Summary
Nöromüsküler kavşağın mimarisini koruyan ve yetişkin Drosophila bacağındaki motor nöronların ayrıntılı bir immünostokimyasal çalışmasını sağlayan bir diseksiyon tekniğini tarif ediyoruz.
Abstract
Drosophila melanogaster , nöronal yapı ve işlevi ve daha sonra hastalık durumlarındaki değişiklikleri incelemek için genetik olarak çekilebilir bir modeli temsil eder. İyi karakterize larva nöromüsküler kavşak genellikle bu tür çalışmalar için kullanılır. Bununla birlikte, metamorfoz sırasında kas histolizisi ve sinir sistemi tadilatı ile takip edilen hızlı larva gelişimi, bu modeli amyotrofik lateral sklerozda meydana gelenler gibi yavaş yaşa bağlı dejeneratif değişikliklerin incelenmesi için sorunlu hale getirir. Alternatif olarak, yetişkin sinekler 90 gün yaşar ve yetişkin bacağı, lütikül yoluyla in vivo floresan görüntüleme kullanarak yetişkin ömrü boyunca motor nöron değişikliklerini incelemek için kullanılabilir. Burada, tanımlanan yetişkin bacak motor nöronlarının nöromüsküler kavşağında moleküler değişikliklerin incelenmesine izin veren immünosimya ile birleştirilmiş bir bacak diseksiyon tekniğini tarif ediyoruz. Bu teknikler, hem pre-hem de post-sinaptik yapıları etiketleyen sayısız antikorla birleştirilmiş olabilir. Bu prosedürler birlikte yetişkin sineklerde yaşa bağlı yavaş değişikliklerin daha eksiksiz bir şekilde karakterize edilmesine izin verir ve birden fazla motor nöron hastalığı modeline uygulanabilir.
Introduction
Motor nöron (MN) hastalıkları, birincil klinik fenotip olarak kas israfına ve felce yol açan ilerleyici dejenerasyonu içeren bir grup heterojen durumu kapsar1. Küresel prevalansı 100.000'de 4,5 olmasına rağmen, yaşlanan bir popülasyonla bu yaygınlığın artması bekleniyor2. Amyotrofik lateral skleroz (ALS) en sık görülen MN hastalığıdır (MND) ve tipik olarak tanıdan kısa bir süre içinde ölümcüldür ve mevcut hastalık değiştirici tedaviler yoktur3. MND'ler, hastalarda görülen erken moleküler biyobelirteç değişiklikleri ve fonksiyonel görüntüleme değişiklikleri ile uzun süreli presemptomatik bir fazı ortak olarak paylaşırlar4. İnsan dışı hastalık modellerinde de erken presemptomatik hücresel patoloji gözlenir5,6,7,8. Nöromüsküler kavşakta erken değişikliklerin incelenmesi MN hastalığı patogenezini anlamak için önemlidir ve erken tanı ve potansiyel terapötiklerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Drosophila'da nöromüsküler kavşağın yapısını ve işlevini incelemek için çok sayıda genetik ve moleküler araç bulunmaktadır (NMJ, iyi karakterize edilmiş larva NMJ'nin gözden geçirilmesi için bkz. Bu araçlar kısa bir ömürle birleştiğinde Drosophila'yı NMJ'deki nörodejeneratif değişiklikleri incelemek için mükemmel bir model haline getirir. Özellikle, yetişkin kaslarını içselleştiren MN'ler ~ 90 günlük yetişkin ömrü boyunca mevcuttur ve normal yaşlanma süreçlerine tabidir10,11,12,13. Bu nedenle yetişkin MN'ler, metamorfozdan sadece kısa bir ~1 haftalık bir süre için var olan larva NMJ'lerinin aksine yavaş dejeneratif değişiklikleri inceleme fırsatı sağlar14,15.
Burada, yetişkin bacağındaki MN'lerin immünosimyasal analizini yapmamızı sağlayan bir diseksiyon prosedürünü açıklıyoruz. Her yetişkin bacağı, hareket etmek için ilişkili bacak kaslarına sinaps oluşturan ~ 50 MNs ile içselleştirilir. Bacak anatomisi, mekanik fizyoloji ve nörobiyoloji iyi tanımlanmıştır16,17,18. Bacak MN'lerinin akson arborsları daha önce bipartit Gal4/UAS sistemi kullanılarak sırt dolgulu veya genetik olarak etiketlenmiş hücre popülasyonlarında tiksel yoluyla görüntüleme ile karakterize edilmiş ve görüntüleme yöntemleri daha önce yayınlanmıştır19. Burada sunulan diseksiyon yöntemleri akson dallanma morfolojisini korur ve NMJ'nin farklı moleküler bileşenlerini etiketlemek için çeşitli antikorlardan yararlanmamızı sağlar. Önceki çalışmamız, kaval kemiği alakatıcı kasını (tilm) içselleştiren ve tutarlı arborizasyon kalıpları ve bouton sayıları gösteren metatorasik (3. ) bacaktaki tanımlanmış bir MN'nin projeksiyonlarına odaklanmıştır. Başlangıçta Drosophila süperoksit dismutaz 1 (dsod1) mutantlarında yaşa bağlı değişiklikleri inceledik ve NMJ20'nin sökülmesiyle tutarlı değişiklikler bulduk. Bu diseksiyon yöntemleri, diğer ALS modelleri, yaşlanmanın temel çalışmaları ve diğer MN ilişkili hastalıklar için NMJ'deki yavaş dejeneratif değişiklikleri daha iyi karakterize etme fırsatı sunmaktadır.
Şekil 1. Bacakları parçalamak için iş akışı özeti. Ayrıntılı adımlar için protokole bakın. (A,B) Sinekler seçilir ve uyuşturulur. (C) Sinekler metanol'e aktarılır ve PBS ile yıkanır. (D) Metateik bacaklar, bir diseksiyon mikroskobu (~30x büyütme) ile görselleştirilirken coxa tabanında çıkarılır; ölçek çubuğu = 500 μm. (E) Bacaklar daha sonra 24 kuyulu plakaların kuyuları içinde 30 dakika boyunca% 3.7 formaldehit / PBS (FA) çözeltisinde sabitlenir ve daha sonra PBS ile yıkanarak FA çıkarılır. (F, G, H) Bacaklar silikon elastomer diseksiyon tepsilerine aktarılır ve 80x'te bir diseksiyon mikroskobu altında görselleştirilirken eğimli forseps kullanılarak proksimal uyluk kemiğinden bir parça kütikül çıkarılır; ölçek çubuğu = 50 μm. (I) Bacaklar DISEKSiyon sonrası SK'da sabitlenir ve PBS ve ardından PBT'de yıkanır (PBS+ % 0.1 iyonik olmayan yüzey aktif madde). (J) Bacaklar immünosimyasal lekelemelere maruz kalır. (K,L) Bacaklar cam bir kaydırağa aktarılır, montaj ortamlarında temizlenir ve kil ara parçaları içeren bir kapakla kaplanır; ölçek çubukları = 2 mm ve 500 μm. (M) Bacaklar konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Bu protokolle birlikte kullanılan çalışma çözümlerini hazırlama yordamları Tablo 1'de açıklanmıştır.
| Reaktif | Hazırlık | Depolama | |||
| PBS | Damıtılmış suda seyrelterek 10x PBS stok çözeltisinden 1x PBS çalışma stoğu yapın. Çalışan PBS stokunun pH'ı 7.2- 7.4 olmalıdır | Bakteriyel kontaminasyon görünene kadar 1+ ay boyunca 4 °C. | |||
| PBT | %0,1 iyonik olmayan yüzey aktif maddeli 1x PBS çözümü. | Bakteriyel kontaminasyon görünene kadar 1+ ay boyunca 4 °C. | |||
| FA | % 37 formaldehit stoğundan yapılan ve 1x PBS'de seyreltilen% 3.7 formaldehit çözeltisi. | Oda sıcaklığı. Diseksiyon her gün taze olun | |||
| DİkKAT: %37 stok çözeltisi olarak sağlanan formaldehit potansiyel bir kanserojendir ve duman kaputunda seyreltilmelidir. | |||||
| %5 NGS | PBT'de %5 normal keçi serumu seyreltilmiştir. Kullanılan serum kullanılacak ikincil antikorun türüyle eşleşmelidir. | Bakteriyel kontaminasyon görünene kadar birkaç hafta boyunca 4 °C | |||
Tablo 1. Yetişkin Drosophila bacağının immünosistosistini yapmak için çözümler .
1. Dokuların ilk sabitlenmesi
- Her genotip ve yaş için yaklaşık 10 sinek seçin. Karbondioksit altındaki bir sineklik üzerinde anestezi (Şekil 1A, B).
NOT: Diseksiyondan sonra yeterince büyük bir örnek boyutu sağlamak için gerekenden daha fazla sinekle başlayın. - Bir boya fırçası kullanarak, yaklaşık 30 saniye ila 1 dakika boyunca bir cam kuyuda veya tabakta soğuk metanollere uçar (Şekil 1C). Metanol, küküler hidrokarbonları çözünür ve sinekler artık sulu çözeltilerde yüzmek yerine batırılabilir.
- Kanatlarla, sinekleri PBS'ye dikkatlice aktarın. Fazla metanol gidermek ve pbs sinekleri diseksiyon ve fiksasyona kadar buz üzerinde tutmak için buz gibi PBS'de 3x durulayın. Bu noktada, sinekleri parçalara ayırın ve mümkün olan en kısa sürede sabitleyin (<30 dakika).
- Bacakları izole etmek için, sinekleri soğuk PBS ile dolu silikon bir elastomer diseksiyon kabına aktarın, iki çift #5 Dumont tokası kullanarak coxa'daki metatorasik bacakları çıkarın veya bacakları Vanna makasıyla kesin (Şekil 1D). Bacakları 1 mL PBS ile dolu plastik 24 kuyu plakasındaki bir kuyuya aktarın ve tüm bacaklar çıkarılıp kuyulara transfer edilene kadar plakayı buzda tutun.
NOT: Her kuyu en az 20 bacak tutabilir. - PBS çözeltisini 1 mL FA çözeltisi ile değiştirin ve bir somun makinesinde 30 dakika döndürün (Şekil 1E). Somun makinesi ayarı orta hızda (17 rpm) ayarlanmalıdır. Yeterli fiksasyon için bu süre zarfında bacakların tamamen FA çözeltisi içine batırıldığından emin olun.
- SK çözeltisini çıkarmak için, 1 mL PBS 3x'te hızlı bir şekilde yıkayın ve ardından 1 mL PBS'de her biri 5 dakika boyunca ek 3 yıkama yapın. Dokuları, aşağıda açıklanan diseksiyon adımlarından önce ve sırasında buz üzerinde 1 mL PBS'de tutun.
2. Bacak Oksikül ve Antikor Lekesinin Giderilmesi
- Bacak manikülü çıkarma
- Diseksiyon forsepsleri başarı için kritik öneme sahiptir. Kütiküllerin dürtmek yerine yüzeysel olarak ele geçirildiğini sağlayan bir eğim sağlamak için #5 süper ince önkurunun sonundaki her iki uçta hafif paralel bükümler tanıtın, bu da dokuyu mahvedebilir (Şekil 1F, G).
NOT: Paralel olarak bükülen uçlar, kapatıldığında çatalın uzunluğu boyunca birbirleriyle temas etmelidir (Şekil 2). - Bacakları diseksiyon için PBS'deki silikon elastomer kabına aktarın. Ön taraf yukarı bakacak şekilde bir bacağı yönlendirin (bacak anatomisi ve oryantasyon bilgileri için Şekil 3'e bakın). Bir çift asa kullanarak kaval kemiği segmentini silikon elastomer kabına doğru tutun. Eğim tarafını aşağı tutan diğer pervaneleri kullanarak, uyluk kemiğinin distal ucunda bir parça kütikül alın ve trokantere doğru proksimal yönde çekin.
- Uyluk kemiğinin proksimal ucunda çıplak kas görünene kadar manikürden metodik olarak çıkarmaya devam edin (Şekil 1F, G, H).
NOT: Kas çekmeyi önlemek için sadece pervanelerin eğimli tarafını kullanarak bacaklarla yüzeysel temas kurun. - Tüm bacaklar parçalandıktan sonra, PBS'yi FA ile değiştirerek bacakları 30 dakika boyunca orta hızda bir somunu titretmek için sabitleyin (Şekil 1I). Numuneleri 1 mL PBS'de 3 kat hızlı ve ardından PBT'de 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın (Şekil 1J).
NOT: Aktif bölgeleri etiketlemek için monoklonal antikor NC82 (anti-bruchpilot) ile lekelenme varsa, bu antijen daha uzun fiksasyonlara duyarlı olduğu için 20 dakika boyunca düzeltme sonrası.
- Diseksiyon forsepsleri başarı için kritik öneme sahiptir. Kütiküllerin dürtmek yerine yüzeysel olarak ele geçirildiğini sağlayan bir eğim sağlamak için #5 süper ince önkurunun sonundaki her iki uçta hafif paralel bükümler tanıtın, bu da dokuyu mahvedebilir (Şekil 1F, G).
Şekil 2. Yetişkin bacaklarının diseksiyon için kullanılan modifiye forseps. (A) Pervanelerin uçları bükülür ve daha sonra altta düzleştirilir (ok) bir bileme taşına törpürlenerek bir eğim oluşturur. (B) Buna karşılık, değiştirilmemiş asaların uçları bükülmez. Ölçek çubuğu = 1 mm Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Antikor boyama
- Antikor boyama için dokuları bloke etmek için, 1 mL PBT'yi PBT'de seyreltilmiş% 5 NGS'nin 1 mL'lerinden oluşan blokaj çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında 4 saat boyunca veya orta hızda (17 rpm) bir somun makinesinde sallanırken 4 °C'de gece boyunca parçalanmış bacakları kuluçkaya bırakın. Tüm inkübasyonlar sırasında, plastik kapağın yanı sıra sızdırmazlık bandı ile kuyuları örtün (Şekil 1J).
NOT: 1,5 mL veya 2 mL mikrosantrifüj yerine immünosimya için 24 kuyu plakası kullanılır, çünkü mikrosantrifüj tüplerini kullanmaya yönelik önceki girişimler kırık bacaklara ve hasarlı dokuya neden oldu. - Blokaj çözeltisini çıkarın ve taze blokaj çözeltisinde seyreltilmiş 300 mL birincil antikor ekleyin. Kullanılan küçük hacimli antikor dokuları örtmek için yeterli olmalıdır. Kuyuları laboratuvar sızdırmazlık bandı ve plastik kapakla yeniden kapatın ve orta hızda bir somun makinesinde sallanarak 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın (Şekil 1J). Bu çalışmalarda kullanılan antikor reaktif bilgileri ve konsantrasyonları Tablo 2'de açıklanmıştır.
- Primer antikorları 1 mL PBT'de 3 kez kısa bir süre ve ardından her biri 15 dakika boyunca 3 kez yıkayın (Şekil 1J).
NOT: Seyreltilmiş primer antikorlar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanırsa kaydedilebilir ve tekrar kullanılabilir. - Dokuları oda sıcaklığında en az 2 saat veya gece boyunca 4 C'de 1 mL%5 NGS'de tekrar bloke edin (Şekil 1J).
- % 5 NGS engelleme çözeltisini çıkarın ve uygun seyreltilmiş floresan konjuge ikincil antikorların 300 μL'sini ekleyin. Ek olarak, etiket kasına floresan konjuge phalloidin 1:2000 seyreltme ekleyin (Şekil 1J).
- İkincil antikor inkübasyonları için kuyuları laboratuvar sızdırmazlık bandı ve kapakla kapatın. Ayrıca, floroforları ışıktan korumak için plakaları alüminyum folyoya sarın. Oda sıcaklığında veya 4 °C'de gece boyunca 6-8 saat kuluçkaya yatırın.
- Yukarıdaki adım 2.2.3'te açıklandığı gibi ikincil antikorları ve phalloidinleri yıkayın. Floroforları ışıktan korumak için yıkamaların arasında alüminyum folyolu kapak plakaları.
- Antikor boyama için dokuları bloke etmek için, 1 mL PBT'yi PBT'de seyreltilmiş% 5 NGS'nin 1 mL'lerinden oluşan blokaj çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında 4 saat boyunca veya orta hızda (17 rpm) bir somun makinesinde sallanırken 4 °C'de gece boyunca parçalanmış bacakları kuluçkaya bırakın. Tüm inkübasyonlar sırasında, plastik kapağın yanı sıra sızdırmazlık bandı ile kuyuları örtün (Şekil 1J).
3. Montaj Ayakları
- Bacakları uzunlayıp ön tarafı yukarı doğru yönlendirerek bir slayda aktarın. Bacakları montaj ortamı ile örtün (Şekil 1K, L).
NOT: Alt delik jiletle kesilerek genişletilirse, parçalanmış bacaklar P1000 pipet ucu ile aspire edilebilir. - Kapak köşelerini küçük bir modelleme kili topu boyunca kazıyarak 22x22 mm2 kapakçık (#1,5 kalınlığı) kil ara parçaları ekleyin. Her köşede 1-2 mm kalınlığında az miktarda kil olmalıdır (Şekil 1K).
- Slaydı örtmek için, kapakçığı kaydırağa bakan kil aralayıcılarla ekleyin ve kapak parçası uyluk kemiğinin yüzeyine dokunana kadar köşeleri dikkatlice itin.
- Buharlaşmayı önlemek için, kapak kapağının kenarlarını oje ile kapatın ve görüntülemeye kadar 4 °C'de saklamadan önce karanlık bir yerde (yaklaşık 10 dakika) kurumaya bırakın.
4. Görüntüleme
- Konfokal mikroskop ile görüntü (Şekil 1M). Diseksiyonun kalitesini daha iyi değerlendirmek için iletilen bir ışık kanalı ekleyin ve ilgi alanındaki gözle görülür şekilde bozulmuş kas liflerine sahip örnekler atılmalıdır.
- 2x yakınlaştırma ve uyluk kemiğinin kalınlığına karşılık gelen ~ 40 mm toplam görüntü derinliği ile 20x büyütme ile z yığınlarını görüntülemeye başlayın. Floresan sinyal algılama için, Nyquist örneklemesi ile tutarlı çözünürlüklerde görüntüler yakalayın (8-10 μs / piksel bekleme ayarına sahip 1024 x 1024 piksel kullanıyoruz). Sinyal yoğunluğu, yüksek voltaj kazanç ayarlarının ayarlanmasıyla elde edilen doğrusal aralıkta olmalıdır. Bir deneme içindeki bir dizi örnek için kazanç ayarları ayarlandıktan sonra, sinyal yoğunluklarının örnekler arasında karşılaştırılabilmesi için değiştirilmemelidir.
- Sinaptik boutonları ve diğer hücre altı yapıyı görüntülemek için, konfokal görüntüleri ≥60x büyütmede yakalayın. Dedektör ayarları doğrusal aralıkta olmalı, piksel yoğunluğu, bekleme ayarları ve z derinliği ise daha düşük büyütmede yakalanan görüntüler için benzer olmalıdır (adım 4.1).
Representative Results
Şekil 4'te anti-hrp, anti-dlg ve phalloidin ile boyanmış metatorasik bacağın temsili bir örneği gösterilmiştir. Femurun proksimal kısmından kütikül çıkaran diseksiyonlar için, otofluoresans ile kolayca tespit edilen tendonun yakınında stereotiplenmiş çardaklar belirgin olacaktır. Bacağa antikor penetrasyonunun, kütikül çıkarılan bölgenin ötesinde kısa bir mesafe için gerçekleştiğini unutmayın (Şekil 4A). Güçlü floresan sinyali mevcut olduğunda bu bölgeler etkili bir şekilde görüntülenebilir. Düşük büyütmede görüntüleme (2x yakınlaştırma ile 20x), 1) ne kadar kütikül çıkarıldığını ve 2) diseksiyon sırasında hasar oluşup oluşmadığının kolay bir şekilde belirlenmesini sağlar. Artan büyütme (60x) tilm üzerine kalıplaşmış projeksiyonlar gösterir (Şekil 4B). Çalışmamız, muhtemelen proksimal uyluk kemiğindeki tilmi içselleştiren I- MN soyundan türetilen bir MN üzerinde yoğunlaştı (kutu, Şekil 4B ve Şekil 4C). Büyütmeyi daha da artırmak (2x yakınlaştırma ile 100x) sinaptik boutonların etkili bir şekilde görselleştirilmesini sağlar (Şekil 4D).
Yetişkin NMJ'deki morfolojik değişiklikleri zaman içinde incelemek için daha önce ALS modeli olarak dsod1 mutantlarını kullandık. Bouton şişmesi dsod1nulland dsod1+ ile ilgili yaşlı dsod1H71Y mutantlarında görülür (Şekil 5A, B). Larva NMJ'de, monoklonal antikor NC82 genellikle aktif bölgeleri etiketlemek için kullanılır ve bu yapılar yetişkin NMJ'de kolayca görselleştirilebilir (Şekil 5C). Zayıf pozitif HRP akson dalları dsod1H71Y mutantlarında bol miktarda bulunur ve bu dallar genellikle zayıf ve dağınık BRP lokalizasyonu (oklar) gösterir.
Nörodejenerasyon için önemli olan, piyasada bulunan antikorlar genellikle agregalarda bulunan her yerde bulunan proteinleri tespit edebilir ve yaşlı mutant dsod1 sineklerinde ve kas içinde MN terminal aksonlarında her yerde bulunan agregalar tespit ettik (Şekil 6A). Ayrıca mitokondriyi etiketleyen antikorlar yaşla birlikte morfolojik değişiklikleri de tespit edebilir (Şekil 6B).
Bazı preparatlar için, diseksiyon sırasında kas hasarı örneği kullanılamaz hale getirir. İlk başta, bu tür bir hasar yaygın bir olay olabilir, ancak uygulama ile iyileşme meydana gelir. İyi diseksiyon örnekleri Şekil 7A, C'yi gösterirken, zayıf diseksiyonlar Şekil 7B, D'de gösterilmiştir. Zayıf diseksiyonlar, faz kontrastı mikroskopisi (Şekil 7B) veya floresan konjuge phalloidin ile görselleştirilen eksik kas lifleri (Şekil 7D, ok) ile tespit edildiği gibi kas liflerinin düzensizleşmesine neden olur. Kas etiketlemek için phalloidin kullanmanın kombinasyonu ve iletilen ışık görüntüleri, bir diseksiyon mikroskobu altında görüntülerken belirgin olmayabilecek bu tür kas hasarlarını tespit etmeye yardımcı olabilir.
Şekil 3. Drosophila bacağının anatomisi. (A) Arka tarafta bulunan belirgin çıplak kütikülün aksine kılların varlığı ile karakterize edilen metatorasik bir bacağın ön tarafının diyagramı. Parçalı bacak, proksimal (Pr) ila distal (Di) sırasına göre coxa (Cx), trokanter (Tr), femur (Fe), kaval kemiği (Ti), 5 tarsal segment (Ta1-5) ve pençeden (Cl) oluşur. Uyluk kemiğinin dorsal (D) ve ventral (V) tarafları da endikedir. Ölçek çubuğu =100 μm. (B) Tibia levator (tilm), tibia depresör (tidm), uzun tendon kası 2 (ltm2) ve kaval kemiği redüktör (tirm) kaslarını ve tilmi içselleştiren proksimal femurdaki akson projeksiyonlarını içeren femur şeması. Bu kalıplaşmış aksonal projeksiyonların I-lineage neuroblasts16'dan türetildiği varsayılmaktadır ve ikinci arborizasyon diseksiyonla (kutulu) erişilmesi en kolay olandır. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Diseksiyonlu metatorasik femur, tilmi içselleştiren kalıplaşmış MN mimarisini ortaya çıkardı. İmmünostokimya nöronları (HRP), diskleri büyük (DLG) ve kası (phalloidin) işaretlemek için kullanıldı. Z-istifleri tüm uyluk kemiği boyunca konfokal mikroskopi ile yakalanmış ve maksimum seri projeksiyon olarak gösterilmiştir. (A) Diseksiyon sırasında saptanabilir kas hasarı oluşmadığını göstermek için iletilen bir ışık kanalı da dahil edildi. Görüntü 20x büyütme, ölçek çubuğu =50 μm'de yakalandı. (B) Tilm (kutulu alan, merkez), ölçek çubuğu =20 μm ile ilişkili tanımlanmış çardaklar; ve (C) 60x büyütmede ölçek çubuğu = 20 μm. (D) 2x yakınlaştırma ile 100x büyütmede görüntülendiğinde vahşi tip hayvanlarda boutonları çevreleyen DLG belirgindi; ölçek çubuğu = 2 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Bacak diseksiyon tekniği kullanılarak tespit edilebilen bouton morfolojisinde yaşa bağlı değişiklikler örneği. Bouton şişmesi yaşlı dsod1H71Y mutantlarında görülür. (A) Hrp lekeli boutonların genç (yeni eklosed, gün 0 yetişkinler) ve yaşlı (gün 10) sineklerin temsili görüntüleri, ölçek çubuğu = 1 μm. (B) Bouton boyutları ImageJ içindeki ölçü fonksiyonu kullanılarak ilgili genotiplerden ölçüldü. s<0.0001 (Geçici Tukey testi ile 2 yönlü ANOVA). (C) Monoklonal antikor NC82 (anti-bruchpilot) ile etiketlenmiş sinaptik boutonlar içindeki aktif bölgeler; ölçek çubuğu = 1 μm. Şekil 20Please'den değiştirildiBu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 6. Drosophila bacak preparatlarında kullanılan nörodejeneratif hastalıkla ilişkili yaygın belirteçler. (A) Yaşlı dsod1H71Y sineklerinin terminal aksonlarında ve kasında hücre altı poliubikinated agregalar tespit edilir. Anti-poliubiquitin (FK2) kullanan immünositokimya, yaşlı dsod1H71Y/H71Y, ölçek çubuğu = 20 μm (solda) ve 5 μm (sağda) puncta (ok) algılar. (B) Şişmiş mitokondri anti-ATP5A, ölçek çubuğu = 1 μm kullanılarak tespit edilebilir. Şekil 20Please'den değiştirildiBu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 7. İyi ve kötü diseksiyon örnekleri. (A) Alttaki kas mimarisini bozmayan diseksiyon. (B) Yıpranmış kas lifleri (ok) gösteren ve analiz için kullanılamayan zayıf bir diseksiyon örneği. Her iki örnek de faz kontrastlı mikroskopi ile görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) HRP (yeşil) ve phalloidin (mavi) ile konfokal mikroskopi ile görüntülenen iyi bir diseksiyon örneği. (D) Zayıf bir diseksiyon eksik TILM eksik sırt kas lifleri (ok). Ölçek çubuğu = 50 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Antikor/Leke | Seyreltme* |
| Anti-ATP5A | 1:500 |
| Bruchpilot karşıtı (nc82) | 1:20 |
| Anti-sistein sicim proteini (ab49) | 1:50 |
| Büyük disk önleyiciler (4F3) | 1:200 |
| Anti-hrp | 1:550 |
| Anti-poliubiquitin (FK2) | 1:1000 |
| Anti-repo (8D12) | 1:5 |
| Keçi anti-fare ikincil antikor | 1:800 |
| Phalloidin | 1:2000 |
| *%5 NGS'de seyreltin |
Tablo 2. Antikorlar ve seyreltmeler. Bu çalışmalarda kullanılan antikorların ticari tedarikçileri Malzeme Listesi'nde listelenmiştir.
Discussion
Drosophila yetişkin bacağı, nöroblast soyundan ve kalıplaşmış arborizasyon kalıplarından haritalanan iyi karakterize edilmiş MN'ler ile göreceli basitlik verilen nörodejenerasyonunu incelemek için ideal bir modeldir. Nörodejeneratif hastalığın çalışması için daha önce birçok rapor bacak MN'leri kullanmıştır21,22. Bu çalışmalar, kütikülden görüntü almak için basınçlı bir hücre işaretleyicisi (MARCM) ile mozaik analizi ile birlikte GFP ifade eden çizgiler kullandı ve bir dizi morfolojik değişikliği belgeledi. Yetişkin NMJ'lerin resected cuticle ile immünosiktokimya ile görüntülenmesi, mevcut bir antikor araç kutusu kullanarak karmaşık moleküler değişiklikleri izleme yeteneği ile daha fazla karakterizasyon sağlar.
Bu protokolün immünosistokimya kısmı nispeten standarttır ve genotip'den bağımsız olarak uygulanabilir (Drosophila ile kullanım için genel antikor boyama yöntemlerinin mükemmel bir açıklaması için bkz. Ayrıca, floresan yoğunluğu, akson dal uzunluğu, bouton sayıları ve boyutu gibi parametreler, görüntüler yakalandıktan ve nicel analiz için ayrıntılı yöntemler yayınlandıktan sonra çeşitli kullanılabilir ImageJ makroları kullanılarak belirlenebilir (örneğin, bkz. 24,25,26). Bu nedenle, diseksiyon tekniği burada açıklanan ana yeniliktir. Diseksiyondan önce, sinekler kütiküler hidrokarbonları soymak için bir alkole batırılır. Hem etanol hem de metanol bu amaç için yaygın olarak kullanılır; Ancak, sadece metanol kullandık. Diseksiyon başarısı için kritik olan birkaç faktördür: İlk olarak, bir eğimli modifiye forseps kullanmak kütikülle çok yüzeysel temas sağlar. İkincisi, kütikül yüzeyinin açıkça görülebilmesi için 60-100x toplam büyütme yapabilen bir diseksiyon mikroskobu kullanarak. Daha düşük maksimum büyütmeye sahip mikroskoplar için, en yaygın markalar için 2x hedefleri mevcuttur ve mevcut lenslerle birleştirildiğinde yeterli olmalıdır. Üçüncüsü, ilk fiksasyon adımı tiktikül kırılgan hale getirir ve altındaki kaslara zarar vermeden çekilmesini kolaylaştırır. Bu adımda aşırı sabitleme, tüm bacağı etkili diseksiyon için çok sert hale getirir. Bu nedenle, ilk sabitleme 30 dakika ile sınırlanmalıdır. Formaldehit fiksatifi, bu kısa süre boyunca alttaki dokuyu etkili bir şekilde çapraz bağlayacak kadar nüfuz etmeyecektir ve bu nedenle ikinci bir fiksasyon adımı gereklidir. İkinci fiksasyondan önce, morfolojideki bozulmayı ve değişiklikleri önlemek için dokular buz üzerinde tutulmalıdır. Dördüncü olarak, soğuk da önemliyken, muhtemelen kütikül kırılgan ve küçük bir parçanın daha kolay çıkarılabilmesi gibi benzer nedenlerden dolayı diseksiyon örnekleri bulduk.
Pratikle, diseksiyonların ~% 50'sinin ayırt edilebilir doku hasarı olmadan kullanılabilir olacağını görüyoruz. Bu yüzde diğer bazı dokulara göre düşük görünse de, diseksiyon prosedürü hızlıdır ve birçok bacak 30- 60 dakika içinde işlenebilir. Bu nedenle, başlangıçta başarı oranları düşük olsa bile, her deney grubu için 4-5 iyi örnek elde etmek mümkündür. Bununla birlikte, genotipler ve/veya yaş önemli ölümcüllükle sonuçlanırsa, herhangi bir zamanda mevcut sinek sayısı bir sınırlama olabilir.
Diğer bir sınırlama, büyüklüğü nedeniyle bacağın diğer bölgelerini uyluk kemiğinin proksimal bölgesinin ötesinde inceleyememiş olmamızdır. Böylece, TILM'yi güvenilir bir şekilde içselleştiren tanımlanmış MN çardaklarını inceleyebiliriz ve tibia depresör kasının üzerindeki kütikülleri, diseksiyon sırasında bacağın yönlendirilme şeklinde küçük değişikliklerle incelemek mümkündür. Bununla birlikte, bacağın diğer bölgelerine erişmek, diseksiyon sırasında aksonal mimariyi bozmadan daha zor olmuştur.
Burada, immünosimya kullanarak tilmi içselleştiren tanımlanmış MN'ler için yetişkin NMJ'deki değişiklikleri tespit etmek için diseksiyon yöntemleri sunuyoruz. Bacak, sadece ~ 50 MN tarafından içselleştirilmiş ve iyi tanımlanmış anatomiye sahip 14 kas içeren basit bir sistem olarak yararlıdır. Parçalanmış bacak hazırlığı genotipler arasında kullanılabilir ve mutant arka planlarda muhabir gen yapılarının genotipsel olarak karmaşık stoklarını oluşturmaya gerek kalmadan NMJ görselleştirmesi için bir antikor paketi mevcuttur. Bu yaklaşım, MN hastalıkları ve yaşla ilgili diğer durumlar için NMJ'deki değişikliklerin daha ayrıntılı bir şekilde nitelendirmesini sağlayacaktır.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Eric Roberts'a görüntüleme konusunda tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Rhode Island College'daki Bilgi Teknolojileri Hizmetleri'ne ve özellikle Michael Caine ve Jake Douglas'a videografi için teşekkür ederiz. Monoklonal antikorlar anti-dlg ve anti-brp sırasıyla UC-Berkeley ve Universitaetsklinikim Wuerzburg tarafından geliştirilmiştir ve NIH NICHD tarafından oluşturulan ve Iowa Üniversitesi Biyoloji Bölümü, Iowa City, IA 52242, ABD'de sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bankası'ndan alınmıştır. Burada bildirilen araştırma, Rhode Island Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Biyomedikal Araştırma Mükemmelliği Ağı tarafından [P20GM103430] hibe numarası altında tam olarak desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
References
- McDermott, C. J., Shaw, P. J. Diagnosis and management of motor neurone disease. BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).
- Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).
- Foster, L. A., Salajegheh, M. K. Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).
- Bede, P., Pradat, P. F. Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease. Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).
- Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).
- Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. Elife. 7, (2018).
- Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
- Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).
- Harris, K. P., Littleton, J. T. Transmission, Development, and Plasticity of Synapses. Genetics. 201 (2), 345-375 (2015).
- Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging. Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).
- Banerjee, S., et al. Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing. Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).
- Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).
- Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H.
- Truman, J. W. Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila. Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Enriquez, J., et al. Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).
- Agudelo, A., et al. Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS. Biology Open. 9 (10), (2020).
- Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).
- Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2. Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry. Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).
- Castells-Nobau, A., et al. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).
- Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).
