Summary
Dieses Protokoll präsentiert eine Sammlung von Sarkomer-, Kalzium- und makroskopischen geometrischen Daten aus einer aktiv kontrahierenden Herztrabekula ex vivo. Diese simultanen Messungen werden durch die Integration von drei Bildgebungsmodalitäten ermöglicht.
Abstract
Im Herzmuskel aktivieren intrazelluläre Ca2+ Transienten kontraktile Myofilamente, was zu Kontraktion, makroskopischer Verkürzung und geometrischer Verformung führt. Unser Verständnis der inneren Beziehungen zwischen diesen Ereignissen war begrenzt, da wir weder in den Muskel "sehen" noch die räumlich-zeitliche Natur der Erregungs-Kontraktionsdynamik genau verfolgen können. Um diese Probleme zu lösen, haben wir ein Gerät konstruiert, das eine Reihe von Bildgebungsmodalitäten kombiniert. Insbesondere integriert es ein Hellfeldmikroskop zur Messung lokaler Veränderungen der Sarkomerlänge und der Gewebebelastung, ein Fluoreszenzmikroskop zur Visualisierung des Ca2+ Transienten und einen optischen Kohärenztomographen, um die geometrischen Veränderungen des Gewebes während des gesamten Zeitraums eines Herzzyklus zu erfassen. Wir stellen hier die Imaging-Infrastruktur und das zugehörige Datenerfassungs-Framework vor. Die Daten werden aus isolierten stäbchenartigen Gewebestrukturen gesammelt, die als Trabeculae carneae bekannt sind. In unserem Instrument hält ein Paar positionsgesteuerter Platinhaken jedes Ende einer Ex-vivo-Muskelprobe, während es kontinuierlich mit nährstoffreicher Kochsalzlösung überlagert wird. Die Haken stehen unter unabhängiger Kontrolle, was eine Echtzeitkontrolle der Muskellänge und -kraft ermöglicht. Die Längsübersetzung ermöglicht das stückweise Scannen der Probe und überwindet Einschränkungen, die mit der relativen Größe des Mikroskop-Bildgebungsfensters (540 μm mal 540 μm) und der Länge einer typischen Trabecula (>2000 μm) verbunden sind. Platinelektroden an beiden Enden der Muskelkammer stimulieren die Trabekel mit einer benutzerdefinierten Rate. Wir nutzen das Stimulationssignal als Auslöser für die Synchronisation der Daten aus jedem Bildgebungsfenster, um das gesamte Probenzucken unter stationären Bedingungen zu rekonstruieren. Die Anwendung von Bildverarbeitungstechniken auf diese Hellfeld-Bildgebungsdaten liefert Gewebeverschiebungs- und Sarkomerlängenkarten. Eine solche Sammlung von Daten wird, wenn sie in eine Experimentmodellierungspipeline integriert wird, ein tieferes Verständnis der kontraktilen Homogenität und Heterogenität der Muskeln in Physiologie und Pathophysiologie liefern.
Introduction
Die Überfusion isolierter Herzmuskelgewebepräparate ist ein standardisiertes und weit verbreitetes Protokoll zur Untersuchung der kardialen Ionenaktivierung und-mechanik 1. Insbesondere die Isolierung von Trabekeln, stäbchenartigen Strukturen aus den ventrikulären Wänden, hat die Beurteilung von Phänomenen wie der längenabhängigen Aktivierung der Kontraktion2,der dehnungsabhängigen Reaktion der Kontraktion3,4und der diastolischen Viskoelastizität5 des Herzgewebes ermöglicht. Ter Keurs, der Initiator dieser Technik der Superfusing isolierter Trabeculae, verwendete zunächst eine Kombination aus Fluoreszenzbildgebung für Ca2+ Messungen und Laserbeugung zur Bestimmung der Sarkomerlängen2,5. Seit diesen frühen Studien ist es immer üblicher geworden, Sarkomerlängeninformationen mit einer größeren räumlichen Auflösung mit Hilfe von 2D-schnellen Fourier-Transformationstechniken (FFT)6 auf Hellfeldmikroskopiebildern zu extrahieren. Die beiden bildgebenden Systeme erlauben eine partielle Beurteilung des zugrunde liegenden Zusammenhangs zwischen Ca2+ Freisetzung und sarkomer längenabhängiger Kraftproduktion.
Der Herzmuskel ist quergestreift, wobei das sichtbare Band mit einer darunter liegenden Reihe von kontraktilen Einheiten verbunden ist, die aus dicken und dicken Filamenten bestehen. Die Wechselwirkung dieser konstituierenden Filamente, aus denen Sarkomere besteht, liegt der Krafterzeugung zugrunde, die wie folgt beginnt: Ein depolarisierendes elektrisches Signal oder Aktionspotential bewirkt, dass sich spannungsabhängige L-Typ-Ca2+-Kanäle in der Zellmembran öffnen; der anschließende zelluläre Zustrom vonCa2+ induziert die Freisetzung vonCa2+ aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR), einem intrazellulärenCa2+-Speicher, in einem Prozess, der alsCa2+-induzierteCa2+-Freisetzung 7bekannt ist; dieser plötzliche Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration vom nanomolaren zum mikromolaren Bereich ermöglicht die Kraftproduktion; Ca2+ Pumpen extrudieren kontinuierlichCa2+ aus dem Zytosol zurück in das SR und extrazelluläre Kompartiment; Wenn die intrazelluläre Ca2+ -Konzentration in den nanomolaren Bereich zurückkehrt, hört die Kraftproduktion auf und der Muskel entspannt sich. Bei der Krafterzeugung gleiten die dicken und dünnen Filamente übereinander. Die Sarkomerlänge bestimmt das relative Ausmaß der Überlappung und damit das Potenzial zur Kraftproduktion des Muskels makroskopisch.
In diesem Artikel erweitern wir diese Fluoreszenz-Hellfeld-Bildgebungsverfahren um die optische Kohärenztomographie (OCT). OCT nutzt das physikalische Prinzip der Interferenz und ist in der Lage, die geometrische Verformung von Gewebe zu sammeln, um die kontraktile Heterogenität der Muskeln zu verstehen8. Unser Gerät (Abbildung 1) verwendet ein SD-OCT-System (Spectral Domain OCT). In SD-OCT teilt ein Strahlteiler das Licht einer breitbandigen Superlumineszenzdiode mit kurzer Kohärenzlänge in Referenz- und Messarme auf. Der Referenzarm enthält einen festen Spiegel und der Messarm ein 2D-Galvanometer zur Steuerung des Lichts. Das von der Probe zurückgestreute Licht wird gesammelt und stört das reflektierte Licht im Referenzarm, um ein Interferenzmuster zu bilden. Die Tiefeninformation wird in der Frequenz des Spektralrandes kodiert. Um die Informationen zu extrahieren, wird das Signal durch ein Spektrometer geleitet und eine inverse FFT wird auf das Ergebnis angewendet. Das entsprechende 1D-Signal stellt die Strukturen in verschiedenen Tiefen dar, entsprechend den Änderungen des Brechungsindex9 (A-Scan). Durch die Steuerung des Lasers in eine einzige Achse kann ein Querschnitt der interessierenden Probe konstruiert werden (B-Scan) und ebenso durch Wiederholung des Prozesses in einem schrittweisen Muster in der verbleibenden Achse kann ein dreidimensionales Bild erzeugt werden (C-Scan). Durch Erweiterung kann man eine Reihe von B-Scans an einem einzigen Slice für ein sich wiederholendes zeitvariables Motiv basierend auf einem externen Trigger sammeln und wiederholen, um einen dreidimensionalen Scan zu erzeugen, der ein zeitvariables planares Bilddarstellt 10.
Bei der Integration der drei bildgebenden Systeme haben wir die folgenden beiden Prinzipien berücksichtigt. Erstens sollten bildgebende Sensoren kein Licht von einer alternativen Bildgebungsmodalität erkennen, und zweitens sollte das physische Design freien Platz für mindestens drei gleichzeitige Bildgebungsebenen enthalten. Um die erste Anforderung zu erfüllen, verwendet das Hellfeldmikroskop eine LED mit einer Wellenlänge von 660 nm, um die Probe in einer invertierten Konfiguration zu beleuchten. Das Fluoreszenzmikroskop befindet sich in einer Epifluoreszenzkonfiguration, bei der die gleiche Objektivlinse sowohl für die Anregung als auch für die Sammlung des emittierten Lichts verwendet wird. Das Anregungslicht hat eine Wellenlänge zwischen 340 nm und 380 nm, und eine Photomultiplierröhre (PMT) misst das emittierte Licht bei einer Wellenlänge von 510 nm. Ein Paar dichroitischer Spiegel ermöglicht es diesen beiden optischen Pfaden, den gleichen physikalischen Fußabdruck zu teilen, ohne die entgegengesetzte Messung zu stören (Abbildung 2). Schließlich verwendet das OCT breitbandiges Licht (100 nm spektrale Breite) mit einer zentralen Wellenlänge von 840 nm, das sich von den beiden anderen Modalitäten unterscheidet. Aufgrund der geringen Kohärenz des für OCT verwendeten Lichts trägt gestreutes Licht von den Hellfeldfluoreszenzquellen nicht zu dem Interferenzmuster bei, das Tiefeninformationen kodiert. Für die zweite Anforderung verfügt das Gehäusedesign für das Kapillarrohr über zugängliche optische Wege zu den vorderen, unteren und oberen Ebenen der Probe. Während der Experimente halten zwei Platinhaken eine Trabecula in einem Kapillarrohr, das mit sauerstoffhaltiger Krebs-Henseleit (KH)-Lösung durchtränkt ist. Der Galvanometerkopf des OCT ist orthogonal auf den Hellfeld-Fluoreszenz-Bildgebungsweg ausgerichtet, um die Vorteile der dritten orthogonalen optischen Ebene zu nutzen (Abbildung 3).
In diesem Artikel werden die Entwurfsüberlegungen für den Bau eines Geräts beschrieben, das gleichzeitig Kalzium, Sarkomerlänge und Muskelgeometrie abbilden kann. Um diese Messmöglichkeiten zu demonstrieren, beschreiben wir den Prozess der Isolierung einer ventrikulären Trabekula, die Herstellung der notwendigen Pufferlösungen sowie die kritischen Schritte bei der Handhabung und Fluoreszenzbelastung einer Ex-vivo-Trabekela. Schließlich werden in diesem Dokument die Prozesse beschrieben, die erforderlich sind, um den Datensatz in nützlichere Visualisierungen zu übersetzen.
Protocol
Die Tierethikkommission der University of Auckland genehmigte den Umgang mit Ratten und die Vorbereitung von Gewebeproben.
1. Bildgebende Kalibrierung
- Pixelkalibrierung des Hellfeldmikroskops
- Füllen Sie die Messkammer mit destilliertem Wasser.
- Legen Sie ein Beugungsgitter mit bekannten Linien pro μm in die Messkammer.
- Drücken Sie F1, um die Aufnahme zu aktivieren, und passen Sie die Bildrate [Hz] an, bis das Beugungsgitter deutlich sichtbar ist (Abbildung 4A). Stellen Sie sicher, dass das Beugungsgitter parallel zum Rand des Rahmens verläuft. Drücken Sie erneut F1, um die Aufnahme zu beenden.
- Legen Sie die Gesamtbilder auf Aufnahme? auf eins fest, drücken Sie Strg + Umschalt + S, um Daten auf die Festplatte zu streamen, und drücken Sie F1, um ein Bild des Beugungsgitters aufzunehmen.
- Öffnen Sie ImageJ und importieren Sie das Beugungsgitterbild (Datei > Öffnen Sie > Kalibrierungsbild auswählen). Halten Sie die Verschiebung gedrückt und zeichnen Sie eine Linie, die 20 helle und dunkle Bänder des Beugungsgitters umfasst.
- Kalibrieren Sie das Bild (Analysieren > Skalieren festlegen). Die Länge der Zeile aus Schritt 1.1.5 legt den Wert für Die Entfernung in Pixel fest. Legen Sie den Wert für den bekannten Abstand auf das 20-fache der Zeilen pro μm und die Längeneinheit auf μm fest. Die Umkehrung der Skala ist die Anzahl der Mikrometer, die durch ein Pixel dargestellt werden.
- Kalibrierung der OCT-Tiefenauflösung
- Messen Sie die Dicke eines Glasmikroskopobjektträgers mit Vernier-Bremssätteln.
- Schalten Sie die OCT-Laserquelle ein.
- Decken Sie den Galvanometerkopf ab und klicken Sie auf GET BG, um das Hintergrundinterferenzmuster zu messen und von der Messung zu subtrahieren (Abbildung 4B).
- Klemmen Sie den gemessenen Glasmikroskopobjektträger (ab Schritt 1.2.1) in den Messarm des OCT.
- Klicken Sie auf Livestream, um das OAT-Bild anzuzeigen. Stellen Sie den Glasmikroskopobjektträger ein, bis er im B-Scan sichtbar ist.
- Um das B-Scan-Bild zu erfassen, legen Sie Bereich Y (Schritte) auf eins fest, klicken Sie auf B-Scan-Daten streamen?und dann auf Erfassen.
- Importieren Sie das B-Scan-Bild in ImageJ (Datei > Öffnen Sie > Wählen Sie B-Scan). Halten Sie die Verschiebung gedrückt, zeichnen Sie eine Linie zwischen den Grenzen des Glasmikroskopobjektträgers.
- Legen Sie die Skala fest (Analysieren > Skalieren festlegen). Legen Sie den bekannten Abstand auf die in Schritt 1.2.1 erfasste Messung fest.
- Um die Tiefenauflösung in Luft zu berechnen, korrigieren Sie den Brechungsindex des Objektträgers (nGlas = 1,5175)11, indem Sie die Messung pro Pixelwert mit nGlasmultiplizieren.
HINWEIS: Das angegebene n-Glas ist für Borosilikatglas. Objektträger können aus verschiedenen Materialien hergestellt werden. Verwenden Sie den entsprechenden Brechungsindex für den gemessenen Folie. - Um die Tiefenauflösung für Myokard zu skalieren, dividieren Sie den Wert aus Schritt 1.2.9. durch nMyokard = 1,38 (zuvor gemeldeter Wert12).
2. Muskelprobenvorbereitung
- Bereiten Sie das Dissektionsrigg vor.
- Gießen Sie einen Teil der Dissektionslösung (siehe Tabelle 1)in eine kleine Metallschüssel und legen Sie sie etwa eine Stunde vor der Herzexzision in den Gefrierschrank.
- Richten Sie ein Dissektionsgerät ein, um sicherzustellen, dass die Dissektionslösung gut mit Sauerstoff (100% Sauerstoff) angereichert ist und durch jede der Schlauchleitungen gespült wurde. Füllen Sie die Sezierkammer mit sauerstoffhaltiger Dissektionslösung und binden Sie locker 3/0 Naht um den Perfusionskatheter.
- Beschneide das Herz.
- Betäuben Sie 8-10 Wochen alte Wistar-Ratte mit gasförmigem Isofluran (< 5% Sauerstoff). Bestätigen Sie die Anästhesie durch Einklemmen des Schwanzes.
- Positionieren Sie die betäubte Ratte in Rückenlage und injizieren Sie subkutan in den Bauchbereich mit Heparinlösung (1000 IE/kg). Halten Sie die Anästhesie für weitere fünf Minuten aufrecht, damit das Heparin zirkulieren kann.
- Holen Sie die Metallschüssel mit der Sezierlösung aus dem Gefrierschrank und stellen Sie sie in die Nähe der Einschläferbank.
HINWEIS: Vermeiden Sie das vollständige Einfrieren der Dissektionslösung, um das vollständige Eintauchen des sezierten Herzens zu ermöglichen. - Die betäubte Ratte auf die Einschläferbank übertragen und durch zervikale Dislokation einschläfern.
- Öffnen Sie die Rattentruhe mit einer Schere, schneiden Sie zuerst die Körperwand entlang der Unterseite des Brustkorbs, dann das Zwerchfell, bevor Sie entlang der seitlichen Grenzen des Brustkorbs fortfahren. Heben Sie die Brust aus dem Weg.
- Greifen Sie das Herz mit einer Hand, während die andere Hand eine gebogene Schere verwendet, um die Verbindungsgefäße (Aorta, Hohlvene usw.) zu schneiden.
- Tauchen Sie das Herz schnell in die kalte Dissektionslösung.
- Isolieren Sie eine Trabecula.
- Identifizieren Sie die Aorta, während sich das Herz in der Metallschüssel befindet, und übertragen Sie das Herz dann in die Sezierkammer. Ziehen Sie die Aorta mit zwei gekrümmten Zzetten über die Perfusionskanüle.
- Halten Sie die Aorta mit einer Zette an Ort und Stelle. Öffnen Sie in der Zwischenzeit die Schlauchlinie, damit die Dissektionslösung durch die Perfusionskanüle fließen kann.
HINWEIS: Ziel ist es, die Durchblutung innerhalb der Minute nach der Herzexzision abzuschließen. - Sobald das koronare Gefäßsystem von Blut befreit ist und das Herz vollständig mit der Dissektionslösung durchblutet ist, stoppen Sie den Perfusionsfluss und sichern Sie die Aorta mit der Naht an Ort und Stelle. Schalten Sie den Fluss wieder ein und durchstöten Sie das kanwellierte Herz.
- Drehen Sie die Kanüle so, dass die linke Koronararterie auf der oberen Oberfläche sichtbar ist. Heften Sie die Spitze des Herzens an den Boden der Sezierkammer (Abbildung 5A). Schneiden Sie beide Vorhöfe ab (Abbildung 5B).
- Schneiden Sie mit einer Federschere entlang der rechten Seite des Septums bis zur Spitze des Herzens (wie in Abbildung 5Bdargestellt). Stecken Sie den geöffneten linken Ventrikel an die Basis der Sezierkammer. Schneiden Sie dann entlang der linken Seite des Septums, öffnen Sie den rechten Ventrikel und heften Sie ihn auch an die Basis der Sezierkammer (Abbildung 5C).
HINWEIS: Um die Ventrikel in einer offenen Position zu fixieren, müssen einige Papillenmuskeln geschnitten werden. Identifizieren Sie eine frei laufende Trabekela im rechten Ventrikel (Abbildung 5D-E). - Schneiden Sie mit der Federschere und einer Zette das Die Trabecula umgebende Wandgewebe ab und schneiden Sie dann das Wandgewebe orthogonal in Richtung der Trabecula in zwei Hälften. Schneiden Sie das Wandgewebe so lange ab, bis seine Abmessung für die verwendete Montagekonfiguration geeignet ist. In diesem Fall etwa halb so groß wie ein Sesamsamen (Abbildung 5F).
HINWEIS: Trabeculae können von den rechten und linken Ventrikeln seziert werden, aber die von links sind typischerweise trüber und weniger anwendbar für Sarkomer- und Geometriemessungen. - Lassen Sie die herausgeschnittene Trabecula in der Sezierkammer und überschlagen Sie sie kontinuierlich mit der Sezierlösung.
3. Experimentelles Protokoll
HINWEIS: Das für dieses Experiment verwendete Gerät13 wurde intern gebaut und verwendet benutzerdefinierten Steuercode. Die notwendigen Überlegungen für das Design eines Geräts, das diese Daten repliziert, sind zwei unabhängig voneinander betätigte Montagehaken, eine Messkammer mit drei optisch klarenAchsen (Abbildung 3)und eine externe Triggerleitung, die die Hellfeld- und OCT-Kameras mit dem Stimulator synchronisiert. Die PMT-Spannung und das Kraftsignal wurden mit analogen Datenerfassungskarten gesammelt, die Bilder des OCT- und Hellfeldmikroskops wurden mit Camera Link-Framegrabber-Karten gesammelt und das Stimulussignal wurde mit einer digitalen I / O-Karte gesammelt. Die Daten wurden offline mit einer Reihe von Producer-Consumer-Schleifen gespeichert, um die zeitliche Ausrichtung aufrechtzuerhalten.
- Bereiten Sie das Kardiomyometer vor.
- Spülen Sie heißes (~ 60 °C) Wasser, destilliertes Wasser (Raumtemperatur) und dann superfusaten Sie die Lösung durch die Messkammer. Die Superfusatlösung kontinuierlich mit Carbogen einblasen.
- Schalten Sie die Beleuchtungsquelle des Hellfeldmikroskops ein, und drücken Sie F1, um die Aufnahme zu aktivieren (Abbildung 4A). Passen Sie den nachgeschalteten Haken manuell an, bis er im Hellfeldbild zentriert ist. Klicken Sie auf Null Downstream-Achseund dann auf Downstream-Achse und dann auf Downstream-Deaktiviert, um den Motor zu aktivieren (Abbildung 4C). Bewegen Sie den Schieberegler DS Setpoint [um], bis das Ende des Hooks am Rand des interessierenden Standardbereichs ausgerichtet ist.
- Setzen Sie die nachgelagerte Achse wieder auf Null, und bewegen Sie dann den Schieberegler DS Setpoint [um] auf 1000. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Upstream-Hook, bewegen Sie jedoch nicht den Schieberegler US-Sollwert [um].
- Klicken Sie auf Zu Montage verschieben (Abbildung 4C).
- Starten Sie das Fluoreszenzbeleuchtungssystem, indem Sie den Lampenschalter umschalten, bevor Sie die Controller-Subsysteme schnell einschalten, indem Sie den Hauptschalter umschalten.
HINWEIS: Einige UV-Lichtquellen produzieren große Mengen ozon. Wenn dies der Fall ist, schließen Sie einen Ozonabsauger an die Auslassöffnung der Lichtquelle an und stellen Sie sicher, dass er läuft, bevor Sie die Fluoreszenzbeleuchtungsquelle einschalten. - Schalten Sie den Betriebsmodus auf Turbo-Blanking um, indem Sie die Modus-Taste auf der Vorderseite drücken, gefolgt von 2und dann 1. Drücken Sie die Online-Taste, damit der Steuercode den Betrieb informiert.
- Besteigen Sie die Trabecula.
- Superfusat-Strömung durch die Messkammer pausieren. Füllen Sie die Montagekammer mit der Sezierlösung.
- Transportieren Sie die Trabekela mit einer 1-ml-Spritze von der Sezierkammer in die Montagekammer (Abbildung 5G).
- Um die Trabecula zu übertragen, platzieren Sie die Spritze vertikal und in Kontakt mit der Oberfläche der Montagekammerlösung. Lassen Sie die Trabecula über die Schwerkraft in die Montagekammer absteigen (Abbildung 5H).
- Senken Sie den Flüssigkeitsstand in der Montagekammer, so dass er sich auf Höhe des Mittelabschnitts der Haken befindet.
- Passen Sie den Abstand zwischen den Haken an, um die schlaffe Länge der Trabecula widerzuspiegeln, indem Sie den Schieberegler DS Setpoint [um] bewegen.
- Greifen Sie mit einem Mikroskop zur Unterstützung der Visualisierung leicht eines der Endgewebestücke mit einer Handzette und montieren Sie es auf dem vorgelagerten Haken. Montieren Sie das andere Stück Endgewebe auf dem nachgeschalteten Haken (Abbildung 5I).
- Nach der sicheren Montage bewegen Sie die Trabecula zurück in die Messkammer (Abbildung 5J), indem Sie Move to Chamber (Abbildung 4C)drücken. Setzen Sie den Superfusatfluss und die Flüssigkeitsextraktion fort.
- Legen Sie die Stimulusfrequenz [Hz] auf 1, die Stimulusdauer [ms] auf 10 und die Stimulusspannung auf 10 fest. Beginnen Sie die Stimulation, indem Sie Stimulus On?drücken.
- Bereiten Sie die Trabecula vor.
- Nach etwa 1 h Akklimatisierung verringern Sie allmählich die Reizspannung und die Reizdauer in 1 V bzw. 1 ms Schritten. Ein typischer Satz von Werten ist 3 V und 3 ms.
- Schalten Sie das Hellfeldbeleuchtungssystem ein. Drücken Sie F1, und wählen Sie einen interessanten Bereich aus, der einen streifengestreiften Bereich auf der Benutzeroberfläche umschließt. Klicken Sie auf SL berechnen,, um die durchschnittliche Sarkomerlänge im hervorgehobenen Bereich zu berechnen. Erhöhen Sie die Muskellänge, bis die durchschnittliche Sarkomerlänge 2,32 μm beträgt, indem Sie den Schieberegler Separation Setpoint [um] erhöhen.
HINWEIS: SL berechnen? verwendet eine 2D-FFT, die in Schritt 4.3 beschrieben wird. Der Bereich von Interesse, der zur Berechnung der durchschnittlichen Sarkomerlänge verwendet wird, ist typischerweise ein Quadrat von 100 μm bis 150 μm. Wenn sich der Muskel der optimalen Sarkomerlänge nähert, werden daher 43 bis 65 Sarkomere verwendet, um die durchschnittliche Sarkomerlänge zu berechnen. - Bewegen Sie den Muskel, indem Sie den Schieberegler Center Setpoint [um] auf der Registerkarte "Center and Separation Control "(Abbildung 4C)so einstellen, dass der Rand des nachgeschalteten Hakens nur im Hellfeldbild sichtbar ist. Sammeln Sie die Fluoreszenzinformationen für zehn Zuckungen.
- Erhöhen Sie den Mittleren Sollwert [um] um 200 und sammeln Sie weitere zehn Zuckungen an Fluoreszenzinformationen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Hellfeldbild den Upstream-Hook enthält. Sammeln Sie die Fluoreszenzinformationen des letzten Fensters.
- Bringen Sie die Trabecula an eine zentrale Position zurück, indem Sie den Wert für den Mittleren Sollwert [um] auf 0 setzen.
- Reduzieren Sie die Reizfrequenz auf 0,2 Hz und wechseln Sie vom KH-Superfusat zur Fura-2-Ladelösung (detailliert in Tabelle 1).
- Messen Sie das Fluoreszenzsignal alle 10 Minuten, indem Sie auf der Registerkarte Stim und Daten auf Fluoreszenzquelle aktivieren klicken. Visualisieren Sie das Fluoreszenzsignal auf der Registerkarte PMT-Signal.
- Nachdem sich das 360 nm Signal um den Faktor 10 erhöht hat oder die Dauer des Ladevorgangs 2 h überschritten hat, geben Sie die Reizfrequenz auf 1 Hz zurück und schalten Sie wieder auf die KH-Superfusatlösung um.
- Überprüfen Sie die Verhältnismessung alle 10 Minuten, bis sich die Verhältnismessung stabilisiert hat, an diesem Punkt kann die Datenerfassung beginnen.
- Sammeln Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebungsdaten.
- Stellen Sie den Muskel an die Position zurück, an der der Rand des nachgeschalteten Hakens nur im Hellfeldbild vorhanden ist. Starten Sie das Streamen von Hardwaredaten, indem Sie auf der Registerkarte Stim und Daten der Hardwaresteuerungsbenutzeroberfläche auf Daten auf Datenträger streamen klicken. Erfassen Sie Fluoreszenzinformationen, indem Sie auf Fluoreszenzquelle aktivierenklicken.
- Stellen Sie auf der Benutzeroberfläche für die Hellfeldbildgebung den Aufnahmemodus auf einen externen Trigger ein, erhöhen Sie die Bildrate auf 100 Hz und legen Sie die Anzahl der aufzunehmenden Bilder auf 100 fest. Drücken Sie Strg + Umschalt + S gefolgt von F1, um die Hellfeldbilddaten für dieses Fenster aufzuzeichnen.
- Erhöhen Sie den Wert für den Mittleren Sollwert [um] um um 200 und wiederholen Sie Schritt 3.4.2. Fahren Sie mit dem Scanprotokoll fort, bis die Bilddaten für das letzte Fenster aus Schritt 3.3.4 gesammelt wurden.
- Bringen Sie die Trabecula an eine zentrale Position zurück, indem Sie den Wert für den Mittleren Sollwert [um] auf 0 setzen.
- Erfassen von OCT-Bilddaten.
- Schalten Sie die OCT-Laserquelle ein, indem Sie die Haupttaste auf die | - Symbol, drücken Sie den Netzschalter, gefolgt von der SLDs-Taste.
- Decken Sie den Galvanometerkopf ab und klicken Sie auf GET BG, um das Hintergrundinterferenzmuster zu messen und von der Messung zu subtrahieren (Abbildung 4B).
- Stellen Sie den Bildaufnahmemodus auf Live-Ansicht ein.
- Passen Sie die y-Positionan, bis das B-Scan-Bild nur den Upstream-Hook enthält. Teilen Sie die auf der Bedienfront angezeigte Muskellänge (Abbildung 4B) durch zwei und subtrahieren Sie die aktuelle y-Position. Geben Sie diesen Wert in die Eingabe"y-offset"ein. Passen Sie den Wert"x-offset" an, bis der Querschnitt der Trabekela im Frame zentriert ist.
- Scannen Sie bei zentriertem Trabecula entlang der y-Achse,indem Sie die y-Positionanpassen, um die Positionen zu finden, die den vor- und nachgelagerten Haken entsprechen. Notieren Sie sich diese Positionen nach unten. Legen Sie Bereich Y (Schritte) auf die absolute Differenz zwischen diesen Werten geteilt durch zehn fest.
- Stellen Sie den Bildaufnahmemodus auf Stimulus Ausgelöst?, Bereich X (Schritte) auf 100 und klicken Sie auf die Schaltfläche Aktive Parameter festlegen.
- Klicken Sie auf B-Scan-Daten streamen?und dann auf Erfassen.
HINWEIS: Das Gated-Imaging-Protokoll erfordert 200 Zuckungen, um die gesamte Muskelgeometrie für eine Probe von 2 mm Länge zu erfassen, was einer Erfassungszeit von ~ 3 min 20 s entspricht.
4. Verarbeiten des Hellfeldbilddatensatzes
- Bereiten Sie die Bilder für die Analyse vor.
- Bilder in ImageJ importieren (Datei > > Bildsequenz importieren > Bild auswählen).
- Erhöhen Sie den Bildkontrast (Bild > Passen Sie > Helligkeit/Kontrast > Verschieben Sie die Schieberegler Minimum und Maximum, um das Bildhetogramm zu zentralisieren).
- Schärfen Sie die Bilder (Prozess > Filter > unscharfe Maske > den Radius (Sigma) auf 1,0 Pixel und die Maskenstärke (0,1-0,9) auf 0,6 einstellen).
- Exportieren Sie die Bildsequenz (Speichern unter > Bildsequenz > Legen Sie das Format auf PNGfest, beginnen Sie bei 0 und Ziffern (1-8) auf 4).
- Fügen Sie die Bilder zusammen, messen Sie die lokalisierte Verschiebung und berechnen Sie die lokalen Sarkomerlängen.
- Öffnen Sie "TrabeculaProcessing.m" (auf Anfrage verfügbar) und setzen Sie die FolderPath-Variable auf den Hauptordner, der alle Daten enthält, und ImagePath auf den Ordner, in dem die Bildsequenz aus Schritt 4.1.4 gespeichert wurde. Legen Sie Abschnitte auf die Anzahl der Imaging-Fenster und Frames auf die Anzahl der pro Fenster erfassten Frames fest.
- Führen Sie den Code aus.
HINWEIS: Die Ausgaben befinden sich in dem vom Benutzer angegebenen Ausgabeordnerpfad. (Standardmäßig ist der Pfad auf FolderPath/Output festgelegt.)
- FFT Sarkomer Länge Technik
- Verwenden Sie Bildverarbeitungssoftware, um eine FFT für einen Bereich des Bildes durchzuführen, in dem Sarkomere gut sichtbar sind.
- Multiplizieren Sie die Pixel pro μm Kalibrierungsergebnisse aus Schritt 1.1.6 mit 1,6 μm und 3,0 μm, bevor Sie die Umkehrung berechnen, um den Bereich der interessierenden räumlichen Frequenzen zu erhalten.
- Passen Sie ein Exponential an das FFT-Ergebnis an, ignorieren Sie die Frequenzinformationen in dem in Schritt 4.3.2 berechneten Frequenzbereich, und subtrahieren Sie sie vom Transformationsergebnis, um den DC-Term zu entfernen.
- Passen Sie eine Gaußsche Kurve an das interessierende Frequenzband an.
- Berechnen Sie die Umkehrung des Peaks der Gaußschen Kurve. Dies ist die durchschnittliche Sarkomerlänge für die Region von Interesse.
HINWEIS: Die FFT-Berechnung und die Anpassung der Exponential- und Gaußschen Gleichungen wurden mit benutzerdefiniertem LabVIEW-Code durchgeführt.
5. Verarbeiten Sie die Fluoreszenzdaten
- Subtrahieren Sie die fensterabhängige Autofluoreszenz vom jeweiligen Fenster und berechnen Sie den Quotienten der Signale, die mit den Anregungswellenlängen 340 nm und 380 nm assoziiert sind.
6. Verarbeiten der OCT-Bilddaten
- Bereiten Sie den OAT-Abbildsatz für die Segmentierung vor.
- Öffnen Sie ImageJ und importieren Sie die Bilder (Datei > > Bildsequenz importieren). Im Datei-Explorer-Fenster wird dieses geöffnet, suchen Sie die Bilder, wählen Sie eines aus und klicken Sie auf Öffnen.
HINWEIS: Wenn der Steuercode für das OAT die Bilder nicht in einem Format speichert, das von ImageJ gelesen werden kann, konvertieren Sie sie in PNG. - Um die Visualisierung zu erleichtern, organisieren Sie die Bildsequenz in einem Hyperstack (Image > Hyperstacks > Stack to Hyperstack). Legen Sie im sich öffnenden Dialogfeld die Anzahl der Slices auf die Anzahl der B-Scans pro Slice und das X auf die Anzahl der Slices entlang der Länge der Trabecula fest.
- Zeichnen Sie ein Rechteck, das die Trabecula umschließt. Vergewissern Sie sich, dass das gesamte Volume im Laufe der Zeit eingeschlossen ist, indem Sie die Schieberegler im Hyperstack-Fenster verwenden. Schneiden Sie das Bild auf das Fenster zu (Bild > Zuschneiden).
- Entfernen Sie Slices, die Bilder der Montagehaken enthalten (Stacks > Tools > Slice Keeper). Wählen Sie den Bereich der Slices aus, der nur Trabecula-Informationen enthält.
- Öffnen Sie ImageJ und importieren Sie die Bilder (Datei > > Bildsequenz importieren). Im Datei-Explorer-Fenster wird dieses geöffnet, suchen Sie die Bilder, wählen Sie eines aus und klicken Sie auf Öffnen.
- WeKA-Segmentierung trainieren.
- Öffnen Sie die WEKA-Segmentierung (Plugins > Segmentierung > Trainable Weka Segmentierung).
- Stellen Sie den Auswahlmodus auf Freihand ein.
- Klicken Sie auf Einstellungen und passen Sie die Klassifizierungs- und Trainingseinstellungen an. (Für dieses Modell wurden die folgenden Trainingsmerkmale verwendet: Gaußsche Unschärfe, Sobelfilter, Hessisch, Unterschied der Gaußianer, Membranprojektionen, Bilateral und Lipschitz. Die Membrandicke wurde auf 1, die Größe des Membranpflasters auf 8, das Minimum Sigma auf 1 und das Maximum Sigma auf 32 festgelegt. Der Klassifikator wurde auf FastRandomForest und die Klassifikatoroptionen auf batchSize 100, maxDepth auf 32, numFeatures auf 32, numThreads auf 0 und numTrees auf 200 festgelegt.)
- Segmentieren Sie Bilder manuell, bis das Training zufriedenstellende Segmentierungen ergibt.
- Speichern Sie den Klassifikator.
- Segmentieren sie die verarbeiteten B-Scans
- Starten Sie die WEKA-Segmentierung nach Schritt 6.2.1.
- Laden Sie den Klassifikator aus Schritt 6.2.5.
- Klicken Sie auf Ergebnis erstellen.
- Konvertieren Sie die Bilder in 8-Bit (Image > Type > 8-Bit).
- Konvertieren Sie die Bilder in binär (Verarbeiten > Binär > Erstellen von binären > Standardmethode und Standardhintergrund).
- Als Bildsequenz speichern (PNG).
- Berechnen Sie den durchschnittlichen CSA in den segmentierten B-Scan-Bildern.
- Zählen Sie die Anzahl der weißen Pixel in einem binären B-Scan-Bild.
- Multiplizieren Sie die Pixelfläche mit der kalibrierten Tiefenauflösung (aus Schritt 1.2) und 10 μm (abstand zwischen benachbarten A-Scans).
- Wiederholen Sie dies für alle B-Scans zwischen den Haken und mittelen Sie die Messungen.
- Konvertieren Sie segmentierte Bilder in ein Netz.
- Öffnen Sie "OCTmain.m" (auf Anfrage verfügbar) und setzen Sie imageDirectory auf den Ordner, der die Ausgabe aus Schritt 6.3.6 enthält. Legen Sie outputPath nach Bedarf fest.
- Legen Sie Slices auf den Wert "Bereich Y (Schritte)" (Schritt 3.5.5) und Frames auf den Wert "Wiederholen X" (Schritt 3.5.6) fest, z_dim auf die Tiefenauflösung (Schritt 1.2.10) und x_dim & y_dim auf den Wert, der 10 zugewiesen ist.
- Klicken Sie auf Ausführen.
Representative Results
Um die hier vorgestellten regionalen Ca2+ und Hellfeldinformationen über die gesamte Länge der Trabecula zu erfassen, waren sieben Muskelpositionen erforderlich. Abbildung 6 deutet darauf hin, dass die Zuckungskraft von dieser Bewegung ungestört war, was zeigt, dass es keine Positionsabhängigkeit der aktiven Kraftproduktion gab.
B-Scans, die mittels optischer Kohärenztomographie mit einer Rate von 100 Hz gesammelt wurden, wurden mit dem ImageJ-Plugin WEKA14 segmentiert (Abbildung 7A). Jeder Querschnitt erscheint aufgrund der Differenz zwischen der lateralen (10 μm) und tiefen (1,73 μm (in Myokard)) Auflösung verzerrt. Diese Verzerrung wurde korrigiert, indem die Tiefenachse des Bildes um das seitliche Auflösungs-Tiefen-Auflösungsverhältnis skaliert wurde. Abbildung 7B,C zeigt, dass nach der Skalierung des rohen C-Scans der Trabekela in der Geometrie annähernd zylindrisch ist. Die Reflexion der Messkammerwand kann sich manchmal mit den Muskeldaten überschneiden (Abbildung 7A, B), aber die Segmentierungssoftware kann darauf trainiert werden ( Abbildung7D, E). Einmal segmentiert, kann die Querschnittsfläche entlang der Länge des Muskels während des gesamten Zuckens berechnet werden (Abbildung 7F). Beachten Sie, dass diese spezielle Trabecula ein kleines Anhängsel hat, das sich von ihr verzweigt. Die Bewegung des Astes ist offensichtlich ~ 0,75 mm entlang der Trabecula. Schließlich können die segmentierten Bilder in Netze umgewandelt werden, um die Konstruktion geometrischer Modelle zu unterstützen (Abbildung 7G).
Bilddaten, die an jeder der verschiedenen Trabekula-Positionen mit einer Rate von 100 fps erfasst wurden, wurden zusammengefügt, um ein einziges vollständiges Bild der Trabecula zu erstellen (Abbildung 8A). Die Auflösung dieser Bilder beträgt 0,535 μm/Pixel. Die Verwendung linearer Gewichtungsfunktionen in den überlappenden Bereichen benachbarter Fenster unterstützt die Visualisierung und minimiert die Auswirkungen der in den Hellfeldbildern vorhandenen Vignette. Zur Messung des fluoreszierenden Signals wird ein 540 μm x 540 μm großes Fenster der Trabecula zyklisch mit 340 nm, 365 nm und 380 nm Wellenlängenlicht mit einer Wellenlänge von 600 Hz beleuchtet. Das Verhältnis der emittierten Fluoreszenz, die mit dem 340 nm und 380 nm Anregungslicht assoziiert ist, korreliert mit dem intrazellulären Kalzium, nachdem die Trabekela mit Fura-2 beladen wurde. Da es sich bei dieser Messung um ein Verhältnis handelt, beträgt die effektive Messrate 200 Hz. Die gemittelten (n = 10) intrazellulären Ca2+ Transienten aus jedem Fenster sind an dem Bereich ausgerichtet, in dem sie abgebildet wurden (Abbildung 8B). Während der Peak der Transienten einigermaßen konsistent erscheint, ist der diastolische [Ca2+] im Bereich zwischen 900 μm und 1800 μm entlang der Trabecula niedriger. In ähnlicher Weise weisen auch die Ergebnisse der Berechnungen zur Verschiebungsverfolgung (Abbildung 8C) und zur Sarkomerlänge (Abbildung 8D) auf das Vorhandensein regionaler Variabilität hin. Die verwendete markerlose Tracking-Technik ist in der Lage, die Verschiebung jedes Pixels bei ausreichendem Kontrast zu verarbeiten. Bei der Abbildung der Verteilung von Sarkomerlängen in post wurde eine Kreuzkorrelationsfläche von 128 Pixeln x 128 Pixeln (~67 μm x 67 μm) verwendet, um die regionale Sarkomerlänge zu berechnen. Dieser Bereich umkapselt ungefähr 29 Sarkomere, wenn die Probe nahe an der optimalen Sarkomerlänge liegt. Die Schrittgröße (sowohl in x- als auch in y-Richtung)zwischen dem Mittelpunkt jedes Kreuzkorrelationsfensters wurde für die Verarbeitung dieser Daten auf 50 Pixel (~26 μm) eingestellt. Die Eignung von Sarkomerlängenschätzungen wurde anhand der Breite und Amplitude der Gaußschen Anpassung an das FFT-Signal getestet. Diese Bedingungen waren im Muskelbereich zwischen 0 μm und 500 μm nicht erfüllt, so dass dort keine Sarkomerlängeninformationen berechnet werden konnten. Angesichts der damit verbundenen Verschiebungen ist es wahrscheinlich, dass sich die Sarkomere in dieser Region während der kontraktilen Phase verlängert haben. Im Einklang mit dieser Spekulation verkürzen sich die durchschnittlichen Sarkomerlängen auf der rechten Seite der Trabecula in diesem Zeitraum. Durch die Kombination der von jedem der Panels bereitgestellten Informationen scheint es, dass die Region mit der größten Querschnittsfläche nicht die bedeutendste Kraft erzeugt. Unter der Annahme, dass die regionale Variation von Ca2+ Transienten einen annähernd glatten Gradienten aufweist, zeigt Abbildung 8B, dass die größte Amplitude Ca2+ Transiente irgendwo zwischen 1300 μm und 1600 μm entlang der Trabecula auftritt. Die Verschiebungskarte zeigt an, dass der Bereich, der die geringste Bewegung durchläuft, gut mit dem Peak Ca2+ Transienten übereinstimmt. Dieser Bereich hat jedoch die kleinsten Querschnittsflächen der Stichprobe. Mit diesen Daten im Hinterkopf könnte man daraus schließen, dass diese Region den größten Stress erzeugte.
Abbildung 1: Kommentiertes Bild des Kardiomyometers. Jede der wichtigsten optischen Komponenten wird skizziert. Der Einschub enthält eine Nahaufnahme des Mikroskopobjektivs in situ, unterhalb der Messkammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Optischer Weg für die gleichzeitige Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie. Die Beleuchtungsquelle für das Fluoreszenzmikroskop ist eine Xenon-Bogenlampe, deren Ausgang zyklisch zwischen 340 nm, 365 nm und 380 nm Licht umschaltet. Der Ausgangspfad der Bogenlampe enthält einen dichroitischen Spiegel mit einer Cut-off-Wellenlänge von 409 nm, der das UV-Licht auf einen Spiegel reflektiert, der das Licht in ein Fluoreszenzmikroskopobjektiv lenkt. Die Linse fokussiert das Anregungslicht auf die Probe und sammelt das emittierte Licht, das eine längere Wellenlänge von 510 nm hat. Dieses emittierte Licht durchläuft den ersten dichroitischen Spiegel, aber nicht den zweiten, da es eine Cut-off-Wellenlänge von 552 nm hat. Eine Feldlinse fokussiert dann das reflektierte Licht auf den Sensor des PMT. Währenddessen befindet sich die Beleuchtungsquelle (660 nm LED) für das Hellfeldmikroskop über der Probe. Das durchgelassene Licht wird durch eine Kondensatorlinse auf die Probe fokussiert, und das 20×Fluoreszenzobjektiv erfasst das resultierende Transmissionsbild. Die Wellenlänge, die für die Hellfeldbeleuchtung verwendet wird, überschreitet die Cut-off-Wellenlänge jedes dichroitischen Spiegels, so dass sie beide durchläuft, bevor das Bild auf den Sensor einer CMOS-Kamera fokussiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auslegung des Messkammerhalters. (A) Isometrische Ansicht des Messkammerhalters mit überlagerten optischen Pfaden. Hellfeldbeleuchtung erfolgt von derübergeordneten Oberfläche (z-Achse); Die Fluoreszenzbeleuchtung erfolgt vonder unteren Oberfläche (z-Achse), und das OCT-Signal des Messarms ist orthogonal zur anderen Beleuchtungsachse(y-Achse). Während des Experiments halten zwei Platinhaken eine Trabecula in einem Glaskapillarrohr, das als Messkammer fungiert. Schwingspulenmotoren steuern jeden Haken und ihre Positionen werden mittels Laserinterferometrie gemessen. Die aktuelle Position wird mit einem benutzerdefinierten Sollwert verglichen und mit einem PID-Regler, der in einem FPGA kodiert ist, wird der Fehler minimiert. (B) Messkammer in situ bei eingeschalteter Hellfeldbeleuchtung. Die Rückansicht ist im Einschub von Abbildung 1 dargestellt. (C) Schematische Darstellung des Superfusatstroms durch den Messkammerhalter. Superfusat dringt in die Rückseite des Blocks ein und fließt in die durch Pfeile angezeigte Richtung. Die vor- und nachgeschalteten Elektroden stellen die Feldstimulation her, um die Kontraktion einer montierten Trabekela in der Messkammer hervorriefen. Die blaue Schattierung zeigt die Bereiche an, in denen das Superfusat während eines Experiments fließt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Vorderseite der Bilderfassungs- und Steuerungssoftware. (A) Benutzeroberfläche für Hellfeldbildgebung. (B) OCT Imaging-Benutzeroberfläche. (C) Benutzeroberfläche für hardwaregesteuerte Steuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Trabecula-Dissektion und Montageprotokoll. (A) Langendorff-perfundiertes Rattenherz in der Dissektionskammer. (B ) Das gleiche Herz mit den Vorhöfen entfernt. Gestrichelte Linien zeigen die Exzisionsbahn an, um die Ventrikel zu öffnen. (C) Ein geöffnetes Herz, um das Innere beider Ventrikel freizulegen. Das gestrichelte Feld gibt den Bereich an, in dem Trabeculae typischerweise gefunden werden. (D) Ausgeschnittener rechtsventrikulärer Wandbereich (derselbe, der durch das gestrichelte Feld in C gekennzeichnet ist). Gestrichelte Linien heben drei Trabeculae hervor. (E) Eine Trabecula, ausgewählt aus den drei in D. (F) Die Trabecula aus Panel E mit entferntem Wandgewebe. (G) Die isolierte Trabecula am Ende einer 1-ml-Spritze. (H) Die Trabecula in der Montagekammer. (I) Die Trabecula ist zwischen zwei Platinhaken montiert. (J) Die trabecula, die zwischen Haken innerhalb der Messkammer montiert ist (Abbildung 3B). Der grüne Fleck ist ein Artefakt aus dem ersten dichroitischen Filter. (K) Sekundärwinkel der montierten Trabecula innerhalb der Messkammer. Der Abstand zwischen der Trabecula und dem Objektiv des Mikroskops beträgt ca. 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Positionsabhängigkeit der Kraftmessung. Die kraft, die der Muskel aus jeder der bildgebenden Positionen (n = 7) erzeugt, überlagert. Die durchschnittliche Wirkkraftproduktion betrug 0,527 mN ± 0,003 mN, die Zeit bis 50 % Kontraktion 77,1 ms ± 0,3 ms und die Zeit bis 50 % Entspannung 328,1 ms ± 0,9 ms (alle Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7:OCT-Bildgebungsanalyse. (A) Beispiel für weKA-Segmentierung. Der segmentierte Querschnitt des Muskels wird rot hervorgehoben, der Hintergrund grün hervorgehoben. (B) Bessere Ansicht der C-Scan-Rohdaten einer Trabecula. Die helle, abgewinkelte Linie zum oberen Bildanhang ist die Reflexion der Messkammerwand. (C) Seitenansicht der C-Scan-Rohdaten einer Trabecula. (D) Obere Ansicht der segmentierten OCT-Daten. (E) Seitenansicht der segmentierten OCT-Daten. (F) Die Querschnittsfläche entlang der Länge der Trabecula(x-Achse)durch die Zeit (y-Achse). Die durchschnittliche Querschnittsfläche entlang der Muskellänge betrug 0,0326 mm2 ± 0,0005 mm2 (mittlere ± S.E.) (G) Ein Netz der Trabecula. Das Netz wurde ungefähr mit dem Querschnittsflächendiagramm von Panel F ausgerichtet.
Abbildung 8: Analyse der Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung. (A) Zusammengefügtes Bild (sieben Bildfenster) der Trabecula. (B) Ca2+ Transienten entlang der Länge der Trabekel. (C) Durchschnittliche x-Verschiebungaus jedem Imaging-Fenster. Eine positive Verschiebung stellt eine Bewegung nach rechts und eine negative nach links dar. (D) Durchschnittliche Sarkomerlängen aus jedem Bildfenster, das den erforderlichen Bildkontrast aufmittelte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Lösungstabelle Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
In dieser Studie stellen wir eine Konfiguration vor, die die Montage von drei optischen Systemen ermöglicht, die Hellfeld-, Fluoreszenz- und OCT-Bildgebung kombinieren, um Daten von einer aktiv kontrabinierenden Ex-vivo-Herztrabekula zu sammeln (Abbildung 1 und Abbildung 2). Eine solche orchestrierte Integration ist aufgrund der Auslegung der Messkammer (Abbildung 3) möglich, um die orthogonale Anordnung des OCT zur Hellfeld-Fluoreszenzachse zu ermöglichen. Das Muskelaufbausystem spielt eine ebenso wichtige Rolle für den Erfolg gleichzeitiger Quantifizierungen von Schlüsselindizes zur Charakterisierung der Herzmuskelerregungs-Kontraktionsdynamik. Seine Neuheit besteht darin, Muskelscan-Verfahren ohne offensichtliche Störung der mechanischen Leistung des Muskels zu ermöglichen (Abbildung 6). Mit der kombinierten Bildgebungskonfiguration und dem motorisierten Hakensystem zur Kraftmessung kann dieses System die regionale Heterogenität in der Ca2+ Transienten-, Verschiebungs- und Sarkomerlänge zusammen mit makroskopischen geometrischen Informationen einer kontrahierenden Trabekela während des gesamten Zeitverlaufs des Zuckens auswerten (Abbildungen 7 und Abbildung 8).
Angesichts der Allgegenwart von Hellfeld-Epifluoreszenz-Bildgebungssystemen in Herzforschungslabors kann die Reproduktion dieser Ergebnisse mit einigen geringfügigen Hardwareüberlegungen erreicht werden. Hier stellen wir das Bildverarbeitungs-Toolkit zur Kombination von Hellfeld-Epifluoreszenz und OCT vor, das für die Analyse der zugrunde liegenden kontraktilen Heterogenität unerlässlich ist. Die Integration des OCT erfordert einen ungehinderten optischen Pfad, während die Gated Imaging eine externe Triggerleitung zwischen dem Stimulus und sowohl der OCT- als auch der Hellfeldkamera sowie Muskelmontagehaken erfordert, die in der Lage sind, die Probe durch die Messkammer zu bewegen. Die benötigte Nachbearbeitungssoftware und -methoden sind frei verfügbar. Insbesondere die verwendete Segmentierungssoftware WEKA14ist Open-Source. Die Technik der markerlosen Verfolgung von Materialpunkten8,Sarkomerlänge, Gated Volumetric Imaging10und Mesh-Generierungscodes sind ebenfalls zugänglich und können auf Anfrage beim entsprechenden Autor zur Verfügung gestellt werden.
Muskellebensfähigkeit, optimale Belastung von Fura-2 und Bildfokus sind die drei Säulen, die die Grundlagen eines erfolgreichen Experiments bilden. Die Verwendung einer BDM-haltigen Dissektionslösung zur Verhinderung von Kontrakturen, der Transport des Muskels in einer Spritze, die kontinuierliche Sauerstoffversorgung der Lösung und die Vorbereitung neuer experimenteller Lösungen am Tag eines Experiments tragen zu einer hohen Muskellebensfähigkeitsrate bei. Vor dem Laden der Trabekela mit Fura-2AM muss die Autofluoreszenz für jede Bedingung, die man untersuchen möchte, gesammelt werden, da sie einen signifikanten Einfluss auf den gemessenen Ca2+ Transient15haben kann. Die Sauerstoffversorgung der Fura-2AM-Beladungslösung wird durch die notwendige Einbeziehung des Tensids pluronic-F127 zur Unterstützung der Farbstoffbeladung erschwert. Um die daraus resultierende überschüssige Blasenbildung zu bekämpfen, die durch dieses Tensid verursacht wird, ermöglicht ein kleiner Tropfen Antischaum in der Ladelösung dem Benutzer, die Sauerstoffversorgungsrate zu erhöhen, wodurch die Chance verbessert wird, dass die Trabekela während des gesamten Ladevorgangs funktionsfähig bleibt. Schließlich muss der Bildgebungsfokus entlang der Muskellänge gleichmäßig sein, um das Signal-Rausch-Verhältnis der Hellfeld- und Fluoreszenzinformationen zu maximieren.
Bei den hier vorgestellten Methoden sind zwei Einschränkungen zu beachten. Erstens die räumliche Auflösung des Fluoreszenzmikroskops. Während die räumlichen Auflösungen der OCT- und Hellfeldbildgebung hoch sind, beschränkt sich die Auflösung des Fluoreszenzmikroskops auf das Integral der Fluoreszenz aus dem Volumen, das innerhalb eines 540 μm x 540 μm großen Bildfensters erfasst wird. Es besteht die Möglichkeit, die räumliche Auflösung des Fluoreszenzmikroskops zu erhöhen, indem anstelle einer PMT eine ladungsgekoppelte Kamera mit hoher Verstärkung verwendet wird, um das Fluoreszenzsignal auf Kosten des Signal-Rausch-Verhältnisses16zu erfassen. Zweitens ist der Durchmesser der Trabecula, der in Bezug auf messbare Sarkomerlänge und geometrische Tiefe untersucht werden kann. Der windowed-FFT-Ansatz zur Berechnung der Sarkomerlänge nutzt den Vorteil einer verbesserten räumlichen Auflösung, ist jedoch mit einer geringeren Robustheit verbunden (Abbildung 8D). In Fällen, in denen trübe oder großflächige Trabekel untersucht werden sollen, wird die Auflösungsfähigkeit der FFT aufgrund des reduzierten Kontrasts, der mit der Sarkomeric-Banding in größeren Gewebeproben verbunden ist, stark reduziert. Ebenso sind innerhalb des OCT die Rückreflexionen aus einer Bildtiefe von mehr als 300 μm zu schwach, um während der Segmentierungsphase aufgelöst zu werden. Daher beschränkt sich unsere Technik auf Trabeculae mit einem Durchmesser von weniger als 300 μm. Es wird jedoch nicht empfohlen, Proben mit großem Durchmesser zu untersuchen, da es bei hohen Stimulationsraten zu Problemen mit der diffusiven Sauerstoffversorgung des Muskelkerns kommen kann17.
Unsere Methode ermöglicht die Beurteilung der mechanischen Funktion der Ionik in Verbindung mit der Muskelgeometrie in gesunden und kranken Muskeln und bietet einen leistungsstarken Ansatz zum Verständnis der Physiologie, Pathophysiologie und Pharmakologie des Herzmuskels. Die hier skizzierte Bildverarbeitungspipeline extrahiert Daten, die für ein tieferes Verständnis der kontraktilen Heterogenität von entscheidender Bedeutung sein werden. Eine Möglichkeit, das Potenzial eines so reichhaltigen Datensatzes voll auszuschöpfen, besteht in der Konstruktion mathematischer Modelle, die diese Daten integrieren und interpretieren, und in der Erstellung von Vorhersagen, die mit unserem Gerät experimentell getestet werden können.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde finanziert durch Promotionsstipendien der University of Auckland (vergeben an JD und MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 und 21/116) des Health Research Council of New Zealand (verliehen an J-CH an KT), ein Promotionsstipendium der National Heart Foundation (verliehen an AA), Marsden Fast-Start Grants (UOA1504 und UOA1703) von der Royal Society of New Zealand (verliehen an J-CH und KT, bzw. ein James Cook Research Fellowship der Royal Society of New Zealand (verliehen an AT). Die ursprüngliche Entwicklung dieses Instruments wurde durch ein Marsden-Stipendium (11-UOA-199) der Royal Society of New Zealand (vergeben an AT und PN) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
| 20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
| 2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
| 50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
| 90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
| Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
| Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
| Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
| Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
| Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
| D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
| DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
| Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
| Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
| Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
| Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
| FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
| Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
| Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
| Heparin | Pfizer | 61024 | |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
| Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
| Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
| Matlab | Mathworks | Data processing code | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
| Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
| pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
| Powerload | Thermofisher | P10020 | |
| Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
| Transimpedance amplifier | Custom | ||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
| Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |
References
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