Summary
Detta protokoll presenterar en samling sarkom, kalcium och makroskopiska geometriska data från en aktivt entreprenad av hjärt trabecula ex vivo. Dessa samtidiga mätningar möjliggörs genom integrering av tre bildframställningsmetoder.
Abstract
I hjärtmuskeln aktiverar intracellulära Ca2 + transienter kontraktilament, orsakar sammandragning, makroskopisk förkortning och geometrisk deformation. Vår förståelse av de interna relationerna mellan dessa händelser har begränsats eftersom vi varken kan "se" inuti muskeln eller exakt spåra den spatio-temporala karaktären av excitation-sammandragningsdynamik. För att lösa dessa problem har vi konstruerat en enhet som kombinerar en uppsättning bildframställnings former. Specifikt integrerar det ett brightfield mikroskop för att mäta lokala förändringar av sarkomisk längd och vävnad stam, ett fluorescensmikroskop för att visualisera Ca2 + transient, och en optisk koherens tomografi för att fånga vävnadens geometriska förändringar under hela tidsförloppet för en hjärtcykel. Vi presenterar här bildinfrastrukturen och tillhörande ramverk för datainsamling. Data samlas in från isolerade stångliknande vävnadsstrukturer som kallas trabeculae carneae. I vårt instrument håller ett par positionsstyrda platinakrokar varje ände av ett ex vivo-muskelprov medan det kontinuerligt superfunderas med näringsrik saltlösning. Krokarna är under oberoende kontroll, vilket möjliggör realtidskontroll av muskellängd och kraft. Översättningen på längden möjliggör en bitvis skanning av provet, vilket övervinner begränsningar i samband med mikroskopets bildfönsters relativa storlek (540 μm med 540 μm) och längden på en typisk trabecula (>2000 μm). Platinaelektroder i vardera änden av muskelkammaren stimulerar trabecula med en användardefinierad hastighet. Vi utnyttjar stimuleringssignalen som en utlösare för att synkronisera data från varje bildfönster för att rekonstruera hela provet som rycker under steady-state förhållanden. Att tillämpa bildbehandlingstekniker på dessa ljusfältsavbildningsdata ger vävnadsförskjutning och sarkomlängdskartor. En sådan insamling av data, när den införlivas i en experimentmodelleringspipeline, kommer att ge en djupare förståelse för muskelkontraktil homogenitet och heterogenitet i fysiologi och patofysiologi.
Introduction
Superfusion av isolerade hjärtmuskelvävnadspreparat är ett standard och allmänt använt protokoll för att studera hjärt jonisk aktivering ochmekanik 1. I synnerhet har isoleringen av trabeculae, stavliknande strukturer från ventrikulära väggar, möjliggjort bedömning av fenomen inklusive längdberoende aktivering av sammandragning2, sträckberoende svar av sammandragning3,4, och diastolisk viskoelasticitet5 av hjärtvävnad. Ter Keurs, initiativtagare till denna teknik för superfusing isolerade trabeculae, använde ursprungligen en kombination av fluorescens imaging för Ca2 + mätningar och laser diffraktion för bestämning sarkomlängder2,5. Sedan dessa tidiga studier har det blivit allt vanligare att extrahera sarkomlängdsinformation med större rumslig upplösning med hjälp av 2D fast Fourier transform (FFT)-baseradetekniker 6 på brightfield mikroskopibilder. De två bildsystemen möjliggör en partiell bedömning av det underliggande förhållandet mellan Ca2 + release och sarkomlängdsberoende kraftproduktion.
Hjärtmuskeln är strimmiga, med den synliga banding som är associerad med en underliggande serie contractila enheter bestående av tjocka och tjocka filament. Interaktionen mellan dessa ingående glödtrådar som utgör sarkomerer ligger till grund för kraftgenerering, som börjar enligt följande: en depolariserande elektrisk signal, eller åtgärdspotential, gör att spänningsberoende L-typ Ca2 + kanaler i cellmembranet öppnas; den efterföljande cellulära tillströmningen av Ca2 + inducerar frisättningen av Ca2 + från sarkoplasmic reticulum (SR), en intracellulär Ca2 + butik, i en process som kallas Ca2 +-inducerad Ca2 + release7; Denna plötsliga ökning av intracellulär Ca2+ koncentration från nanomolar till mikromolar sortiment gör det möjligt att uppnå kraftproduktion; Ca2+ pumpar extruderar kontinuerligt Ca2+ ur cytosolen tillbaka in i SR och extracellulärt fack; när den intracellulära Ca2 + koncentrationen återgår till nanomolarområdet, kraftproduktionen upphör och muskeln slappnar av. Under kraftproduktionen glider de beståndsdelar tjocka och tunna filamenten över varandra. Sarkomlängden dikterar den relativa omfattningen av överlappning och därmed potentialen för kraftproduktion av muskeln makroskopiskt.
I detta dokument utökar vi dessa fluorescens-brightfield imaging tekniker till att omfatta optisk koherens tomografi (OCT). OCT använder den fysiska störningsprincipen och kan samla den geometriska deformationen av vävnad för att förstå muskelkontraktil heterogenitet8. Vår enhet (Figur 1) använder ett Spektrala-domän OCT (SD-OCT) system. I SD-OCT delar en stråldelare upp ljuset från en bredbands kort koherenslängd superluminescerande diod i referens- och mätarmar. Referensarmen innehåller en fast spegel och mätarmen innehåller en 2D-galvanometer för att styra ljuset. Ljus som backas upp från provet samlas in och stör det reflekterade ljuset i referensarmen för att bilda ett interferensmönster. Djupinformationen kodas i frekvensen av spektralfransen. För att extrahera informationen skickas signalen genom en spektrometer och en omvänd FFT tillämpas på resultatet. Motsvarande 1D-signal representerar strukturerna på olika djup, vilket motsvarar förändringar i brytningsindex9 (A-skanning). Genom att styra lasern i en enda axel kan man konstruera ett tvärsnitt av det intresseprov (B-skanning) och på samma sätt genom att upprepa processen i ett stegvist mönster i den återstående axeln kan en tredimensionell bild genereras (C-skanning). I förlängningen kan man samla in en serie B-skanningar på ett enda segment för ett upprepande tidsvarierande ämne baserat på en extern utlösare och upprepa för att generera en tredimensionell skanning, som representerar en tidsvarierande planbild10.
Vid integreringen av de tre bildsystemen har vi övervägt följande två principer. För det första bör bildsensorer inte upptäcka ljus från en alternativ bildframställningsmodalitet, och för det andra bör den fysiska designen innehålla ledigt utrymme för minst tre samtidiga bildplan. För att uppfylla det första kravet använder brightfieldmikroskopet en 660 nm våglängdslampa för att belysa provet i en inverterad konfiguration. Fluorescensmikroskopet är i en epifluorescenskonfiguration där samma objektiv används för både excitation och insamling av det avgivna ljuset. Excitationslampan har en våglängd på mellan 340 nm och 380 nm, och ett fotomultiplierrör (PMT) mäter det avgivna ljuset vid en våglängd på 510 nm. Ett par tärande speglar gör det möjligt för dessa två optiska banor att dela samma fysiska fotavtryck utan att störa den motsatta mätningen (figur 2). Slutligen använder ULT bredbandsljus (100 nm spektralbredd) med en central våglängd på 840 nm, skild från de andra två formerna. På grund av den låga samstämmigheten hos det ljus som används för OCT kommer allt spridda ljus från ljusfältets fluorescenskällor inte att bidra till interferensmönstret som kodar djupinformation. För det andra kravet har höljets konstruktion för kapillärröret tillgängliga optiska vägar till provets främre, sämre och överlägsna plan. Under experiment håller två platinakrokar en trabecula i ett kapillärrör perfused med syresatt Krebs-Henseleit (KH) lösning. Okjovometerns galvanometerhuvud är ortogonalt inriktat på den ljusfältsfluorescensavbildningsväg som kan dra nytta av det tredje ortogonala optiska planet (figur 3).
Detta dokument beskriver designövervägandena för att bygga en enhet som samtidigt kan avbilda kalcium, sarkomlängd och muskelgeometri. För att demonstrera dessa mätfunktioner beskriver vi processen att isolera en ventrikulär trabecula, beredningen av nödvändiga buffertlösningar, tillsammans med de kritiska stegen som är involverade i hantering och fluorescensbelastning av en ex vivo trabecula. Slutligen beskriver det här dokumentet de processer som krävs för att översätta datauppsättningen till mer användbara visualiseringar.
Protocol
University of Aucklands animaliska kommitté godkände hantering av råttor och beredning av vävnadsprover.
1. Avbildningskalibrering
- Kalibrering av brightfield-mikroskoppixlar
- Fyll mätkammaren med destillerat vatten.
- Placera ett diffraktionsgaller med kända linjer per μm i mätkammaren.
- Tryck på F1 för att aktivera fångsten och justera bildhastigheten [Hz] tills diffraktionsgallret är tydligt synligt (bild 4A). Se till att diffraktionsgallret löper parallellt med ramens kant. Tryck på F1 igen för att stoppa fångsten.
- Ställ in totalbilderna på En, tryck på Ctrl + Skift + S för att strömma data till disk och tryck på F1 för att ta en bild av diffraktionsgallret.
- Öppna ImageJ och importera diffraktionsgallerbilden (Fil > Öppna > välj kalibreringsbild). Håll skift, rita en linje som omfattar 20 ljusa och mörka band av diffraktionsgallret.
- Kalibrera bilden (analysera > setskala). Längden på raden från steg 1.1.5 anger värdet Avstånd i pixlar. Ställ in värdet för känt avstånd på 20 gånger linjerna per μm-mätning och längdenheten till μm. Vågens inverter är antalet mikrometer som representeras av en pixel.
- KALIBRering av OCT-djupupplösning
- Mät tjockleken på en glasmikroskopbild med Vernier-bromsok.
- Slå på OCT-laserkällan.
- Täck galvanometerhuvudet och klicka på Hämta BG för att mäta bakgrundsstörningsmönstret och subtrahera det från mätningen (Bild 4B).
- Kläm fast den uppmätta glasmikroskopsrutschbanan (från steg 1.2.1) i ULT:s mätarm.
- Klicka på Livestream om du vill visa OCT-bilden. Justera glasmikroskopsutschbanan tills den är synlig i B-skanningen.
- Om du vill ta B-skanningsbilden ställer du in Intervall Y (steg) på en, klickar på Strömma B-skanningsdata?och klickar på Hämta.
- Importera B-skanningsbilden till ImageJ (File > Open > Select B-scan). Håll skift, rita en linje mellan gränserna för glasmikroskopets glidning.
- Ställ in skalan (Analysera > setskala). Ställ in känt avstånd till mätningen som samlats in i steg 1.2.1.
- För att beräkna djupupplösningen i luften, korrigera för mikroskopets brytningsindex (nglas = 1,5175)11 genom att multiplicera mätningen per pixelvärde med nglas.
OBS: N-glaset som anges är för borosilikatglas. Mikroskopbilder kan tillverkas av olika material. Använd lämpligt brytningsindex för den uppmätta bilden. - Om du vill skala djupupplösningen för myokardiet delar du värdet från steg 1.2.9. med nmyokardium = 1,38 (värde rapporterat tidigare12).
2. Beredning av muskelprov
- Förbered dissekeringsriggen.
- Häll en del av dissektionslösningen (skisserad i tabell 1) i en liten metallskål och lägg i frysen ungefär en timme före hjärtexcision.
- Ställ in en dissekeringsrigg som säkerställer att dissekeringslösningen är väl syresatt (100% syre) och har spolat genom var och en av rörledningarna. Fyll dissekeringskammaren med syresatt dissekeringslösning och bind löst 3/0 sutur runt perfusionskatetern.
- Ta bort hjärtat.
- Söv 8-10 veckor gammal Wistar råtta med gasformig isofluran (< 5% i syre). Bekräfta anestesi genom svansknapning.
- Placera den bedövade råttan i ett supinläge och injicera subkutant i bukområdet med heparinlösning (1000 IE/kg). Behåll anestesin i ytterligare fem minuter så att heparin cirkulerar.
- Hämta metallskålen som innehåller dissektionslösning från frysen och placera den nära dödshjälpsbänken.
OBS: Undvik att frysa dissekeringslösningen helt för att möjliggöra fullständig nedsänkning av det dissekerade hjärtat. - Överför den bedövade råttan till dödshjälpsbänken och avliva genom livmoderhalsförskjutning.
- Öppna råttkistan med sax, skär först kroppsväggen längs undersidan av revbenet, sedan membranet, innan du fortsätter längs revbenet. Lyft bröstet ur vägen.
- Ta tag i hjärtat med ena handen medan den andra handen använder ett par böjda saxar för att skära av anslutningskärlen (aorta, vena cava, etc.).
- Sänk snabbt ner hjärtat i den kalla dissekeringslösningen.
- Isolera en trabecula.
- Identifiera aortan medan hjärtat är i metallskålen och överför sedan hjärtat till dissekeringskammaren. Använd två böjda tångar, dra aortan över perfusions cannula.
- Håll aortan på plats med en tång. Under tiden öppnar du slanglinjen så att dissekeringslösningen kan flöda genom perfusionsbaleln.
OBS: Sträva efter att slutföra perfusion inom minuten efter hjärtexcisionen. - När kranskärlsvaskulaturen har rensats från blod och hjärtat är helt perfused med dissekeringslösningen, stoppa perfusionsflödet och säkra aortan på plats med suturen. Slå på flödet igen och granska det kannulerade hjärtat.
- Rotera kanylen så att den vänstra kranskärlen är synlig på den överlägsna ytan. Fäst hjärtats spets på botten av dissekeringskammaren(figur 5A). Kapa av båda atria(figur 5B).
- Med en uppsättning fjädersax, skär längs septumens högra sida till hjärtats spets (enligt figur 5B). Fäst den öppnade vänstra ventrikeln på dissekeringskammarens botten. Skär sedan längs septumens vänstra sida, öppna den högra ventrikeln och fäst den på dissekeringskammarens botten också (figur 5C).
OBS: För att fästa ventriklarna i ett öppet läge måste vissa papillärmuskler skäras. Identifiera en frikörd trabecula i höger ventrikel (Figur 5D-E). - Använd vårsaxen och en tång, skär väggvävnaden som omger trabecula och skär sedan väggvävnaden i hälften orthogonally till trabeculas riktning. Trimma väggvävnaden tills dess dimension är lämplig för monteringskonfigurationen som används. I detta fall ungefär hälften så stor som ett sesamfrö (figur 5F).
OBS: Trabeculae kan dissekeras från höger och vänster ventrikel, men de från vänster är vanligtvis mer grumliga och mindre tillämpliga för sarkom- och geometrimätningar. - Lämna den strukna trabecula i dissekeringskammaren och superfusera kontinuerligt med dissekeringslösningen.
3. Experimentellt protokoll
OBS: Enheten13 som användes för det här experimentet byggdes internt och använder anpassad kontrollkod. De nödvändiga övervägandena för utformningen av en enhet som är byggd för att replikera dessa data är två oberoende aktiverade monteringskrokar, en mätkammare med tre optiskt klara axlar (figur 3) och en extern utlösarlinje som synkroniserar brightfield- och OCT-kamerorna med stimulatorn. PMT-spännings- och kraftsignalen samlades in med analoga DAQ-kort, bilderna från OCT och brightfield-mikroskopet samlades in med Camera Link-ramfångarkort, och stimulanssignalen samlades in med ett digitalt I / O-kort. Data lagrades offline med hjälp av en uppsättning producent konsument loopar för att upprätthålla temporal justering.
- Förbered kardiomyometern.
- Spola varmt (~60 °C) vatten, destillerat vatten (rumstemperatur) och superfusera sedan lösningen genom mätkammaren. Bubbla kontinuerligt superfusatlösningen med karbon.
- Slå på ljusfältets mikroskopbelysningskälla och tryck på F1 för att aktivera fångst (Bild 4A). Justera nedströmskroken manuellt tills den är centrerad i brightfield-bilden. Klicka på Noll nedströmsaxeloch sedan nedströms inaktiverad för att aktivera motorn (Bild 4C). Flytta skjutreglaget DS Setpoint [um] tills krokens ände justeras mot kanten av standardområdet av intresse.
- Nollställ nedströmsaxeln igen och flytta sedan skjutreglaget DS Setpoint [um] till 1000. Upprepa processen med uppströmskroken, men flytta inte skjutreglaget US Setpoint [um].
- Klicka på Flytta till montering ( bild4C).
- Starta lysrörsbelysningssystemet genom att växla lampbrytaren innan du snabbt slår på styrenhetens delsystem genom att växla huvudbrytaren.
OBS: Vissa UV-ljuskällor producerar stora mängder ozon. Om så är fallet, anslut ett ozonutsug till ljuskällans utloppsventil och se till att den är igång innan fluorescensbelysningskällan slås på. - Växla driftläget till Turbo-Blanking genom att trycka på lägesknappen på frontpanelen, följt av 2, sedan 1. Tryck på onlineknappen för att låta kontrollkoden informera om driften.
- Montera trabecula.
- Pausa superfusatflödet genom mätkammaren. Fyll monteringskammaren med dissekeringslösningen.
- Använd en 1 ml spruta och transportera trabeculan från dissekeringskammaren till monteringskammaren (figur 5G).
- För att överföra trabecula, placera sprutan vertikalt och i kontakt med monteringskammarens yta. Låt trabekulan sjunka ner i monteringskammaren via gravitationen (Figur 5H).
- Sänk vätskenivån i monteringskammaren så att den är i nivå med krokens mittsektion.
- Justera avståndet mellan krokarna så att det återspeglar trabeculas slacklängd genom att flytta skjutreglaget DS Setpoint [um].
- Använd ett mikroskop för att underlätta visualisering, greppa lätt en av bitarna av ändvävnaden med tång och montera den på den uppströms kroken. Montera den andra delen av ändvävnaden på nedströmskroken(figur 5I).
- När trabekulan är ordentligt monterad flyttar du tillbaka trabeculan till mätkammaren (figur 5J) genom att trycka på Flytta till kammaren ( figur4C). Återuppta superfusatflödet och vätskeextraktionen.
- Ställ in stimulansfrekvensen [Hz] på 1, stimulanstiden [ms] till 10 och stimulansspänningen till 10. Börja stimuleringen genom att trycka på Stimulans på?.
- Förbered trabecula.
- Efter ca 1 h acklimatisering, gradvis minska stimulansspänningen och stimulans varaktigheten i 1 V respektive 1 ms steg. En typisk uppsättning värden är 3 V och 3 ms.
- Slå på ljusfältets belysningssystem. Tryck på F1 och välj en intresseregion som omsluter ett strimmiga område i användargränssnittet. Klicka på Beräkna SL? om du vill beräkna den genomsnittliga sarkomiska längden i det markerade området. Öka muskellängden tills den genomsnittliga sarkomlängden är 2,32 μm genom att öka skjutreglaget separationspunkt [um].
Obs: Beräkna SL? använder en 2D FFT som beskrivs i steg 4.3. Den intresseregion som används för att beräkna den genomsnittliga sarkomlängden är vanligtvis en kvadrat på 100 μm till 150 μm. Därför, när muskeln närmar sig optimal sarkomlängd, används 43 till 65 sarkomerer för att beräkna den genomsnittliga sarkomlängden. - Flytta muskeln genom att justera mittpunktens skjutreglage på fliken "Centre and Separation Control ( Bild4C) så att kanten på den nedströms kroken bara är synlig inom brightfield-bilden. Samla in fluorescensinformationen för tio ryckningar.
- Öka centrets börvärde med 200 och samla in ytterligare tio ryckningar med fluorescensinformation. Upprepa den här processen tills brightfield-bilden innehåller den uppströms kroken. Samla in det sista fönstrets värde av fluorescensinformation.
- Sätt tillbaka trabecula till en central position genom att ställa in mittpunktens [um] värde till 0.
- Minska stimulansfrekvensen till 0,2 Hz och växla från KH-superfusatet till Fura-2-lastlösningen (specificerat i tabell 1).
- Mät fluorescenssignalen var 10:e minut genom att klicka på Aktivera fluorescenskälla på fliken Stim och Data. Visualisera fluorescenssignalen på fliken PMT-signal.
- Efter att 360 nm-signalen har ökat med en faktor 10 eller varaktigheten av belastningsproceduren har överskridit 2 h, returnerar stimulansfrekvensen till 1 Hz och växlar tillbaka till KH-superfusatlösningen.
- Kontrollera förhållandesmätningen var 10:e minut tills förhållandesmätningen stabiliseras, då datainsamlingen kan påbörjas.
- Samla in ljusfälts- och fluorescensavbildningsdata.
- Sätt tillbaka muskeln i den position där kanten på den nedströms kroken bara finns i brightfield-bilden. Börja strömma maskinvarudata genom att klicka på Strömma data till disk på fliken Stim och data i användargränssnittet för maskinvarukontroll. Fånga fluorescensinformation genom att klicka på Aktivera fluorescenskälla.
- På användargränssnittet för brightfield imaging ställer du in hämtningsläget på en extern utlösare, ökar bildhastigheten till 100 Hz och ställer in antalet bilder som ska fångas till 100. Tryck på Ctrl + Skift + S följt av F1 för att spela in ljusfältsavbildningsdata för det här fönstret.
- Öka värdet för centrumpunkten [um] med 200 och upprepa steg 3.4.2. Fortsätt med skanningsprotokollet tills bilddata har samlats in för det slutliga fönstret från steg 3.3.4.
- Sätt tillbaka trabecula till en central position genom att ställa in mittpunktens [um] värde till 0.
- Samla in OCT-bilddata.
- Slå på OCT-laserkällan genom att vrida huvudnyckeln till | och tryck på strömbrytaren, följt av SLD-knappen.
- Täck galvanometerhuvudet och klicka på Hämta BG för att mäta bakgrundsstörningsmönstret och subtrahera det från mätningen (Bild 4B).
- Ställ in bildinspelningsläget på livevisning.
- Justera y-positionentills B-skanningsbilden endast innehåller den uppströms kroken. Dividera muskellängden som visas på kontrollfrontpanelen (bild 4B) med två och subtrahera den aktuella y-positionen. Ange det här värdet iindatan " y-offset ". Justera värdet "x-offset" tills tvärsnittet av trabecula är centrerat i ramen.
- Med trabecula centrerad, skanna längs y-axeln genomatt justera y-positionen föratt hitta de positioner som motsvarar uppströms och nedströms krokar. Notera dessa positioner nedåt. Ställ in Intervall Y (steg) på den absoluta skillnaden mellan dessa värden dividerat med tio.
- Ställ in bildinspelningsläget på Stimulans utlöst?, Intervall X (steg) till 100 och klicka på knappen Ange aktiva parametrar.
- Klicka på Strömma B-skanningsdata?
OBS: Det gated imaging protokollet kräver 200 ryckningar för att fånga hela muskelgeometrin för ett prov 2 mm i längd, vilket motsvarar en fångsttid på ~ 3 min 20 s.
4. Bearbeta ljusfältsbilddatauppsättningen
- Förbered bilderna för analys.
- Importera bilder till ImageJ (> Importera > bildsekvens > Välj bild).
- Öka bildkontrasten( > Justera > ljusstyrka/kontrast > Flytta minimireglage och Maxreglage för att centralisera bild histogrammet).
- Slipa bilderna (Process > Filter > Unsharp Mask > set Radius (Sigma) till 1,0 pixlar och Maskvikt (0,1-0,9) till 0,6).
- Exportera bildsekvensen (Spara som > Bildsekvens > Ställ in formatet på PNG, Börja på 0 och Siffror (1-8) till 4).
- Sy bilderna, mät den lokaliserade förskjutningen och beräkna de lokala sarkomlängderna.
- Öppna "TrabeculaProcessing.m" (tillgänglig på begäran) och ställ in folderpath-variabeln på huvudmappen som innehåller alla data och ImagePath till mappen där bildsekvensen från steg 4.1.4 sparades. Ange avsnitt till antalet bildfönster och bildrutor till antalet bildrutor som fångas in per fönster.
- Kör koden.
Obs: Utdata kommer att finnas i den utdatamappsökväg som anges av användaren. (Som standard är sökvägen inställd på FolderPath/Output).
- FFT sarkomisk längd teknik
- Använd bildbehandlingsprogram för att utföra en FFT i en region i avbildningen där sarkomerer är mycket synliga.
- Multiplicera pixlarna per μm kalibreringsresultat från steg 1.1.6 med 1,6 μm och 3,0 μm innan du beräknar inversen för att få intervallet för rumsliga frekvenser av intresse.
- Anpassa en exponentiell till FFT-resultatet, ignorera frekvensinformationen i frekvensområdet som beräknas i steg 4.3.2 och subtrahera den från transformeringsresultatet för att ta bort DC-termen.
- Montera en gaussisk kurva på frekvensbandet av intresse.
- Beräkna inversen av toppen av den gaussiska kurvan. Detta är den genomsnittliga sarkomiska längden för intresseområdet.
OBS: FFT-beräkningen och monteringen av de exponentiella och gaussiska ekvationerna utfördes med hjälp av anpassad LabVIEW-kod.
5. Behandla fluorescensdata
- Subtrahera den fönsterberoende autofluorescensen från respektive fönster och beräkna kvoten för de signaler som är associerade med 340 nm och 380 nm excitation våglängder.
6. Bearbeta avbildningsdata för ULT
- Förbered OKT-bilduppsättningen för segmentering.
- Öppna ImageJ och importera bilderna (> Importera > bildsekvens). I utforskarfönstret öppnas detta, hittar bilderna, markerar en och klickar på Öppna.
OBS: Om kontrollkoden för OKT inte lagrar bilderna i ett format som kan läsas av ImageJ, konvertera dem till PNG. - Om du vill underlätta visualiseringen ordnar du bildsekvensen i en hyperstack(Bild > Hyperstacks > Stack to Hyperstack). I dialogrutan som öppnas anger du antalet segment till antalet B-skanningar per segment och X till antalet segment längs trabeculas längd.
- Rita en rektangel som omsluter trabecula. Bekräfta att den omsluter hela volymen genom tiden med hjälp av skjutreglagen i hyperstackfönstret. Beskär bilden till fönstret (Bild > Beskär ).
- Ta bort segment som innehåller bilder av monteringskrokarna (Staplar > Verktyg > Slice Keeper). Markera det segmentintervall som endast innehåller trabeculainformation.
- Öppna ImageJ och importera bilderna (> Importera > bildsekvens). I utforskarfönstret öppnas detta, hittar bilderna, markerar en och klickar på Öppna.
- Träna WEKA-segmentering.
- Öppna WEKA-segmentering(plugins > segmentering > Trainable Weka Segmentation).
- Ställ in markeringsläget på Freehand.
- Klicka på Inställningar och justera klassificeraren och träningsinställningarna. (För denna modell användes följande träningsfunktioner: Gaussisk oskärpa, Sobel-filter, Hessian, skillnad mellan gaussier, membranprojektioner, bilaterala och lipschitz. Membrantjockleken var inställd på 1, Membranplåsterstorlek till 8, Minsta sigma till 1 och Maximal sigma till 32. Klassificeraren var inställd på FastRandomForest och klassificeraralternativen var inställda på: batchSize 100, maxDepth to 32, numFeatures to 32, numThreads to 0 och numTrees to 200.)
- Segmentera bilder manuellt tills träningen resulterar i tillfredsställande segmenteringar.
- Spara klassificeraren.
- Segmentera de bearbetade B-skanningarna
- Starta WEKA-segmentering efter steg 6.2.1.
- Läs in klassificeraren från steg 6.2.5.
- Klicka på Skapa resultat.
- Konvertera bilderna till 8-bitars(bild > typ > 8-bitars).
- Konvertera bilderna till binära (Process > Binär > Gör binär > Standardmetod och standardbakgrund).
- Spara som bildsekvens (PNG).
- Beräkna den genomsnittliga CSA i de segmenterade B-skanningsbilderna.
- Räkna antalet vita pixlar i en binär B-skanningsbild.
- Multiplicera pixelområdet med den kalibrerade djupupplösningen (från steg 1.2) och 10 μm (avståndet mellan närliggande A-skanningar).
- Upprepa för alla B-skanningar mellan krokarna och genomsnittliga mätningar.
- Konvertera segmenterad bild till ett nät.
- Öppna "OCTmain.m" (tillgänglig på begäran) och ställ in imageDirectory på mappen som innehåller utdata från steg 6.3.6. Ange outputPath efter behov.
- Ställ in segment på värdet "Intervall Y (steg)" (steg 3.5.5) och bildrutor till värdet "Upprepa X" (steg 3.5.6), z_dim till djupupplösningen (steg 1.2.10) och x_dim & y_dim till det värde som tilldelats 10.
- Klicka på Kör.
Representative Results
För att fånga den regionala Ca2 + och brightfield information för hela längden av trabecula presenteras här, sju muskel positioner krävdes. Figur 6 antyder att ryckkraften var ostörd av denna rörelse, vilket avslöjar att det inte fanns något positionsberoende av den aktiva kraftproduktionen.
B-skanningar som samlats in med hjälp av optisk koherenstomografi med en hastighet av 100 Hz segmenterades med ImageJ-plugin WEKA14 (Figur 7A). Varje tvärsnitt verkar förvrängt på grund av skillnaden mellan upplösningarna i sidled (10 μm) och djup (1,73 μm (i myokardium).Each cross-section appears distorted due to the lateral (10 μm) and depth (1.73 μm (in myocardium)) resolutions. Denna förvrängning korrigerades genom att bildens djupaxel skalas med förhållandet för lateral upplösningsdjupupplösning. Figur 7B, C visar att efter skalning av den råa C-skanningen av trabecula är den ungefär cylindrisk i geometri. Reflektionen av mätkammarens vägg kan ibland överlappa muskeldata (figur 7A, B), men segmenteringsprogramvaran kan tränas för att ta hänsyn till detta ( Figur7D, E). När det har segmenterats kan tvärsnittsområdet längs muskelns längd beräknas under hela rycket (Figur 7F). Observera att just denna trabecula har ett litet bihang som förgrenar sig från den. Grenens rörelse är uppenbar ~ 0,75 mm längs trabecula. Slutligen kan de segmenterade bilderna omvandlas till maskor för att underlätta byggandet av geometriska modeller(figur 7G).
Bilddata som tagits vid var och en av de olika trabeculapositionerna med en hastighet av 100 fps syddes ihop för att skapa en enda komplett bild av trabecula (Figur 8A). Upplösningen på dessa bilder är 0,535 μm/pixel. Användningen av linjära viktningsfunktioner i de överlappande regionerna i angränsande fönster underlättar visualisering och minimerar effekten av vinjetten som finns i brightfield-bilderna. För att mäta den fluorescerande signalen är ett 540 μm med 540 μm fönster av trabecula cykliskt upplyst med 340 nm, 365 nm och 380 nm våglängdsljus med en hastighet av 600 Hz. Förhållandet mellan det utsläppt fluorescens som är förknippat med excitationsljuset på 340 nm och 380 nm korrelerar med det intracellulära kalciumet efter att trabecula har laddats med Fura-2. Eftersom denna mätning är ett förhållande är den effektiva mäthastigheten 200 Hz. De genomsnittliga (n = 10) intracellulära Ca2+ transienterna från varje fönster är justerade med den region de avbildades (figur 8B). Även om övergåendes topp verkar någorlunda konsekvent, är diastoliska [Ca2+] lägre inom regionen mellan 900 μm och 1800 μm längs trabecula. På samma sätt tyder resultaten av beräkningarna av förskjutningsspårningen (figur 8C) och sarkomlängden(figur 8D)också på förekomsten av regional variabilitet. Den markörlösa spårningstekniken som används kan bearbeta förskjutningen av varje pixel, med tillräcklig kontrast. Vid kartläggning av fördelningen av sarkomlängder i inlägg användes ett korrelationsområde på 128 pixlar med 128 pixlar (~ 67 μm med 67 μm) för att beräkna regional sarkomlängd. Detta område kapslar in cirka 29 sarkomerer när nära provet är nära optimal sarkomlängd. Stegstorleken (i både x- och y-riktningarna)mellan centroiden i varje korrelationsfönster var inställd på 50 pixlar (~ 26 μm) för bearbetning av dessa data. Lämpligheten av sarkomiska längd uppskattningar testades baserat på bredden och amplituden av gaussiska passform till FFT signalen. Dessa villkor var inte uppfyllda i muskelregionen mellan 0 μm och 500 μm så ingen sarkomlängdsinformation kunde beräknas där. Med tanke på de associerade förskjutningarna är det troligt att sarkomerna i denna region förlängdes under kontraktilfasen. I linje med denna spekulation förkortas de genomsnittliga sarkomiska längderna på höger sida av trabecula under den perioden. Genom att kombinera den information som lämnats av var och en av panelerna verkar det som om den region som har det största tvärsnittsområdet inte producerar den viktigaste kraften. Under antagandet att den regionala variationen av Ca2+ transienter har en ungefär jämn lutning, indikerar figur 8B att den största amplituden Ca2 + transient förekommer någonstans mellan 1300 μm och 1600 μm längs trabecula. Förskjutningskartan anger att den region som genomgår minst rörelse stämmer väl överens med toppen Ca2+ övergående. Denna region har dock de minsta tvärsnittsområdena i urvalet. Med dessa data i åtanke kan man dra slutsatsen att denna region genererade mest stress.
Bild 1: Kommenterad bild av kardiomyometern. Var och en av de viktigaste optiska komponenterna beskrivs. Insetet innehåller en närbild, bakifrån, av mikroskopmålet in situ ,under mätkammaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Optisk väg för samtidig ljusfälts- och fluorescensmikroskopi. Belysningskällan för fluorescensmikroskopet är en Xenon-båglampa, vars utgång cykliskt växlar mellan 340 nm, 365 nm och 380 nm ljus. Ljusbågslampans utgångsbana innehåller en tärande spegel med en avskuren våglängd på 409 nm som reflekterar UV-ljuset på en spegel som leder ljuset in i ett fluorescensmikroskopmål. Linsen fokuserar excitationslampan på provet och samlar upp det avgivna ljuset, som har en längre våglängd på 510 nm. Detta avgivna ljus passerar genom den första tärande spegeln, men inte den andra, eftersom den har en avskuren våglängd på 552 nm. En fältlins fokuserar sedan det reflekterade ljuset på PMT:s sensor. Under tiden är belysningskällan (660 nm LED) för brightfieldmikroskopet placerad ovanför provet. Det överförda ljuset är inriktat på provet med en kondensorlins, och 20× fluorescensmålet fångar den resulterande överföringsbilden. Våglängden som används för brightfieldbelysning överstiger den avskurna våglängden för varje dichroisk spegel, så den passerar genom dem båda innan bilden fokuseras på sensorn på en CMOS-kamera. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Hållarens utformning av mätkammarens hållare. Brightfield belysning sker från den överlägsna ytan (z-axeln); fluorescensbelysning sker från den sämre ytan(z-axeln),och mätarmen OCT-signalen är ortogonal mot den andra belysningsaxeln (y-axeln). Under försöket håller två platinakrokar en trabecula i ett kapillärrör i glas som fungerar som mätkammare. Röstspolemotorer styr varje krok och deras positioner mäts med laserinterferometri. Den aktuella positionen jämförs med en användardefinierad börspunkt och med hjälp av en PID-styrenhet kodad i en FPGA minimeras felet. B)Mätkammare på plats med ljusfältsbelysningen på. Bakgrundsvyn visas i inset figur 1 . C)Schematiskt för superfusatflödet genom mätkammarens hållare. Superfusate kommer in i baksidan av blocket och strömmar i den riktning som indikeras av pilar. Elektroderna uppströms och nedströms fastställer fältstimuleringen för att framkalla sammandragningen av en monterad trabecula i mätkammaren. Blå skuggning anger de regioner där superfusatet flödar under ett experiment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4: Frontpanelen för bildförvärvs- och kontrollprogramvaran. (B) OCT imaging användargränssnitt. (C) Användargränssnitt för maskinvarukontroll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5:Trabecula dissekerings- och monteringsprotokoll. B) Samma hjärta med atria borttaget. Streckade linjer indikerar excisionsbanan för att öppna ventriklarna. (C)Ett öppnat hjärta för att exponera insidan av båda ventriklarna. Den streckade rutan anger den region där trabeculae vanligtvis hittas. D)Struket högerkammkulärt väggområde (samma som anges i den streckade rutan i C). Streckade linjer markerar tre trabeculae. E)En trabecula som valts ut bland de tre i D.FTrabecula från panel E med väggvävnaden borttagen. g)Den isolerade trabeculan i slutet av en 1 ml spruta. (H) Trabecula i monteringskammaren. Trabeculamonterad mellan två platinakrokar. j)Trabecula, monterad mellan krokar, i mätkammaren(figur 3B). Den gröna platsen är en artefakt från det första tärande filtret. k)Sekundär vinkel på den monterade trabekulan i mätkammaren. Avståndet mellan trabecula och mikroskopets objektiv är ca 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Kraftmätningens positionsberoende. Kraften som produceras av muskeln från var och en av bildpositionerna (n = 7) överlagrad. Den genomsnittliga aktiva kraftproduktionen var 0,527 mN ± 0,003 mN, tid till 50 % minskning 77,1 ms ± 0,3 ms och tid till 50 % avslappning 328,1 ms ± 0,9 ms (alla uppgifter presenteras som medelvärdet ± SE). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7:OCT-bildanalys. (A) Exempel på WEKA-segmentering. Det segmenterade tvärsnittet av muskeln markeras i rött, och bakgrunden markeras i grönt. B)Överlägsen vy över de råa C-skanningsdata för en trabecula. Den ljusa vinklade linjen mot bildens överst är reflektionen av mätkammarens vägg. C)Sidovy av de råa C-skanningsdata för en trabecula. (D) Överlägsen vy över segmenterade OCT-data. (E)Sidovy över segmenterade ULT-data. F)Tvärsnittsområdet längs trabekulaens längd(x-axel)genom tiden(y-axeln). Det genomsnittliga tvärsnittsområdet längs muskellängden var 0,0326 mm2 ± 0,0005 mm2 (medelvärde ± S.E.) g)En maska av trabecula. Nätet har justerats ungefär med tvärsnittsområdet på panel F. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Ljusfälts- och fluorescensavbildningsanalys. (A) Sydd bild (sju bildfönster) av trabecula. B)Ca2+ transienter längs trabeculas längd. (C) Genomsnittlig x-deplacement från varje bildfönster. En positiv förskjutning representerar en rörelse till höger och negativ till vänster. (D) Genomsnittliga sarkomlängder från varje bildfönster som hade den nödvändiga bildkontrasten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tabell 1: Lösningstabell Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
I denna studie presenterar vi en konfiguration som gör det möjligt att montera tre optiska system som kombinerar brightfield, fluorescens och OCT imaging för att samla in data från en aktivt kontrakterande ex vivo hjärt trabecula (figur 1 och figur 2). En sådan orkestrerad integration är möjlig på grund av mätkammarens utformning (figur 3) för att möjliggöra det ortogonala arrangemanget till den ljusfältsfluorescensaxeln. Muskel-montering systemet spelar en lika viktig roll i framgången för samtidiga kvantifieringar av viktiga index i karakterisering hjärt muskel excitation-kontraktion dynamik. Dess nyhet ligger i att möjliggöra muskelskanningsförfaranden utan uppenbar störning av muskelens mekaniska prestanda (figur 6). Med den kombinerade bildkonfigurationen och motoriserade kroksystemet för kraftmätning kan detta system utvärdera regional heterogenitet i Ca2 + transient, förskjutning och sarkomlängd, tillsammans med makroskopisk geometrisk information om en kontrakterande trabecula under hela rycktiden (figurerna 7 och figur 8).
Med tanke på allestädes närvarande av brightfield-epifluorescens bildframställningssystem inom hjärt forskning laboratorier, reproduktionen av dessa resultat kan uppnås med några mindre hårdvara överväganden. Här presenterar vi verktygssatsen för bildbehandling för att kombinera brightfield-epifluorescens och OCT, vilket är viktigt för att analysera den underliggande kontraktil heterogeniteten. Integrationen av ULT kräver en fri optisk bana, medan den gated imaging kräver en extern utlösarlinje mellan stimulansen och både OCT och brightfield imaging camera och muskelmonteringskrokar som kan flytta provet genom hela mätkammaren. Den nödvändiga programvaran och metoderna efter bearbetningen är fritt tillgängliga. I synnerhet är segmenteringsprogramvaran som används, WEKA14, öppen källkod. Tekniken för markörlös spårning av materialpunkter8, sarkomlängd, gated volumetric imaging10, och nätgenereringskoder är också tillgängliga och kan göras tillgängliga på begäran från motsvarande författare.
Muskelkraft, optimal belastning av Fura-2 och bildfokus är de tre pelarna som utgör grunden för ett framgångsrikt experiment. Att använda en dissekeringslösning som innehåller BDM för att förhindra kontraktur, transport av muskeln i en spruta, kontinuerlig syresättning av lösningen och förberedelse av nya experimentella lösningar på dagen för ett experiment bidrar alla till en hög muskel livskraft. Innan trabecula laddas med Fura-2AM, autofluorescens måste samlas in för varje tillstånd man är intresserad av att studera eftersom det kan ha en betydande effekt på den uppmätta Ca2 + transient15. Syresättning av Fura-2AM lastlösning kompliceras av den nödvändiga införandet av tensiden pluronic-F127 för att underlätta färgbelastning. För att bekämpa den resulterande överskottsbubblabildningen orsakad av detta tensid gör en liten droppe skumskydd i lastlösningen det möjligt för användaren att öka syresättningshastigheten och därigenom förbättra risken för att trabecula upprätthåller funktionell livskraft under hela lastningsprocessen. Slutligen måste avbildningsfokus vara enhetligt längs muskellängden för att maximera signal-till-brusförhållandet för brightfield- och fluorescensinformationen.
Det finns två begränsningar att tänka på med de metoder som presenteras här. Den första är den rumsliga upplösningen av fluorescensmikroskopet. Medan de rumsliga upplösningarna för OCT och brightfield imaging är höga, är upplösningen på fluorescensmikroskopet begränsad till integralen av fluorescensen från volymen som fångas inom ett 540 μm med 540 μm bildfönster. Det finns utrymme att öka den rumsliga upplösningen på fluorescensmikroskopet genom att använda en hög förstärkningsladdningsankparerad enhetskamera, istället för en PMT, för att fånga fluorescenssignalen på bekostnad av signal-till-brusförhållandet16. För det andra är diametern på trabecula som kan studeras i termer av mätbar sarkomlängd och geometriskt djup. Metoden med fönster-FFT för databehandlingslängd utnyttjar fördelarna med förbättrad rumslig upplösning men är förknippad med minskad robusthet (figur 8D). I de fall där grumlig eller stor diameter trabeculae ska studeras, kommer FFT: s resolvability att minskas kraftigt på grund av den minskade kontrasten i samband med sarkomisk bandning i större vävnadsprover. På samma sätt kommer backreflektionerna från ett bilddjup på mer än 300 μm inom ULT att vara för svaga för att lösas under segmenteringsstadiet. Därför är vår teknik begränsad till trabeculae med en diameter mindre än 300 μm. Det rekommenderas dock inte att studera prover med stor diameter eftersom det kan finnas problem med diffus syresättning av muskelkärnan under höga stimuleringshastigheter17.
Vår metod möjliggör bedömning av jonisk mekanisk funktion i samband med muskelgeometri i friska och sjuka muskler, vilket ger ett kraftfullt tillvägagångssätt för att förstå hjärtmuskelfysiologi, patofysiologi och farmakologi. Den bildbehandlingspipeline som beskrivs här extraherar data som kommer att vara avgörande för att samla in en djupare förståelse för kontraktil heterogenitet. En väg att fullt ut inse potentialen i en så rik datauppsättning är att bygga matematiska modeller som integrerar och tolkar dessa data och att göra förutsägelser som kan testas experimentellt med hjälp av vår enhet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av doktorandstipendier från University of Auckland (tilldelas JD och MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 och 21/116) från Health Research Council of New Zealand (tilldelas J-CH till KT, respektive), ett doktorandstipendium som delas ut av National Heart Foundation (tilldelas AA), Marsden Fast-Start grants (UOA1504 och UOA1703) från Royal Society of New Zealand (tilldelas J-CH och KT, respektive), och en James Cook Research Fellowship från Royal Society of New Zealand (tilldelas AT). Den ursprungliga utvecklingen av detta instrument finansierades av ett Marsden-anslag (11-UOA-199) från Royal Society of New Zealand (tilldelat AT och PN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
| 20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
| 2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
| 50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
| 90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
| Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
| Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
| Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
| Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
| Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
| D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
| DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
| Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
| Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
| Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
| Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
| FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
| Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
| Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
| Heparin | Pfizer | 61024 | |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
| Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
| Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
| Matlab | Mathworks | Data processing code | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
| Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
| pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
| Powerload | Thermofisher | P10020 | |
| Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
| Transimpedance amplifier | Custom | ||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
| Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |
References
- Han, J. -C., et al. Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat. American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).
- Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
- Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).
- Dowrick, J. M., et al. The slow force response to stretch: Controversy and contradictions. Acta Physiologica. 226 (1), 13250 (2019).
- Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).
- Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration. Conference Record - IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).
- Bers, D. M.
- Cheuk, M. L., et al. A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations. Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).
- Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform. Optics Express. 20 (21), 23398 (2012).
- Cheuk, M. L., et al. Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).
- Ritland, H. N. Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature. Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).
- Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).
- Taberner, A., et al. A dynamometer for nature's engines. IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Jiang, Y., Julian, F. J. Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).
- Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).
- Han, J. -C., et al. Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).
