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Bioengineering

एक साथ ब्राइटफील्ड, फ्लोरेसेंस, और ऑप्टिकल जुटने से टोमोग्राफिक इमेजिंग ऑफ कॉन्ट्रैक्टिंग कार्डियक ट्रैबेकुले एक्स वीवो

Published: October 2, 2021 doi: 10.3791/62799
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1,2
1Auckland Bioengineering Institute, University of Auckland, 2Department of Engineering Science, University of Auckland

Summary

यह प्रोटोकॉल एक सक्रिय रूप से अनुबंध कार्डियक ट्रैबेकुला एक्स वीवोसे सारकोमेरे, कैल्शियम और स्थूल ज्यामितीय डेटा का संग्रह प्रस्तुत करता है। ये एक साथ माप तीन इमेजिंग तौर-तरीकों के एकीकरण से संभव होते हैं।

Abstract

हृदय की मांसपेशी में, इंट्रासेलुलर सीए2 + क्षणिक संकुचन माइफलामेंट को सक्रिय करते हैं, जिससे संकुचन, स्थूल छोटा और ज्यामितीय विरूपण होता है। इन घटनाओं के बीच आंतरिक संबंधों की हमारी समझ सीमित रही है क्योंकि हम मांसपेशियों के अंदर न तो 'देख' सकते हैं और न ही उत्तेजना-संकुचन गतिशीलता की स्थानिक-लौकिक प्रकृति को ठीक से ट्रैक कर सकते हैं। इन समस्याओं को हल करने के लिए, हमने एक उपकरण का निर्माण किया है जो इमेजिंग तौर-तरीकों के एक सूट को जोड़ती है। विशेष रूप से, यह सारकोमरे लंबाई और ऊतक तनाव के स्थानीय परिवर्तनों को मापने के लिए एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप को एकीकृत करता है, सीए2 + क्षणिक कल्पना करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप, और कार्डियक चक्र के समय-पाठ्यक्रम में ऊतक के ज्यामितीय परिवर्तनों को पकड़ने के लिए एक ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफ। हम यहां इमेजिंग इंफ्रास्ट्रक्चर और संबद्ध डेटा संग्रह फ्रेमवर्क पेश करते हैं। डेटा अलग रॉड की तरह ऊतक संरचनाओं से एकत्र कर रहे है trabeculae कार्नियाई के रूप में जाना जाता है । हमारे साधन में, स्थिति नियंत्रित प्लेटिनम हुक की एक जोड़ी एक पूर्व वीवो मांसपेशी नमूने के प्रत्येक छोर पकड़ जबकि यह लगातार पोषक तत्वों से भरपूर खारा समाधान के साथ superfused है । हुक स्वतंत्र नियंत्रण में हैं, मांसपेशियों की लंबाई और बल के वास्तविक समय नियंत्रण की अनुमति देते हैं। लंबाई के लिहाज से अनुवाद माइक्रोस्कोप इमेजिंग विंडो (540 माइक्रोन बाय 540 माइक्रोन) के सापेक्ष आकार से जुड़ी सीमाओं पर काबू पाने और एक ठेठ ट्राबेकुला (>2000 माइक्रोन) की लंबाई, नमूने की टुकड़े-टुकड़ी स्कैनिंग को सक्षम बनाता है। मांसपेशी कक्ष के दोनों छोर पर प्लेटिनम इलेक्ट्रोड उपयोगकर्ता-परिभाषित दर पर ट्राबेकुला को उत्तेजित करते हैं। हम स्थिर-राज्य स्थितियों के तहत पूरे नमूना हिल पुनर्निर्माण के लिए प्रत्येक इमेजिंग विंडो से डेटा को सिंक्रोनाइज़ करने के लिए एक ट्रिगर के रूप में उत्तेजना संकेत का फायदा उठाते हैं। इन ब्राइटफील्ड इमेजिंग डेटा के लिए छवि प्रसंस्करण तकनीकों को लागू करना ऊतक विस्थापन और सारकोमेरे लंबाई नक्शे प्रदान करता है। डेटा का ऐसा संग्रह, जब एक प्रयोग-मॉडलिंग पाइपलाइन में शामिल किया जाता है, तो शरीर विज्ञान और रोगविज्ञान में मांसपेशियों के संकुचन एकरूपता और विषमता की गहरी समझ प्रदान करेगा।

Introduction

अलग - अलग हृदय की मांसपेशी ऊतकों की तैयारी का सुपरफ्यूजन कार्डियक आयनिक सक्रियण औरयांत्रिकी 1का अध्ययन करने के लिए एक मानक और व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला प्रोटोकॉल है। विशेष रूप से, वेंट्रिकुलर दीवारों से ट्राबेकुला, रॉड जैसी संरचनाओं के अलगाव ने संकुचन 2 की लंबाई-निर्भर सक्रियण, संकुचन3,4,और हृदय ऊतक के डायस्टोलिक चिपचिपाहट5 की लंबाई-निर्भर सक्रियता सहित घटनाओं का आकलन करने में सक्षम बनाया है। अलग-थलग ट्रैबेकुले को सुपरफ्यूज करने की इस तकनीक के सर्जक टेर कीर्स ने शुरू में सारकोमरे लंबाई2,5निर्धारितकरने के लिए सीए2 + माप और लेजर विवर्तन के लिए फ्लोरेसेंस इमेजिंग के संयोजन का उपयोग किया। इन शुरुआती अध्ययनों के बाद से, ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी छवियोंपर 2डी फास्ट फोरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) आधारित तकनीकों का उपयोग करके अधिक स्थानिक संकल्प के साथ सारकोमेरे लंबाई जानकारी निकालना तेजी से आम हो गया है। दो इमेजिंग सिस्टम सीए2 + रिलीज और सारकोमेरे लंबाई पर निर्भर बल उत्पादन के बीच अंतर्निहित संबंधों का आंशिक आकलन करने की अनुमति देते हैं।

कार्डियक मांसपेशी को फितीर्ण किया जाता है, जिसमें मोटी और मोटी तंतुओं से मिलकर संकुचन इकाइयों की अंतर्निहित श्रृंखला से जुड़े दृश्यमान बैंडिंग होती है। इन घटक फिलामेंट्स की बातचीत जो सारकोमर को बनाती है, बल उत्पादन को रेखांकित करती है, जो इस प्रकार शुरू होती है: एक डीपोलराइजिंग इलेक्ट्रिकल सिग्नल, या एक्शन क्षमता, कोशिका झिल्ली में वोल्टेज-निर्भर एल-टाइप सीए2 + चैनलों को खोलने का कारण बनती है; सीए2 + की आगामी सेलुलर आमद सीए2 + रिलीज 7 के रूप में जानी जाने वाली प्रक्रिया में एक इंट्रासेल्युलर सीए2 + स्टोर, सरकोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) से सीए2+ की रिहाई को प्रेरित करतीहै; नैनोमोलर से माइक्रोमोलर रेंज तक इंट्रासेलुलर सीए2 + एकाग्रता में यह अचानक वृद्धि बल उत्पादन को सक्षम बनाती है; सीए2 + पंप लगातार सीए2 + को साइटोसोल से वापस एसआर और बाह्य कोशिकीय डिब्बे में बाहर निकालते हैं; जब इंट्रासेलर सीए2 + एकाग्रता नैनोमोलर रेंज में लौटती है, तो बल उत्पादन समाप्त हो जाता है, और मांसपेशियों में आराम मिलता है। बल उत्पादन के दौरान, घटक मोटी और पतली तंतुओं एक दूसरे पर स्लाइड । सारकोमेरे लंबाई ओवरलैप की सापेक्ष सीमा तय करती है और इसलिए, मांसपेशियों के बल उत्पादन की क्षमता मैक्रोस्कोपिक रूप से।

इस पेपर में, हम ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT) को शामिल करने के लिए इन फ्लोरेसेंस-ब्राइटफील्ड इमेजिंग तकनीकों का विस्तार करते हैं। OCT हस्तक्षेप के भौतिक सिद्धांत का उपयोग करता है और मांसपेशियों के संकुचन विषमता को समझने के लिए ऊतक के ज्यामितीय विरूपण को जुटाने में सक्षम है8. हमारा डिवाइस(चित्रा 1)एक स्पेक्ट्रल-डोमेन OCT (एसडी-OCT) सिस्टम का उपयोग करता है। एसडी-OCT में, एक बीम स्प्लिटर एक ब्रॉडबैंड शॉर्ट जुटना-लंबाई सुपरल्यूमिनेसेंट डायोड से प्रकाश को संदर्भ और माप हथियारों में विभाजित करता है। संदर्भ शाखा में एक निश्चित दर्पण होता है, और माप शाखा में प्रकाश को चलाने के लिए 2डी-गैलेवनोमीटर होता है। नमूने से प्रकाश बैकस्कैटर एकत्र किया जाता है और हस्तक्षेप पैटर्न बनाने के लिए संदर्भ शाखा में परावर्तित प्रकाश के साथ हस्तक्षेप करता है। स्पेक्ट्रल फ्रिंज की आवृत्ति में गहराई की जानकारी एन्कोड की जाती है। जानकारी निकालने के लिए, सिग्नल को स्पेक्ट्रोमीटर से गुजरना पड़ता है और परिणाम पर एक इनवर्स एफएफटी लागू होता है। इसी 1D सिग्नल विभिन्न गहराई पर संरचनाओं का प्रतिनिधित्व करता है, जो अपवर्तक सूचकांक9 (ए-स्कैन) में परिवर्तन के अनुरूप है। एक ही धुरी में लेजर स्टीयरिंग करके, एक ब्याज के नमूने (बी स्कैन) के एक पार अनुभाग का निर्माण कर सकते है और, इसी तरह, शेष धुरी में एक कदम वार पैटर्न में प्रक्रिया को दोहराने के द्वारा, एक त्रि-आयामी छवि (सी-स्कैन) उत्पन्न किया जा सकता है । विस्तार से, कोई भी बाहरी ट्रिगर के आधार पर दोहराने वाले समय-अलग विषय के लिए एक टुकड़े पर बी-स्कैन की एक श्रृंखला एकत्र कर सकता है और एक त्रि-आयामी स्कैन उत्पन्न करने के लिए दोहरा सकता है, जो एक समय-अलग प्लानर छवि10का प्रतिनिधित्व करता है।

तीन इमेजिंग सिस्टम को एकीकृत करने में, हमने निम्नलिखित दो सिद्धांतों पर विचार किया है। सबसे पहले, इमेजिंग सेंसर एक वैकल्पिक इमेजिंग मोडलिटी से प्रकाश का पता नहीं लगाना चाहिए, और दूसरा, भौतिक डिजाइन में कम से कम तीन एक साथ इमेजिंग विमानों के लिए मुफ्त जगह होनी चाहिए। पहली आवश्यकता को संबोधित करने के लिए, ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप एक उल्टे विन्यास में नमूना रोशन करने के लिए एक 660 एनएम तरंग दैर्ध्य एलईडी का उपयोग करता है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप एक एपिफ्लोरेसेंस कॉन्फ़िगरेशन में है जहां उत्सर्जित प्रकाश के उत्तेजन और संग्रह दोनों के लिए एक ही उद्देश्य लेंस का उपयोग किया जाता है। उत्तेजन प्रकाश में 340 एनएम और 380 एनएम के बीच की तरंगदैर्ध्य होती है, और एक फोटोमल्टीपीयर ट्यूब (पीएमटी) 510 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जित प्रकाश को मापता है। डिक्रोइक मिरर की एक जोड़ी इन दो ऑप्टिकल रास्तों को विपरीत माप(चित्रा 2)के साथ हस्तक्षेप किए बिना एक ही भौतिक पदचिह्न साझा करने में सक्षम करती है। अंत में, OCT 840 एनएम की केंद्रीय तरंगदैर्ध्य के साथ ब्रॉडबैंड (100 एनएम स्पेक्ट्रल चौड़ाई) प्रकाश का उपयोग करता है, जो अन्य दो तौर-तरीकों से अलग है। अक्टूबर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रकाश की कम सामंजस्य प्रकृति के कारण, ब्राइटफील्ड-फ्लोरेसेंस स्रोतों से कोई भी बिखरे हुए प्रकाश हस्तक्षेप पैटर्न में योगदान नहीं देगा जो गहराई से जानकारी को एन्कोड करता है। दूसरी आवश्यकता के लिए, केशिका ट्यूब के लिए आवास डिजाइन में नमूने के पूर्वकाल, अवर और बेहतर विमानों के लिए सुलभ ऑप्टिकल रास्ते हैं। प्रयोगों के दौरान, दो प्लेटिनम हुक ऑक्सीजनयुक्त क्रेब्स-हेन्सेलिट (केएच) समाधान के साथ एक केशिका ट्यूब के भीतर एक ट्रैबेकुला पकड़ते हैं। अक्टूबर का गैलेवनोमीटर हेड तीसरे ऑर्थोगोनल ऑप्टिकल प्लेन(चित्रा 3)का लाभ उठाने के लिए ब्राइटफील्ड-फ्लोरेसेंस इमेजिंग पाथवे के लिए ऑर्थोगोनली उन्मुख है।

यह पेपर कैल्शियम, सारकोमेरे लंबाई और मांसपेशियों की ज्यामिति को एक साथ इमेजिंग करने में सक्षम डिवाइस के निर्माण के लिए डिजाइन विचारों को रेखांकित करता है। इन माप क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए, हम एक वेंट्रिकुलर ट्रैबेकुला को अलग करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, आवश्यक बफर समाधानों की तैयारी, एक पूर्व वीवो ट्राबेकुला की हैंडलिंग और फ्लोरेसेंस लोडिंग में शामिल महत्वपूर्ण कदमों के साथ। अंत में, यह पेपर डेटासेट को अधिक उपयोगी दृश्यों में अनुवाद करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है।

Protocol

यूनिवर्सिटी ऑफ ऑकलैंड की एनिमल एथिक्स कमेटी ने चूहों की हैंडलिंग और टिश्यू सैंपल तैयार करने को मंजूरी दी ।

1. इमेजिंग अंशांकन

  1. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप पिक्सल अंशांकन
    1. माप कक्ष को आसुत पानी से भरें।
    2. माप कक्ष में प्रति माइक्रोन ज्ञात लाइनों के साथ एक विवर्तन झंझरी रखें।
    3. जब तक विवर्तन झंझरी स्पष्ट रूप से दिखाई न दे(चित्रा 4A)तक फ्रेम रेट [हर्ट्ज] को कैप्चर और समायोजित करने के लिए एफ 1 दबाएं। सुनिश्चित करें कि विवर्तन झंझरी फ्रेम के किनारे के साथ समानांतर चलाता है। पर कब्जा रोकने के लिए फिर से F1 दबाएं।
    4. कैप्चर करने के लिए कुल छवियां सेट करें? एक से, डिस्क में डेटा स्ट्रीम करने के लिए Ctrl + Shift + S दबाएँ, और F1 को डिफेक्शन झंझरी की छवि कैप्चर करने के लिए दबाें।
    5. ओपन इमेजजे और विवर्तन झंझरी छवि(फाइल > ओपन > सेलेक्ट कैलिब्रेशन इमेज) आयात करें। शिफ्ट होल्डिंग, एक लाइन है कि विवर्तन झंझरी के 20 प्रकाश और अंधेरे बैंड शामिल आकर्षित ।
    6. छवि को कैलिब्रेट करें(सेट स्केल > विश्लेषण करें)। चरण 1.1.5 से लाइन की लंबाई पिक्सल मूल्य में दूरी सेट करती है। ज्ञात दूरी मूल्य को प्रति माइक्रोन माप और लंबाई की इकाई को 20 गुना लाइनों में सेट करें। पैमाने का विलोम एक पिक्सेल द्वारा प्रतिनिधित्व माइक्रोमीटर की संख्या है।
  2. अक्टूबर गहराई संकल्प अंशांकन
    1. वर्नियर कैलिपर्स का उपयोग करके ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड की मोटाई को मापें।
    2. अक्टूबर लेजर स्रोत चालू करें।
    3. गैल्वानोमीटर सिर को कवर करें और पृष्ठभूमि हस्तक्षेप पैटर्न को मापने के लिए बीजी प्राप्त करें और इसे माप(चित्रा 4B) से घटाएं।
    4. अक्टूबर के माप शाखा में मापा ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड (चरण 1.2.1 से) क्लैंप करें।
    5. OCT इमेज देखने के लिए लाइव स्ट्रीम पर क्लिक करें. ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड को तब तक समायोजित करें जब तक कि यह बी-स्कैन के भीतर दिखाई न दे।
    6. बी-स्कैन इमेज कैप्चर करने के लिए, रेंज वाई (स्टेप्स) को एक में सेट करें, स्ट्रीम बी-स्कैन डेटापर क्लिक करें? और अधिग्रहणपर क्लिक करें ।
    7. बी-स्कैन इमेज को इमेजजे(फाइल > ओपन > सेलेक्ट बी-स्कैन)में आयात करें । शिफ्ट होल्डिंग, ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड की सीमाओं के बीच एक लाइन खींचते हैं।
    8. स्केल सेट करें(सेट स्केल > विश्लेषण करें)। चरण 1.2.1 में एकत्र माप के लिए ज्ञात दूरी निर्धारित करें।
    9. हवा में गहराई से संकल्प की गणना करने के लिए, माइक्रोस्कोप स्लाइड के अपवर्तक सूचकांक(एनग्लास = 1.5175)11 के लिए सही एनग्लासद्वारा प्रति पिक्सेल मूल्य माप गुणा करके।
      नोट: उद्धृत एनग्लास बोरोसिलिकेट ग्लास के लिए है। माइक्रोस्कोप स्लाइड विभिन्न सामग्रियों से बनाया जा सकता है। मापा स्लाइड के लिए उपयुक्त अपवर्तक सूचकांक का उपयोग करें ।
    10. मायोकार्डियम के लिए गहराई से संकल्प को स्केल करने के लिए, चरण 1.2.9 से मूल्य विभाजित करें। एनमायोकार्डियम = 1.38 (मूल्य पहले12की सूचना दी) द्वारा।

2. मांसपेशी नमूना तैयारी

  1. विच्छेदन रिग तैयार करें।
    1. विच्छेदन समाधान के कुछ डालो (तालिका 1में उल्लिखित) एक छोटे से धातु के कटोरे में और फ्रीजर में जगह के बारे में एक घंटे पहले दिल उत्तेजना ।
    2. सेटअप एक विच्छेदन रिग विच्छेदन समाधान सुनिश्चित करने के अच्छी तरह से ऑक्सीजनयुक्त (१००% ऑक्सीजन) है और टयूबिंग लाइनों में से प्रत्येक के माध्यम से निकाल दिया गया है । विच्छेदन कक्ष को ऑक्सीजनयुक्त विच्छेदन समाधान के साथ भरें और पर्फ्यूजन कैथेटर के चारों ओर शिथिल टाई 3/0 सीवन करें।
  2. दिल को आबकारी करें।
    1. गैसीय आइसोफ्लुन (ऑक्सीजन में 5% <) का उपयोग करके 8-10 सप्ताह पुराने विस्टार चूहे को एनेस्थेटाइज करें। टेल पिंचिंग करके संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
    2. एनेस्थेटाइज्ड चूहे को एक रीढ़ की स्थिति में रखें और पेट के क्षेत्र में हेपरिन समाधान (1000 आईयू/किलो) के साथ चमड़े का इंजेक्शन दें। हेपरिन को प्रसारित करने की अनुमति देने के लिए पांच मिनट के लिए संज्ञाहरण बनाए रखें।
    3. फ्रीजर से विच्छेदन समाधान युक्त धातु कटोरा पुनः प्राप्त करें और इसे इच्छामृत्यु पीठ के पास रखें।
      नोट: विच्छेदन समाधान को पूरी तरह से ठंडा करने से बचें ताकि विच्छेदित हृदय की पूर्ण पनडुब्बी को सक्षम किया जा सके।
    4. एनेस्थेटाइज्ड चूहे को इच्छामृत्यु पीठ में स्थानांतरित करें और सर्वाइकल अपभ्रंश द्वारा इच्छामृत्यु करें।
    5. रिबकेज की पार्श्व सीमाओं पर आगे बढ़ने से पहले, चूहे की छाती को कैंची से खोलें, पहले रिबकेज के नीचे शरीर की दीवार को काटना, फिर डायाफ्राम। सीने को रास्ते से बाहर उठाएं।
    6. एक हाथ से दिल को पकड़ो जबकि दूसरा हाथ कनेक्टिंग जहाजों (महाधमनी, वेना कावा, आदि) को काटने के लिए घुमावदार कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करता है।
    7. ठंड विच्छेदन समाधान में दिल को जल्दी से पनडुब्बी करें।
  3. एक ट्रैबेकुला को अलग करें।
    1. महाधमनी की पहचान करें जबकि दिल धातु के कटोरे में है, फिर दिल को विच्छेदन कक्ष में स्थानांतरित करें। दो घुमावदार संदंश का उपयोग करके, परफ्यूजन कैनुला पर महाधमनी खींचें।
    2. एक संदंश के साथ जगह में महाधमनी पकड़ो। इस बीच, विच्छेदन समाधान को परफ्यूजन कैनुला के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए ट्यूबिंग लाइन खोलें।
      नोट: दिल उत्तेजना के बाद मिनट के भीतर पर्फ्यूजन को पूरा करने का लक्ष्य रखें।
    3. एक बार कोरोनरी वाक्यूलेचर रक्त से साफ हो जाता है और दिल विच्छेदन समाधान के साथ पूरी तरह से प्रेरित होता है, परफ्यूजन प्रवाह को रोकता है, और सीवन का उपयोग करके महाधमनी को सुरक्षित करता है। प्रवाह को वापस चालू करें और कैनोलेटेड दिल को छिद्रित करें।
    4. कैनुला को घुमाएं ताकि बेहतर सतह पर बाईं कोरोनरी धमनी दिखाई दे। विच्छेदन कक्ष(चित्रा 5A)के नीचे दिल के शीर्ष पिन करें। दोनों अटरिया(चित्रा 5B)को काट लें ।
    5. वसंत कैंची के एक सेट के साथ, दिल के शीर्ष पर पट के दाईं ओर कटौती (जैसा कि चित्र 5Bपर इंगित किया गया है)। विच्छेदन कक्ष के आधार पर खोला गया बाएं वेंट्रिकल को पिन करें। फिर पट के बाईं ओर काटें, दाएं वेंट्रिकल को खोलें, और इसे विच्छेदन कक्ष के आधार पर पिन करें, भी(चित्रा 5C)।
      नोट: एक खुली स्थिति में वेंट्रिकल पिन करने के लिए, कुछ पेपिलरी मांसपेशियों को काटना होगा। सही वेंट्रिकल(चित्रा 5D-ई)में एक मुक्त चलने वाले ट्रैबेकुला की पहचान करें।
    6. वसंत कैंची और एक संदंश का उपयोग करके, ट्राबेकुला के आसपास की दीवार के ऊतकों को काटें, फिर दीवार के ऊतकों को आधे ऑर्थोगोनली में ट्राबेकुला की दिशा में काटें। दीवार के ऊतकों को तब तक ट्रिम करें जब तक कि इसका आयाम बढ़ते विन्यास के लिए उपयुक्त न हो जाए। इस मामले में, तिल के बीज(चित्र 5F)का लगभग आधा आकार।
      नोट: ट्राबेकुला को दाएं और बाएं वेंट्रिकल से विच्छेदित किया जा सकता है, लेकिन बाईं ओर से वे आम तौर पर अधिक टर्बिड होते हैं और सारकोमेरे और ज्यामिति माप के लिए कम लागू होते हैं।
    7. विच्छेदन कक्ष में उत्पादित ट्रैबेकुला छोड़ दें, लगातार विच्छेदन समाधान के साथ सुपरफ्यूज।

3. प्रायोगिक प्रोटोकॉल

नोट: इस प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले डिवाइस13 को इन-हाउस बनाया गया था और कस्टम कंट्रोल कोड का उपयोग करता है। इन डेटा को दोहराने के लिए बनाए गए डिवाइस के डिजाइन के लिए आवश्यक विचार दो स्वतंत्र रूप से एक्ट्यूएटेड बढ़ते हुक, तीन ऑप्टिकली स्पष्ट कुल्हाड़ियों(चित्रा 3)के साथ एक माप कक्ष और एक बाहरी ट्रिगर लाइन है जो उत्तेजक के साथ ब्राइटफील्ड और OCT कैमरों को सिंक्रोनाइज करता है। पीएमटी वोल्टेज और फोर्स सिग्नल एनालॉग डीएक्यू कार्ड का उपयोग करके एकत्र किए गए थे, अक्टूबर और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप से छवियों को कैमरा लिंक फ्रेम-हथियाने वाले कार्ड का उपयोग करके एकत्र किया गया था, और डिजिटल I/O कार्ड का उपयोग करके उत्तेजना संकेत एकत्र किया गया था। अस्थायी संरेखण बनाए रखने के लिए उत्पादक उपभोक्ता छोरों के एक सेट का उपयोग करके डेटा को ऑफ़लाइन संग्रहीत किया गया था।

  1. कार्डियोमायोमीटर तैयार करें।
    1. फ्लश गर्म (~ 60 डिग्री सेल्सियस) पानी, आसुत पानी (कमरे का तापमान), और फिर माप कक्ष के माध्यम से समाधान सुपरफ्यूज़ेट करें। लगातार कार्बोजन के साथ सुपरफ्यूज समाधान बुलबुला।
    2. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप रोशनी स्रोत चालू करें और कैप्चर(चित्रा 4A)को सक्षम करने के लिए F1 दबाएं। जब तक यह ब्राइटफील्ड छवि में केंद्रित न हो जाए तब तक नीचे के हुक को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। क्लिक करें जीरो डाउनस्ट्रीम एक्सिस,फिर डाउनस्ट्रीम डिसेबल्ड मोटर(चित्रा 4C)को सक्षम करने के लिए हुक के अंत तक डीएस सेटपॉइंट [उम] स्लाइडर को ब्याज के डिफ़ॉल्ट क्षेत्र के किनारे के साथ संरेखित करें।
      1. डाउनस्ट्रीम अक्ष को फिर से शून्य करें, फिर डीएस सेटपॉइंट [उम] स्लाइडर को 1000 में ले जाएं। अपस्ट्रीम हुक के साथ प्रक्रिया दोहराएं, लेकिन यूएस सेटपॉइंट [उम] स्लाइडर को स्थानांतरित न करें।
    3. क्लिक करें मूव टू माउंटिंग (चित्रा 4C)।
    4. मुख्य स्विच को जल्दी से चालू करने से पहले लैंप स्विच को थोड़ा करके फ्लोरेसेंस रोशनी प्रणाली शुरू करें।
      नोट: कुछ यूवी प्रकाश स्रोत बड़ी मात्रा में ओजोन का उत्पादन करते हैं। यदि यह मामला है, तो प्रकाश स्रोत के आउटलेट वेंट से ओजोन चिमटा कनेक्ट करें और यह सुनिश्चित करें कि यह फ्लोरेसेंस रोशनी स्रोत को चालू करने से पहले चल रहा है।
    5. फ्रंट पैनल पर मोड बटन दबाकर ऑपरेशनल मोड को टर्बो-ब्लैंकिंग में स्विच करें, इसके बाद 2,फिर 1। कंट्रोल कोड को ऑपरेशन की जानकारी देने की अनुमति देने के लिए ऑन लाइन बटन दबाएं।
  2. ट्राबेकुला माउंट।
    1. माप कक्ष के माध्यम से सुपरफ्यूसेट प्रवाह को रोकें। विच्छेदन समाधान के साथ बढ़ते कक्ष भरें।
    2. 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, विच्छेदन कक्ष से बढ़ते कक्ष(चित्रा 5G)तक ट्रैबेकुला का परिवहन करें।
    3. ट्राबेकुला को स्थानांतरित करने के लिए, सिरिंज को खड़ी और बढ़ते कक्ष समाधान की सतह के संपर्क में रखें। ट्राबेकुला को गुरुत्वाकर्षण(चित्रा 5H)के माध्यम से बढ़ते कक्ष में उतरने की अनुमति दें।
    4. बढ़ते कक्ष में तरल पदार्थ के स्तर को कम करें ताकि यह हुक के मिडसेक्शन के साथ स्तर में हो।
    5. डीएस सेटपॉइंट [उम] स्लाइडर को स्थानांतरित करके ट्राबेकुला की सुस्त लंबाई को प्रतिबिंबित करने के लिए हुक के बीच की दूरी को समायोजित करें।
    6. दृश्य सहायता करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, हल्के से संदंश के साथ अंत ऊतक के टुकड़ों में से एक पकड़ और यह अपस्ट्रीम हुक पर माउंट । डाउनस्ट्रीम हुक(चित्रा 5I)पर अंत ऊतक के दूसरे टुकड़े माउंट ।
    7. एक बार सुरक्षित रूप से घुड़सवार होने के बाद, ट्राबेकुला को चैंबर (चित्रा4C)में लेप दबाकर मापन कक्ष(चित्रा 5J)में वापस ले जाएं। सुपरफ्यूसेट प्रवाह और तरल पदार्थ निकालने को फिर से शुरू करें।
    8. 1 को प्रोत्साहन आवृत्ति [हर्ट्ज] सेट करें, उत्तेजना अवधि [एमएस] 10, और उत्तेजना वोल्टेज 10 को। पर उत्तेजना दबानेसे उत्तेजना शुरू करो? ।
  3. ट्राबेकुला तैयार करें।
    1. अनुकूलन के बारे में 1 एच के बाद, धीरे-धीरे क्रमशः 1 वी और 1 एमएस चरणों में उत्तेजना वोल्टेज और उत्तेजना अवधि को कम करें। मूल्यों का एक विशिष्ट सेट 3 वी और 3 एमएस है।
    2. ब्राइटफील्ड रोशनी प्रणाली चालू करें। F1 दबाएं और रुचि के एक क्षेत्र का चयन करें जो उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस पर एक स्ट्रेटेड क्षेत्र को संलग्न करता है। क्लिक करें एसएल की गणना करें? हाइलाइट किए गए क्षेत्र में औसत सारकोमेरे लंबाई की गणना करने के लिए। मांसपेशियों की लंबाई बढ़ाएं जब तक कि सेपरेशन सेटपॉइंट [उम] स्लाइडर बढ़ाकर औसत सारकोमर की लंबाई 2.32 माइक्रोन न हो जाए।
      नोट: गणना SL? चरण 4.3 में उल्लिखित 2D एफएफटी का उपयोग करता है। औसत सारकोमेरे लंबाई की गणना करने के लिए उपयोग किया जाने वाला ब्याज का क्षेत्र आमतौर पर 100 माइक्रोन से 150 माइक्रोन वर्ग होता है। इसलिए, चूंकि मांसपेशी इष्टतम सारकोमेरे लंबाई तक पहुंचती है, इसलिए औसत सारकोमर लंबाई की गणना करने के लिए 43 से 65 सारकोमर का उपयोग किया जाता है।
    3. केंद्रऔर पृथक्करण नियंत्रण टैब(चित्रा 4C)पर केंद्र सेटपॉइंट [उम] स्लाइडर को समायोजित करके मांसपेशियों को स्थानांतरित करें ताकि डाउनस्ट्रीम हुक का किनारा सिर्फ ब्राइटफील्ड छवि के भीतर दिखाई दे। दस झटकों के लिए फ्लोरेसेंस की जानकारी लीजिए।
    4. केंद्र सेटपॉइंट [उम] मूल्य को 200 तक बढ़ाएं और फ्लोरेसेंस की जानकारी के लायक दस झटकों को एकत्र करें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि ब्राइटफील्ड इमेज में अपस्ट्रीम हुक न हो। फ्लोरेसेंस जानकारी के अंतिम खिड़की के मूल्य को इकट्ठा करें।
    5. केंद्र सेटपॉइंट [उम] मूल्य को 0 तक स्थापित करके ट्राबेकुला को केंद्रीय स्थिति में लौटा दें।
    6. उत्तेजना आवृत्ति को 0.2 हर्ट्ज तक कम करें और केएच सुपरफ्यूसेट से फुरा-2 लोडिंग समाधान (तालिका 1में विस्तृत) में स्विच करें।
    7. स्टिम और डेटा टैब पर सक्षम फ्लोरेसेंस स्रोत पर क्लिक करके हर 10 मिनट में फ्लोरेसेंस सिग्नल को मापें। पीएमटी सिग्नल टैब पर फ्लोरेसेंस सिग्नल की कल्पना करें।
    8. 360 एनएम सिग्नल के बाद 10 के कारक से वृद्धि हुई है या लोडिंग प्रक्रिया की अवधि 2 घंटे से अधिक हो गई है, उत्तेजना आवृत्ति को 1 हर्ट्ज में वापस करें और केएच सुपरफ्यूसेट समाधान पर वापस स्विच करें।
    9. अनुपात माप स्थिर होने तक हर 10 मिनट में अनुपात माप की जांच करें, जिस पर बिंदु डेटा संग्रह शुरू हो सकता है।
  4. ब्राइटफील्ड- और फ्लोरेसेंस-इमेजिंग डेटा एकत्र करें।
    1. मांसपेशियों को उस स्थिति में लौटाएं जहां डाउनस्ट्रीम हुक का किनारा ब्राइटफील्ड छवि के भीतर मौजूद है। हार्डवेयर-कंट्रोल यूजर इंटरफेस के स्टिम और डेटा टैब पर डिस्क करने के लिए स्ट्रीम डेटा पर क्लिक करके हार्डवेयर डेटा स्ट्रीम करना शुरू करें। सक्षम फ्लोरेसेंस सोर्स पर क्लिक करके फ्लोरेसेंसकी जानकारी कैप्चर करें ।
    2. ब्राइटफील्ड इमेजिंग यूजर इंटरफेस पर, कैप्चर मोड को बाहरी ट्रिगर पर सेट करें, फ्रेम दर को 100 हर्ट्ज तक बढ़ाएं, और 100 तक कैप्चर करने के लिए छवियों की संख्या सेट करें। प्रेस Ctrl + शिफ्ट + एस इस विंडो के लिए ब्राइटफील्ड इमेजिंग डेटा रिकॉर्ड करने के लिए F1 के बाद ।
    3. 200 तक केंद्र सेटपॉइंट [उम] मूल्य बढ़ाएं और चरण 3.4.2 दोहराएं। स्कैनिंग प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें जब तक इमेजिंग डेटा चरण 3.3.4 से अंतिम विंडो के लिए एकत्र किया गया है।
    4. केंद्र सेटपॉइंट [उम] मूल्य को 0 तक स्थापित करके ट्राबेकुला को केंद्रीय स्थिति में लौटा दें।
  5. OCT इमेजिंग डेटा एकत्र करें।
    1. | के लिए मास्टर कुंजी मोड़ द्वारा OCT लेजर स्रोत चालू करें प्रतीक, पावर बटन दबाने, SLDs बटन के बाद।
    2. गैल्वानोमीटर सिर को कवर करें और पृष्ठभूमि हस्तक्षेप पैटर्न को मापने के लिए बीजी प्राप्त करें और इसे माप(चित्रा 4B) से घटाएं।
    3. लाइव-व्यू के लिए इमेज कैप्चर मोड सेट करें।
    4. वाई-स्थितिको तब तक समायोजित करें जब तक कि बी-स्कैन छवि में केवल अपस्ट्रीम हुक न हो। नियंत्रण फ्रंट पैनल(चित्रा 4B)पर प्रदर्शित मांसपेशियों की लंबाई को दो से विभाजित करें और वर्तमान वाई-स्थितिको घटाएं। इस मूल्य को"वाई-ऑफसेट"इनपुट में दर्ज करें। ट्राबेकुला के क्रॉस-सेक्शन फ्रेम में केंद्रित होने तक"एक्स-ऑफसेट"मूल्य को समायोजित करें।
    5. ट्रैबेकुला केंद्रित के साथ, ऊपर और डाउनस्ट्रीम हुक के अनुरूप स्थिति को खोजने के लिए वाई-पोजीशनको समायोजित करके वाई-एक्सिसके साथ स्कैन करें। इन पदों को नीचे नोट करें। दस से विभाजित इन मूल्यों के बीच पूर्ण अंतर के लिए रेंज वाई (चरण) सेट करें।
    6. इमेज कैप्चर मोड को उत्तेजना ट्रिगर करने के लिए सेट करें?, रेंज एक्स (चरण) 100 तक, और सेट एक्टिव पैरामीटर बटन पर क्लिक करें।
    7. स्ट्रीम बी-स्कैन डेटा परक्लिक करें? , फिर अधिग्रहण।
      नोट: गेटेड इमेजिंग प्रोटोकॉल की लंबाई में 2 मिमी के नमूने के लिए पूरी मांसपेशियों की ज्यामिति को पकड़ने के लिए 200 चिकोटी की आवश्यकता होती है, जो ~ 3 मिनट 20 एस के कैप्चर समय से मेल खाती है।

4. ब्राइटफील्ड इमेज डेटासेट को प्रोसेस करें

  1. विश्लेषण के लिए छवियों को तैयार करें।
    1. इमेजजे में आयात चित्र(फाइल > आयात > इमेज सीक्वेंस > चुनिंदा छवि)।
    2. इमेज कंट्रास्ट बढ़ाएं(इमेज > इमेज हिस्टोग्राम को केंद्रीकृत करने के लिए > ब्राइटनेस/कंट्रास्ट > मूव मिनिमम और मैक्सिमम स्लाइडर्स को एडजस्ट करें)।
    3. छवियों को पैनापन(फ़िल्टर > > प्रक्रिया > अनशारप मास्क > सेट रेडियस (सिग्मा) को 1.0 पिक्सल और मास्क वजन (0.1-0.9) से 0.6) तक) ।
    4. इमेज सीक्वेंस का निर्यात करें(> इमेज सीक्वेंस के रूप में सहेजें > पीएनजी के लिए प्रारूप सेटकरें, 0 से शुरू करें और अंक (1-8) से 4) करें।
  2. छवियों को सिलाई करें, स्थानीयकृत विस्थापन को मापें, और स्थानीय सारकोमेरे लंबाई की गणना करें।
    1. "ट्राबेकुलाप्रोसेसिंग.m" (अनुरोध पर उपलब्ध) खोलें और फ़ोल्डरपाथ वेरिएबल को सभी डेटा वाले मुख्य फ़ोल्डर पर सेट करें, और इमेजपाथ को फ़ोल्डर में जहां चरण 4.1.4 से छवि अनुक्रम सहेजा गया था। इमेजिंग खिड़कियों और फ्रेम की संख्या के लिए अनुभागों को प्रति खिड़की पर कब्जा कर लिया फ्रेम की संख्या के लिए सेट करें।
    2. कोड चलाएं।
      नोट: आउटपुट उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट आउटपुट फ़ोल्डर पथ में मौजूद होंगे। (डिफ़ॉल्ट रूप से, रास्ता फ़ोल्डरपाथ/आउटपुट के लिए सेट है)।
  3. एफएफटी सारकोमेरे लंबाई तकनीक
    1. छवि के उस क्षेत्र पर एफएफटी करने के लिए इमेज-प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें जहां सारकोमर अत्यधिक दिखाई देते हैं।
    2. ब्याज की स्थानिक आवृत्तियों की सीमा प्राप्त करने के लिए विलोम की गणना करने से पहले स्टेप 1.1.6 से 1.6 माइक्रोन और 3.0 माइक्रोन से पिक्सल प्रति माइक्रोन अंशांकन परिणामों को गुणा करें।
    3. चरण 4.3.2 में गणना की गई आवृत्ति सीमा में आवृत्ति जानकारी की अनदेखी करते हुए एफएफटी परिणाम के लिए एक घातीय फिट करें, और डीसी टर्म को हटाने के लिए इसे ट्रांसफॉर्म परिणाम से घटाएं।
    4. ब्याज की आवृत्ति बैंड के लिए एक गॉसियन वक्र फिट करें।
    5. गॉसियन वक्र के शिखर के विलोम की गणना करें। यह ब्याज के क्षेत्र के लिए औसत सारकोमेरे लंबाई है ।
      नोट: एफएफटी गणना और घातीय और गॉसियन समीकरणों की फिटिंग कस्टम लैबव्यू कोड का उपयोग करके की गई थी।

5. फ्लोरेसेंस डेटा को संसाधित करें

  1. खिड़की पर निर्भर ऑटोफ्लोरेसेंस को संबंधित विंडो से घटाएं और 340 एनएम और 380 एनएम उत्तेजन तरंगदैर्ध्य से जुड़े संकेतों के भागफल की गणना करें।

6. अक्टूबर इमेजिंग डेटा की प्रक्रिया

  1. विभाजन के लिए सेट की गई OCT छवि तैयार करें।
    1. इमेजजे खोलें और छवियों को आयात करें(फाइल > आयात > इमेज सीक्वेंस)। फ़ाइल एक्सप्लोरर विंडो पर, यह खुलता है, छवियों का पता लगाएं, एक का चयन करें और ओपनपर क्लिक करें।
      नोट: यदि OCT के लिए नियंत्रण कोड छवियों को इमेजजे द्वारा पठनीय प्रारूप में संग्रहीत नहीं करता है, तो उन्हें पीएनजी में परिवर्तित करें।
    2. विज़ुअलाइज़ेशन को कम करने के लिए, इमेज सीक्वेंस को हाइपरस्टैक में व्यवस्थित करें(इमेज > हाइपरस्टैक > स्टैक टू हाइपरस्टैक)। संवाद बॉक्स में है कि खुलता है, स्लाइस की संख्या के लिए स्लाइस की संख्या सेट-टुकड़ा प्रति स्कैन और एक्स trabecula की लंबाई के साथ स्लाइस की संख्या के लिए ।
    3. एक आयत तैयार करें जो ट्राबेकुला को संलग्न करता है। पुष्टि करें कि यह हाइपरस्टैक विंडो पर स्लाइडर्स का उपयोग करके समय के माध्यम से पूरी मात्रा को संलग्न करता है। छवि को खिड़की पर क्रॉप करें(इमेज > क्रॉप)।
    4. स्लाइस है कि बढ़ते हुक(ढेर > उपकरण > स्लाइस कीपर) कीछवियों को शामिल निकालें । स्लाइस की सीमा का चयन करें जिसमें केवल ट्राबेकुला जानकारी होती है।
  2. ट्रेन WEKA विभाजन।
    1. ओपन WEKA सेगमेंटेशन(प्लगइन्स > सेगमेंटेशन > ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन)।
    2. फ्रीहैंड के लिए चयन मोड सेट करें।
    3. सेटिंग पर क्लिक करें और क्लासिफायर और ट्रेनिंग सेटिंग्स को एडजस्ट करें। (इस मॉडल के लिए, निम्नलिखित प्रशिक्षण सुविधाओं का उपयोग किया गया था: गॉसियन धुंधला, सोबेल फिल्टर, हेसियन, गॉसियन का अंतर, झिल्ली अनुमान, द्विपक्षीय और लिप्सचिट्ज। झिल्ली की मोटाई 1, झिल्ली पैच आकार को 8, न्यूनतम सिग्मा को 1, और अधिकतम सिग्मा को 32 तक सेट किया गया था। क्लासिफायर को फास्टरैंडोमफॉरेस्ट के लिए सेट किया गया था और क्लासिफायर विकल्प ों को सेट किया गया था: बैचसाइज 100, मैक्सडेप्थ से 32, 32 को एनुमेचर, नुंए थरेड को 0, और न्यूट्री को 200 करने के लिए।)
    4. प्रशिक्षण के परिणामस्वरूप संतोषजनक विभाजन होने तक मैन्युअल रूप से छवियों को खंडित करें।
    5. क्लासिफायर को बचाएं।
  3. प्रोसेस्ड बी-स्कैन सेगमेंट करें
    1. चरण 6.2.1 के बाद WEKA विभाजन लॉन्च करें।
    2. स्टेप 6.2.5 से क्लासिफायर लोड करें।
    3. क्लिक करें रिजल्ट बनाएं।
    4. छवियों को 8-बिट में परिवर्तित करें(इमेज > टाइप > 8-बिट)।
    5. छवियों को बाइनरी में परिवर्तित करें(बाइनरी > > प्रक्रिया बाइनरी > डिफ़ॉल्ट विधि और डिफ़ॉल्ट पृष्ठभूमिबनाएं)।
    6. इमेज सीक्वेंस (पीएनजी) के रूप में सहेजें।
  4. खंडित बी-स्कैन छवियों में औसत सीएसए की गणना करें।
    1. बाइनरी बी-स्कैन इमेज में वाइट पिक्सल की संख्या गिनें।
    2. पिक्सेल क्षेत्र को कैलिब्रेटेड गहराई रिज़ॉल्यूशन (चरण 1.2 से) और 10 माइक्रोन (पड़ोसी ए-स्कैन के बीच की दूरी) द्वारा गुणा करें।
    3. हुक और औसत माप के बीच बी स्कैन के सभी के लिए दोहराएं ।
  5. खंडित छवि को जाल में परिवर्तित करें।
    1. "ओक्टेन.m" (अनुरोध पर उपलब्ध) खोलें और चरण 6.3.6 से आउटपुट वाले फ़ोल्डर के लिए इमेजडायरेक्ट्री सेट करें। आवश्यक के रूप में आउटपुटपाथ सेट करें।
    2. "रेंज वाई (चरण) के मूल्य के लिए स्लाइस सेट करें " (चरण 3.5.5) और "रिपीट एक्स" (चरण 3.5.6) के मूल्य के लिए फ्रेम, गहराई संकल्प (चरण 1.2.10) के z_dim, और x_dim और 10 को सौंपे गए मूल्य के y_dim।
    3. रन परक्लिक करें ।

Representative Results

यहां प्रस्तुत ट्राबेकुला की पूरी लंबाई के लिए क्षेत्रीय सीए2 + और ब्राइटफील्ड जानकारी को पकड़ने के लिए, सात मांसपेशियों की स्थिति की आवश्यकता थी। चित्र 6 से पता चलता है कि चिकोटी बल इस प्रस्ताव से अशान्त था, खुलासा है कि वहां सक्रिय बल उत्पादन की कोई स्थिति निर्भरता थी ।

100 हर्ट्ज की दर से ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग करके एकत्र किए गए बी-स्कैन को इमेजजे प्लगइन WEKA14 (चित्रा 7A)का उपयोग करके खंडित किया गया था। पार्श्व (10 माइक्रोन) और गहराई (1.73 माइक्रोन (मायोकार्डियम में) संकल्पों के बीच अंतर के कारण प्रत्येक क्रॉस-सेक्शन विकृत दिखाई देता है। पार्श्व संकल्प-गहराई संकल्प अनुपात द्वारा छवि की गहराई धुरी को स्केल करके इस विरूपण को ठीक किया गया था। चित्रा 7B,सी प्रदर्शित करता है कि ट्राबेकुला के कच्चे सी-स्कैन को स्केल करने के बाद यह ज्यामिति में लगभग बेलनाकार है। माप कक्ष की दीवार का प्रतिबिंब कभी-कभी मांसपेशियों के डेटा(चित्रा 7 ए,बी)के साथ ओवरलैप हो सकता है, लेकिन विभाजन सॉफ्टवेयर को इसके लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है(चित्रा 7D,ई)। एक बार खंडित होने के बाद, मांसपेशियों की लंबाई के साथ क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र की गणना पूरे चिकोटी(चित्रा 7F)में की जा सकती है। ध्यान दें कि इस विशेष ट्रैबेकुला में इससे एक छोटा सा उपांग शाखा है। शाखा की गति स्पष्ट है ~ 0.75 मिमी trabecula के साथ. अंत में, ज्यामितीय मॉडल(चित्रा 7G)के निर्माण में सहायता करने के लिए खंडित छवियों को meshes में परिवर्तित किया जा सकता है।

100 एफपीएस की दर से अलग-अलग ट्राबेकुला पदों में से प्रत्येक पर कैप्चर किए गए इमेजिंग डेटा को ट्राबेकुला(चित्रा 8A)की एक पूरी छवि बनाने के लिए एक साथ सिले गए थे। इन छवियों का रेजोल्यूशन 0.535 माइक्रोन/पिक्सल है। पड़ोसी खिड़कियों के ओवरलैपिंग क्षेत्रों में रैखिक भार कार्यों का उपयोग दृश्य को सहायता देता है और ब्राइटफील्ड छवियों में मौजूद विग्नेट के प्रभाव को कम करता है। फ्लोरोसेंट सिग्नल को मापने के लिए, ट्राबेकुला की 540 माइक्रोन विंडो द्वारा 540 माइक्रोन विंडो चक्रीय रूप से 340 एनएम, 365 एनएम और 600 हर्ट्ज की दर से 380 एनएम तरंगदैर्ध्य प्रकाश के साथ प्रकाशित की गई है। 340 एनएम और 380 एनएम एक्सटिटेशन लाइट से जुड़े उत्सर्जित फ्लोरेसेंस का अनुपात ट्रासेलुलर कैल्शियम से संबंधित है। चूंकि यह माप एक अनुपात है, प्रभावी माप दर 200 हर्ट्ज है। प्रत्येक विंडो से औसत(एन = 10) इंट्रासेलुलर सीए2 + यात्रियों को उस क्षेत्र के साथ गठबंधन किया जाता है जिस पर उन्हें चित्रित किया गया था(चित्र 8बी)। जबकि यात्रियों की चोटी काफी सुसंगत दिखाई देती है, डायस्टोलिक [सीए2 +] इस क्षेत्र के भीतर 900 माइक्रोन और 1800 माइक्रोन के बीच कम है। इसी तरह, विस्थापन ट्रैकिंग(चित्रा 8सी)और सारकोमेरे लंबाई(चित्रा 8 डी)गणना के परिणाम भी क्षेत्रीय परिवर्तनशीलता की उपस्थिति का संकेत देते हैं। उपयोग की जाने वाली मार्करलेस ट्रैकिंग तकनीक पर्याप्त विपरीत देखते हुए प्रत्येक पिक्सेल के विस्थापन को संसाधित करने में सक्षम है। पोस्ट में सारकोमेरे लंबाई के वितरण का मानचित्रण करते समय, क्षेत्रीय सारकोमेरे लंबाई की गणना करने के लिए 128 पिक्सल (~ 67 माइक्रोन बाय 67 माइक्रोन) के क्रॉस-सहसंबंध क्षेत्र का उपयोग किया गया था। यह क्षेत्र लगभग 29 सारकोमर को समाहित करता है जब नमूना बंद इष्टतम सारकोमर लंबाई के करीब होता है। प्रत्येक क्रॉस-सहसंबंध विंडो के केंद्र के बीच चरण-आकार (एक्स-और वाई-डायरेक्शनदोनों में) इन डेटा को संसाधित करने के लिए 50 पिक्सल (~ 26 माइक्रोन) के लिए सेट किया गया था। सारकोमेरे लंबाई अनुमानों की उपयुक्तता का परीक्षण एफएफटी सिग्नल के लिए गॉसियन फिट की चौड़ाई और आयाम के आधार पर किया गया था। इन स्थितियों को मांसपेशियों के क्षेत्र में 0 माइक्रोन और 500 माइक्रोन के बीच पूरा नहीं किया गया था इसलिए वहां कोई सारकोमेरे लंबाई जानकारी की गणना नहीं की जा सकती थी। संबद्ध विस्थापन को देखते हुए, यह संभावना है कि इस क्षेत्र में सारकोर्स अनुबंध चरण के दौरान लम्बी हो गई। इस अटकलों को ध्यान में रखते हुए, उस अवधि के दौरान ट्राबेकुला के दाहिने हाथ की ओर औसत सारकोमेरे लंबाई छोटा हो जाती है। प्रत्येक पैनल द्वारा प्रदान की गई जानकारी के संयोजन से, ऐसा लगता है कि सबसे बड़े क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र वाला क्षेत्र सबसे महत्वपूर्ण बल का उत्पादन नहीं करता है। इस धारणा पर कि सीए2 + यात्रियों की क्षेत्रीय भिन्नता में लगभग चिकनी ढाल है, चित्रा 8B इंगित करता है कि सबसे बड़ा आयाम Ca2 + क्षणिक ट्राबेकुला के साथ 1300 माइक्रोन और 1600 माइक्रोन के बीच कहीं होता है। विस्थापन मानचित्र इंगित करता है कि सबसे कम गति से गुजरने वाला क्षेत्र पीक सीए2 + क्षणिक के साथ अच्छी तरह से संरेखित होता है। हालांकि, इस क्षेत्र में नमूने का सबसे छोटा क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र है। इन आंकड़ों को ध्यान में रखते हुए, कोई यह अनुमान लगा सकता है कि इस क्षेत्र ने सबसे अधिक तनाव उत्पन्न किया ।

Figure 1
चित्रा 1:कार्डियोमायोमीटर की एनोटेटेड छवि। प्रत्येक मुख्य ऑप्टिकल घटकों को रेखांकित किया गया है। इनसेट में माप कक्ष के नीचे, सीटू मेंमाइक्रोस्कोप उद्देश्य का एक क्लोज-अप, रियर-व्यू शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:एक साथ ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए ऑप्टिकल मार्ग। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के लिए रोशनी स्रोत एक ज़ेनन आर्क लैंप है, जिसका आउटपुट चक्रीय रूप से 340 एनएम, 365 एनएम और 380 एनएम प्रकाश के बीच स्विच करता है। आर्क लैंप आउटपुट पथ में 409 एनएम की कट-ऑफ तरंगदैर्ध्य के साथ एक डिक्रोइक मिरर होता है जो यूवी प्रकाश को दर्पण पर प्रतिबिंबित करता है जो प्रकाश को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप उद्देश्य में निर्देशित करता है। लेंस नमूने पर उत्तेजन प्रकाश केंद्रित करता है और उत्सर्जित प्रकाश एकत्र करता है, जिसमें 510 एनएम की लंबी तरंगदैर्ध्य होती है। यह उत्सर्जित प्रकाश पहले डिक्रोइक दर्पण से गुजरता है, लेकिन दूसरा नहीं, क्योंकि इसमें 552 एनएम की कटौती की तरंग दैर्ध्य होती है। एक क्षेत्र लेंस तो पीएमटी के सेंसर पर परिलक्षित प्रकाश केंद्रित है । इस बीच, ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के लिए रोशनी स्रोत (660 एनएम एलईडी) नमूने के ऊपर स्थित है। प्रेषित प्रकाश एक कंडेनसर लेंस द्वारा नमूने पर केंद्रित है, और 20 × फ्लोरेसेंस उद्देश्य परिणामी संचरण छवि को कैप्चर करता है। ब्राइटफील्ड रोशनी के लिए उपयोग की जाने वाली तरंगदैर्ध्य प्रत्येक डिक्रोइक दर्पण की कट-ऑफ तरंगदैर्ध्य से अधिक है, इसलिए यह छवि को सीएमओएस कैमरे के सेंसर पर केंद्रित करने से पहले उन दोनों के माध्यम से गुजरता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:माप कक्ष धारक डिजाइन। (ए)ऑप्टिकल रास्तों के साथ माप कक्ष धारक का आइसोमेट्रिक दृश्य मढ़ा। ब्राइटफील्ड रोशनी बेहतर सतह(जेड-एक्सिस)से होती है; फ्लोरेसेंस रोशनी अवर सतह(जेड-एक्सिस) से होती है, और माप हाथ OCT सिग्नल अन्य रोशनी धुरी(वाई-एक्सिस)के लिए ऑर्थोगोनल है। प्रयोग के दौरान, दो प्लेटिनम हुक एक ग्लास केशिका ट्यूब के भीतर एक ट्रैबेकुला पकड़ते हैं जो माप कक्ष के रूप में कार्य करता है। वॉयस-कॉइल मोटर्स प्रत्येक हुक को नियंत्रित करते हैं और उनकी स्थिति लेजर इंटरफेरोमेट्री का उपयोग करके मापी जाती है। वर्तमान स्थिति की तुलना उपयोगकर्ता-परिभाषित सेट बिंदु से की जाती है और एफपीजीए के भीतर एन्कोड किए गए पीआईडी नियंत्रक का उपयोग करके, त्रुटि को कम किया जाता है। (ख)ब्राइटफील्ड रोशनी के साथ सीटू में माप कक्ष चालू हो गया । बैक-व्यू को फिगर 1 इनसेट में दिखाया गया है। (ग)माप कक्ष धारक के माध्यम से सुपरफ्यूजेसेट प्रवाह की योजनाबद्ध । सुपरफ्यूसेट ब्लॉक के पीछे प्रवेश करता है और तीर द्वारा इंगित दिशा में बहता है। अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम इलेक्ट्रोड माप कक्ष में एक घुड़सवार ट्रैबेकुला के संकुचन को प्राप्त करने के लिए क्षेत्र उत्तेजना स्थापित करते हैं। ब्लू शेडिंग उस क्षेत्र को इंगित करता है जहां एक प्रयोग के दौरान सुपरफ्यूजेट बहता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:छवि अधिग्रहण और नियंत्रण सॉफ्टवेयर का फ्रंट पैनल। (A)ब्राइटफील्ड इमेजिंग यूजर इंटरफेस। (B)OCT इमेजिंग यूजर इंटरफेस। (C)हार्डवेयर कंट्रोल यूजर इंटरफेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:ट्राबेकुला विच्छेदन और बढ़ते प्रोटोकॉल। (ए)लंगेंडोर्फ-परफ्यूस्ड चूहा दिल विच्छेदन कक्ष में। (ख) अटरिया के साथ एक ही दिल निकाल दिया । धराशायी रेखाएं वेंट्रिकल्स को खोलने के लिए एक्सीशन प्रक्षेपवक्र का संकेत देती हैं। (ग)दोनों वेंट्रिकल्स के इंटीरियर को बेनकाब करने के लिए एक खोला हुआ दिल । धराशायी बॉक्स उस क्षेत्र को इंगित करता है जहां ट्रैबेकुले आमतौर पर पाए जाते हैं। (घ)एक्साइज्ड राइट-वेंट्रिकुलर वॉल क्षेत्र (सी में धराशायी बॉक्स द्वारा इंगित समान) । धराशायी रेखाएं तीन ट्रैबेकुला को हाइलाइट करते हैं । (ई)दीवार के ऊतकों के साथ पैनल ई से तीनों में से चुना गया एक ट्राबेकुला (एफ)दीवार के ऊतकों के साथ ट्रैबेकुला। (जी)एक 1 एमएल सिरिंज के अंत में अलग ट्राबेकुला । (ज)बढ़ते चैंबर में ट्राबेकुला । (I)दो प्लेटिनम हुक के बीच घुड़सवार ट्राबेकुला। (जम्मू)ट्राबेकुला, हुक के बीच घुड़सवार, माप कक्ष के भीतर(चित्रा 3B)। ग्रीन स्पॉट पहले डिक्रोनिक फिल्टर से एक आर्टिफैक्ट है। (K)माप कक्ष के भीतर घुड़सवार ट्राबेकुला का माध्यमिक कोण। ट्राबेकुला और माइक्रोस्कोप ऑब्जेक्टिव लेंस के बीच की दूरी लगभग 1 मिमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6:बल माप की स्थिति निर्भरता। प्रत्येक इमेजिंग पोजीशन(एन = 7) मढ़ा से मांसपेशियों द्वारा उत्पादित बल। औसत सक्रिय बल उत्पादन 0.527 एमएन ± 0.003 एमएन, समय से 50% संकुचन 77.1 एमएस ± 0.3 एमएस, और समय के लिए 50% छूट 328.1 एमएस ± 0.9 एमएस (सभी डेटा मतलब ± एसई के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:अक्टूबर इमेजिंग विश्लेषण। (A)WEKA विभाजन का उदाहरण। मांसपेशियों के खंडित क्रॉस-सेक्शन को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है, और पृष्ठभूमि को हरे रंग में हाइलाइट किया गया है। (ख)एक ट्राबेकुला के कच्चे सी-स्कैन डेटा का सुपीरियर व्यू । छवि के शीर्ष की ओर उज्ज्वल कोण रेखा माप कक्ष दीवार का प्रतिबिंब है। (ग)एक ट्राबेकुला के कच्चे सी-स्कैन डेटा का पार्श्व दृश्य। (घ)खंडित OCT डेटा का सुपीरियर व्यू । (ई)खंडित OCT डेटा का पार्श्व दृश्य। (च)ट्राबेकुला(एक्स-एक्सिस)की लंबाई के साथ क्रॉस-सेक्शनल एरिया समय(वाई-एक्सिस)के माध्यम से। मांसपेशियों की लंबाई के साथ औसत क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र 0.0326मिमी 2 ± 0.0005मिमी 2 (ईई ± मतलब) था (जी)ट्राबेकुला का एक जाल। जाल लगभग पार पैनल एफ के अनुभागीय क्षेत्र साजिश के साथ गठबंधन किया गया है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8:ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस इमेजिंग विश्लेषण। (A)ट्राबेकुला की सिले हुए इमेज (सात इमेजिंग विंडो) । (ख)सीए2 + ट्राबेकुला की लंबाई के साथ यात्रियों । (ग)प्रत्येक इमेजिंग विंडो से औसत एक्स-विस्थापन। एक सकारात्मक विस्थापन बाईं ओर सही और नकारात्मक करने के लिए एक प्रस्ताव का प्रतिनिधित्व करता है । (घ)प्रत्येक इमेजिंग विंडो से औसत सारकोमेरे लंबाई जिसमें आवश्यक छवि विपरीत थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम एक विन्यास पेश करते हैं जो ब्राइटफील्ड, फ्लोरेसेंस और ऑक्ट इमेजिंग के संयोजन वाले तीन ऑप्टिकल सिस्टम की असेंबली को सक्रिय रूप से अनुबंधित पूर्व वीवो कार्डियक ट्राबेकुला(चित्रा 1 और चित्रा 2)से डेटा इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है। इस तरह के एक करवाया एकीकरण माप कक्ष(चित्रा 3)के डिजाइन के कारण संभव है ताकि ऑकक्ट की ऑर्थोगोनल व्यवस्था को ब्राइटफील्ड-फ्लोरेसेंस एक्सिस में सक्षम बनाया जा सके। मांसपेशियों में बढ़ते सिस्टम हृदय की मांसपेशी उत्तेजना-संकुचन गतिशीलता की विशेषता में प्रमुख सूचकांकों के एक साथ मात्रा की सफलता में एक समान रूप से महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसकी नवीनता मांसपेशियों के यांत्रिक प्रदर्शन(चित्र 6)के लिए कोई स्पष्ट अशांति के साथ मांसपेशियों की स्कैनिंग प्रक्रियाओं को सक्षम करने में रहता है । बल माप के लिए संयुक्त इमेजिंग विन्यास और मोटराइज्ड-हुक सिस्टम के साथ, यह प्रणाली सीए2 + क्षणिक, विस्थापन और सारकोमेरे लंबाई में क्षेत्रीय विषमता का मूल्यांकन कर सकती है, साथ ही चिकोटी(आंकड़े 7 और चित्र 8)के समय पाठ्यक्रम में एक करार ट्राबेकुला की स्थूल ज्यामितीय जानकारी के साथ।

कार्डियक अनुसंधान प्रयोगशालाओं के भीतर ब्राइटफील्ड-एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम की सर्वव्यापकता को देखते हुए, इन परिणामों का प्रजनन कुछ मामूली हार्डवेयर विचारों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। यहां, हम ब्राइटफील्ड-एपिफ्लोरेसेंस और अक्टूबर के संयोजन के लिए इमेज-प्रोसेसिंग टूलकिट पेश करते हैं, जो अंतर्निहित संकुचन विषमता का विश्लेषण करने में आवश्यक है। अक्टूबर के एकीकरण के लिए एक अबाधित ऑप्टिकल पथ की आवश्यकता होती है, जबकि गेटेड इमेजिंग को उत्तेजना और अक्टूबर और ब्राइटफील्ड इमेजिंग कैमरा दोनों के बीच एक बाहरी ट्रिगर लाइन की आवश्यकता होती है, और मांसपेशियों के बढ़ते हुक जो माप कक्ष में नमूना ले जाने में सक्षम हैं। आवश्यक पोस्ट-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर और विधियां स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं। विशेष रूप से, उपयोग किया जाने वाला सेगमेंटेशन सॉफ्टवेयर, WEKA14,ओपन-सोर्स है। सामग्री अंक8,सारकोमेरे लंबाई, गेटेड वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग10,और जाल पीढ़ी कोड की मार्करलेस ट्रैकिंग की तकनीक इसी तरह सुलभ है और इसी लेखक के अनुरोध पर उपलब्ध कराई जा सकती है।

मांसपेशियों की व्यवहार्यता, फुरा-2 की इष्टतम लोडिंग, और छवि फोकस तीन स्तंभ हैं जो एक सफल प्रयोग की नींव बनाते हैं। संकुचन को रोकने के लिए बीडीएम युक्त विच्छेदन समाधान का उपयोग करना, सिरिंज में मांसपेशियों का परिवहन, समाधान का निरंतर ऑक्सीजन, और प्रयोग के दिन नए प्रयोगात्मक समाधान तैयार करना, सभी उच्च मांसपेशियों की व्यवहार्यता दर में योगदान देते हैं। फ्यूरा-2 AM के साथ ट्राबेकुला लोड करने से पहले, प्रत्येक स्थिति के लिए ऑटोफ्लोरेसेंस एकत्र किया जाना चाहिए क्योंकि यह मापा Ca2 + क्षणिक15पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। फुरा-2एएम लोडिंग समाधान का ऑक्सीजन डाई लोडिंग सहायता करने के लिए सर्फेक्टेंट प्लेओरोनिक-एफ 127 के आवश्यक समावेश से जटिल है। इस सर्फेक्टेंट की वजह से परिणामी अतिरिक्त बुलबुला गठन का मुकाबला करने के लिए, लोडिंग समाधान में एंटी-फोम की एक छोटी सी बूंद उपयोगकर्ता को ऑक्सीजन दर बढ़ाने की अनुमति देती है, जिससे इस संभावना में सुधार होता है कि ट्रैबेकुला लोडिंग प्रक्रिया में कार्यात्मक व्यवहार्यता बनाए रखता है। अंत में, इमेजिंग फोकस उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरेसेंस जानकारी के शोर अनुपात के संकेत को अधिकतम करने के लिए मांसपेशियों की लंबाई के साथ एक समान होना चाहिए।

यहां प्रस्तुत तरीकों के साथ विचार करने के लिए दो सीमाएं हैं। सबसे पहले फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का स्थानिक संकल्प है। जबकि अक्टूबर और ब्राइटफील्ड इमेजिंग के स्थानिक संकल्प अधिक हैं, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का संकल्प 540 माइक्रोन इमेजिंग विंडो द्वारा 540 माइक्रोन के भीतर कैप्चर की गई मात्रा से फ्लोरेसेंस के अभिन्न अंग तक सीमित है। पीएमटी के बजाय पीएमटी के बजाय फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के स्थानिक संकल्प को बढ़ाने की गुंजाइश है, ताकि सिग्नल टू शोर रेशियो16की कीमत पर फ्लोरेसेंस सिग्नल पर कब्जा किया जा सके । दूसरा ट्राबेकुला का व्यास है जिसका अध्ययन मापने योग्य सारकोमेरे लंबाई और ज्यामितीय गहराई के संदर्भ में किया जा सकता है। कंप्यूटिंग सारकोमेरे लंबाई के लिए खिड़की-FFT दृष्टिकोण बेहतर स्थानिक संकल्प के लाभ का फायदा उठाता है, लेकिन कम मजबूती(चित्रा 8 डी)के साथ जुड़ा हुआ है । ऐसे मामलों में जहां टर्बिड या बड़े व्यास वाले ट्रैबेकुले का अध्ययन किया जाना है, बड़े ऊतक नमूनों में सारकोमरिक बैंडिंग से जुड़े कम विपरीत के कारण एफएफटी की समाधानशीलता बहुत कम हो जाएगी। इसी तरह, अक्टूबर के भीतर, ३०० माइक्रोन से अधिक की इमेजिंग गहराई से बैक-रिफ्लेक्शन विभाजन चरण के दौरान हल करने के लिए बहुत कमजोर होंगे । इसलिए, हमारी तकनीक 300 माइक्रोन से कम व्यास के ट्राबेकुला तक सीमित है। हालांकि, बड़े व्यास के नमूनों का अध्ययन करने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि उत्तेजना17की उच्च दरों के दौरान मांसपेशियों के कोर के प्रसार ऑक्सीजन के साथ समस्या हो सकती है।

हमारी विधि स्वस्थ और रोगग्रस्त मांसपेशियों में मांसपेशियों की ज्यामिति के सहयोग से आयनिक यांत्रिक कार्य के मूल्यांकन को सक्षम बनाती है, जो हृदय की मांसपेशी फिजियोलॉजी, रोगविज्ञान और फार्माकोलॉजी को समझने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है। यहां उल्लिखित छवि-प्रसंस्करण पाइपलाइन डेटा निकालती है जो संकुचन विषमता की गहरी समझ जुटाने के लिए निर्णायक होगी। इस तरह के एक समृद्ध डेटासेट की क्षमता को पूरी तरह से महसूस करने का एक अवसर गणितीय मॉडलों के निर्माण में है जो इन डेटा को एकीकृत और व्याख्या करते हैं, और भविष्यवाणियों को बनाने के लिए जो हमारे डिवाइस का उपयोग करके प्रयोगात्मक रूप से परीक्षण किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को ऑकलैंड विश्वविद्यालय (जेडी और एमसी को सम्मानित) से डॉक्टरेट छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित किया गया था, सर चार्ल्स हर्कस हेल्थ रिसर्च फैलोशिप (20/011 और 21/116) न्यूजीलैंड के स्वास्थ्य अनुसंधान परिषद से (केटी को जे-सीएच को सम्मानित किया गया, क्रमशः), नेशनल हार्ट फाउंडेशन द्वारा प्रदान की गई एक डॉक्टरेट छात्रवृत्ति (ए. ए. को सम्मानित), मार्सडन फास्ट-स्टार्ट अनुदान (UOA1504 और UOA1703) रॉयल सोसायटी ऑफ न्यूजीलैंड से (जे-सीएच और केटी को सम्मानित किया गया, क्रमशः), और न्यूजीलैंड के रॉयल सोसायटी से एक जेम्स कुक रिसर्च फैलोशिप (एटी को सम्मानित) । इस उपकरण का मूल विकास न्यूजीलैंड के रॉयल सोसायटी (एटी और पीएन को सम्मानित) से मार्सडन ग्रांट (11-यूओए-199) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3-Butanedione monoxime Acros Organics 150375000
20× microscope lens Nikon CFI Super Fluor 20× NA 0.75
2D Galvanometer Thorlabs GVSM002/M
50-50 beam splitter Thorlabs FC850-40-50-APC
90-10 beam-splitter Thorlabs TW850R2A2
Analogue input module National Instruments NI-9205 Records the PMT signal at 200 kHz
Brightfield imaging light source CoolLED PE-2 660 nm LAM
Broadband light source Superlum Broadlighter-840
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Cameralink card National Instruments NI-1429 Brightfield imaging frame grabber
Carbogen 5 BOC Gas code: 181
Condensor lens Nikon LWD 0.52
D(+)-Glucose Merck 108337
DAQ National Instruments NI-6259 Triggers the galvanometer movement
Dichroic mirror 1 Semrock FF409-Di03
Dichroic mirror 2 Semrock FF552-Di02
Diffraction grating Wasatch Photonics 1200 lines/mm @840 nm
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
Direct-Q 3 UV System Merck Millipore ZRQSVR3WW Distilled water machine
Dry bath Corning 6875-SB LSE digital dry bath
FIJI ImageJ Open-source image processing software
Fura-2AM pentapotassium salt Thermofisher F14186
Hardware FPGA card National Instruments NI-7813R Also controls the triggering of the brightfield capture
Heparin Pfizer 61024
HEPES PanReac AppliChem A1069
Inverted microscope Nikon TI-DH illumination pillar
Isofluorane MedSource VAPDRUGISO250
KCl Sigma-Aldrich P9541
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Line-scan camera Basler spL2048-70km Spectrometer camera
Magnetic stirrer IKA 3810000 RCT basic
Matlab Mathworks Data processing code
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
MgSO4.7H2O Sigma-Aldrich M1880
NaCl Sigma-Aldrich 71376
NaH2PO4.2H2O Sigma-Aldrich 71505
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6014
OCT FPGA card National Instruments NI-1483R
Oxygen tank BOC Gas code: 100D
pH meter Mettler Toledo MP220
Photomultiplier tube Hamamatsu H7422-20
Powerload Thermofisher P10020
Superluminescent diode Broadlighter D-840
Transimpedance amplifier Custom
Tris(hydroxymethyl)amino-methane Sigma-Aldrich 252859
Wistar rat Vernon Jansen Unit 8 – 10 weeks
Xenon arc lamp Sutter Instrument DG-4 Lambda DG-4

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 176
एक साथ ब्राइटफील्ड, फ्लोरेसेंस, और ऑप्टिकल जुटने से टोमोग्राफिक इमेजिंग ऑफ कॉन्ट्रैक्टिंग कार्डियक ट्रैबेकुले <em>एक्स वीवो</em>
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Dowrick, J. M., Anderson, A. J., Cheuk, M. L., Tran, K., Nielsen, P. M. F., Han, J. C., Taberner, A. J. Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo. J. Vis. Exp. (176), e62799, doi:10.3791/62799 (2021).

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