Determinazione dell'interazione tripartita tra due monomeri di un fattore di trascrizione MADS-box e una proteina sensore di calcio mediante saggio BiFC-FRET-FLIM
Summary
Qui presentiamo un metodo per visualizzare la formazione di complessi ternari tra tre partner proteici utilizzando proteine fluorescenti marcate dal test FRET-FLIM basato su BiFC. Questo metodo è prezioso per studiare i complessi di interazione proteina-proteina in vivo.
Abstract
Le interazioni proteina-proteina sono parte integrante di tutti i processi biologici nelle cellule in quanto svolgono un ruolo cruciale nella regolazione, nel mantenimento e nella modifica delle funzioni cellulari. Queste interazioni sono coinvolte in una vasta gamma di fenomeni come la trasduzione del segnale, la risposta dei patogeni, le interazioni cellula-cellula, i processi metabolici e di sviluppo. Nel caso di fattori di trascrizione, queste interazioni possono portare all’oligomerizzazione di subunità, sequestrando in specifici contesti subcellulari come il nucleo, il citoplasma, ecc., Che, a sua volta, potrebbe avere un effetto più profondo sull’espressione dei geni a valle. Qui, dimostriamo una metodologia per visualizzare l’interazione tripartita in vivo utilizzando la complementazione di fluorescenza bimolecolare (BiFC) basata sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) che coinvolge l’imaging a vita di fluorescenza (FLIM). Due delle proteine selezionate per questa dimostrazione interagiscono come partner BiFC e la loro attività di fluorescenza ricostituita viene utilizzata per analizzare FRET-FLIM con il terzo partner. Le piante di Nicotiana benthamiana coltivate a camera di crescita da quattro a cinque settimane sono state utilizzate come sistema vegetale modello per questa dimostrazione.
Introduction
Le interazioni proteina-proteina (PPI) costituiscono la base del corretto funzionamento delle cellule eucariotiche regolando vari processi metabolici e di sviluppo. Alcuni IPP sono stabili, mentre altri sono di natura transitoria. Le interazioni possono essere classificate in base al numero e al tipo di membri nell’interazione come dimerico, trimerico, tetramerico omomerico ed eteromerico1. L’identificazione e la caratterizzazione delle interazioni proteiche può portare a una migliore comprensione delle funzioni proteiche e delle reti regolatorie.
I fattori di trascrizione sono proteine coinvolte nelle funzioni regolatorie. Regolano il tasso di trascrizione dei loro geni a valle legandosi al DNA. A volte l’oligomerizzazione o la formazione di complessi di ordine superiore da parte delle proteine è un prerequisito per svolgere le loro funzioni2. I fattori di trascrizione MADS-box delle piante sono geni omeotici che regolano vari processi come la transizione floreale, lo sviluppo di organi floreali, la fecondazione, lo sviluppo dei semi, la senescenza e lo sviluppo vegetativo. Sono noti per formare complessi di ordine superiore che si legano al DNA3,4. Lo studio delle reti PPI tra i fattori di trascrizione e i loro interattori fornisce informazioni sulla complessità alla base della regolazione trascrizionale.
L’espressione proteica transitoria in Nicotiana benthamiana è stata un approccio popolare per studiare la localizzazione proteica o le interazioni proteina-proteina in vivo5. BiFC e FRET sono metodi per studiare le interazioni proteina-proteina in vivo utilizzando sistemi reporter fluorescenti6. Una combinazione di queste due tecniche ha dimostrato di rivelare l’interazione tra tre proteine7. Il FRET viene misurato utilizzando la fotosbiancamento dell’accettore, l’emissione sensibilizzata e la tecnica FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging). Il test FRET basato su FLIM è emerso come uno strumento che fornisce una quantificazione accurata e una specificità spaziotemporale alle misurazioni del trasferimento di energia tra due molecole in base alla loro durata di fluorescenza8. FLIM misura il tempo in cui un fluoroforo rimane in uno stato eccitato prima di emettere un fotone ed è migliore delle tecniche che utilizzano solo misurazioni di intensità9,10. Oltre a sistemi eterologhi come la Nicotiana benthamiana e le bucce epidermiche di cipolla, rapporti più recenti hanno dimostrato l’uso di radici di Arabidopsis e giovani piantine di riso, ecc., per l’analisi in vivo delle interazioni proteina-proteina in condizioni native11,12.
Oltre a un adeguato sistema di espressione, anche la selezione di partner interagenti per i test BiFC e FRET è cruciale per il successo di questo esperimento. Il PPI tra i partner utilizzati nella configurazione BiFC deve essere convalidato utilizzando controlli appropriati prima del loro utilizzo come partner coniugato nell’esperimento FRET13. BiFC utilizza la complementazione strutturale di parti N- e C-terminali della proteina fluorescente. Una limitazione comune nella maggior parte se non in tutte le proteine fluorescenti utilizzate nei saggi BiFC è stata l’autoassemblaggio tra i due frammenti non fluorescenti derivati, contribuendo alla fluorescenza falsamente positiva e diminuendo il rapporto segnale-rumore (S / N)14. Recenti sviluppi, tra cui mutazioni puntiformi o posizione di scissione della proteina fluorescente, hanno dato origine a coppie BiFC con maggiore intensità, maggiore specificità, alto rapporto S/N15,16. Queste proteine fluorescenti possono anche essere utilizzate per eseguire BiFC a seconda dell’idoneità dell’esperimento.
Tradizionalmente, CFP e YFP sono stati utilizzati come coppia donatore e accettore negli esperimenti FRET17. Tuttavia, YFP o m-Citrino sono risultati essere migliori donatori di FRET (se usati con RFP come accettore) a causa dell’elevata resa quantistica (QY) durante l’espressione nativa delle proteine bersaglio nel sistema radicale di Arabidopsis. Anche la selezione di promotori (costitutivi rispetto a quelli nativi/endogeni) e fluorofori svolgono un ruolo cruciale nella progettazione di un esperimento BiFC-FRET-FLIM di successo. È essenziale notare che l’efficienza dei donatori di FRET e l’idoneità delle coppie FRET tendono a cambiare con il cambiamento del promotore e del sistema biologico utilizzato per l’espressione. Il QY del fluoroforo, che si riferisce alla sua luminosità, dipende dal pH, dalla temperatura e dal sistema biologico in uso. Suggeriamo che questi criteri siano attentamente considerati prima di scegliere la coppia di fluorofori per l’esperimento FRET. Il sistema biologico, i promotori e le proteine utilizzate per questo protocollo hanno funzionato bene con i fluorofori CFP-YFP per l’esperimento BiFC FRET-FLIM.
Nel presente studio, incorporiamo la funzione di FLIM per visualizzare l’interazione tra tre molecole proteiche utilizzando FRET basato su BiFC. In questa tecnica, due proteine sono etichettate con la proteina YFP divisa e la terza proteina con CFP. Poiché eravamo interessati a studiare l’interazione di un omodimero MADS-box protein (M) con una proteina sensore di calcio (C), queste proteine sono state etichettate con proteine fluorescenti nei vettori pSITE-1CA e pSITE-3CA18. Due dei partner interagenti, in questo test, sono stati etichettati con parti N- e C-terminali della YFP nei vettori pSPYNE-35S e pSPYCE-35S19e la loro interazione si traduce nella ricostituzione della YFP funzionale che funge da accettore FRET per il terzo partner interagente, che è taggato con CFP (che agisce come donatore FRET) (Figura 1 ). In questo caso particolare, il PPI tra due monomeri M e tra M e C è stato convalidato eseguendo BiFC in tre diversi sistemi insieme al sistema lievito-due-ibrido. Questi vettori sono stati mobilitati nel ceppo Agrobacterium tumifaciens GV3101 mediante elettroporazione. Il ceppo GV3101 ha un plasmide Ti disarmato pMP90 (pTiC58DT-DNA) con resistenza alla gentamicina20. Un ceppo di Agrobacterium p19 è stato aggiunto insieme a tutte le infiltrazioni per prevenire il silenziamento transgenico21. Raccomandiamo che le tre proteine siano utilizzate anche in conformazioni opposte per convalidare le interazioni tripartite.
In questa tecnica, abbiamo impiegato FLIM, dove in primo luogo, la durata di fluorescenza del donatore (vita del donatore inestinguibile) viene misurata in assenza di un accettore. Successivamente, la sua durata viene misurata in presenza dell’accettore (vita del donatore estinto). Questa differenza nella durata di fluorescenza del donatore viene utilizzata per calcolare l’efficienza FRET, che dipende dal numero di fotoni che presentano una riduzione della durata di fluorescenza. Di seguito è menzionato un protocollo dettagliato per determinare la formazione di un complesso ternario tra tre proteine qualsiasi esprimendo transitoriamente le proteine marcate fluorescenti in Nicotiana benthamiana e analizzando la loro interazione con BiFC-FRET-FLIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo dimostra l’uso del test FRET-FLIM basato su BiFC per accertare la formazione di un complesso ternario tra due monomeri di una proteina MADS-box e una proteina sensore di calcio. Il protocollo è adattato da un rapporto di Y. John Shyu et al. dove hanno sviluppato un metodo FRET basato su BiFC per visualizzare il complesso ternario formato tra eterodimeri Fos-Jun e NFAT o p65 utilizzando il metodo di emissione sensibilizzata7. In precedenza, un sistema FRET a tre fluorofori ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NB, GG, SB, KC ringraziano sinceramente la University Grants Commission (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE e il Council for Scientific and Industrial Research (CSIR) per le loro borse di ricerca. Per fortuna riconosciamo il Dipartimento di Biotecnologia (DBT), il Governo dell’India, il Dipartimento di Scienza e Tecnologia (DST-FIST), il Governo dell’India per il sostegno finanziario.
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
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