל 2.6 ns. יעילות FRET המחושבת עמדה על כ-55% במקרה זה(איור 6).
אם לגרסת CFP או לכל פלואורופור תורם אחר יש אורך חיים פלואורסצנטי יחיד, עקומת הריקבון תצטרך להתאים באמצעות מודל התורם המונו-מעריכי. במקרה זה, ניתן לחשב את היעילות של FRET באמצעות הנוסחה:
τ הוא אורך החיים פלואורסצנטי של המדגם המכיל תורם בלבד
τ להרוות נמדד בנוכחות המקבל (בזמן FRET מתרחשת)
קריאות פלורסצנטיות גולמיות לכל החיים מ-10 תאים לפחות עבור כל התקנה ניסיונית נאסף כעלילת פיזור באמצעות הכלי המקוון PlotsOfData (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, איור 6C)28. הירידה בחיי הפלואורסצנטיות של תורם FRET מספקת ראיות חזקות לאינטראקציה משולשת בין שלושת החלבונים האלה.
איור 1: ייצוג סכמטי של העיקרון של שיטת BiFC ו- BiFC FRET-FLIM. אינטראקציה בין שני חלבוני M גורמת לחזרה של YFP, וזוג זה יכול לשמש כמולקולה מקבלת. החלבון השלישי C-CFP פועל כתורם FRET כאן. לכן, אות FRET חיובי מוכיח אינטראקציה משולשת בין שני חלבוני M וחלבון C אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שיבוט גנים M ו-C בווקטורים הסופיים של היעד. רצפי הקידוד של הגנים מוגברים ומשוכפלים לראשונה בווקטור pENTR/D-TOPO ולאחריו גיוס המבנים בווקטורים הסופיים של היעד pSITE-1CA, pSITE-3CA, pSPYNE-35S ו-pSPYCE-35S על ידי תגובת רקומבינציה LR Clonase II. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: באמצעות אלקטרופורציה, השילובים הווקטוריים הרצויים מועברים בזן GV3101 של אגרובקטריום tumefaciens. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: איור דיאגרמתי של חדירת אגרו של צמחי ניקוטיאנה ושילובי המבנים המשמשים לניסוי. (A)C-CFP המכיל תרבות אגרובקטריאלית משמש כדגימה תורמת בלבד (B)C-CFP ו- M-YFP משמשים כבקרת FRET חיובית, (C)C-CFP וחלבון M בקונפורמציית BiFC; M-YFPn ו- M-YFPc משמשים לחקר אינטראקציה משולשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ייצוג אורך חיים פלואורסצנטי של הדגימות בהיעדר ונוכחות של המקבל. (A)תקופת החיים של C-CFP בנוכחות M-YFP מצטמצמת ל- 2.67 ns כפי שמוצג בגרף העמודות. באופן דומה (B) מציג את הירידה לאורך החיים של C-CFP ל 2.3 ns במקרה של אינטראקציה משולשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: אינטראקציה משולשת בין שני מונומרים M וחלבון C מנותח באמצעות BIFC מבוסס FRET-FLIM. (A)תא המציג רק CFP (i) או CFP ו- YFP (ii ו- iii) הנובע מחלבונים תורמים ומקבלים המשתמשים באורכי גל עירור ופליטה בהתאמה. (B) i, ii, iii מייצג תמונת FLIM המציגה את משך החיים של פלואורסצנטיות של CFP בתא. סרגל קנה המידה של הצבע מייצג את הצבע המדומה המתאים לאורך החיים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) נתווה פיזור המציג את משך החיים של פלואורסצנטיות של CFP כאשר קיים לבד או עם השותפים אינטראקציה שבו n = 10. העלילה נוצרת באמצעות הכלי המקוון PlotsOfdata (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/); אורך החיים הממוצע של פלואורסצנטיות מיוצג כקו בין הנקודות לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: ניסוי שליטה שלילית לאימות האינטראקציה בין חלבונים M ו-C על ידי BiFC. אינטראקציה בין הצורה המוטציה של חלבון M (MΔCBD), אשר חסר את כל אזורי כריכת חלבון C, ואת היתוך חלבון C-YFPc ניסה לשמש שליטה שלילית עבור ניתוח BiFC. לוחות עליונים מציגים ביטוי ארעי של MΔCBD-GFP בתאי קליפת בצל, ותוצאות ניסיון האינטראקציה בין MΔCBD-YFPn ו- C-YFPc מוצגות בחלוניות התחתונות. היעדר פלואורסצנטיות מ- YFP המחודש מעיד על חוסר האינטראקציה בין חלבון MΔCBD ל- C. N, גרעין; C, ציטופלסמה; BF, שדה בהיר; FL, פלואורסצנטיות; OL, שכבת-על דיגיטלית, האזור הציטופלסמי מוצג באמצעות חצים לבנים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
| S.No. | וקטור | בחירת אנטיביוטיקה |
| וקטור כניסה | ||
| 1 | pENTR/D-TOPO | קנאמיצין |
| וקטורים המשמשים כיעד | ||
| 2 | pSPYNE-35S | קנאמיצין |
| 3 | pSPYCE-35S | קנאמיצין |
| 4 | pSITE-1CA | ספקטינומיצין |
| 5 | pSITE-3CA | ספקטינומיצין |
טבלה 1: וקטורים המשמשים במחקר.
| S.No. | אינטראקציה | שילוב של מבנים |
| 1 | אינטראקציה משולשת | C-CFP + M-YFPn:M-YFPc + עמ' 19 |
| 2 | שליטה חיובית | C-CFP + M-YFP + עמ' 19 |
| 3 | שליטה שלילית | C-CFP + ריק-YFP + עמ' 19 |
| אופציונלי (קונפורמציות הפוכות) | ||
| 4 | אינטראקציה משולשת | M-CFP + M-YFPn:C-YFPc + עמ' 19 |
| 5 | שליטה חיובית | M-CFP + C-YFP + עמ' 19 |
| 6 | שליטה שלילית 1 | M-CFP + ריק-YFP + עמ' 19 |
| 7 | שליטה שלילית 2 | ריק -CFP + C-YFP + עמ' 19 |
| 8 | שליטה שלילית 3 | ריק -CFP + M-YFP + עמ' 19 |
טבלה 2: בניית שילובים המשמשים במחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת FRET-FLIM מבוססת BiFC כדי לברר את היווצרותו של קומפלקס טרנרי בין שני מונומרים של חלבון תיבת MADS וחלבון חיישן סידן. הפרוטוקול מותאם מדו"ח של Y. John Shyu et al. שבו הם פיתחו שיטת FRET מבוססת BiFC כדי לדמיין קומפלקס טרנרי שנוצר בין הטרודימרים פוס-יוני ו- NFAT או p65 בשיטת הפליטה הרגישה7. מוקדם יותר, מערכת FRET שלושה פלואורופור פותחה על ידי Galperin ושותפיו בשנת 200429, אבל זה דורש שישה מסננים המכילים הגדרת מיקרוסקופ מתוחכם. כמו כן, תנועה מהירה של אברונים, כגון אנדוזומים, במהלך רכישת תמונה הטילה קשיים ניסיוניים. מצד שני, FRET-FLIM מבוסס BiFC משתמש במסננים עבור שני פלואורופורים בלבד ויש לו הגדרת מיקרוסקופ פשוטה. התקנה זו מאפשרת הדמיה ישירה של קומפלקס טרנרי, שלא כמו מערכת 3-FRET. יש לכך גם יתרון על פני מערכת BiFC-FRET בלהיות חזק וכמותי יותר ממדידות FRET הכוללות פליטה רגישה7. ב- assay זה, אורך חיים פלואורסצנטי של פוטונים בודדים נמדדים לחישוב יעילות FRET, ולא שינויים כוללים בעוצמות הפלואורסצנטיות היחסית של מולקולות התורם והמקבל. יתרון נוסף של השיטה מבוססת FLIM על פני שיטת BiFC-FRET הוא שיש למדוד רק את חיי התורם; התכונות של פליטת פלואורסצנטיות של המקבל אינן משפיעות על התוצאה של מדידות FRET. היתרונות והפשטות של שיטה זו הופכים את FRET-FLIM המבוססת על BiFC לשיטה קלה יותר, פשוטה יותר וכמותית יותר לחקר אינטראקציות משולשות. עם זאת, צריך שתהיה גישה למערך קונפוקלי עם לייזרים פולס, גלאים מהירים המסוגלים לספור פוטונים בודדים ותוכנה תואמת.
להצלחת ניסוי זה, חשוב כי האינטראקציה בין שני שותפי חלבון המשמשים בקונפורמיציה BiFC מאומתת באמצעות שיטות מרובות פקדים מתאימים לפני השימוש בהם כקבל FRET. מומלץ להשתמש בבקרות שליליות כגון צורה מוטציה של שותף אינטראקציה או חלבון colocalizing שאינו קשור כשותף אינטראקציה שלילי16. הבקרות השליליות לאימות האינטראקציות של BiFC בין חלבוני M ו- C המשמשים בפרוטוקול זה כללו מוטציות בתחום המחייב putative של חלבונים אלה, אשר ביטל לחלוטין את אות BiFC (איור משלים 1). יתר על כן, אינטראקציה זו אומתה גם על ידי שיטות Y2H ו- FRET במערכות שונות.
כמו כן, מומלץ למזער את ההשפעות השליליות של ביטוי יתר של חלבונים, שעלולות להוביל לתוצאות חיוביות כוזבות. כמו כן יש צורך לכלול את זן p19 יחד עם זנים אגרובקטריאליים המכילים מבנים כדי למנוע השתקת גנים לאחר שעתוק. p19 הוא מדכא של השתקת גנים מווירוס פעלולים סבוכים עגבניות ומשפר את יעילות הטרנספורמציה עד 90%30. לאחרונה פותחו גרסאות טובות יותר של הפלורופורים, כלומר, m-טורקיז-SYFP2, SYFP2-mRFP ו- SCFP3a-SYFP2. אלה יכולים לשמש כזוגות FRET בהתאם להתאמתם למערכת היעד ולסוג התא11. מדידות FRET-FLIM צריך להתבצע במינימום של עשרה תאים כדי לקבל נתונים משמעותיים סטטיסטית. במידת האפשר, הוספת מספר גדול יותר של דגימות במדידות תשפר עוד יותר את האיכות והאמינות של הנתונים. בהתאם לפלורופור התורם, יש לבחור את המודל המתמטי שיתאים לנתונים עם עקומת הריקבון לכל החיים של הפלואורסצנטיות.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא כלי רב עוצמה כדי לקבוע את האינטראקציות המשולשות בתאים חיים. זה עוזר לקבוע את המיקום התאי של קומפלקס אינטראקציה, אשר חשוב בפענוח הפונקציה ואת המשמעות הפיזיולוגית של כל קומפלקס חלבון. זה יכול גם לפתור את הריכוזים היחסיים של השותף אינטראקציה בהתבסס על נתוני FRET-FLIM, כי לא ניתן להבהיר על ידי שיטות מדידת אינטנסיביות לבד10. באופן חד משמעי, בדיקת FRET-FLIM מבוססת BiFC מספקת הזדמנות ללמוד ולאפיין היבטים חשובים של אינטראקציות חלבון משולשות, אשר ניתן להשתמש בהם בבעלי חיים כמו גם במערכות צמחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.
Acknowledgments
NB, GG, SB, KC מודים בכנות לוועדת המענקים של האוניברסיטה (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE והמועצה למחקר מדעי ותעשייתי (CSIR) על מלגות המחקר שלהם. למרבה המזל אנו מכירים במחלקה לביוטכנולוגיה (DBT), ממשלת הודו, המחלקה למדע וטכנולוגיה (DST-FIST), ממשלת הודו לתמיכה כספית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
References
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
