Summary
Mevcut protokol, yetişkin fare damak tadından elde edilen oral keratinositlerin izolasyonu ve kültürünü açıklar. İmmünasyon kullanılarak yapılan bir değerlendirme yöntemi de rapor edilir.
Abstract
Yıllardır, keratinositleri içeren çoğu çalışma insan ve fare derisi epidermal keratinositler kullanılarak yapılmıştır. Son zamanlarda, oral keratinositler benzersiz işlevleri ve özellikleri nedeniyle dikkat çekmektedir. Oral epitelin homeostazını korurlar ve rejeneratif tedavilerdeki uygulamalar için kaynak görevi ederler. Bununla birlikte, yetişkin farelerden oral primer keratinositler kullanan in vitro çalışmalar, verimli ve köklü bir kültür protokolünün olmaması nedeniyle sınırlı olmuştur. Burada, oral primer keratinositler yetişkin farelerin damak dokularından izole edildi ve chelexed-serum ile desteklenmiş ticari bir düşük kalsiyum ortamında kültürlendi. Bu koşullar altında keratinositler proliferatif veya kök hücre benzeri bir durumda muhafaza edildi ve pasajlar arttıktan sonra bile farklılaşmaları inhibe edildi. İşaretleyici ekspresyon analizi, kültürlü oral keratinositlerin bazal hücre belirteçlerini p63, K14 ve α6-integrin olarak ifade ettiğini ve K13 farklılaşma işaretleyicisi ve fibroblast belirteci PDGFRα için negatif olduğunu göstermiştir. Bu yöntem in vitro oral epitel kök hücre fonksiyonlarının incelenmesinde aşağı akış uygulamalarına uygun uygulanabilir ve kültlenebilir hücreler üretti.
Introduction
Oral epitel, vücudu kimyasal veya fiziksel hasar ve bakteriyel ve viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çevresel streslerden korumada ilk bariyer görevi görür1,2. Oral mukoza, esas olarak fibroblastlar ve hücre dışı matristen oluşan lamina propria adı verilen keratinositler ve alttaki bağ dokusundan oluşan tabakalı skuamöz epitelin dış tabakasından oluşur. Fare oral mukozası geniş ölçüde üç alt tipe ayrılabilir: mastikatör (sert damak ve diş eti), özel (dorsal dil) ve astar (bukkal mukoza, ventral dil, yumuşak damak, dudaklar) mukoza2,3 (Şekil 1A). Oral epitel, mastikatör ve özel mukozada keratinize edilir ve astar mukozasında keratinize değildir. Anatomik konumuna rağmen, oral epitel cilt epidermisine benzer, çünkü çeşitli derecelerde farklılaşma ile sıkıca paketlenmiş epitel hücrelerinden oluşur: farklılaşmamış hücreler içeren bazal tabakalar; keratinize epitel oluşturan dikenli, granül ve kornişli katmanlar veya keratinize edilmemiş epitel oluşturan orta ve yüzeysel katmanlar4. Transgenik fare modelleri oral epitel kök hücrelerinin damak, bukkal mukoza, dil ve diş eti hücresel ve moleküler özelliklerinin incelenmesini kolaylaştırdı5,6,7,8,9,10,11. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu öncelikle vivo fare deneylerinde kullanılır. Hücre kültürü sistemleri genellikle yerleşik ve verimli protokollerin eksikliği nedeniyle kullanılmamıştır.
Kök hücre düzenleyicilerinin moleküler ve biyokimyasal analizi, hücre bazlı tahliller ve ilaç taraması için in vitro kültür sistemi kullanılabilir. Şu anda, bazal keratinositlerin klinik ve araştırma amacıyla başarılı bir şekilde izole edilebildiği ve kültürlenebildiği cilt epidermisinin primer keratinosit kültürü için protokoller geliştirilmiştir12,13,14,15. 1980'de Hennings ve arkadaşları, kültür ortamında düşük kalsiyum konsantrasyonu (< 0.09 mM Ca2+) çoğalma ve hücrelerin farklılaşmamış bir durumda tutulmasını kolaylaştırdığını gösterdi. Daha yüksek kalsiyum seviyesi hücre farklılaşmasına ve çoğalma azalmasına neden oldu16. Daha sonra, yenidoğan ve yetişkin murine epidermal keratinositler için kültür metodolojileri oluşturulmuş ve in vitro çalışmalar için farklı genetik geçmişlere sahip çok sayıda fare modeline yaygın olarak uygulanmıştır17,18,19. Cilt ve oral epitel ortak özellikleri paylaşmakla birlikte, keratinizasyon durumlarında, ciro oranında, gen ifadesinde ve yara iyileşme yeteneklerinde de içsel farklılıklar gösterirler3,11,20,21,22,23,24,25,26.
İnsan oral keratinosit kültürü başarıyla gerçekleştirilmesine rağmen 27.28,29, fare oral keratinosit kültürü üzerine yapılan yayınlar30,31,32 hedef dokunun küçüklüğü ve hücrelerin cilt epidermal keratinositlere göre farklı özellikleri nedeniyle sınırlıdır. Bu protokol, fare birincil oral keratinositlerinin yalıtımını ve uzun vadeli kültür tekniklerini açıklar.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Kumamoto Üniversitesi ve Tsukuba Üniversitesi Kurumsal Hayvan Deney Komitesi yönergelerine göre gerçekleştirildi.
1. Reaktiflerin ve kültür medyasının hazırlanması
- 60 μM kalsiyum ve 600 μL antibiyotik-antimykotik çözelti içeren 40 mL keratinosit kültür ortamı hazırlayın. 20 mL%0,025 tripsin ve 400 μL antibiyotik-antimycotic çözelti hazırlayın.
- Tripin inhibisyon çözeltisini oda sıcaklığında çözün ve 4.1 adımında kullanılana kadar 4 °C'de tutun.
NOT: İzolasyon reaktifi beş farenin doku izolasyonu için hazırlanır.
- Tripin inhibisyon çözeltisini oda sıcaklığında çözün ve 4.1 adımında kullanılana kadar 4 °C'de tutun.
- Kültür medyasını hazırlamak için, 500 mL orta alın ve 5 mL büyüme takviyesi çözeltisi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) (bundan böyle tam orta olarak anılacaktır) ve% 20 kalsiyum tükenmiş chelexed-fetal sığır serumu (FBS)33 (bundan böyle chelexed-FBS olarak anılacaktır).
2. Damak dokusunun yetişkin fareden diseksiyonu
- Yetişkin bir C57BL/6J fareyi (erkek veya dişi) tesisin hayvan refahı ile ilgili yönetmeliklerine uygun olarak servikal çıkık yoluyla kurban edin.
- Ağız çevresindeki saçları bir tıraş makinesi ile çıkarın. Makas kullanarak, yanaktan çeneye doğru, her iki taraftan kesin.
NOT: Kurbandan önce farenin uyuşturulması gerekir. Metetomididin, midazolam ve butorphanolün anestezik karışımı kullanılır (bkz. Malzeme Tablosu).
- Ağız çevresindeki saçları bir tıraş makinesi ile çıkarın. Makas kullanarak, yanaktan çeneye doğru, her iki taraftan kesin.
- Ağzı geniş açmak ve pamuklu çubuk kullanarak herhangi bir kanı emmek için kümesleri kullanın. Damağı dezenfekte etmek için ağzın içini% 10 povidone-iyot içeren bir pamuklu çubukla silin.
- Fare damağı toplamak için, önce, maksiller dişlerin damak tarafı boyunca tam kalınlıklı marjinal bir kesi yapmak için cerrahi bir neşter bıçağı kullanın. Daha sonra, bir raspatorium kullanarak tüm damağı dikkatlice parçalara ayırın.
NOT: Raspatorium, mukoperiosteal bir flep yükseltmek için kullanılan bir araçtır (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1B). - Damak dokusunu 4 mL tam orta + antibiyotik-antimykotik çözelti içeren 15 mL'lik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın. Dokuları inkübasyona hazır olana kadar buzda tutun.
NOT: Birden fazla fareden toplanmak için damak dokuları 4 saate kadar buzda tutulabilir.
3. Damak dokusunun ön işlemden önce
- Laminer akış davlumbazında, dokuları 4 mL tam orta + antibiyotik-antimykotik çözelti içeren 60 mm'lik bir tabağa aktarın.
- Kısa, künt tokalar ve neşter bıçağı kullanarak, dokulardaki herhangi bir kanı nazikçe çıkarın. Dokuları tam ortamda 10 kez yıkayın.
- Dokuları, epitel yüzeyi aşağı bakacak şekilde 4 mL%0,025 tripsin + antibiyotik-antimycotic çözelti içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın.
NOT: İçe doğru kıvrılan epitel yüzeyi tripsin çözeltisinde bekletilmelidir; lamina propria yüz yüze olmalıdır. Doku tamamen tripsin çözeltisinde inkübe edilecek şekilde mümkün olduğunca düzleştirilmelidir. - Dokuları kültür kaputunda oda sıcaklığında ~16 saat boyunca % 0.025 trypsin içinde kuluçkaya yatırın.
4. Birincil hücrelerin toplanması ve kültürü
- Bir çift künt forseps kullanarak, dokuyu tripsin çözeltisinden (35 mm'lik tabakta) çıkarın ve epitel yüzeyi yukarı bakacak şekilde 60 mm'lik bir tabakta (çanak başına 4 mL) tripsin inhibitörü çözeltisine aktarın.
- Damak kenarına tutunmak için epansları kullanarak, neşter bıçağı kullanarak alttaki lamina propria'daki epitel tabakasını hafifçe kazıyın.
NOT: Bağ dokusu tripsin ile sindirilmez, bu nedenle kazıma sırasında soyulmaz. - Dokulardan maksimum miktarda epitel hücresi toplamak için, dokuyu 4 mL tam orta ile başka bir 60 mm'lik çanağa aktarın ve kazıma adımını tekrarlayın.
NOT: Bıçağın ucuyla dokuyu kazımaktan kaçındığından emin olun; bunun yerine bıçağın kenarını kullanın. Kazıma doku başına 5-10 dakika boyunca gerçekleştirilir. - Steril bir 100 μm hücre süzgecini 50 mL konik tüpün üstüne yerleştirin.
- Steril bir pipet kullanarak, yüzeyini ıslatmak için 2 mL tripsin çözeltisini (adım 4.1'den) süzgeçe aktarın.
- Pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 60 mm'lik tabakta (4.2-4.3 adımlarından) birkaç kez karıştırın ve hücreleri 4.4-4.5 adımlarında hazırlanan 100 μm hücre süzgecinden filtreleyin.
- Hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın. 15 μL trippan mavisi çözelti hazırlayın ve 15 μL hücre süspansiyonu ekleyin (adım 4.6). Hücre-trippan mavi karışımının 10 μL'sini bir hemositometreye aktarın ve hücre sayısını sayın.
NOT: Bir fare damak parçası 1 milyon hücreye kadar verim verebilir. - Sayarken, tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 x g'da (adım 4.6'dan itibaren) santrifüj edin.
- Bir pipet ile süpernatant aspirat. Tüpe 2 mL komple orta + chelexed-FBS ekleyin. 5 mL pipet kullanarak birkaç kez tritüre ederek hücre peletini yeniden canlandırın.
- Plaka 2-5 x 105 hücre bir fareden kollajen tip I ile önceden kaplanmış 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna (bkz. Malzeme Tablosu).
- Ortamı değiştirmeden hücreleri 2 gün boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Tohumlamadan iki gün sonra, kültür ortamının yarısını tam orta + chelexed-FBS ile değiştirin. Mikroskop altındaki hücre morfolojisini kontrol et. Hücreleri her 2 günde bir tam orta + chelexed-FBS ile besleyin.
NOT: Tohumlamadan sonra, farklı boyutlarda hücreler gözlenecektir. Tohumlamadan yaklaşık 3-5 gün sonra, parke taşı morfolojisi olan keratinositler (Şekil 2) gözlenebilir. İlk pasajın gerçekleştirilebilmesi için 1-2 hafta kültür gerekir ve hücreler ikinci ve üçüncü pasajlara hazır olmadan önce sonraki 1-2 hafta gereklidir. Bundan sonra, hücreler daha hızlı büyür ve kriyoprezervasyona hazırlanabilir. Hücreler sırasıyla birinci ve ikinci geçitte bir kuyuya (24 kuyu plakası) ve 6 kuyu plakasına yeniden kaplanabilir. Sonraki geçiş hücre büyümesine ve yoğunluğuna bağlı olacaktır. Üçüncü pasajdan sonra 1:2 veya 1:3 hücre bölünme oranı kullanılabilir.
5. Keratinosit pasajı
- Kültür çanaktan 2 mL süpernatant toplayın ve 15 mL konik bir tüpe (buz üzerinde) dağıtın. Hücreleri steril 1x PBS ile iki kez yıkayın.
NOT: Hücreler yaklaşık %70-%80 izdiah süresine ulaştığında geçişe hazırdır. - 6 kuyulu bir tabağa yemeğe 1 mL% 0.05 trypsin-EDTA ekleyin.
- 37 °C'de 5-15 dakika kuluçkaya yatır; hücrelerin tabaktan ayrılıp kopmadığını görmek için 5 dakika sonra kontrol edin.
- Hafif pipetleme ile 1 mL tripsin inhibisyon çözeltisi ve 2 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS kullanarak reaksiyonu nötralize edin. Ardından, hücre süspansiyonu 5.1 adımındakiyle aynı 15 mL konik tüpe aktarın.
- Hücre süspansiyonu 100 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj. Süpernatantı bir pipetle aspire edin ve hücre peletini 1 mL tam kültür ortamında yeniden dirilir.
- Hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunun 1 mL'lik plakasını yeni bir 24 veya 6 kuyu kültür plakasına koyun.
NOT: Erken pasajlardan gelen hücrelerin bir kısmı %70 komple kültür ortamı + %20 chelexed-FBS + %10 DMSO karışımında dondurulabilir. Bir birleştiği kültür plakasından 1-2 hücre kriyovyalleri toplanabilir.
6. Kriyoprezervasyon ve keratinositlerin geri kazanımı
- Hücre dondurma
- Keratinositleri% 80-% 90 izdiah eder.
NOT: Hücrelerin aşırı büyümesine izin vermeyin, çünkü bu onların çoğalma durumlarını ve canlılıklarını azaltabilir. - Yemekteki keratinositleri 5.1-5.5 adımlarında açıklandığı gibi% 0.05 tripsin-EDTA ile tedavi edin.
- Hemositometre kullanarak keratinositleri sayın. Her şişeye 1 x 106 hücre/mL aktarımı için hesaplanan hücre numaralarına göre cryovials hazırlayın.
- Hücre süspansiyonu 100 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj. Süpernatantı atın ve hücre peletini % 10 DMSO + % 20 chelexed-FBS + % 70 tam kültür ortamı (9 mL komple orta + chelexed-FBS ve 1 mL DMSO) 10 mL çözeltisinde yeniden kullanın.
- Hücreleri şişe başına 1 mL süspansiyonda cryovials içine dağıtın. Şişeleri -80 °C'de gece boyunca kriyojenik bir saklama kabına yerleştirin. Şişeleri ertesi gün sıvı bir azot tankına aktarın.
- Keratinositleri% 80-% 90 izdiah eder.
- Hücre kurtarma
- Sıvı nitrojen tankından bir cryovial çıkarın ve oda sıcaklığında kısmen çözün. 15 mL'lik bir tüpte, hücre süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını 3 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS ile karıştırın.
- Karışımı 100 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve peletin 1 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS'de yeniden diriltin.
- Hücre süspansiyonlarını yeni 60 mm Collagen I kaplamalı kültür yemeklerine dönüştürin. Kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirin ve bir kez birleştiğinde hücreleri geçin.
7. İmmünofluoresan boyama
- 2 gün boyunca 6 kuyulu plakalarda (5 x 105 hücre/kuyu) kare kapaklarda (22 mm x 22 mm) kültür oral keratinositler.
- Keratinositleri 1x PBS ile üç kez yıkamadan önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ve PBS çözeltisinde sabitlayın.
- PBS'de %0,1 Triton çözeltisinde hücrelerin dengesini bozar. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca reaktifi bloke eden hücreleri (%2,5 keçi serumu, %2,5 eşek serumu) kuluçkaya yatırın, ardından 4 °C'de birincil antikorlarla gece boyunca inkübasyon (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Birincil antikorlar aşağıdaki seyreltmelerde kullanılmıştır: tavşan anti-K14 (1:1000), sıçan α6-integrin (1:100), tavşan anti-p63 (1:500), tavşan anti-K13 (1:100) ve keçi anti-PDGFRα (1:100). - Örnekleri PBS'de% 0.1 Triton çözeltisinde yıkayın, ardından oda sıcaklığında 1 saat ikincil antikorlarla inkübasyon.
NOT: İkincil antikorlar (Alexa 488 veya 555) 1:300 seyreltmede kullanıldı. - Tüm numuneleri Hoechst çözeltisi ile 10 dakika boyunca karşı tutun ve hücreleri cam slaytlara monte edin.
NOT: Hoechst çözeltisi hücrelerin çekirdeklerini lekelendirmek için kullanılır. - Konfokal mikroskop kullanarak örnek görüntüleme gerçekleştirin.
NOT: Parlaklık ve kontrast, görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak eşit yoğunluğa ayarlanır.
Representative Results
Diseksiyon sürecine ve oral keratinositlerin yetişkin fare damak tadından izolasyonuna genel bakış
Dissositli oral keratinositler yetişkin fare damak tadından toplandı ve özelleştirilmiş% 20 chelexed-FBS'de kültürlendi. Fare damağı sert damak ve yumuşak damaktan oluşur (Şekil 1C). Fare oral keratinositlerin izolasyonu prosedürü Şekil 1D'de özetlenmiştir. Damak dokusu, bir gecede 4 °C'de % 0.025 tripsin çözeltisinde kuluçkaya yatırılmadan önce antibiyotik-antimycotic çözelti içeren bir ortama aktarılır. Ertesi gün, damak dokusu trypsin inhibitör çözeltisi ve tam kültür ortamı ile eşit hacimlerde tedavi edilir. Daha sonra, dokular oral keratinositleri toplamak için cerrahi bir neşter bıçağı kullanılarak kazınır. Hücre süspansiyonu 100 μm hücre süzgecinden süzülerek santrifüj edilir. Hücreler daha sonra 2 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS içeren Collagen I kaplamalı 24 kuyu plakalarında tohumlanır.
Fare oral keratinositlerin başarılı izolasyonunun temsili sonuçları
Primer oral keratinositler monolayer olarak büyüdü ve parke taşı morfolojisi gösterdi (Şekil 2). Küçük keratinosit kolonileri 3-5 günde görülebilirdi (Şekil 2A,B); bunlar büyüdü ve 1 haftalık inkübasyonda sıkı koloniler oluşturdu (Şekil 2C). Keratinosit kolonileri bazal keratinositlerin tipik morfolojik özelliklerini göstererek sağlıklı durumlarını gösterdiler. İnsan oral keratinositleri, 0.06 mM Ca2+16,28 içeren tam kültür ortamında birkaç pasaj için farklılaşmadı. İlk pasaj ilk kaplamadan yaklaşık 2 hafta sonra gerçekleştirildi (Şekil 2D). Daha sonraki pasajlarda keratinositler daha kısa bir kültür süresi ile istikrarlı bir büyüme sergilediler (Şekil 2E-G). İzolasyon işlemi sırasında önemli fibroblast kontaminasyonu meydana gelirse keratinositler büyümeyi durdurmuştur (Şekil 2H).
İzole fare oral keratinositler ekspres bazal hücre işaretleyicileri
Primer oral keratinositlerin durumunu doğrulamak için keratin 14 (K14) ve α6-integrin34 bazal hücre belirteçleri kullanılarak immünostaining yapıldı. K14 ve α6-integrin kültleme sonrası keratinositlerde eksprese edildi (Şekil 3A,B). Hücreler ayrıca köklüklerini doğrulamak için kök hücre işaretleyici p63 ile boyandı. Erken geçiş (pasaj 4) ve geç geçiş (pasaj 7) hücreleri p63'ün tek tip ifadesini göstermiştir (Şekil 3C, D). Buna karşılık, yüksek kalsiyumla tedavi edilen keratinositler (2 gün boyunca 1.2 mM indüksiyon) azalmış p63 ekspresyonu (Şekil 3E) sergiledi ve bu da yüksek kalsiyum tedavisinin primer keratinositlerde kök hücre ile ilgili genleri baskıladığını gösteriyor16. Keratin 13 (K13) farklılaşma belirteci hem erken hem de geç pasajlarda nadir veya hiç ifade göstermemiş ve yüksek kalsiyum tedavisi altında anlamlı ekspresyon göstermiştir (Şekil 3F-H). Keratinosit kültüründe fibroblast kontaminasyon olasılığını test etmek için, fibroblast işaretleyici PDGFRα kullanılarak boyama fare embriyonik fibroblast (MEF' ler) ile karşılaştırıldığında aynı keratinosit seti ile gerçekleştirildi. Mef hücrelerinde gözlenen yüksek ekspresyonla karşılaştırıldığında keratinosit kültüründe PDGFRα ifadesi yoktu (Şekil 3I-3L). Bu sonuçlar, bu protokolün bazal keratinositleri başarıyla izole edebileceğini ve bu hücreleri farklılaşmamış durumda tutabileceğini gösterdi.
Şekil 1: Fare oral keratinositlerinin diseksiyon prosedürüne ve izolasyonuna genel bakış. (A) Fare ağız boşluğunun şematik gösterimi. (B) Damakları parçalamak ve fare oral keratinositlerini izole etmek için kullanılan aletler. (C) Fare damağı Brightfield görüntüsü. Ölçek çubuğu: 100 μm. (D) Protokolün özeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare oral keratinositlerinin başarılı izolasyonunun temsili sonuçları. (A-G) İzolasyondan sonra 3 gün (A), 5 gün (B), 1 hafta (C) ve 2 hafta (D) kültürde kültürlü primer oral keratinositlerin zaman kursu görüntüleri. Birinci (E), ikinci (F) ve üçüncü (G) pasajlardan sonra fare oral keratinositlerinin morfolojileri gösterilmiştir. (H) Fare oral keratinosit kültüründe fibroblast kontaminasyonu örneği. Ölçek çubuğu: 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İzole fare oral keratinositler bazal hücre işaretleyicilerini ifade eder. (A-B) 4. geçişte K14 (A; kırmızı) ve α6-integrin (B; yeşil) immünofluoresan boyamanın temsili görüntüleri. (C-E) 4 (C), pasaj 7 (D) ve yüksek kalsiyum tedavisinde (E) p63 (yeşil) immünoresan boyamanın temsili görüntüleri. (F-H) 4 (F), geçiş 7 (G) ve yüksek kalsiyum tedavisinde (H) K13 (yeşil) immünostaining görüntüleri. (I-L) PDGFRα (kırmızı) pasaj 4 (I), pasaj 7 (J), yüksek kalsiyum tedavisi (K) ve MEF'lerin (L) immün şok edici görüntüleri. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyanmıştır. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
İnsan veya fare derisi epidermisinden izole edilen primer keratinositler araştırma ve klinik uygulamalarda uzun yıllardır kullanılmaktadır12,13,15,18,27,28,29. Bunun aksine, birincil oral keratinositleri yetişkin farelerden izole etmek ve kültüre etmek için çok az protokol oluşturulmuştur30,31,32. Bu çalışmada keratinositleri proliferatif veya kök hücre benzeri bir durumda tutmak için ticari bir tam kültür ortamı ve chelexed-FBS kullanılmıştır. Bu kültür sistemi, oral epitel kök hücrelerinin özelliklerini ve ilgili hastalıklarını daha iyi anlamak için moleküler ve biyokimyasal tahlillerde kullanılabilir.
Bu protokolde birkaç kritik adım yer almaktadır. İlk olarak, tripin konsantrasyonu ve kuluçka süresi sonraki kültürler için uygulanabilir hücreler üretmek için gereklidir. Oda sıcaklığında oda başlığında sürekli olarak %0,025 tripsin solüsyonu ve 16 saat kuluçka periyodu kullandık. Yeterli süre inkübe edilmezse, keratinositler dokudan düzgün bir şekilde ayrışmaz ve bu da daha düşük bir nihai hücre verimi ile sonuçlanır. İkincisi, hücre süspansiyonunun ikinci günde hafifçe pipetlemesi özellikle hücre canlılığını etkiler. Kazıma epitel tarafından hafifçe başlamalı ve doku örneği başına 10 dakikayı geçmemelidir. Son olarak, ilk izole hücre süspansiyonu fibroblastlar ve diğer hücre tiplerini içerir; bu istenmeyen hücreler genellikle sonraki kültürlerde kaybolmaya başlayacaktır.
Hücre izolasyonu ve kültürü sırasında potansiyel sınırlamalar belirlendi. Nadir durumlarda, fibroblastlar izolasyon işlemi sırasında kontamine olabilir ve fibroblastlar sonraki pasajlarda keratinositlerin büyümesini engelleyebilir (Şekil 2H). Kültürdeki bu tür kirlenmeyi ortadan kaldırmak için fibroblast büyüme inhibitörü içeren ticari bir ortam seçmek gerekir. Fare damağı ve diğer oral mukoza nispeten küçük boyutlara sahip olduğundan, bir fareden ilk hücre verimi düşük olabilir. Bu nedenle, kriyoprezervasyon aşamasına kadar bu protokolün tüm kültür süresi birincil cilt keratinositleri için bundan daha uzundur. İzole oral keratinositler en iyi 10 pasajda kullanılır, çünkü daha uzun kültür süreleri hücre özelliklerini değiştirebilir ve kök hücre sayısını azaltabilir.
Mevcut yöntem, fare oral keratinositlerinin sıkıca paketlenmiş, parke taşı morfolojisi sergilediğini ve proliferatif koşullar altında monolayer koloniler oluşturduğunu göstermiştir. Ayrıca bazal belirteçler α6-integrin, K14 ve kök hücre işaretleyici p63'ün yüksek ekspresyonlarını gösterdiler. Gelecekteki çalışmalarda, immünofluoresans lekelemesine ek olarak, bu hücrelerin doğasını daha da iyi anlamamızı sağlayacak olan oral keratinositlerin hücresel heterojenliğini ve saflığını doğrulamak için RNA-dizileme, RT-PCR ve batı leke analizleri kullanılacaktır.
2-3 pasajdan sonra oral keratinositler daha sonraki fonksiyonel deneylerde kullanılabilecek kadar kararlıydı. Daha da önemlisi, bu kültür protokolü gen nakavt, Cre-loxP ve tet-indüklenebilir sistemler de dahil olmak üzere transgenik fare çizgileriyle birleştirilebilir ve hücresel ve moleküler testlerde de kullanılabilir. Bu nedenle, mevcut protokol araştırmacılara oral keratinosit kök hücre biyolojisini daha fazla anlamak için kullanılabilecek temel ve verimli bir yöntem sunmaktadır.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibesi (B) (20H03266) (A.S.'ye), Erken Kariyer Bilim adamları için Yardım Hibesi (18K14709) (A'ya) tarafından desteklenmiştir. .S.), JP21gm6110016 ve 21bm0704067 (A.S.'ye) hibe numarası altında AMED ve Takeda Bilim Vakfı'ndan (A.S.'ye) araştırma hibeleri. Kumamoto Üniversitesi Hayvan Kaynakları ve Geliştirme Merkezi'ne ve Tsukuba Üniversitesi Hayvan Kaynakları Merkezi'ne mükemmel fare bakımları için teşekkür ederiz. Kumamoto Üniversitesi'ndeki IRCMS çekirdek tesisine konfokal görüntüleme konusundaki desteği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
- Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
- Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
- Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
- Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
- Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
- Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).
- Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
- Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
- Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
- Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
- Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
- Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2 (2013).
- O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
- Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
- Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471 (2010).
- Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
- Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160 (2019).
- Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480 (2014).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
- Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
