Summary
Bu protokolde AAV2 vektörü, süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-yeşil floresan protein (GFP) veya terapötik gen ve BV-AAV2-rep-cap enfekte Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla üretilmektedir. AAV parçacıkları deterjan kullanılarak hücrelerden salınır, netleştirilir, benzeşim kolonu kromatografisi ile saflaştırılır ve teğetsel akış filtrasyonu ile konsantre edilir.
Abstract
Adeno ilişkili virüsler (AAV) gen tedavisi uygulamaları için umut verici vektörlerdir. Burada, AAV2 vektörü, serumsuz süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-GFP (veya terapötik gen) ve BV-AAV2-rep-cap ile enfekte olmuş Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) hücrelerinin ortak kültürü tarafından üretilir. Hücreler bir yörünge çalkalayıcı veya Dalga biyoreaktöründe bir şişede kültürlenir. AAV parçacıklarını serbest bırakmak için, üretici hücreler deterjan içeren tamponda lislenir ve daha sonra düşük hızlı santrifüjleme ve filtrasyon ile netleştirilir. AAV parçacıkları, AAV parçacıklarını bağlayan AVB Sepharose sütun kromatografisi kullanılarak hücre lisattan arındırılır. Bağlı parçacıklar, kirleticileri gidermek için PBS ile yıkanır ve pH 3.0'da sodyum sitrat tamponu kullanılarak reçineden elde edilir. Asidik elüat alkali Tris-HCl tamponu (pH 8.0) ile nötralize edilir, fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir ve teğetsel akış filtrasyonu (TFF) ile daha da yoğunlaşır. Protokol, insan gen terapisi uygulamaları için büyük ölçekli klinik sınıf AAV üretimine kadar ölçekleme ile uyumlu küçük ölçekli klinik öncesi vektör üretimini tanımlamaktadır.
Introduction
Adeno ilişkili virüsler (AAV), 4,6 kb'lık tek iplikli DNA içeren zarfsız insan parvovirüsleridir. AAV vektörleri gen tedavisi uygulamaları için diğer viral vektörlere göre çeşitli avantajlara sahiptir1,2,3,4. AAV'ler doğal olarak çoğaltma yetersizdir, böylece çoğaltma için yardımcı bir virüs ve ana bilgisayar makineleri gerektirir. AAV'ler herhangi bir hastalığa neden olmaz ve enfekte konakta düşük immünojenikliğe sahiptir3,5. AAV hem sessiz hem de aktif olarak bölünen hücreleri enfekte edebilir ve konak hücrelerin genomuna entegre olmadan epizom olarak devam edebilir (AAV nadiren konak genomuna entegre olur)1,3. Bu özellikler AAV'ı gen tedavisi uygulamaları için arzu edilen bir araç haline getirmiştir.
Bir AAV gen transfer vektörü oluşturmak için, terapötik gen de dahil olmak üzere transgene kaseti, tipik olarak AAV serotip 2'den türetilen iki iç terminal tekrarı (ITR) arasında klonlanır. Transgene dizisi de dahil olmak üzere 5' ITR'den 3' ITR'ye kadar olan maksimum boyut 4,6 kb6 'dır. Farklı kapsidler farklı bir hücre veya doku tromizmine sahip olabilir. Bu nedenle, AAV vektörü ile hedef alınması amaçlanan doku veya hücre tipine göre kapsidler seçilmelidir7.
Rekombinant AAV vektörleri genellikle insan embriyonik böbrek hücreleri, HEK293 gibi memeli hücre hatlarında AAV gen transfer vektörü, AAV rep-cap ve yardımcı virüs plazmidleri2,3transeksiyon ile üretilir. Bununla birlikte, yapışan HEK293 hücrelerinin geçici transfeksiyon yoluyla büyük ölçekli AAV üretimi için çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, çok sayıda hücre yığınına veya makaralı şişeye ihtiyaç vardır. İkinci olarak, yüksek kaliteli plazmid DNA ve transfeksiyon reaktiflerine ihtiyaç vardır ve bu da üretim maliyetini arttırır. Son olarak, yapışık HEK293 hücreleri kullanılırken, serum sıklıkla en uygun üretim için gereklidir, aşağı akışişlemeyizorlaştırır 1,2,3. AAV üretiminin alternatif bir yöntemi, böcek hücre hattının, Spodoptera frugiperda (Sf9) hücrelerinin ve rekombinant Autographa californica multicapsid nükleer polihedroz virüsü (AcMNPV veya baculovirus) 8,9,10adı verilen bir böcek virüsünün kullanılmasını içerir. Sf9 hücreleri, ölçeğini büyütmesi kolay ve plazmid veya transfeksiyon reaktifleri gerektirmeyen büyük ölçekte mevcut iyi üretim uygulaması (cGMP) üretimiyle uyumlu serumsuz süspansiyon kültüründe yetiştirilir. Ayrıca, Sf9-baculovirüs sistemini kullanan AAV üretiminin maliyeti, plazmidlerin HEK293 hücrelerine geçici transfeksiyonunun kullanılması maliyetinden daha düşüktür11.
Baculovirus-Sf9 hücrelerinin kullanıldığı orijinal rAAV üretim sistemi üç baculovirüs kullandı: gen transfer kaseti içeren bir baculovirüs, rep geni içeren ikinci baculovirüs ve serotipe özgü kapsid geni içeren üçüncü baculovirüs12,13. Bununla birlikte, rep yapısı içeren baculovirüs, büyük ölçekli AAV üretimi için baculovirüsun amplifikasyonuna engel olan birden fazla geçiş turunda genetik olarak kararsızdı. Bu sorunu çözmek için, iki baculovirüs (TwoBac) içeren yeni bir rAAV vektör sistemi geliştirildi: AAV gen transfer kasetini içeren bir baculovirüs ve AAV rep-cap genlerini içeren başka bir baculovirüs, genetik olarak orijinal sistemden daha kararlı ve üç14yerine TwoBac kullandığı için rAAV üretmek için daha uygunolan , 15. OneBac sistemi, TwoBac veya ThreeBac 2,16,17kullanmak yerine bir baculovirüs kullanmak nedeniyle rAAV'ı üretmekiçin daha uygun olan tek bir baculovirüste AAV gen transfer kasetini ve rep-cap genlerini kullanır. Çalışmamızda, TwoBac sistemi optimizasyon için kullanılmıştır.
AAV üretimi için baculovirüs sisteminin de sınırlamaları vardır: baculovirüs parçacıkları serumsuz orta11'deuzun süreli depolama için kararsızdır ve baculovirüs titresi düşükse, AAV üretimi sırasında Sf9 hücrelerinin büyümesi için toksik hale gelebilecek büyük miktarda baculovirüs supernatant'a ihtiyaç vardır (kişisel gözlem). Titersiz enfekte hücre koruma ve ölçek büyütme (TIPS) hücrelerinin veya baculovirüs bulaşmış böcek hücrelerinin (BIIC) kullanılması, baculovirüs bulaşmış Sf9 hücrelerinin hazırlandığı, kriyoprezervasyona edildiği ve daha sonra taze Sf9 hücrelerinin enfeksiyonu için kullanıldığı AAV üretimi için iyi bir seçenek sağlar. Bir diğer avantaj, kriyoprezervasyon10 , 11'densonra Sf9 hücrelerinde baculovirüs (BV)stabilitesininartmasıdır.
AAV üretimini sağlamak için iki tip TIPS hücresi üretilir: birincisi Sf9 hücrelerinin BV-AAV2-GFP veya terapötik gen ile enfeksiyonu ve ikincisi BV-AAV2-rep-cap ile Sf9 hücresinin enfeksiyonu ile. TIPS hücreleri küçük ve kullanıma hazır aliquotlarda kriyoprezot olarak saklanır. AAV vektörleri, baculovirüsler ve taze Sf9 hücreleri üreten TIPS hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla yörüngesel çalkalayıcıya veya Dalga biyoreaktörüne yerleştirilen bir şişede serumsuz süspansiyon kültüründe üretilir. Sf9 hücreleri, AAV2-GFP vektörünü taşıyan baculovirüsler ve AAV oluşturmak için rep-cap dizileri ile enfekte olur. Dört ila beş gün sonra, AAV verimi en yüksek olduğunda, üretici hücreler AAV parçacıklarını serbest bırakmak için deterjanla yutlanır. Hücre lysate daha sonra düşük hızlı santrifüjleme ve filtrasyon ile netleştirilir. AAV parçacıkları AVB Sepharose kolon kromatografisi ile lysattan arındırılır. Son olarak, AAV vektörleri TFF kullanılarak yoğunlaşmıştır. Protokol, AAV'nin araştırma ve klinik öncesi çalışmalar için yararlı olan küçük ölçekte üretimini tanımlamaktadır. Bununla birlikte, yöntemler ölçeklenebilir ve gen tedavisi uygulamaları için klinik sınıf AAV vektörleri üretimi ile uyumludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokolü özetleyen bir çizim için Şekil 1'e bakın.
1. Baculovirüs ile enfekte TIPS hücrelerinin üretimi
- Bir şişe Sf9 hücresini çözün ve hemen 50 mL böcek hücre kültürü ortamında tohumlayın. Sf9 hücrelerini 125 rpm'de bir orbital çalkalayıcı inkübatörde ve 28 °C'de, hava değişimi için gevşek bir şekilde tutturulmuş bir kapakla yuvarlak alt şişelerde büyütün8,9. TIPS hücrelerinin üretimi için yeterli hücre elde etmek için hücreleri 200 mL orta içeren 1 L şişeye yayın.
- İki şişeye 2 x 106 hücre/mL'de 50 mL Sf9 hücresi ekleyin: bir şişe Sf9 hücresini 0,5 mL baculovirüs (BV)-AAV2-GFP (veya terapötik gen) ve diğer hücre şişesini 0,5 mL BV-AAV2-rep-cap ile enfekte edin.
NOT: AAV vektör plazmidleri Dr. Robert M. Kotin (NIH) tarafından cömertçe sağlanmıştır. Bacmid DNA'sından (Bac-to-Bac Sistemi) baculovirüs üretimi daha öncetanımlanmıştır 8,9. Geçiş sırasındaki baculovirüs stabilitesi, rAAV'ın ölçek büyütme üretimi için kritik bir sorundur. Daha düşük bir baculovirüs sayısı kullanmak daha iyidir (geçiş numarası 4'e kadar). TIPS hücre üretimi sırasında akış sitometrisi (Şekil 2) kullanarak baculovirüs enfeksiyon verimliliğini kontrol larak baculovirüs süpernatantının en uygun hacmini ampirik olarak belirleyin. - Enfekte Sf9 hücrelerinde baculovirüs gp64'i aşağıdaki gibi lekelenerek baculovirüs enfeksiyonunu enfeksiyondan 3-4 gün sonra izleyin.
- Leke 2 x 105 Sf9 hücreleri (hem enfekte olmayan hem de baculovirüs bulaşmış hücreler) 0,5 μg fare anti-baculovirüs gp64 antikoru (1:200) ile ortam sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 μL bloke tamponunda floresan boya içerir.
- Antikoru çıkarmak için hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve lekeli hücreleri% 0,5 sığır serum albümini içeren 300 μL PBS'de yeniden biriktirin.
- Akış sitometrisi kullanarak hücrelerde baculovirus gp64 ekspresyonını analiz edin (Şekil 2).
NOT: Akış sitometrisi alımı ve analizi için gating stratejisini ampirik olarak belirleyin. Toplam 10.000 tek canlı hücre elde edilir. Sf9 hücre yüzeylerindeki Baculovirus gp64 ekspresyonu baculovirüs enfeksiyonuna işaret eder. 3-4 gün sonra, Sf9 hücrelerinin çoğu baculovirüs gp64 ekspresyonu ile kanıtlandıkça baculovirüs ile enfekte olur (Şekil 2).
- Hücreler çapı artarak% 80-% 90 yaşayabilir olduğunda (Şekil 3), hücreleri hasat edin ve -80 ° C'de yavaş donan bir kapta% 10 fetal sığır serumu ve% 10 dimetil süloksit ile desteklenmiş 1 mL böcek kültürü ortamında 1 x 107 hücreyi hasat edin. Ertesi gün, TIPS hücrelerini içeren tüpü uzun süreli depolama için sıvı bir azot dondurucuya aktarın.
NOT: Biyogüvenlik Seviye 2'de (BSL-2) standart aseptik laboratuvar tekniğini izleyerek hücre kültürünü biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
2. AAV vektör üretimi
- 1. Gün: Baculovirüs bulaşmış TIPS hücreleri ile ortak kültür Sf9 hücreleri
- AAV üretimi için gerekli olan bir çalkalayıcı inkübatörde 400 mL böcek hücresi kültürü ortamı içeren birkaç 2 L şişede 28 °C'de 1 x 106 hücre/mL'de saf Sf9 hücrelerini kültüre edin ve büyütün. 3-4 gün sonra hücre yoğunluğu 5 x 106 -6x 106 hücre/mL'ye kadar artar.
NOT: CO2 ve nem Sf9 hücrelerinin büyümesi için önemli faktörler değildir. - Sf9 hücrelerini sallama şişelerinde veya bir biyoreaktörde aşağıdaki gibi tohumlayın.
- Yörüngesel çalkalayıcı inkübatördeki şişelerde AAV üretimi: 2 x 106 hücre/mL'de 400 mL Sf9 kültürünü aseptik olarak 2 L şişeye tohumlamak için bir pipet veya peristaltik pompa kullanın. Yörünge çalkalayıcıyı 125 rpm ve 28 °C'de kurun.
NOT AAV üretiminin ölçeğine bağlı olarak peristaltik bir pompa veya standart pipet kullanın. - Bir biyoreaktörde AAV üretimi: 2 x 106 hücre/mL'de 1 L Sf9 kültürünü aseptik olarak 10 L biyoreaktör torbasına tohumlamak için peristaltik bir pompa kullanın. Çantayı 28 °C'de kültleme için Biyoreaktör ünitesine yükleyin. Biyoreaktör torbasına 0.1 psi'de % 40 oksijen ekleyin. Biyoreaktör ünitesini 20° açıyla kurun ve torbayı 25 rpm'de sallayın.
- Yörüngesel çalkalayıcı inkübatördeki şişelerde AAV üretimi: 2 x 106 hücre/mL'de 400 mL Sf9 kültürünü aseptik olarak 2 L şişeye tohumlamak için bir pipet veya peristaltik pompa kullanın. Yörünge çalkalayıcıyı 125 rpm ve 28 °C'de kurun.
- Her BV-AAV2-GFP (veya terapötik gen) ve BV-AAV2-rep-cap TIPS hücrelerinden bir şişe çözün. Hücreleri 20 mL böcek kültürü ortamı ile seyreltin ve trippan mavisi kullanarak hücrelerin canlılık sayısını gerçekleştirin. Her iki TIPS hücresini de bir çalkalayıcı şişede veya biyoreaktörde kültürlenmiş naif Sf9 hücrelerine göre 1:10.000 oranında aşılayın.
NOT: TIPS hücrelerinin hayatta kalması kriyoprezervasyon nedeniyle azalır ve trippan mavisi boyama ile hücre canlılığı belirlendiğinde iyileşme oranı yaklaşık% 50'dir. Büyük ölçekli rAAV üretiminden önce TIPS hücrelerinin ve naif Sf9 hücrelerinin oranını ampirik olarak belirlemek için bir pilot deney gerçekleştirin.
- AAV üretimi için gerekli olan bir çalkalayıcı inkübatörde 400 mL böcek hücresi kültürü ortamı içeren birkaç 2 L şişede 28 °C'de 1 x 106 hücre/mL'de saf Sf9 hücrelerini kültüre edin ve büyütün. 3-4 gün sonra hücre yoğunluğu 5 x 106 -6x 106 hücre/mL'ye kadar artar.
- 2. Gün: Kültür izleme
- 1 mL Sf9 kültürünü aseptik olarak hasat edin. Hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz etmek için Trypan mavi boyası ile leke.
- 3. Gün: Kültür izleme ve besleme
- 1 mL Sf9 kültürünü hasat edin ve hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz edin. Adım 1.3'te belirtildiği gibi Sf9 hücrelerini lekeledikten sonra baculovirüs enfeksiyonunun durumunu kontrol edin.
NOT: Hücre çapında artış ve sitopatik etki baculovirüs enfeksiyonunun endikasyonlarıdır. Çap artışı hücre canlılığındaki azalmadan önce gelir ve bu parametreler AAV üretimi sırasında hücre hasat süresini belirlemek için kullanılır. Ampirik olarak en uygun zaman noktasını belirleyin. - Sf9 kültürünü 1:5 aseptik bir oranda taze böcek kültürü ortamı ile besleyin.
- 1 mL Sf9 kültürünü hasat edin ve hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz edin. Adım 1.3'te belirtildiği gibi Sf9 hücrelerini lekeledikten sonra baculovirüs enfeksiyonunun durumunu kontrol edin.
- 4. Gün: Kültür izleme
- 1 mL Sf9 kültürünü hasat edin ve hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz edin. Oksijen kaynağını biyoreaktör torbasından çıkarın.
- 5. Gün: Kültür izleme ve hasat
- 1 mL Sf9 kültürünü hasat edin ve hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz edin. Sf9 hücre canlılığı yaklaşık% 50'ye düştüğünde kültür ortamını ve hücrelerini hasat etmek (Şekil 4).
- Hücre süspansiyonu 2100 x g'da 4 °C'de 15 dakika döndürün. Süpernatant ve hücre peletini toplayın ve -80 ° C'de saklayın.
3. Hücrelerin lizisi ve AAV'nin serbest bırakılması
- AAV üreticisi hücre peletini çözün. Hücre peletine 100 mL hücre lizis tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM sodyum klorür, % 0.5 Triton-X-100) ekleyin, kuvvetlice karıştırın ve AAV parçacıklarını serbest bırakmak için ortam sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatın.
- 2100 × g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin ve hücre lisatını yeni bir kaba aktarın. Çözdükten sonra hücre lisatını ve hücre kültürü üstnatantını karıştırın.
- DNA ve RNA'yı sindirmek için hücre lisatine20 U/mL nükleaz ve 10 mM MgCl 2 ekleyin. 37 °C'de 2-4 saat kuluçkaya yaslanın.
- Bir pompa kullanarak 0,8 μm ve 0,2 μmpolyethersulfone çift filtrasyon sistemi aracılığıyla lisatı filtreleyin.
- Netleştirilmiş hücre lisatını bir gecede 4 °C'de saklayın veya AAV'ı hemen arındırın.
4. Benzeşim sütunu kromatografi sistemi kullanılarak AAV vektörün saflaştırılması
- Numune ve tampon hatlarını steril su, 1 N sodyum hidroksit, su ve fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ile 50 mL/dk akış hızında sırayla yıkayarak kromatografi aletini hazırlayın.
- AVB Sepharose sütununu (10,0 mL) kromatografi sistemine monte edin ve 5 mL/dk akış hızında 100 mL PBS çalıştırın.
NOT: AAV üretiminin ölçeğine bağlı olarak daha düşük veya daha yüksek hacimli bir AVB Sepharose sütunu kullanın ve sütun veya reçine üreticisi tarafından önerildikçe akış hızını ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu). - Sütun geçiş çözeltisi, yıkama tamponu ve AAV parçacıklarını içeren elütion tamponunun fraksiyonlarını toplamak için, tüpleri kromatografi aletinin fraksiyon toplayıcı yuvalarına yerleştirin.
- Sütunu PBS ile 5,0 mL/dk akış hızında dengele.
- AAV partikülleri içeren filtrelenmiş hücre lisasını, numune pompası ile donatılmış kromatografi makinesini kullanarak sütuna yükleyin. Numuneyi dakikada 3,0 mL akış hızında çalıştırın.
- PBS'yi AVB Sepharose sütununda 3,0 mL/dk akış hızında çalıştırın, ta ki ultraviyole (UV) emiciliği eğrisi (280 nm) taban çizgisine dönene ve kararlı hale gelene kadar.
- AAV parçacıklarını sütundan 3,0 mL/dk akış hızında 50 mM sodyum sitrat (pH 3,0) tampon ile elute edin (Şekil 5).
NOT: AAV parçacıkları reçineden ayrışırken ve UV dedektöründen geçerken, kromatogramda proteinin bir elüasyon zirvesi görülebilir. - AAV'nin asidik elüsyon tamponu ile pH aracılı bozulmasını önlemek için, süpernatant içeren AAV'nin pH'ını yaklaşık pH 5,5'e çıkarmak için AAV süpernatantı 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) beşte bir hacimle hemen seyreltin. Ayrıca, pH'ı tamamen nötralize etmek için AAV süpernatantını PBS ile 10 kat seyreltin.
NOT: rAAV çözeltisini nötralize ettikten sonra pH değeri yaklaşık 5,5'tir. AAV'yi nötralize ettikten sonra, rAAV çözeltisini PBS (pH 7.4) ile 10 kat seyreltin, böylece AAV fizyolojik bir tampondadır. - Hedef hücrelerin enfeksiyonu ile AAV varlığını değerlendirmek için her sütundan 1 mL'lik numuneleri, yıkama tamponunu ve 100 μL'lik eluted AAV süpernatantını saklayın.
- AVB Sepharose sütununu 100 mL 100 mM sitrik asit (pH 2.1) ve 100 mL PBS (pH7.4) ile 5.0 mL/ dk akış hızında temizleyin. Sütunu % 20 etanol ile 5,0 mL / dk akış hızında durulayın ve 4 ° C'de saklayın.
- Kromatografi aletinin işlem hatlarını bölüm 4.1'de açıklandığı gibi sütun çevrimdışı konumuyla temizleyin. Son olarak, kromatografi sistemini 50,0 mL/ dk akış hızında% 20 Etanol 200 mL ile durulayın ve% 20 etanol depolayın.
5. Teğetsel akış filtrasyonu kullanılarak AAV vektörün konsantrasyonu ve diafiltasyonu (TFF)
- AAV'yi konsantre etmek için polisülfone membran kartuşu (100 kDa Moleküler Ağırlık Kesme) ile donatılmış TFF sistemini kurun.
- 10 dakika boyunca 200 mL PBS ile TFF modüllerini dengele.
- 2-3 psi'de trans-membran basıncını korurken numune istenen hacme düşürülene kadar pompanın akışını kontrol ederek AAV örneğini yükleyin.
- Bu çalışmada kullanıldığı gibi, retentate'i 100 mL PBS ile diafiltrate edin veya AAV'nin uzun vadeli stabilitesini destekleyen alternatif tamponu ampirik olarak tanımlayın.
- AAV örneğini istenen hacme konsantre ettikten sonra, AAV örneğini toplayın, 0,2 μm poliethersülfonefiltre, aliquot ile filtreleyin ve sonra -80 ° C'de saklayın.
6. Arınma adımlarında AAV varlığını değerlendirmek için AAV örneklerinin hedef hücrelere bulaşması
- Enfeksiyondan bir gün önce % 1 L-glutamin, % 1 sodyum piruvat ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 500 μL Dulbecco Modifiye Kartal Ortası (DMEM) içinde 24 kuyulu bir plakada 7 x 104 HT1080 hücre / kuyu aşıla. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'debir inkübatörde kültüre edin.
- Enfeksiyondan önce hücreleri sayın. Sütun çalışmadan önce seyreltilmiş unpurified AAV toplu örneğini, sütun çalıştırma örneklerini, yıkama tamponunu ve eluted saflaştırılmış AAV örneğini ekleyin.
NOT: Trypan mavi lekeli hücreleri hemositometre ile sayın. AAV numunelerinin seyreltme faktörünü ve hacmini (μL) ampirik olarak belirleyin. AAV titreleri ne kadar yüksek olursa, o kadar fazla seyreltme gerekir. Sütun çalışmadan önce amaçlanmamış dökme numunenin baculovirüs parçacıklarının, sütundan geçen numunelerin, yıkama tamponunun AAV'nin enfeksiyöz titrelerini belirlemek için hedef hücreleri enfekte etmeden önce 50 ° C'de 50 ° C'de ısı inaktive edildiğinden emin olun. - Enfeksiyondan iki gün sonra, bir akış sitometresi kullanarak hücrelerdeki protein ekspresyonunu (örneğin, GFP veya terapötik gen) analiz edin.
- Enfeksiyon anında hücre sayısını, seyreltme faktörünü ve GFP+ hücrelerinin yüzdesini şu formülle AAV'nin enfeksiyöz titrelerini hesaplayın: (Toplam hücre sayısı x Yüzdeler GFP+ hücreleri x Seyreltme Faktörü) / Mililitre cinsinden AAV hacmi.
NOT: Örneğin, hücre sayısı 1 x 105, GFP+ hücrelerinin yüzdesi% 3.4, seyreltme faktörü 100 ve eklenen AAV hacmi 2 μL'dir. AAV'nin titer'i 1.7 x 108 enfeksiyöz birimdir (IU)/mL. Eluted fraksiyonun 25 mL'sinde saflaştırılmış AAV parçacıklarının toplam miktarı 4,3 x 109 enfeksiyöz birimdir (IU)/mL (Şekil 6). İlk teşvik edilmemiş AAV parçacıklarının toplam sayısı 1,09 x 1010 IU/mL'dir ve saflaştırılmış AAV parçacıkları 4,3 x 109 IU/mL'dir. Bu nedenle, iyileşme yüzdesi% 39.4'tür. GFP+ hücrelerinin yüzdesi% 1-30 arasında olmalıdır, bu da AAV'nin enfeksiyöz titerini hesaplamak için kullanıldığında doğrusal bir aralığa karşılık gelir. Hedef hücrelere daha konsantre AAV vektör parçacıkları bulaşırsa; AAV parçacıklarının birden fazla kopyasının vektörün tek bir kopyası olarak gösterilecek tek bir hücreye bulaşma olasılığı vardır. Bu nedenle, hedef hücrelerde%1-%30 vektör enfeksiyonu elde etmek için AAV vektör süpernatantını seyreltin. AAV vektörüne muhabir geni yoksa, transgene veya AAV vektörü tarafından ifade edilen terapötik geni, akış sitometresi kullanılarak tespit edilebilen ve miktarlandırılabilen floresan boya içeren bir antikorla lekeleyin. Tüm AAV serotipleri HT1080 hücrelerini verimli bir şekilde enfekte edebilir. Bu nedenle, diğer AAV serotipleri için enfeksiyozluk testini gerçekleştirmek için farklı hücre çizgileri kullanın. HT1080 hücrelerinde saflaştırmadan önce ve saflaştırmadan sonra AAV2-GFP parçacıklarını titretin ve GFP ekspresyonını akış sitometrisi ile ölçün. Saflaştırmadan önce saflaştırılmış AAV partiküllerinin sayısı ve AAV parçacıklarının sayısı 100 ile çarpılarak geri kazanımı (%) hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, Sf9 böcek hücre sistemi kullanılarak AAV vektörlerinin üretimi ve saflaştırılması için proses gelişiminin temsili sonuçları gösterilmiştir. Yöntem, Sf9 hücrelerinin baculovirüs ile enfekte TIPS hücreleri ile birlikte kültürlenmesini, hücrelerin büyüme ortamı ile beslenmesini, AAV parçacıklarını serbest bırakmak için üretici hücrelerin toplanmasını ve lizizlenmesini, hücre lizatının nükleaz tedavisi ile netleştirilmesini, santrifüjlenme ve filtrasyonunu, AVB Sepharose benzeşim kromatografisi kullanılarak AAV'nin saflaştırılmasını ve TFF ile konsantrasyonu içerir (Şekil 1).
TIPS hücreleri, BV-AAV2-GFP veya terapötik gen ve BV-AAV2-rep-cap'in ayrı ayrı Sf9 hücrelerine enfeksiyonu ile üretilir. Sf9 hücrelerinin çoğu, baculovirüs glikoprotein gp64 ekspresyonu ile kanıtlanan çoklu enfeksiyon turları nedeniyle3-4gün içinde baculovirüs ile enfekte olur ve hücreler çapında bir artış gösterir (Şekil 3). TIPS hücreleri enfeksiyon sonrası 3-4 gün hasat edilir ve kriyopreziserv edilir. Sf9 hücreleri, saf Sf9 hücrelerini enfekte eden kültür ortamında baculovirüs parçacıkları salgılayan TIPS hücreleri ile birlikte kültürlenir. Baculovirus replikasyona yetkindir; bu nedenle, enfekte hücrelerin sayısı hızla kültür ortamına salgılanan yeni üretilen baculovirüs parçacıkları ile birden fazla yuvarlak enfeksiyon ile artar8,9. Hücreler çapında bir artış, sitopatik etki gösterir ve hücrelerin yaklaşık yarısı, AAV üretiminin tamamlanma belirtileri olan enfeksiyon sonrası 5 gün içinde ölür (Şekil 4).
AAV üretici hücreleri, AAV'yi hücre lisatına serbest bırakmak için deterjan içeren tamponla yutulmuş düşük hızlı santrifüjleme ile hasat edilir. Bu daha sonra viskoziteyi azaltmak için DNA ve RNA sindirimi için çekirdek ile tedavi edilir, 0.8 μm ve 0.2 μm membrandan süzülür ve daha sonra saflaştırılarak konsantre edilir. Hücre lisat, kromatografi sistemi kullanılarak AVB Sepharose sütununa yüklenir. AVB Sepharose reçinesi, kapsid proteinlerine yakınlığı nedeniyle AAV2 parçacıklarını bağlar. Yıkama tamponu, ultraviyole (UV) emiciliği eğrisi (280 nm) taban çizgisine sabitleninceye kadar ilişkisiz ve gevşek bağlı malzemeleri çıkarmak için AVB Sepharose sütunundan çalıştırılır. AAV parçacıkları AVB Sepharose'ı güçlü bir şekilde bağladığından, yıkama sırasında önemli sayıda AAV2 parçacığı tespit değildir. AAV parçacıkları, AAV parçacıkları ve AVB Sepharose reçinesi arasındaki etkileşimi ayıran asidik tampon (pH 3.0) ile eluted edilir. AAV'nin asidik çözelti ile pH aracılı bozulmasını önlemek için, eluant alkali tampon (pH 8.0) ile nötralize edilir. AAV fraksiyonuna karşılık gelen asidik tampon ile elüsyon yapılırken bir protein zirvesi görülür (Şekil 5 ve Şekil 6). Saflaştırılmış AAV, PBS ile 10 kat seyreltilir, konsantre edilir ve bir TFF sistemi ile tampon olarak değiştirilir. Bu örnekte, hücre lisatında (560 mL) toplam AAV parçacıkları 1.1 x 1014 vektör genomudur (vg), AVB Sepharose kromatografi saflaştırması (25 mL) 4.1 x 1013 vg ve TFF ile konsantrasyondan sonra (25 mL) 2.4 x 1013 vg'dir. Saflaştırılmış AAV örnekleri, SDS-PAGE ve gümüş boyamadan sonra VP1, VP2 ve VP3 olmak üzere üç farklı kapsid proteini gösterir (Şekil 7)
Şekil 1: AAV Vector'un üretimi ve saflaştırılması için şematik bir diyagram.
Şekil 2: Sf9 hücrelerinde baculovirus gp64 ekspresyonunun akış sitometri analizi. Baculovirus enfekte Sf9 hücreleri, akış sitometrisi ile tespit edilen floresan boya içeren bir fare anti-baculovirus gp64 antikoru ile lekelenir. (A) Enfekte olmayan Sf9 hücreleri. (B) Baculovirus enfekte Sf9 hücreleri hücrelerin çoğunda gp64 ekspresyonu gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Baculovirüs ile enfekte Sf9 (TIPS) hücrelerinin morfolojisi. Baculovirus, TIPS hücrelerini üretmek için Sf9 hücrelerine bulaşır. (A) Enfekte olmayan Sf9 hücreleri. (B) Baculovirüs Sf9 (TIPS) hücrelerini enfekte etti. Hücreler 200x büyütmede gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: AAV üretimi sırasında baculovirüs bulaşmış Sf9 hücrelerinin morfolojisi. TIPS hücreleri, AAV üretimi sırasında birlikte kültürlenmiş naif Sf9 hücrelerini enfekte eden baculovirüsler salgılar. (A) Enfekte olmayan Sf9 hücreleri. (B) Baculovirüs enfekte Sf9 hücreleri çapında bir artış gösterir. Enfeksiyondan beş gün sonra, hücrelerin neredeyse yarısı ölür (trippan mavisi lekelemeden sonra ters faz mikroskobu altında görselleştirilir). Kırmızı oklar canlı hücreleri, mavi oklar ise ölü hücreleri gösterir. Hücreler 200x büyütmede gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: AVB Sepharose kolon kromatografisi kullanılarak AAV saflaştırması. Kromatogram, kolon, yıkama ve elüasyon üzerine numune yüklemesi sırasında protein örneklerinin emiciliğini 280 nm olarak gösterir. Kromatogram şilteye uyacak şekilde değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kolona yükleme, yıkama ve elüasyon sırasında akıştaki enfeksiyöz AAV parçacıklarının sayısı. 10 mL AVB Sepharose sütununa toplam 560 mL AAV numunesi yüklenir. Sütun yükü için kesir hacmi 50 mL, kolon yıkama 50 mL ve elution 25 mL'dir. AAV titreleri, HT1080 hücrelerinin kolon üzerinden geçen örneklerle enfeksiyon kapması sonrasında, saflaştırmanın her adımında AAV'nin varlığını araştırmak için kolon, yıkama ve elution üzerine yüklenirken ölçülür. Toplam saflaştırılmış AAV verimi 4,3 x 109 enfeksiyöz birimdir. Elmas şeklindeki her sembol, her kesirde AAV'nin enfeksiyöz birimlerini (IU) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. Kapsid proteinlerini gösteren saf AAV vektörün SDS-PAGE ve gümüş lekesi. Azaltılmış AAV örnekleri SDS-PAGE'de çalıştırılır ve gümüş boyama yapılır. Üç farklı AAV kapsid proteini grubu, VP1, VP2 ve VP3 görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AAV vektörlerinin üretim, saflaştırma ve konsantrasyonunun proses geliştirilmesi için bu protokolde kullanılan parametreler, gen tedavisi uygulamaları için AAV vektörlerinin hem küçük hem de büyük ölçekli üretimine uygulanabilir. Tüm yukarı ve aşağı akış işlemi, mevcut İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) ile uyumlu kapalı bir sistemde gerçekleştirilebilir. Sf9-baculovirüs sisteminin en büyük avantajları, uygun maliyetle büyük ölçekli GMP sınıfı AAV üretimi için ölçeklenebilirliktir. Sistemin HEK293 hücrelerini kullanarak AAV üretimi için gerekli olan pahalı plazmidlere ve transfeksiyon reaktiflerine ihtiyacı yoktur. Hem HEK293 hücrelerinin hem de Sf9 hücrelerinin benzer kalitede AAV vektörleri verdiği bildirilmiştir (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Özet #100). En büyük zorluk, bu sistemin önemli bir zaman ve çaba gerektiren baculovirüslerin ve TIPS hücrelerinin üretilmesini gerektirmasıdır.
Bu protokolde iki tip TIPS hücresi (TwoBac sistemi) kullanılmıştır: AAV gen transfer kaseti ile baculovirüs içeren bir TIPS hücresi ve AAV-rep-cap içeren başka bir TIPS hücresi. OneBac sistemi2,16,17, tek bir baculovirüste hem AAV gen transfer kaseti hem de rep-cap genleri içeren TIPS hücreleri oluşturabilir. OneBac sistemi, protokolü daha da basitleştirecek olan TwoBac sisteminde açıklandığı gibi iki yerine yalnızca bir TIPS hücresi kümesi kullanarak rAAV'ı üretmek için alternatif bir yaklaşım sağlar.
Bu protokol, Sf9 hücrelerindeki AAV üretimini açıklar. İyi bir AAV verimi elde etmek için baculovirüs ile enfekte OLMUŞ TIPS hücrelerinin naif Sf9 hücrelerinin üreticisine oranını optimize etmek önemlidir. Bu oran en uygunun altındaysa, AAV'nin verimi11azalır. Örneğin, TIPS ve prodüktör hücrelerinin alt optimal oranı nedeniyle üretici hücrelerdeki kapsidlerden daha fazla gen transfer vektörü içeren AAV ITR üretilirse, mevcut gen transfer vektörlerinin tümü tam AAV parçacıkları üretmek için yeterli kapsid alamaz. Öte yandan, üretici hücrelerdeki AAV gen transfer vektörlerinden daha fazla kapsid üretilirse, tüm kapsidler boş AAV parçacıkları ile sonuçlanan gen transfer vektörleri içeren AAV ITR alamaz.
Hücreler çoğaldıkça, kültür ortamının besinleri tükenir ve metabolik atık ürünler birikir. Bu nedenle, TIPS hücrelerinin ve Sf9 hücrelerinin ortak kültüründen 2 gün sonra hücre kültürüne% 20 taze büyüme ortamının takviyesi AAV titerlerini önemli ölçüde artırabilir (Amine A. Kamen, Ulusal Araştırma Konseyi Kanada, kişisel iletişim).
AAV parçacıklarının saflığı, hem in vitro hem de in vivo çalışmalar için herhangi bir sitotoksiklik olmadan hedef hücrelerin etkili transdüksiyonunun sağlanması için kritik bir faktördür3,5. Bu nedenle, AAV parçacıklarını seçici olarak arındırabilen ve konak hücre proteinleri ve döküntüleri, genomik ve baculoviral DNA ve agrega ve parçalanmış vektörler gibi safsızlıkları ortadan kaldırabilen bir kromatografi adımı eklemek önemlidir. AAV süpernatantı bir AVB Sepharose sütununa yüklerken, reçineye bağlanmadan sütundan geçebilecek AAV parçacıklarının varlığı için akış örneklerini kontrol etmek önemlidir. Bu durumda, (1) AAV parçacıklarının bağlanması için daha uzun bir oturma süresiyle sonuçlanan daha düşük bir çalışma hızı gerekli olacaktır, (2) sütuna yüklenen numune miktarı azaltılmalı ve /veya (3) AVB Sepharose'un hacmi artırılmalıdır, böylece sütunun bağlama kapasitesi asla AAV parçacıklarının sayısını geçmemelidir. AVB Sepharose reçinesinin AAV parçacıklarını yüksek debide ve yüksek benzeşim ve kapasiteyle bağlama yeteneği, saflaştırma süresini azaltmak için önemlidir. AVB Sepharose'un en büyük sınırlaması, AAV serotipleri 1, 2 ve 5'in kapsidini bağlamasıdır. Bu nedenle, farklı kromatografi reçineleri test edilmeli ve diğer AAV serotiplerinin saflaştırılması için kullanılmalıdır18. Burada açıklanan aşağı akış arıtma protokolü, HEK 293 hücrelerinde üretilen AAV'yi arındırmak için de kullanılabilir.
Bu protokol AAV'yi hücre lisattan arındırabilir, ancak boş parçacıkları kaldıramaz. Birkaç makalede, saflaştırılmış AAV stoklarındaki boş ve tam AAV parçacıklarını ayırt edebilecek yöntemler tanımlanmıştır19,20. Bununla birlikte, AAV üretiminin boş parçacıkların üretimini en aza indirmek için yukarı akış proses seviyesinde optimize edilmesi gerektiğine inanıyoruz. Üretici hücrelerde AAV gen transfer vektörü ve kapsid üretiminin oranı optimal değilse, daha fazla boş parçacık üretebilir.
TAM AAV partiküllerinin bağlanmasına ek olarak, AVB Sepharose ortamı, TFF kullanılarak çıkarılabilen parçalanmış AAV parçacıklarını veya kapsid proteinlerini bağlar. Düşük moleküler ağırlıklı parçacıkların çoğu, kolon kromatografisinin TFF adımı aşağı doğru dahil ederek AAV örneklerinden elimine edilir. Ayrıca TFF tampon değişimi/diafiltrasyon yapmak ve AAV 10,21 .00'ıkonsantre etmek için kullanılır.
AAV lisfatının sezyum klorür veya iyodixanol gradyanı ile ultrasantrifüjlenmesi küçük ölçekli ve klinik öncesi sınıf AAV saflaştırma için tercih edilen yöntem olmasına rağmen, bu yöntem ölçeklenebilir değildir ve AAV 21,22'ninbüyük ölçekli saflaştırılması için daha az uygundur.
Sonuç olarak, AAV'nin üretim ve saflaştırılmasının süreç geliştirilmesine yönelik bu protokol, kalıtsal genetik hastalıkların gen tedavisi için rekombinant AAV'nin küçük ölçekli klinik öncesi ve büyük ölçekli üretimi için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Dr. Robert M. Kotin'e (Ulusal Kalp, Kan ve Akciğer Enstitüsü, NIH) bize cömertçe AAV plazmidlerini ve Danielle Steele ve Rebecca Ernst'e (Cincinnati Çocuk Hastanesi) teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı'ndan M.N.'ye start-up fonu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
References
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
- Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
- Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
- Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
- Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
- Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
- Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M.
- Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
- Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
- Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
- Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
- Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).
