Summary
このプロトコルは、積極的に収縮している心臓の柱状の筋柱からサルコメア、カルシウム、および巨視的幾何学的データの集合 を提示する。これらの同時測定は3つのイメージのモダリティの統合によって可能にされる。
Abstract
心筋において、細胞内Ca2+ 過渡は収縮筋線維を活性化し、収縮、巨視的な短縮、幾何学的変形を引き起こす。これらの事象間の内部関係に関する我々の理解は、筋肉の内部を「見る」ことも、興奮収縮ダイナミクスの時空間的性質を正確に追跡することもできないため、限られている。これらの問題を解決するために、イメージングモダリティのスイートを組み合わせたデバイスを構築しました。具体的には、サルコメアの長さと組織株の局所的変化を測定するための明視野顕微鏡、Ca2+ 過渡性を視覚化する蛍光顕微鏡、および心臓周期の時間経過を通じて組織の幾何学的変化を捉える光学コヘレンストモグラフを統合する。ここでは、イメージングインフラストラクチャと関連するデータ収集フレームワークを紹介します。データは、トラベキュラカルネとして知られている孤立した棒様組織構造から収集されます。私たちの器械では、位置制御されたプラチナフックのペアは、それが継続的に栄養豊富な生理食塩水で過重化しながら、 元生体筋 サンプルの両端を保持します。フックは独立した制御下にあり、筋肉の長さと力のリアルタイム制御が可能です。縦方向の翻訳により、サンプルの部分走査が可能になり、顕微鏡イメージングウィンドウの相対サイズ(540 μm x 540 μm)と典型的な柱管の長さ(>2000 μm)に関連する制限を克服できます。筋肉室の両端にある白金電極は、ユーザー定義の速度でトラベキュラを刺激する。刺激信号を各イメージングウィンドウからデータを同期させるトリガーとして利用し、定常状態の下でサンプル全体のけいれんを再構築します。これらの明視野画像データに画像処理技術を適用することで、組織変位およびサルコメア長さの地図が提供されます。このようなデータの収集は、実験モデリングパイプラインに組み込まれると、筋肉の収縮性均質性と生理学および病理生理学における不均一性のより深い理解を提供する。
Introduction
分離された心筋組織製剤の重ね合いは、心臓イオン活性化および力学1を研究するための標準および広く使用されるプロトコルである。特に、心室壁からの柱状構造の単離により、収縮2の長さ依存的活性化、収縮3、4、および心組織の伸縮性5の伸縮性応答を含む現象の評価が可能となった。テル・ケールスは、孤立した線維柱を重ね合わせたこの技術のイニシエータであり、最初はサルコメア長を決定するためのCa2+測定とレーザー回折のための蛍光イメージングの組み合わせを使用した。これらの初期の研究以来、明視野顕微鏡画像上の2D高速フーリエ変換(FFT)ベースの技術6を用いて、より大きな空間解像度でサルコメアの長さの情報を抽出することがますます一般的になっています。2つの画像システムはCa2+放出とサルコメアの長さに依存する力の生産の間の基礎的な関係の部分的な評価を可能にする。
心臓の筋肉は、厚くて厚いフィラメントからなる収縮ユニットの基礎となる一連の基になる一連の関連付けられた可視バンディングで、線条化される。サルコメアを構成するこれらの構成フィラメントの相互作用は、次のように開始する力の生成の根底にある:脱分極電気信号、または作用電位は、細胞膜の電圧依存性L型Ca2+チャネルを開く原因となる。Ca2+の続く細胞流入は、Ca2+誘導Ca2+放出7として知られているプロセスで、細胞内Ca2+ストアであるサルコプラスミクスレチクル(SR)からのCa2+の放出を誘導する。ナノモルからマイクロモル範囲への細胞内Ca2+濃度のこの急激な増加は、力生産が発生することを可能にする;Ca2+ポンプは、細胞質ゾルからCa2+をSRおよび細胞外コンパートメントに連続的に押し出します。細胞内Ca2+濃度がナノモル範囲に戻ると、力の産生が停止し、筋肉が弛緩する。力の生産の間に、構成厚く、薄いフィラメントは互いの上に滑る。サルコメアの長さは、重なり合いの相対的な程度を決定し、したがって、筋肉の力産生の可能性をマクロコスティックに決定する。
本論文では、これらの蛍光・明視野イメージング技術を拡張し、光コヘレンス断層撮影(OCT)を含む。OCTは、干渉の物理的原理を利用し、筋肉収縮不均一性8を理解するために組織の幾何学的変形を獲得することができる。当社のデバイス(図1)は、スペクトルドメインOCT(SD-OCT)システムを使用しています。SD-OCTでは、ビームスプリッタは、広帯域短いコヘレンス長超発光ダイオードからの光をリファレンスアームと測定アームに分割します。リファレンスアームには固定ミラーが含まれ、測定アームには2D-ガルバノメーターが含まれ、光を操縦します。サンプルから後方散乱した光が収集され、参照アームの反射光に干渉して干渉パターンを形成します。深度情報は、スペクトル縞の周波数でエンコードされます。情報を抽出するために、信号は分光計を通り、逆FFTが結果に適用されます。対応する1D信号は、屈折率9(A-スキャン)の変化に対応する異なる深度の構造を表す。レーザーを単軸に操舵させることにより、目的のサンプルの断面(B-スキャン)を構築することができ、同様に、残りの軸にステップワイズパターンで工程を繰り返すことで、3次元画像を生成することができる(C-スキャン)。延長すると、外部トリガに基づいて時間変動の被験者を繰り返し行う一連のBスキャンを収集し、3次元スキャンを繰り返して生成し、時間変動平面画像10を表すことができる。
3つのイメージングシステムを統合する際には、次の2つの原理を検討しました。第一に、イメージングセンサは代替画像モダリティからの光を検出せず、第2に、物理設計には少なくとも3つの同時イメージングプレーンのための空き領域が含まれるべきです。最初の要件に対応するために、明視野顕微鏡は660 nmの波長LEDを使用して、逆の構成でサンプルを照らします。蛍光顕微鏡は、放出された光の励起および収集の両方に同じ対物レンズが使用される、励起構成である。励起光は340nm~380nmの波長を有し、光増倍管(PMT)は510nmの波長で放出された光を測定する。二色性ミラーのペアは、これら2つの光路が反対の測定を妨げることなく同じ物理的フットプリントを共有することを可能にする(図2)。最後に、OCT は、他の 2 つのモダリティとは異なる、中心波長 840 nm の広帯域 (100 nm スペクトル幅) ライトを使用します。OCT に使用される光の低コメレンスの性質上、明視野蛍光源からの散乱光は深度情報をコードする干渉パターンに寄与しません。第二の要件のために、キャピラリーチューブのハウジング設計は、サンプルの前部、劣った、および優れた平面へのアクセス可能な光学経路を有する。実験中、2つのプラチナフックは、酸素化されたクレブス・ヘンセレイト(KH)溶液を透過させた毛細管内に柱管を保持します。OCTのガルバノメータヘッドは、第3直交光学平面を利用する明視野蛍光イメージング経路に直交方向に向けられた(図3)。
この論文では、カルシウム、サルコメアの長さ、筋肉の形状を同時にイメージングできるデバイスを構築するための設計上の考慮事項について説明します。これらの測定能力を実証するために、心室性線維柱を単離するプロセス、必要な緩衝液の調製、 およびエクスビボ トラベキュラの取り扱いと蛍光負荷に関与する重要なステップについて述べています。最後に、データセットをより有用な視覚化に変換するために必要なプロセスの概要を説明します。
Protocol
オークランド大学動物倫理委員会は、ラットの取り扱いと組織サンプルの調製を承認しました。
1. イメージングキャリブレーション
- ブライトフィールド顕微鏡ピクセルキャリブレーション
- 測定室に蒸留水を充填します。
- 測定チャンバに、μm当たりの既知の線を含む回折格子を配置します。
- F1 キーを押してキャプチャを有効にし、回折格子がはっきりと見えるまで フレーム レート [Hz] を 調整します (図4A)。回折格子がフレームのエッジと平行に動作することを確認します。 F1 キーをもう一度押してキャプチャを停止します。
- [合計イメージをキャプチャする]を1 つに設定し、Ctrl + Shift + S キーを押してデータをディスクにストリームし、F1キーを押して回折格子の画像をキャプチャします。
- ImageJ を開き、回折格子画像 (ファイル>開く>キャリブレーションイメージを選択) をインポートします。シフトを保持し、回折格子の20の光と暗いバンドを包含する線を描きます。
- イメージを調整する([スケールを設定>分析] をクリックします)。ステップ 1.1.5 の線の長さによって、[ 距離(ピクセル数)] の値が設定されます。既知の 距離 の値を μm 測定あたりの線の 20 倍に設定し、 長さの単位 を μm に設定します。スケールの逆は、ピクセルで表されるマイクロメートルの数です。
- OCT 深度分解能キャリブレーション
- バーニエキャリパーを使用して、ガラス顕微鏡スライドの厚さを測定します。
- OCT レーザー光源をオンにします。
- ガルバノメーターの頭部を覆い、BGを取得をクリックしてバックグラウンド干渉パターンを測定し、測定から引きます(図4B)。
- OCT の測定アームで測定したガラス顕微鏡スライド (ステップ 1.2.1 から) をクランプします。
- OCT 画像を表示するには、[ ライブ ストリーム ] をクリックします。ガラス顕微鏡スライドをB-スキャン内で見えるように調整します。
- B-スキャン イメージをキャプチャするには、[ 範囲 Y (ステップ)] を 1 に設定し 、[B-スキャン データのストリームを取得する]をクリックして、[ 取得] をクリックします。
- B-スキャンイメージを ImageJ (ファイル>開く> B-scanを選択)にインポートします。シフトを保持し、ガラス顕微鏡スライドの境界間に線を引く。
- スケールを設定する (スケールを設定>分析)。ステップ 1.2.1 で収集した測定値に 既知の距離 を設定します。
- 空気中の深度分解能を計算するには、ピクセル当たりの測定値にnガラスを掛けることで、顕微鏡スライド(nガラス=1.5175)11の屈折率を補正する。
注:引用 されたnガラス は、ホウケイ酸ガラス用です。顕微鏡のスライドは異なった材料からなることができる。測定したスライドに適切な屈折率を使用します。 - 心筋の深度分解能をスケールするには、ステップ 1.2.9 の値を除算します。n心筋= 1.38 (以前に報告された値12)。
2. 筋肉サンプル調製
- 解剖リグを準備します。
- 解剖溶液の一部( 表1に概説)を小さな金属製のボウルに注ぎ、心臓切除の約1時間前に冷凍庫に入れます。
- 解剖ソリューションが十分に酸素化され(100%酸素)、各チューブラインを通してフラッシュされていることを確認する解剖リグを設定します。解剖チャンバに酸素解剖液を充填し、灌流カテーテルの周りに3/0縫合糸をゆるやかに結びます。
- 心を物品切りする。
- 8-10週齢のウィスターラットをガス状のイソフルラン(<5%酸素)を使用して麻酔します。尾をつまんで麻酔を確認します。
- 麻酔ラットをスピーヌ位置に置き、ヘパリン溶液(1000 IU/kg)で腹部に皮下注射します。ヘパリンが循環できるように、さらに5分間麻酔を維持します。
- 解剖液を含む金属ボウルを冷凍庫から取り出し、安楽死ベンチの近くに置きます。
注:解剖液を完全に凍結して、解剖された心臓の完全な水没を可能にしないようにしてください。 - 麻酔ラットを安楽死ベンチに移し、頸部脱臼で安楽死させる。
- はさみでラットの胸を開き、まず胸部の下側に沿って体壁を切断し、次に横隔膜を切断してから、胸部の横の境界に沿って進みます。胸を持ち上げます。
- 片手で心臓をつかみ、もう一方の手は湾曲したハサミを使って接続容器(大大根、大静脈、大静脈など)を切断します。
- 冷たい解剖液に心臓を素早く沈めます。
- トラベキュラを分離する。
- 心臓が金属ボウルにある間に大動脈を識別し、その後、解剖室に心臓を移します。2つの湾曲した鉗子を使用して、大大間を灌流カニューレの上に引っ張る。
- 大間を1つの鉗子で所定の位置に保持します。一方、チューブラインを開けて、解剖溶液が輸血カニューレを通って流れるようにする。
注:心臓切除後1分以内に灌流を完了することを目指してください。 - 冠状動脈脈管が血液を取り除かれ、心臓が解剖溶液で完全に浸透し、灌流の流れを止め、縫合を使用して大動脈を所定の位置に固定します。流れを元に戻し、カニュードハートを穿刺します。
- 左冠動脈が上面に見えるようにカニューレを回転させます。心臓の頂点を解剖室の底に固定する(図5A)。両方のアトリアを切断します(図5B)。
- スプリングハサミのセットで、中隔の右側に沿って心臓の頂点まで切り取ります(図5Bに示すように)。開いた左心室を解剖室の基部に固定します。次に、中隔の左側に沿って切り、右心室を開き、解剖室の基部にピン留めします(図5C)。
注:心室を開いた位置に固定するには、いくつかの乳頭の筋肉を切断する必要があります。右心室で自由に動く柱管を特定する(図5D-E)。 - スプリングハサミと鉗子を使用して、柱柱を取り巻く壁組織を切断し、壁組織を半音で切断して、柱壁の方向に向かって切断する。壁組織をトリムし、その寸法が使用する取り付け構成に適しています。この場合、ゴマシードの約半分の大きさ(図5F)。
注:トラベキュラは右心室と左心室から解剖することができますが、左からのそれらは通常、サルコメアおよび幾何学的測定にはより濁っていて適用されません。 - 切除槽内に切除された線維柱を残し、解剖液を継続的に重ね合わします。
3. 実験プロトコル
注: この実験に使用したデバイス13 は、社内で構築され、カスタム コントロール コードを使用します。これらのデータを複製するために構築されたデバイスの設計に必要な考慮事項は、2つの独立して作動した取り付けフック、3つの光学的に明確な軸を持つ測定室(図3)、および明視野カメラとOCTカメラを刺激器と同期させる外部トリガラインです。PMT電圧・力信号をアナログDAQカードを用いて集め、カメラリンクフレームグラバカードを用いてOCTと明視野顕微鏡の画像を収集し、デジタルI/Oカードを用いて刺激信号を集めた。データは、時間的な位置合わせを維持するために、一連のプロデューサー コンシューマー ループを使用してオフラインで格納されました。
- カーディオミオメーターを準備します。
- 高温(〜60°C)の水を洗い流し、蒸留水(室温)、次いで測定室を通して溶液を過疎化させる。カルボーゲンでスーパーフューズ液を連続的に泡立ててください。
- 明視野顕微鏡照明光源をオンにし 、F1 を押してキャプチャを有効にします(図4A)。下流フックを、明視野イメージの中央に配置するまで手動で調整します。[ 下流軸ゼロ] をクリックし、[ ダウンストリームが無効] をクリックしてモーターを有効にします (図 4C)。フックの終わりが既定の対象領域のエッジに合うように DS 設定ポイント [um] スライダを動かします。
- 下流軸を再びゼロにしてから 、DS 設定点 [um] スライダーを 1000 に移動します。上流フックでプロセスを繰り返しますが、 米国設定[um] スライダーは動かしません。
- [取り付けに移動]をクリックします(図4C)。
- メインスイッチを切り替えてコントローラサブシステムを素早くオンにする前に、ランプスイッチを切り替えて蛍光照明システムを起動します。
注: 一部の UV 光源は、大量のオゾンを生成します。この場合は、オゾン抽出器を光源の出口の通気孔に接続し、蛍光照明光源をオンにする前にオゾン抽出器が動作していることを確認します。 - フロントパネルのモードボタンを押して操作モードをターボ・ブランキングに切り替え、続いて2、1を押します。[On-line]ボタンを押して、コントロール コードに操作を通知できるようにします。
- トラベキュラを取り付ける。
- 測定チャンバーを通るスーパーフューズートの流れを一時停止します。取り付けチャンバーに解剖液を充填します。
- 1 mL シリンジを使用して、分離チャンバーから取り付けチャンバに柱管を輸送する(図5G)。
- 柱柱を移送するには、シリンジを上下に配置し、取り付けチャンバー溶液の表面と接触させます。重力を介して柱管が取り付けチャンバーに降下することを許可する(図5H)。
- 取り付けチャンバーの流体レベルを下げて、フックの中央部と同じレベルにします。
- DS セットポイント [um]スライダーを動かして、トラベキュラの緩み長さを反映するようにフック間の距離を調整します。
- 顕微鏡を使用して視覚化を助け、端部組織の片方を鉗子で軽く握り、上流フックに取り付けます。他の端のティッシュを下流のフックに取り付ける(図5I)。
- しっかりと取り付けられたら、トラベキュラを測定室(図5J)に戻し 、移動をチャンバーに移動 (図4C)を押して戻します。スーパーフューズド流れと流体抽出を再開します。
- 刺激周波数[Hz]を1、刺激持続時間[ms]を10、刺激電圧を10に設定します。刺激を押して刺激を開始?
- トラベキュラを準備します。
- 順応の約1時間後、それぞれ1Vおよび1msステップで刺激電圧と刺激持続時間を徐々に減少させる。一般的な値のセットは 3 V と 3 ミリ秒です。
- 明視野照明システムをオンにします。 F1 キーを押して、ユーザー インターフェイス上の線分の領域を囲む対象地域を選択します。 [SL を計算 ]をクリックして、ハイライトされた領域の平均サルコメア長さを計算します。 分離セットポイント [um] スライダーを大きくして、平均サルコマー長が 2.32 μm になるまで筋肉の長さを増やします。
注 :SLを計算しますか? は、ステップ 4.3 で概説した 2D FFT を使用します。平均サルコマー長の計算に使用される対象領域は、通常100 μm~150 μmの正方形です。したがって、筋肉が最適なサルコメア長に近づくにつれて、平均サルコメア長を計算するために43〜65サルコメアが使用される。 - 「中心と分離制御」タブのセンター設定点[um]スライダを調整して筋肉を動かし、下流のフックの端が明視野画像内で見えるようにします。10回のツイッチの蛍光情報を収集します。
- センターセットポイント[um]値を200増加させ、さらに10個分の蛍光情報を収集します。明視野のイメージに上流フックが含まれるまで、このプロセスを繰り返します。最後のウィンドウの蛍光情報を収集します。
- センターの設定値 [um]の値を 0 に設定して、柱柱を中央の位置に戻します。
- 刺激周波数を0.2 Hzに下げ、KHスーパーフューセートからFura-2負荷溶液に切り替えます( 表1を参照)。
- [スティムとデータ]タブの[蛍光ソースを有効にする]をクリックして、10分ごとに蛍光信号を測定します。PMTシグナルタブで蛍光信号を可視化します。
- 360 nm信号が10倍増加した後、または負荷手順の持続時間が2hを超えた後、刺激周波数を1Hzに戻し、KHスーパーフューザート溶液に戻します。
- 比率測定が安定し、その時点でデータ収集を開始できるまで、10分ごとに比率測定を確認します。
- 明視野および蛍光イメージングデータを収集します。
- 下流フックのエッジが明視野画像内にある位置に筋肉を戻します。ハードウェア制御ユーザーインターフェイスの[スティムとデータ]タブで[ディスクにデータをストリーミング]をクリックして、ハードウェアデータのストリーミングを開始します。蛍光ソースを有効にするをクリックして蛍光情報をキャプチャします。
- 明視野イメージングユーザインタフェースで、キャプチャモードを外部トリガに設定し、フレームレートを100 Hzに増やして、キャプチャする画像の数を100に設定します。 Ctrl + Shift + S キー を押し、F1 キーを押して、このウィンドウの明視野イメージングデータを記録します。
- センターセットポイント [um]値を 200 増やし、ステップ 3.4.2 を繰り返します。ステップ 3.3.4 から最終ウィンドウのイメージング データが収集されるまで、スキャン プロトコルを続行します。
- センターの設定値 [um]の値を 0 に設定して、柱柱を中央の位置に戻します。
- OCT イメージング データを収集します。
- マスターキーを|に回してOCTレーザー光源をオンにするをクリックし、電源ボタンを押し、続いて SL ボタンを押します。
- ガルバノメーターの頭部を覆い、BGを取得をクリックしてバックグラウンド干渉パターンを測定し、測定から引きます(図4B)。
- イメージ キャプチャ モードをライブ ビューに設定します。
- B-スキャンイメージにアップストリームフックのみが含まれるまでyの位置を調整します。コントロールフロントパネル (図 4B)に表示される筋肉の長さを 2 で割り、現在のy位置を引きます。この値を"y-オフセット" 入力に入力します。「x-オフセット」値を調整して、柱の断面がフレームの中央に配置されるようにします。
- 柱柱を中心に 、y-位置を調整して y軸に沿ってスキャンし、上流および下流のフックに対応する位置を見つけます。これらの位置を下に置き、注意してください。 範囲 Y (ステップ) を 、これらの値の絶対差を 10 で割った値に設定します。
- イメージキャプチャモードを 刺激トリガー?に設定し、 範囲 X(ステップ)を 100 に 設定し、[アクティブなパラメータの設定 ] ボタンをクリックします。
- [ ストリーム B-スキャン データ?] をクリックし 、[取得] をクリックします。
注:ゲートイメージングプロトコルは、約3分20 sのキャプチャ時間に対応する長さのサンプル2ミリメートルの全体の筋肉の形状をキャプチャするために200のツイッチを必要とします。
4. 明視野画像データセットの処理
- 画像を解析用に準備します。
- ImageJ にイメージをインポートする (ファイル>イメージシーケンス>読み込む>イメージを選択します)。
- 画像のコントラストを上げる (イメージ> [明るさ/コントラスト>調整>最小および最大のスライダーを動かして画像ヒストグラムを集中させます。
- イメージをシャープにする (プロセス > フィルター > アンシャープ マスク >半径 (シグマ) を 1.0 ピクセルに設定し、[マスク ウェイト (0.1 ~ 0.9)] を 0.6 に設定します。
- イメージ シーケンスをエクスポートする (画像シーケンス>保存 > [フォーマット] を PNG に設定し、[0から開始]、[数字 (1 ~ 8) を 4 に設定します。
- 画像をステッチし、局所的な変位を測定し、局所的なサルコメアの長さを計算します。
- "TrabeculaProcessing.m" (要求に応じて利用可能) を開き、FolderPath 変数をすべてのデータを含むメインフォルダーに設定し、ImagePath をステップ 4.1.4 のイメージ シーケンスが保存されたフォルダーに設定します。セクションをイメージング ウィンドウとフレームの数に設定し、ウィンドウごとにキャプチャされたフレーム数に設定します。
- コードを実行します。
注: 出力は、ユーザーが指定した出力フォルダーパスに存在します。(デフォルトでは、パスはフォルダパス/出力に設定されます)。
- FFTサルコメア長さ技術
- 画像処理ソフトウェアを使用して、サルコメアが非常に見える画像の領域でFFTを実行します。
- ステップ 1.1.6 の μm キャリブレーション結果のピクセル数に 1.6 μm と 3.0 μm を掛けてから、インバースを計算して対象の空間周波数の範囲を取得します。
- ステップ 4.3.2 で計算された周波数範囲の周波数情報を無視して、FFT の結果に指数を合わせ、変換結果からその値を引いて DC 項を削除します。
- ガウス曲線を目的の周波数帯に合わせます。
- ガウス曲線のピークの逆数を計算します。これは、関心領域の平均サルコメアの長さです。
注: FFT 計算と指数方程式とガウス方程式の適合は、カスタムのLabVIEWコードを使用して実行されました。
5. 蛍光データの処理
- ウィンドウ依存の自己蛍光をそれぞれのウィンドウから差し引き、340 nm および 380 nm の励起波長に関連する信号の商を計算します。
6. OCT イメージング データの処理
- セグメンテーション用に OCT イメージ セットを準備します。
- ImageJ を開き、イメージをインポートします (ファイル > インポート > イメージ シーケンス)。ファイル エクスプローラ ウィンドウで、イメージを見つけて選択し、[ 開く] をクリックします。
注: OCT のコントロール コードが ImageJ で読み取り可能な形式でイメージを格納しない場合は、PNG に変換します。 - 視覚化を容易にするために、イメージ シーケンスをハイパースタック (イメージ > ハイパースタック>ハイパースタックからハイパースタック) に整理します。開いたダイアログボックスで、スライスの数をスライスごとのB-スキャンの数に、Xを、柱の長さに沿ったスライスの数に設定します。
- 柱形を囲む長方形を描きます。ハイパースタックウィンドウのスライダーを使用して、時間をかけてボリューム全体を囲むか確認します。画像をウィンドウにトリミングします (イメージ> トリミング)。
- 取り付けフックのイメージを含むスライスを削除します (スタック>ツール>スライスキーパー)。トラベキュラ情報のみを含むスライスの範囲を選択します。
- ImageJ を開き、イメージをインポートします (ファイル > インポート > イメージ シーケンス)。ファイル エクスプローラ ウィンドウで、イメージを見つけて選択し、[ 開く] をクリックします。
- WEKA セグメンテーションを訓練します。
- WEKA セグメンテーションを開く (プラグイン>セグメンテーション>トレーニング可能な Weka セグメンテーション)
- 選択モードをフリーハンドに設定します。
- [ 設定] をクリックして、分類子とトレーニングの設定を調整します。(このモデルでは、ガウスブラー、ソベルフィルター、ヘッシアン、ガウスの違い、膜投影、両側、リプシッツのトレーニング機能が使用されました。膜厚は1、膜パッチサイズは8、最小シグマは1、最大シグマは32とした。分類子が FastRandomForest に設定され、分類子オプションが設定されました: batchSize 100、最大深度を 32 に、numFeatures を 32 に、numThreads を 0 に、numTrees を 200 にします。
- トレーニングが十分なセグメント化になるまで画像を手動でセグメント化します。
- 分類子を保存します。
- 処理された B スキャンをセグメント化する
- ステップ 6.2.1 に続いて WEKA セグメンテーションを起動します。
- ステップ 6.2.5 から分類器をロードします。
- [ 結果の作成] をクリックします。
- イメージを 8 ビット (イメージ > タイプ > 8 ビット) に変換します。
- バイナリに画像を変換する (バイナリ>のプロセス > バイナリ>デフォルトの方法とデフォルトの背景を作る.
- 画像シーケンス (PNG) として保存します。
- セグメント化された B スキャン イメージの平均 CSA を計算します。
- バイナリB-スキャン画像の白色ピクセル数をカウントします。
- ピクセル領域に、キャリブレーション済みの深さ解像度(ステップ 1.2 から)と 10 μm(隣接する A スキャン間の距離)を掛けます。
- フック間のすべてのBスキャンについて繰り返し、測定値を平均します。
- セグメント化されたイメージをメッシュに変換します。
- 「OCTmain.m」を開き(リクエストに応じて利用可能)、ステップ6.3.6からの出力を含むフォルダにimageDirectoryを設定します。必要に応じて出力パスを設定します。
- スライスを「Range Y (ステップ)」(ステップ 3.5.5)、フレームを「繰り返し X」(ステップ 3.5.6)の値に設定し、深度分解能(ステップ 1.2.10)にz_dimし、x_dim&y_dimを 10 に割り当てられた値に設定します。
- [ ファイルを実行 ]をクリックします。
Representative Results
ここで提示されるトラベキュラの全長の地域Ca2+ と明視野情報をキャプチャするためには、7つの筋肉位置が必要でした。 図6 は、この動きによってけいれん力が乱され、活性力生産の位置依存性が存在しなかったことを示唆している。
光コヒーレンス断層撮影を使用して収集したBスキャンは、ImageJプラグインWEKA14を使用してセグメント化された(図7A)。各断面は、横(10 μm)と深さ(1.73 μm(心筋)の解像度の差により歪んで表示されます。この歪みは、画像の深度軸を横方向の解像度-深さ解像度比でスケーリングすることで修正されました。図7B,Cは、原C-スキャンをスケーリングした後、それが幾何学的にほぼ円筒形であることを示す。測定室壁の反射は、筋肉データ(図7A、B)と重なる場合がありますが、セグメンテーションソフトウェアはこれを考慮して訓練することができます(図7D,E)。セグメント化されると、筋の長さに沿った断面領域を、ツイッチ全体で計算することができます(図7F)。この特定の柱管はそれから分岐する小さい付属器を有することに注意してください。枝の動きは、柱柱に沿って約0.75mm明らかです。最後に、セグメント化された画像をメッシュに変換して、ジオメトリモデルの構築を支援することができます(図7G)。
100 fpsの速度で異なる柱の位置で撮影された画像データをつなぎ合わせて、柱柱の単一の完全な画像を作成した(図8A)。これらの画像の解像度は0.535 μm/ピクセルです。隣接するウィンドウの重なる領域で線形重み関数を使用すると、ビニゼーションが助けになり、明視野画像に存在するビネットの影響を最小限に抑えることができます。蛍光信号を測定するために、540 μm~540 μmの経線を、340 nm、365 nm、380 nmの波長光で周期的に600 Hzの速度で照らします。340nmおよび380nmの励起光に関連する放出された蛍光の比は、トラベキュラがFura-2を装填された後の細胞内カルシウムと相関する。この測定は比率であるため、実効測定率は200Hzです。各ウィンドウからの平均(n=10) 細胞内Ca2+ の過渡は、それらが画像化された領域に整列している(図8B)。過渡性のピークは合理的に一貫しているように見えますが、拡張期[Ca2+]は、柱柱に沿って900 μmから1800 μmの領域内で低くなっています。同様に、変位追跡の結果(図8C)とサルコメアの長さ(図8D)計算は、地域変動の存在を示しています。使用されるマーカーレストラッキング技術は、十分なコントラストを与えられた各ピクセルの変位を処理することができます。ポストでサルコメアの長さの分布をマッピングする場合、128×128ピクセル(〜67μm×67μm)の相互相関領域を使用して、局所サルコメアの長さを計算しました。この領域は、サンプルを閉じるときに約29個のサルコメアをカプセル化します。各相互相関ウィンドウの重心間のステップサイズ (x 方向と y方向の両方)は、これらのデータを処理するために50ピクセル(〜26μm)に設定されました。サルコメア長さの推定の適合性は、FFT信号に合わせたガウスの幅と振幅に基づいてテストされた。これらの条件は、0 μm から 500 μm の筋肉領域では満たされなかったため、サルコメアの長さの情報はそこで計算できませんでした。関連する変位を考えると、この領域のサルコメアは収縮期に細長い可能性が高い。この推測に従って、その期間中に、トラベキュラの右側の平均サルコメアの長さが短くなります。各パネルから提供された情報を組み合わせることで、最も大きい断面面積を持つ領域が最も重要な力を生み出さないことが分かります。Ca2+ トランジェントの地域変動がほぼ滑らかな勾配を有することを前提に、 図8B は、最大振幅Ca2+ 過渡が、柱管に沿って1300 μmから1600μmの間のどこかで起こることを示しています。ディスプレイスメント マップは、最小モーションを受ける領域がピーク Ca2+ 過渡性とよく一致していることを示します。ただし、この領域はサンプルの最小の断面領域を持ちます。これらのデータを念頭に置いて、この領域が最もストレスを発生させると推測できます。
図1: 心筋計の画像に関するアノテ例 主要な光学部品のそれぞれは概説される。インセットは、測定室の下の 、その場で顕微鏡の目的のクローズアップ、リアビューが含まれています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:同時明視野と蛍光顕微鏡のための光学経路 蛍光顕微鏡の照明源は、キセノンアーク灯であり、その出力は340nm、365 nm、および380 nm光の間で周期的に切り替わる。アークランプの出力経路は、光を蛍光顕微鏡目的に導く鏡にUV光を反射する409 nmのカットオフ波長の二色性ミラーを含む。レンズは、励起光をサンプルに焦点を当て、510 nmの長波長を有する放出光を収集する。この放出光は、552 nmのカットオフ波長を有するので、第1の二色性鏡を通過するが、第2の二色性ミラーを通過しない。フィールドレンズは、反射光をPMTのセンサーに焦点を当てる。一方、明視野顕微鏡用の照明源(660 nm LED)は、サンプルの上方に位置しています。透過光は凝縮レンズによって試料に集着し、20×蛍光目的は、得られた透過画像を捕捉する。明視野照明に使用される波長は、各二色性鏡のカットオフ波長を超えているため、画像がCMOSカメラのセンサーに焦点を合わせる前に両方を通過します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:測定室ホルダー設計(A)光学パスを重ねた測定室ホルダーのアイソメトリック図。明視野照明は、上面(z軸)から発生します。蛍光照明は、劣った表面(z-軸)から発生し、測定アームOCT信号は他の照明軸(y-軸)に直交している。実験中、2つのプラチナフックは、測定室として機能するガラスキャピラリーチューブ内に柱管を保持します。ボイスコイルモーターは、各フックを制御し、その位置はレーザー干渉法を使用して測定されます。現在の位置はユーザ定義の設定ポイントと比較され、FPGA内で符号化されたPIDコントローラを使用すると、エラーが最小化されます。(B)明視野照明をオンにした現場の測定室。バックビューは、図 1のインセットに示されています。(C)測定室ホルダーを通るスーパーフューズート流れの概略。スーパーフューセートはブロックの背面に入り、矢印で示される方向に流れます。上流および下流電極は測定室の取付けられた柱の収縮を引き出すためのフィールド刺激を確立する。青いシェーディングは、実験中にスーパーフューズが流れる領域を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:画像取得および制御ソフトウェアの前面パネル( A)ブライトフィールドイメージングユーザインタフェース(B) OCT イメージング ユーザ インタフェース。(C) ハードウェア制御ユーザー インターフェイス。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:トラベキュラ解剖および取り付けプロトコル(A)解剖室でのランゲンドルフ浸透ラット心臓。 (B ) 心房を取り除いた同じ心臓。破線は、心室を開く切除軌道を示します。(C) 両方の心室の内部を露出する心を開いた。破線のボックスは、通常、トラベキュラが見つかる領域を示します。(D) 切除された右心室壁領域 (C の破線ボックスで示されるのと同じ)。破線は3本の柱を強調する。(E)D. (F) 壁組織を除去したパネルEから3つの中から選択された柱管。(G)1 mL シリンジの末端に単離されたトラベキュラ。(H)取り付けチャンバー内のトラベキュラ。(I) 2つのプラチナフックの間に取り付けられたトラベキュラ。(J)この柱は、フック間に取り付けられ、測定チャンバー内(図3B)内に設置される。緑色のスポットは、最初の二色性フィルターからのアーティファクトです。(K)測定室内に取り付けられた柱管の二次角度。柱筋キュラと顕微鏡対物レンズの距離は約1mmです。この図の大きなバージョンを見るにはこちらをクリックしてください。
図6: 力測定の位置依存性 各撮像位置(n=7) から筋肉によって生じる力が重ねられる。平均活性力生産は0.527 mN±0.003 mN、50%収縮に時間は0.3ms±、時間は50%緩和328.1 ms±0.9 msであった(すべてのデータは平均±SEとして提示される)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: OCTイメージング解析(A) WEKA セグメンテーションの例。筋肉のセグメント化された断面は赤でハイライトされ、背景は緑色で強調表示されます。(B) 柱柱の生のC-スキャンデータの優れたビュー。画像の上部に向かって明るい角度の線は、測定室の壁の反射です。(C) 柱柱の生のCスキャンデータの側面図。(D) セグメント化された OCT データの上位ビュー。(E) セグメント化された OCT データの横ビュー。(F) 経時(y軸) を経て、柱管の長さ(x 軸) に沿った断面領域。筋肉長に沿った断面の平均面積は0.0326 mm2 ± 0.0005 mm2(平均±S.E.)(G) 柱のメッシュ。メッシュはパネルFの断面面積プロットとほぼ一致しています。
図8:ブライトフィールドと蛍光イメージング解析(A)柱柱のステッチ画像(7つのイメージングウィンドウ)(B) Ca2+は、柱管の長さに沿って過渡的である。(C) 各イメージングウィンドウからの平均x-変位。正の変位は、右に動き、左に負の値を表します。(D)必要な画像コントラストを持つ各イメージングウィンドウからの平均サルコメア長さ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
本研究では、明視野、蛍光、OCTイメージングを組み合わせた3つの光学系を組み立てて、積極的に収縮するex vivo心臓柱管路筋道からデータを収集できる構成を提示する(図1および図2)。このような調整された統合は、測定チャンバ(図3)の設計により、明視野蛍光軸にOCTの直交配置を可能にするため可能である。筋肉取り付けシステムは、心筋励起収縮ダイナミクスを特徴付ける上で主要指数の同時定量化の成功に同様に重要な役割を果たす。その新しさは、筋肉の機械的性能に明らかな妨害を伴う筋肉スキャン手順を可能にすることに存在する(図6)。このシステムは、力測定用のイメージング構成と電動フックシステムを組み合わせることで、Ca2+過渡性、変位、サルコメアの長さの地域異質性を、収縮する柱管の巨視的幾何学的情報と共に、ツイッチの時間経過を通じて評価することができます(図7および図8)。
心臓研究所内の明視野-蛍光イメージングシステムの普遍性を考えると、これらの結果の再現は、いくつかのマイナーなハードウェアの考慮事項で達成することができます。ここでは、基礎となる収縮性異種性の解析に不可欠な、明視野発蛍光とOCTを組み合わせるための画像処理ツールキットを紹介する。OCTの統合には遮るもののない光路が必要ですが、ゲート付きイメージングには刺激とOCTと明視野イメージングカメラの両方の間の外部トリガラインと、測定チャンバー全体でサンプルを移動できるマッスルマウントフックが必要です。必要な後処理ソフトウェアと方法は自由に利用できます。特に、使用されるセグメンテーションソフトウェアWEKA14はオープンソースである。材料点8、サルコメア長さ、ゲート容積画像10、およびメッシュ生成コードのマーカーレス追跡の技術も同様にアクセス可能であり、対応する著者からの要求に応じて利用可能にすることができる。
筋生存率、Fura-2の最適な荷重、画像フォーカスは、実験の基礎となる3本の柱です。BDMを含む解剖溶液を用いて拘縮を防ぎ、注射器中の筋肉の輸送、溶液の継続的な酸素化、および実験の日に新しい実験溶液を調製し、すべてが高い筋肉生存率に寄与する。Fura-2AMでトラベキュラをロードする前に、自家蛍光を収集する必要があり、測定されたCa2+ 過渡過渡15に大きな影響を与えることができるので、1つは、研究に興味を持っている。フラ-2AMローディング溶液の酸素化は、色素の負荷を助けるために界面活性剤pluronic-F127の必要な包含によって複雑である。この界面活性剤によって引き起こされる過剰な気泡の形成に対抗するために、ローディング溶液中の抗泡剤の小さな低下は、ユーザが酸素化速度を増加させ、それによって、線維柱が負荷プロセス全体で機能的な生存率を維持する可能性を改善する。最後に、明視野情報と蛍光情報のノイズ比に対する信号を最大にするために、画像化焦点は筋肉の長さに沿って均一でなければならない。
ここで説明する方法には、2 つの制限事項があります。1つ目は、蛍光顕微鏡の空間分解能です。OCTと明視野イメージングの空間分解能は高いが、蛍光顕微鏡の分解能は、540 μm x 540 μmのイメージングウィンドウ内で撮影された体積からの蛍光の積分に限定される。PMTの代わりに高利電結合デバイスカメラを用いて蛍光顕微鏡の空間分解能を高める範囲があり、信号対雑音比16を犠牲にして蛍光信号を捕捉する。第二は、測定可能なサルコメアの長さと幾何学的深さの点で研究することができる柱の直径です。サルコメアの長さを計算するためのウィンドウ付きFFTアプローチは、空間分解能の向上の利点を利用しますが、ロバストネスの低下に関連しています(図8D)。濁ったまたは大口径の線維が研究される場合、より大きい組織サンプルの肉体バンドに関連するコントラストが減少するため、FFTの解決性は大きく低下する。同様に、OCT 内では、300 μm を超えるイメージング深度からのバック反射は、セグメント化段階で解決するには弱すぎる。したがって、我々の技術は、直径300μm未満のトラベキュラに限定されています。しかし、刺激率が高い17の間に筋核の拡散性酸素化に問題がある可能性があるので、大径サンプルを研究することはお勧めできません。
健康筋や病気筋の筋肉幾何学に関連したイオン性機械的機能の評価が可能となり、心筋生理学、病態生理学、薬理学を理解するための強力なアプローチを提供します。ここで概説する画像処理パイプラインは、収縮性の不均一性に対する深い理解を得るための極めて重要なデータを抽出します。このような豊富なデータセットの可能性を十分に認識する1つの手段は、これらのデータを統合して解釈する数学的モデルの構築と、私たちのデバイスを使用して実験的にテストできる予測をすることです。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、オークランド大学(JDおよびMCに授与)、サー・チャールズ・ハーカス健康研究フェローシップ(20/011および21/116)ニュージーランド保健研究評議会(J-CHからKTに授与)の博士奨学金によって資金提供されました。 それぞれ)、国立心臓財団(AAに授与)、ニュージーランド王立協会からのマースデン・ファスト・スタート交付金(UOA1504およびUOA1703)によって授与された博士課程の奨学金(J-CHおよびKTに授与される) それぞれ)、ニュージーランド王立協会(ATに授与)のジェームズ・クック研究フェローシップを授与。この楽器の元の開発は、ニュージーランド王立協会(ATとPNに授与)からのマースデン助成金(11-UOA-199)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
| 20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
| 2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
| 50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
| 90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
| Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
| Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
| Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
| Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
| Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
| D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
| DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
| Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
| Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
| Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
| Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
| FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
| Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
| Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
| Heparin | Pfizer | 61024 | |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
| Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
| Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
| Matlab | Mathworks | Data processing code | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
| Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
| pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
| Powerload | Thermofisher | P10020 | |
| Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
| Transimpedance amplifier | Custom | ||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
| Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |
References
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