Summary
Dette manuskriptet beskriver en metode for bruk av encellet fluorescensmikroskopi for å visualisere og kvantifisere bakteriell konkurranse i kokultur.
Abstract
Interbakteriell konkurranse kan direkte påvirke mikrobiomenes struktur og funksjon. Dette arbeidet beskriver en fluorescensmikroskopitilnærming som kan brukes til å visualisere og kvantifisere konkurranseinteraksjoner mellom ulike bakteriestammer på encellet nivå. Protokollen som er beskrevet her gir metoder for avanserte tilnærminger i lysbildeforberedelse på både oppreist og invertert epifluorescence mikroskoper, live-celle og tidsforløp bildeteknikker, og kvantitativ bildeanalyse ved hjelp av open source programvare FIJI. Tilnærmingen i dette manuskriptet skisserer kvantifiseringen av konkurranseinteraksjoner mellom symbiotiske Vibrio fischeri-populasjoner ved å måle endringen i området over tid for to myntkubaterte stammer som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner fra stabile plasmider. Alternative metoder er beskrevet for å optimalisere denne protokollen i bakterielle modellsystemer som krever forskjellige vekstforhold. Selv om analysen beskrevet her bruker forhold optimalisert for V. fischeri, er denne tilnærmingen svært reproduserbar og kan lett tilpasses for å studere konkurranse blant dyrkbare isolasjoner fra forskjellige mikrobiomer.
Introduction
Denne artikkelen skisserer en metode for kvantifisering av bakteriell konkurranse på encellet nivå ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Strukturen og funksjonen til mikrobielle samfunn er ofte formet av konkurranseinteraksjoner mellom mikrober, og i mange tilfeller krever karakterisering av disse interaksjonene å observere forskjellige bakteriestammer i coincubation1,2,3,4,5,6,7,8 . Tradisjonelt kvantifiseres bakteriekonkurransen på befolkningsnivå ved å telle kolonidannende enheter (CFUer) av inhibitor og målstammer før og etter en myntutdelingsperiode2,9. Mekanismer for mikrobiell konkurranse er bredt fordelt mellom bakterier og kan være avhengige av enten diffusjon eller cellecellekontakt for å hemme målcellene10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.
Selv om bakteriestammer ofte observeres i myntkubering på befolkningsnivå, skisserer dette manuskriptet en analyse for encellet kvantifisering av bakteriell konkurranse. Videre inneholder dette arbeidet forslag til tilpasning av protokollen for bruk med andre bakteriearter. Mens de spesifikke teknikkene i denne artikkelen brukes til å studere kontaktavhengig intraspesifikk konkurranse mellom stammer av den symbiotiske bakterien Vibrio fischeri20,21,22, kan de tilpasses for konkurranse mellom mange organismer. Denne artikkelen inneholder instruksjoner for lysbildeoppsett på både oppreiste og inverterte mikroskoper, og all analyse er beskrevet ved hjelp av åpen kildekode-programvaren FIJI23, slik at metoden kan brukes av forskere med tilgang til forskjellige bildeoppsett og analyseprogrammer. Gitt viktigheten av å studere mikrobiell konkurranse både på befolknings- og encellet nivå, vil denne metoden være en verdifull ressurs for forskere å kvantifisere konkurranseinteraksjoner, spesielt de som ikke har tilgang til proprietær analyseprogramvare.
Protocol
1. Optimalisering av bakteriestammer
- Velg to bakteriestammer for encellede bakterielle konkurranseanalyser. Her brukes to stammer av V. fischeri: en målstamme (ES11424) og en inhibitorstamme (MJ1125) som er kjent for å drepe målstammen ved hjelp av type VI-sekresjonssystemet på kromosom II (T6SS2)1, som er en kontaktavhengig drapsmekanisme.
- Bestem de riktige kontrollene for eksperimentet. I dette eksemplet er den riktige kontrollen å inkubere både villtype og T6SS mutanthemmerstammer med målstammen for å kvantifisere effekten av T6SS-mediert drap.
MERK: Ytterligere kontroller kan omfatte en målstamme som uttrykker de nødvendige immunitetsgenene for å forhindre T6SS-avhengig drap eller en hemmermutantstamme som uttrykker villtypekopier av de muterte genene i trans for å gjenopprette T6SS-aktivitet1. - Når det er mulig, transformer stammer med stabile plasmider som koder gener for forskjellige fluorescerende proteiner (f.eks. GFP eller RFP) for å visuelt skille stammetyper på mikroskopet. Her er inhibitorstammen merket med en GFP-kodingsplasmid (pVSV102), og målstammen er merket med en dsRed-kodingsplasmid (pVSV208)26.
MERK: Hvis det ikke er mulig å bruke stabile plasmider, kan fluorescerende koder innføres på bakteriekromosomet for visualisering27,28. - I løpet av den første optimaliseringsperioden er bildeklonale kulturer av de taggede stammene under hvert av fluorescerende filtre som vil bli brukt under eksperimentet for å sikre at cellene bare er synlige i den tiltenkte kanalen. Sørg for eksempel for at en GFP-merket stamme bare er synlig i FITC-kanalen.
2. Agarose pad forberedelse
- Forbered agarose pad løsning ved å oppløse 2% lavsmelting agarose (w / v) i mPBS. Varm opp oppløsningen kort i mikrobølgeovnen og virvelen til agarose er helt oppløst. Hold denne oppløsningen varm ved å plassere den i et 55 °C vannbad til den er klar til bruk. Se diskusjonsdelen hvis du vil ha mer informasjon om hvordan du klargjør agarose pads.
MERK: Her ble mPBS utarbeidet ved å legge til 20 g / L NaCl til standard 1x PBS. - Pakk et stykke lab tape rundt en glasssklie fem ganger. Gjenta denne prosessen en gang til på samme lysbilde, slik at avstanden mellom de to tapedelene er litt mindre enn bredden på en dekslelip (Figur 1A). For eksempel, hvis du bruker 25 mm2 deksler, bør tapestykkene fordeles ca. 20 mm fra hverandre.
MERK: Selv om antall ganger båndet er viklet rundt lysbildet kan endres for å justere tykkelsen på agaroseputen, er det viktig at lagene med tape har samme høyde på begge sider av lysbildet slik at agaroseputen forblir flat. - Pipette varm agarose løsning mellom de to tapestykkene og umiddelbart topp med en dekslelip slik at den hviler på tapestykkene. Dette vil sikre at overflaten på agaroseputen forblir flat. Volumet av agarose løsning pipettert i dette trinnet bør være nok at dekslene gjør kontakt med væsken og skyver ut eventuelle bobler i agarose-løsningen. For dette spesielle oppsettet er 200 μL varm agarose tilstrekkelig.
- La agaroseputen størkne ved romtemperatur i minst 1 time før myntekubasjonsanalysen. Trinn 2.2 vil produsere en agarosepute på ca. 20 mm2.
- Klipp denne agaroseputen med et barberblad i fire, 5 mm2 pads som skal brukes til avbildning.
MERK: Agarose pads kan gjøres opptil en uke før eksperimentet og lagres ved 4 °C i en tom, steril Petri-plate forseglet med parafilm for å forhindre tørking.
3. Forbered stammer for saminkubasjon
- Strekk ut hver stamme som skal brukes i myntkuubasjonsanalysen fra -80 °C på LBS-agarplater supplert med passende antibiotika og inkuber over natten ved 24 °C. I dette eksemplet brukes tre stammer: wild-type inhibitorstammen, type VI-sekresjonssystemet mutant og målstammen.
- Neste dag, start nattkulturer i biologisk duplikat ved å plukke to kolonier fra hver stamme og resuspending dem i LBS medium supplert med passende antibiotika og inkubere over natten ved 24°C med risting ved 200 rpm.
- Neste morgen replikerer subkultur hver biologisk 1:1000 til friskt LBS-medium uten antibiotika og inkuberer ved 24 °C med risting i 4-5 timer eller til cellene når en OD600 på ~1,5.
MERK: Tidspunktet for trinn 3.1, 3.2 og 3.3 må kanskje optimaliseres for forskjellige bakteriearter, da vekstraten kan variere betydelig. For denne analysen var cellene rettet mot å være i midtloggfasen ved starten av myntsubasjonsanalysen.
4. Coincubate bakteriestammer
- Start med midtloggkulturer fra trinn 3.3, mål og registrer den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) for alle prøver.
- Normaliser hver prøve til en OD600 = 1,0, som tilsvarer omtrent 109 CFU / ml for V. fischeri, ved å fortynne kulturen med LBS-medium.
- Bland de to konkurrerende stammene sammen med et 1:1-forhold basert på volum ved å tilsette 30 μL av hver normaliserte belastning til et merket 1,5 ml rør. Virvel blandet belastning kultur for 1-2 s.
MERK: I noen tilfeller kan det være hensiktsmessig å blande kokulturer i forskjellige forhold. For eksempel, når den ene stammen vokser mye raskere enn den andre, kan det være nødvendig å starte den langsommere voksende belastningen med en numerisk fordel for å observere konkurransen. Optimalisering kan også være nødvendig hvis OD600 ikke samsvarer med lignende CFU/ml for begge stammene. - Gjenta trinn 4.3 for hver biologiske replikering og behandling. I eksemplet som vises her, vil dette resultere i totalt fire blandede strekkrør: to biologiske replikerer med den ville hemmerstammen blandet med målstammen og to biologiske replikerer med type VI-sekresjonssystemet mutantstamme blandet med målstammen.
- For å sikre at konkurrerende celler er tilstrekkelig tette for kontaktavhengig drap i mynteknusingen på agarputen, konsentrer hver blandet kultur 3 ganger ved å sentrifugere den blandede kulturen i et standard 1,5 ml sentrifugerør i 1 min ved 21 130 x g, kaste bort supernatanten og bruke hver pellets på nytt i 20 μL LBS medium. Gjenta dette for hver prøve.
MERK: Noen bakterieceller er følsomme for skade ved sentrifugering ved høy rcf; i slike tilfeller kan den blandede kulturen sentrifugeres i 3 min ved 4600 x g29. I tillegg, når du kvantifiserer kontaktavhengig konkurranse, er det viktig å sikre tilstrekkelig celletetthet på lysbildet for å observere drap. I denne artikkelen hadde "overfylte" behandlinger, hvor drap observeres, ca 10 celler / 20 μm2; Se diskusjonsdelen hvis du vil ha mer informasjon.
5. Skyv oppsettet
- Når du bruker et oppreist mikroskop, plasserer du en ~5 mm2 agarosepute på en standard 1 mm glasssklie. Spot 2 μL av en blandet kultur på agarose pad og plassere en #1.5 coverlip (25 mm2) over stedet. Se figur 1B for eksempel.
- Når du bruker et invertert mikroskop, spot 2 μL av en blandet kultur på #1,5 dekslerlip bunnen av en 35 mm Petri parabolen og plassere en ~ 5 mm2 agarose pad over coincubation spot. Plasser en 12 mm sirkulær glassdeksle over agaroseputen. Se figur 1C for et eksempel.
- Gjenta trinn 5.1 eller 5.2, avhengig av mikroskopoppsettet som brukes, for de resterende tre blandede kulturene, noe som resulterer i at fire lysbilder eller retter blir avbildet.
- La skliene sitte på benken i ca. 5 minutter før du går videre til trinn 6. Dette gjør at celler kan bosette seg på agarputen og eliminerer bevegelse under avbildningsprosessen.
6. Fluorescensmikroskopi
- Begynn med å fokusere på celler ved hjelp av hvitt lys (fasekontrast eller DIC) for å minimere effekten av fotobleking. Basert på gjennomsnittsstørrelsen på en enkelt bakteriecelle, bruk et 60x eller 100x oljemål.
- Juster eksponeringstiden og anskaffelsesinnstillingene for hver kanal slik at cellene er synlige i riktig kanal med minimal bakgrunnsgjenkjenning.
MERK: Det er hensiktsmessig å bruke forskjellige eksponeringstider for forskjellige kanaler, men samme eksponeringstid bør brukes på tvers av alle biologiske replikeringer og behandlinger for en gitt kanal. - For hvert eksempel velger du minst fem synsfelt (FOV) og henter bilder i hver enkelt kanal ved hjelp av anskaffelsesinnstillingene fra trinn 6.2 (se eksempler i figur 2). Lagre XY-punktene fra hver FOV slik at den samme FOV-en kan avbildes i løpet av det siste tidspunktet. Avbildning av samme FOV på hvert tidspunkt er nødvendig for å bestemme andelen areal okkupert av mål- eller hemmerceller under analysetrinnene.
MERK: I dette eksemplet oppdages fluorescensen til GFP ved hjelp av et filter med en eksitasjonsbølgelengde på 467 - 498 nm og et utslippsfilter på 513 - 556 nm og er falskt farget grønt. Fluorescens av dsRed oppdages ved hjelp av et filter med en eksitasjonsbølgelengde på 542 - 582 nm og et utslippsfilter på 603 - 678 nm og er falskfarget magenta. - Etter 2 timer gjentar du trinn 6.3 for hver prøve ved hjelp av de tidligere lagrede XY-punktene (Fig. 2).
MERK: Tidspunktet for påfølgende bilder må kanskje optimaliseres for organismer med forskjellige vekstrater eller konkurransemekanismer.
7. Bildeanalyse i FIJI
- Last ned og installer FIJI-bildebehandlingsprogramvaren ved hjelp av instruksjonene som du finner her: https://imagej.net/Fiji/Downloads
- Åpne FIJI og importer bildefiler for analyse.
MERK: I de fleste tilfeller . TIFF-filer vil bli brukt til bildeanalyse, selv om noen bildeinnhenting programvare vil eksportere ved hjelp av proprietære filtyper. FIJI kan gjenkjenne de fleste proprietære filtyper og bilder kan importeres og analyseres som følger. - For hvert bilde som er hentet i trinn 6.3 og 6.4, konverterer du bildet til gråtoner, skiller kanalene og begynner med terskelverdi (Ctrl + Skift + T) og oppretter en binær maske av det forhåndsbehandlede bildet (Figur 3A,B).
MERK: Her brukes standard terskelinnstillinger i FIJI. I noen tilfeller kan det være nødvendig å endre disse innstillingene, i så fall bør de samme innstillingene brukes for alle bildene i det eksperimentet. - Angi skala på bildet (Analyser | Angi skala) ved hjelp av de riktige verdiene for mikroskopioppsettet23.
- Angi mål (Analyser | Angi mål) og velg Område.
MERK: Andre målinger kan legges til hvis de passer for eksperimentet. Bare målet for objektområdet er nødvendig for eksempelanalysen som vises her. - Analysere partikler (Analysere | Analyser partikler) ved hjelp av standardinnstillingene (Figur 3C). Hvis det er rusk i prøven, kan det være nødvendig å justere størrelsen eller sirkulariteten for å filtrere ut ikke-cellepartikler. Velg Vis | Omriss slik at utdataene for denne analysen vil inneholde en nummerert omriss av alle analyserte partikler (Figur 3D).
MERK: Sammenligning av omrisset i figur 3D med det første bildet er spesielt viktig i optimaliseringstrinnet for å sikre at (1) alle celler analyseres, og (2) at eventuelle rusk utelukkes fra analysen. - Eksporter målene fra trinn 7.4 (figur 3E) til en regnearkprogramvare for videre analyse og grafer.
- Gjenta trinn 7.1 - 7.5 for alle kanaler og bilder som er anskaffet under eksperimentet.
8. Beregne prosentandelen av det opprinnelige målområdet over tid
- For hvert synsfelt som analyseres i avsnitt 7, må du sørge for at den eksporterte filen inneholder en individuell arealmåling for hver partikkel som ble analysert. Fra og med målstammens fluorescenskanal beregner du sumpartikkelområdet for hvert enkelt synsfelt. For to biologiske replikeringer med fem FOV hver, bør dette resultere i ti sum områder per behandling på hvert tidspunkt.
- Beregn prosentandelen av det opprinnelige målområdet over tid for hver FOV ved hjelp av følgende formel: (
) - Gjenta denne beregningen for alle behandlinger, og graf prosenten av det opprinnelige målområdet (resultatet av ligningen fra trinn 8.2) for hver behandling (figur 4A).
- Avgjøre om det er en netto økning i målpopulasjonen (som indikerer vekst), en netto nedgang i målpopulasjonen (som indikerer død), eller ingen endring (som indikerer ingen vekst eller død) for hver behandling.
MERK: Prosent av det opprinnelige målområdet med verdier større enn 100 angir netto målvekst, og verdier lavere enn 100 indikerer netto måldød. Prosent av innledende målverdier som forblir på 100, indikerer ingen bevegelse i målpopulasjonen. Se diskusjon for foreslåtte oppfølgingseksperimenter.
)9. Beregning av prosentandelen av innledende inhibitorområde over tid
- Gjenta trinn 8.1 til 8.3, denne gangen ved hjelp av målingene samlet inn fra inhibitorstammens fluorescenskanal i avsnitt 7 (Figur 4B).
- Avgjøre om det var en netto økning i hemmerpopulasjonen (vekst); en netto reduksjon i hemmerpopulasjonen (død), eller ingen endring for hver behandling. Verdier større enn 100 indikerer netto hemmervekst, og verdier lavere enn 100 indikerer netto inhibitordød.
Representative Results
For å visualisere og kvantifisere konkurranseinteraksjoner mellom bakterier på encellet nivå, ble en protokoll utviklet og optimalisert for V. fischeri ved å endre vår veletablerte CFU-baserte analyse1,2. Denne metoden bruker GFP- og dsRed-koding av stabile plasmider for å visuelt skille forskjellige stammer av V. fischeri. Det konkurransedyktige resultatet av disse interaksjonene kan kvantifiseres ved å analysere bildene som er anskaffet fra denne analysen ved hjelp av open source-programvaren FIJI. Som et eksempel ble følgende eksperiment utført ved hjelp av V. fischeri-isolasjoner. En inhibitorstamme inneholdt en plasmid som koder GFP, og en målstamme inneholdt en plasmid som koder dsRed. Gitt at T6SS2-kodet av inhibitoren er en kontaktavhengig drapsmekanisme, ble behandlinger inkludert der celler enten var overfylte (høycellekontakt) eller spredning (lavcellekontakt) på et lysbilde for å markere virkningen av eksperimentelt oppsett på de endelige resultatene av denne analysen. I utvalgsdataene ble konkurrerende stammer blandet med et 1: 1-forhold og inkubert på en agarosepute i 2 timer, og både innledende og endelige (2 t) bilder ble tatt. Som en kontroll ble en T6SS2 mutantstamme også myntet med målstammen under både overfylte og spredte forhold. Kulturer av hver stamme ble utarbeidet og coincubated som beskrevet ovenfor og lysbilder ble utarbeidet som vist i figur 1.
Figur 2 viser representative fluorescensmikroskopibilder av hver eksperimentelle behandling med samme synsfelt avbildet på et innledende og endelig tidspunkt. For hver behandling ble enten en villtypehemmer eller T6SS mutantstamme som inneholdt en GFP-kodingsplasmid blandet med et 1:1-forhold med målstammen som inneholdt en dsRed-kodingsplasmid. I løpet av en 2 h coincubation periode med dette eksperimentelle oppsettet, voksende V. fischeri celler kan gå gjennom 1-2 divisjoner (Figur 2; grå piler). I figur 2Able cellecellekontakt tvunget mellom målet og hemmeren ved å konsentrere den blandede kulturen før den oppdaget på lysbildet. Flere målceller observeres for å bli avrundet og/eller forsvinne i løpet av 2 timer, i samsvar med at målcellene elimineres av inhibitoren (Figur 2; hvite piler). Se diskusjonsdelen hvis du vil ha mer informasjon om tolking av avrundings- eller lysingsmålceller. I figur 2Bble den samme myntkubasjonen oppdaget på et lysbilde, denne gangen uten å konsentrere den blandede kulturen slik at cellene forble spredt og det var minimal kontakt mellom stammer på lysbildet. Her observeres ingen målceller for å forsvinne eller runde, noe som tyder på at målstammen ikke ble hemmet i denne behandlingen. Figur 2C og figur 2D viser de samme overfylte og spredte behandlingene som er beskrevet ovenfor, denne gangen ved hjelp av et T6SS-mutant som inhibitorstammen. Målceller ble ikke observert å forsvinne eller runde når coincubated med en T6SS mutant i enten overfylte eller spre forhold, igjen tyder på at målet ikke ble hemmet i noen av behandlingene.
Figur 3 viser arbeidsflyten for FIJI-analyse som brukes til å kvantifisere konkurranse i denne protokollen. Et representativt bilde fra målkanalen ble valgt (Figur 3A) og en binær maske ble opprettet ved hjelp av standard terskelinnstillinger i FIJI (Figur 3B). Bildeskalaen ble riktig angitt for dette mikroskopioppsettet. Partikler ble analysert ved hjelp av størrelsesparameteren = 0 - uendelig, sirkularitetsparameter = 0,00 - 1,00, og Vis disposisjoner ble valgt (Figur 3C). Resultatene av denne partikkelanalysen vises både som en nummerert omriss av hver partikkel (figur 3D), og som en tabell med kolonner for partikkelnummer, filnavn (etikett) og partikkelområde i μm2 (område) (Figur 3E).
I figur 4vises og analyseres data hentet fra figur 3E. I figur 4Apresenteres prosentandelen av det opprinnelige målområdet ved siste tidspunkt for hver behandling i henhold til trinn 8.2. Hvis prosenten av det opprinnelige målområdet er større enn 100, representerer dette netto økning i målet (dvs. vekst) og observeres under forhold der målpopulasjonen ikke er signifikant hemmet. Men hvis prosentandelen av det opprinnelige målområdet er lavere enn 100, indikerer dette resultatet en netto reduksjon i målet (dvs. død) og observeres under forhold der målpopulasjonen er betydelig hemmet. Når målet ble coincubated med en wild-type inhibitor i overfylte forhold, viser dataene en netto nedgang i målområdet. Til sammenligning, når målet ble coincubated med enten en wild-type inhibitor i spredningsforhold eller en T6SS mutant i overfylte eller spre forhold, viser dataene en netto økning i målområdet. Prosentandelen av det opprinnelige målområdet da målet ble coincubated med en wild-type hemmer under overfylte forhold var under 100 og betydelig lavere enn alle andre behandlinger i henhold til en enveis ANOVA etterfulgt av en Tukeys flere sammenligningstest på tvers av alle behandlinger (p < 0,0001). Disse dataene indikerer at målcelledød er avhengig av en funksjonell T6SS i inhibitoren og understreker viktigheten av et eksperimentelt oppsett som tillater tilstrekkelig cellecellekontakt, for å oppdage celledød fra en kontaktavhengig drapsmekanisme.
Figur 4B presenterer prosentandelen av innledende inhibitorområde ved siste tidspunkt for hver behandling. I dette eksemplet ble netto vekst av inhibitorstammen observert på tvers av alle behandlinger. Imidlertid var prosentandelen av det første inhibitorområdet betydelig høyere når en villtypehemmer ble coincubated med målet i overfylte forhold sammenlignet med alle andre behandlinger i henhold til en enveis ANOVA etterfulgt av en Tukeys multisammenligningstest på tvers av alle behandlinger (p < 0,0001). I utgangspunktet vurderte vi at nettoøkningen i inhibitorområdet kan være drevet av økningen i tilgjengelig plass å vokse inn i etter hvert som målceller elimineres. Imidlertid ble den samme økningen i inhibitorvekst ikke observert i spredningsbehandlinger, hvor inhibitorceller hadde plass til å vokse fra begynnelsen av mynteubasjonen. Alternativt kan dette resultatet tyde på at næringsstoffer frigjort fra lysingsmålceller gir en større økning i hemmerpopulasjonen. Samlet sett antyder disse resultatene at inhibitorstammen eliminerer målet på en T6SS-avhengig måte bare når høy cellecellekontakt blir tvunget av trengselceller på lysbildet.
Figur 1: Klargjøring av agarosepute og lysbildeoppsett for myntsubasjonsanalyser. (A) Oppsett for å lage 2 % agaroseputer. Fem lag med lab tape (grønn) er pakket rundt et deksel slip på to punkter ca 20 mm fra hverandre. Deretter pipetteres varme 2% agarose i mPBS (gul) mellom tapestykkene og umiddelbart dekket med en 25 mm2 dekselglidning og får lov til å størkne i minst 1 time ved romtemperatur. Bruk et barberblad til å kutte agaroseputen i ~ 5 mm2 stykker og bruk pinsett til å overføre puten til et nytt lysbilde for avbildning. (B) Når du ser på et oppreist mikroskop, plasserer du den 5 mm2 agaroseputen direkte på lysbildet, fulgte blandet kultur (blå) og en 12 mm rundskriv #1,5 dekselglidning. (C) Ved avbildning på et invertert mikroskop, se den blandede kulturen direkte på #1,5 glassdeksel slip bunnen av en 35 mm Petri tallerken, og plasser en agarose pad på toppen av kulturen etterfulgt av en andre 12 mm sirkulær deksel slip for å flate ut agarose pad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tidsforløpbilder av myntkubasjonspunkter i enten overfylte eller spredte forhold. (A) Representative bilder ved første og siste tidspunkt der en blandet kultur av mål og wild-type inhibitor var konsentrert 3x før spotting på lysbildet for å tvinge cellecellekontakt mellom stammer. Hvite piler i TRITC-kanalen indikerer eksempler på målceller som runder eller lyser gjennom hele eksperimentet. (B) Representative bilder der en blandet kultur av mål og wild-type inhibitor ble oppdaget uten å konsentrere seg slik at cellene er spredt og det er minimal cellecellekontakt mellom stammer. Grå piler i FITC- og TRITC-kanaler indikerer eksempler på celledeling i løpet av eksperimentet. (C) Representative bilder der blandet målkultur og T6SS- mutant var konsentrert 3x før spotting på lysbildet for å tvinge cellecellekontakt mellom stammer. (D) Representative bilder der blandet målkultur og T6SS- mutant ble oppdaget uten å konsentrere seg slik at cellene spres og det er minimal cellecellekontakt mellom stammer. Skalalinjer = 5 μm og er konsekvente på tvers av alle bilder. TRITC-kanalen er falskt farget magenta, FITC-kanalen er falskfarget grønn. Dekonvolusjon ble utført på alle bilder; bakgrunnen ble trukket fra, og lysstyrke/kontrast justeres jevnt på tvers av alle bilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Arbeidsflyt forFIJI-analyse. (A) Representativt bilde for analyse. Denne arbeidsflyten gjentas for begge kanaler på tvers av alle synsfelt og eksempler. Skalalinjer = 5 μm og er konsekvente på tvers av alle bilder. TRITC-kanalen er falskt farget magenta, FITC-kanalen er falskfarget grønn. (B) Binær maske opprettet ved å terskelstille bildet ved hjelp av standardinnstillingene i FIJI. (C) Eksempel på innstillinger for partikkelanalyse som brukes i dette manuskriptet. Størrelsesområde = 0 - uendelig μm2; sirkularitet = 0,00 - 1,00; show = konturer. (D) Partikkelomriss opprettet som en utgang av partikkelanalyse i (C). Partikkelomrisset i (D) bør sammenlignes med det opprinnelige bildet (A) for å sikre at alle cellene ble fanget opp i partikkelanalysen. (E) Resultattabell opprettet som en utgang fra partikkelanalyse i (C). Objektnummer (kolonne 1) tilsvarer individuelle partikler (én eller flere celler) som er omrisset og merket med rødt i panelet (D). Etikett = filnavn for analysert bilde. Areal = totalt partikkelområde i μm2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempeldata for å vurdere om målstammen er hemmet. Prosentandelen av det opprinnelige området på det siste tidspunktet for målstammen (A) og inhibitorstammen (B), ved forskjellige innledende celletettheter. Lysbildetetthet angir enten en startcelletetthet som er overfylt (høy cellekontakt mellom stammer) eller mer spredning (lav cellekontakt mellom stammer) som beskrevet i figur 2. Inhibitorgenotype indikerer at enten en villtype eller T6SS-mutantstammen (T6SS-) ble coincubated med målstammen. Stjerner indikerer en signifikant forskjell i % endring som sammenligner alle behandlinger (enveis ANOVA etterfulgt av en Tukeys multipareringstest som sammenligner alle behandlinger; (p < 0,0001). Stiplet linje angir ingen bevegelse i strekkområdet mellom det første og siste tidspunktet. en % endring > 100 indikerer netto økning (dvs. vekst) og % endring < 100 indikerer netto reduksjon (dvs. celledød). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor gir et kraftig verktøy for kvantifisering og karakterisering av interbakteriell konkurranse på encellet nivå. Denne analysen, som ble utviklet ved å endre vår CFU-baserte konkurranseanalyse på agarplater1,2, tillatt for visualisering av encellet konkurranse blant V. fischeri isolerer og forslag er gitt for å optimalisere metoden for et bredt spekter av systemer og mikroskopioppsett. Selv om metoden beskrevet her ble optimalisert for lysorganet symbiont V. fischeri, kan den lett modifiseres for å imøtekomme mange forskjellige, dyrkbare mikrober. Det er viktig å merke seg at konkurransemekanismer kan reguleres av et hvilket som helst antall miljøvariabler, inkludert temperatur, saltholdighet og viskositet30,31,32,33,34. Tidligere arbeid har bekreftet at V. fischeri konkurrerer ved hjelp av et kontaktavhengig Type VI-sekresjonssystem som er aktivt på overflate30, noe som gjør forholdene beskrevet i denne analysen egnet for å studere konkurranse mellom eksempelstammene. Det er også viktig å vurdere den første tettheten av celler på lysbildet når du kvantifiserer bakteriell konkurranse. Gitt at kontakt mellom mål- og inhibitorceller ofte er nødvendig for at drap skal skje, bør den blandede kulturen konsentreres slik at cellecellekontakten maksimeres og cellene forblir i et enkelt plan på lysbildet. Cellekulturer bør dyrkes til en lignende optisk tetthet (midtloggfase) og deretter konsentreres for å tvinge kontakt i stedet for bare å vokse kulturer til en høyere optisk tetthet på grunn av de fysiologiske endringene i celler i forskjellige vekstfaser. I andre systemer kan det hende at kulturforhold og det eksperimentelle oppsettet må endres for å sikre at konkurransemekanismen er aktiv og kan oppdages i myntkuubasjonstilstanden.
Agaroseputene som brukes i denne analysen gir flere fordeler: de gir stabilisering slik at cellene ikke beveger seg fritt, og de forhindrer kulturen i å tørke ut i løpet av eksperimentet. I tillegg, hvis kjemiske indusere, som isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), kreves for eksperimentet, kan de lett legges til agaroseløsningen. Det er imidlertid viktig å merke seg at agarosepreparatet sannsynligvis må justeres for forskjellige systemer. I eksemplet beskrevet ovenfor ble agaroseputen utarbeidet ved å oppløse 2% agarose (w / v) i 20 psu mPBS, som er standard saltholdighet som brukes i V. fischeri vekstmedium. Videre kan det i noen tilfeller hende at en karbonkilde må legges til agaroseputen for at cellene skal vokse og konkurrere om lengre eksperimenter. I et slikt tilfelle kan mPBS i agarose pads erstattes med ethvert vekstmedium, selv om næringsstoffene i vekstmediet kan komme med avveining av ekstra bakgrunnsfluorescens.
Uten proprietær bildeanalyseprogramvare kan det være svært vanskelig å få individuelle celletall når cellecellekontakten er høy, noe som vi viser her er nødvendig for å observere kontaktavhengig drap. Denne analysen ble utformet for å gi en alternativ metode for kvantifisering som ikke er avhengig av individuelle celleantall. I stedet brukes det totale celleområdet for hver fluorescenskanal til å kvantifisere omfanget av drap mellom myntkubaterte stammer. Fordi denne metoden er avhengig av område i stedet for individuelle celleantall, er standard terskelinnstillinger vanligvis tilstrekkelige til å skissere det totale celleområdet. Nøyaktigheten av terring kan verifiseres ved å dele det totale objektområdet for et representativt synsfelt med den gjennomsnittlige cellestørrelsen for modellorganismen og sammenligne dette estimerte cellenummeret med et manuelt celleantall for det samme bildet.
I mynter mellom en inhibitor og en målstamme (ikke-morderisk) forutses netto vekst av inhibitoren. Som sett i figur 4, kan hemmerveksten være betydelig høyere i behandlinger der drap observeres, sammenlignet med behandlinger der drap ikke observeres, kanskje fordi næringsstoffer frigjort av lysende målceller tillater inhibitorstammen å vokse raskere. I eksemplet som vises her, observeres netto måldød fordi T6SS-mediert konkurranse resulterer i målcellelys der målet er fysisk eliminert. Det er imidlertid viktig å merke seg at ikke alle konkurransemekanismer resulterer i fysisk eliminering av målceller. Hvis et mål er ufør av et giftstoff som forårsaker veksthemming, kan protokollen som er skissert her føre til at den synlige målpopulasjonen forblir stabil over tid, da målcellene ikke lenger vokser, men heller ikke lyser. I et slikt tilfelle vil det være hensiktsmessig å sammenligne resultatene av denne analysen med oppfølgingstester for målcelle levedyktighet, for eksempel plating for kolonidannende enheter (CFUer) eller ved å utføre levende døde analyser ved å fargelegge med propidiumjodid eller SYTOX grønn35,36.
Sammenlignet med myntkubasjonsanalyser som er avhengige av CFU-tellinger, gjør denne analysen det mulig å observere og kvantifisere konkurransestrukturen mellom stammer og sporendringer i målcellemorfologi over tid. For eksempel er inhibitorceller som dreper ved hjelp av en T6SS kjent for å kode LysM-domeneproteiner som forringer målcelleveggen, noe som resulterer i første celleavrunding og deretter lysis13, som vi observerte i eksemplet vist i figur 2A. Videre kan denne protokollen brukes til å spore konkurranse med høy oppløsning over svært korte tidsskalaer. I eksemplet som vises her, observeres en betydelig reduksjon i målområdet etter bare to timer når cellene er overfylte og cellecellekontakten tvinges mellom stammer (figur 4). Bildeanalysen beskrevet her kan også utføres ved hjelp av konfektmikroskopi, noe som vil gjøre det mulig å studere bakteriell konkurranse in vivo eller i komplekse biofilmer, uten å forstyrre den romlige fordelingen av myntkubaterte stammer.
Oppsummert har analysen beskrevet her som mål å gi en tilgjengelig og lett modifisert tilnærming for visualisering og kvantifisering av bakteriell konkurranse på encellet nivå ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Denne metoden kan brukes på forskjellige bakterieisolasjoner og kan brukes til å visualisere bakteriell konkurranse selv i komplekse miljøer som i en verts- eller biofilmmatrise.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
A.N.S ble støttet av NIGMS grant R35 GM137886 og S.N.S ble støttet av National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 uL single channel pipette | |||
| 1000 uL single channel pipette | |||
| 20 uL single channel pipette | |||
| 200 uL single channel pipette | |||
| Agarose | Fisher | BP165-25 | Low melting agarose |
| Calculator | |||
| Cellvis 35 mm Dish | Fisher | NC0409658 | #1.5 cover glass bottom |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Fisher | EN62248 | optional (if not using stable plasmids) |
| FIJI image analysis sofware | ImageJ | https://imagej.net/Fiji/Downloads | open-source software |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher | 12-545-81P | #1.5 cover glass; 12 mm diameter |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Lens Cleaning Tissue Paper | Fisher | S24530 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Petri Plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Razor Blades | Fisher | S65921 | |
| Semi-micro Cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| Spectrophotometer | |||
| SYBR Green Nucleic Acid Stain | Fisher | S7563 | optional (if not using stable plasmids) |
| Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides | Fisher | 12-518-100B | |
| Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass | Fisher | 22-050-235 | #1.5 cover glass, 25 mm2 |
| Type F Immersion Oil | Fisher | NC0297589 | |
| Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software | Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. | ||
| Vortex | |||
| Water bath | Used to keep agarose warm prior to pipetting | ||
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
| mPBS (marine PBS) | Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad | ||
| 10X PBS | Fisher | ICN1960454 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS1-160P | Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here |
| Sterile Vacuum Filter Units | Fisher | SCGVU01RE | Used to filter-sterilize mPBS |
| Vacuum pump | Used to filter-sterilize mPBS |
References
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (36), 8528-8537 (2018).
- Speare, L., Septer, A. N. Coincubation assay for quantifying competitive interactions between Vibrio fischeri isolates. Journal of Visualized Experiments. (149), e59759 (2019).
- Frost, I., et al. Cooperation, competition and antibiotic resistance in bacterial colonies. The ISME journal. 12 (6), 1582-1593 (2018).
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial communities: interactions to scale. Frontiers in Microbiology. 7, 1234 (2016).
- Souza, D. P., et al. Bacterial killing via a type IV secretion system. Nature Communications. 6 (1), 1-9 (2015).
- Anderson, M. C., Vonaesch, P., Saffarian, A., Marteyn, B. S., Sansonetti, P. J. Shigella sonnei encodes a functional T6SS used for interbacterial competition and niche occupancy. Cell Host and Microbe. 21 (6), 769-776 (2017).
- Basler, M., Ho, B., Mekalanos, J. Tit-for-tat: Type VI secretion system counterattack during bacterial cell-cell interactions. Cell. 152 (4), 884-894 (2013).
- Guillemette, R., Ushijima, B., Jalan, M., Häse, C. C., Azam, F. Insight into the resilience and susceptibility of marine bacteria to T6SS attack by Vibrio cholerae and Vibrio coralliilyticus. PloS One. 15 (1), 0227864 (2020).
- Hachani, A., Lossi, N. S., Filloux, A. A visual assay to monitor T6SS-mediated bacterial competition. Journal of Visualized Experiments. (73), e50103 (2013).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Ruhe, Z. C., Low, D. A., Hayes, C. S. Bacterial contact-dependent growth inhibition. Trends in Microbiology. 21 (5), 230-237 (2013).
- Wood, D. W., Pierson, L. S. The phzI gene of Pseudomonas aureofaciens 30-84 is responsible for the production of a diffusible signal required for phenazine antibiotic production. Gene. 168 (1), 49-53 (1996).
- Smith, W. P., et al. The evolution of the type VI secretion system as a disintegration weapon. PLoS Biology. 18 (5), 3000720 (2020).
- Chen, L., Zou, Y., She, P., Wu, Y. Composition, function, and regulation of T6SS in Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research. 172, 19-25 (2015).
- Sana, T. G., Lugo, K. A., Monack, D. M. T6SS: The bacterial "fight club" in the host gut. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006325 (2017).
- Basler, M. Type VI secretion system: secretion by a contractile nanomachine. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1679), 20150021 (2015).
- Joshi, A., et al. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in Microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 589-600 (2016).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of Bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Septer, A. N. The Vibrio-squid symbiosis as a model for studying interbacterial competition. Msystems. 4 (3), (2019).
- Tischler, A. H., Hodge-Hanson, K. M., Visick, K. L. Vibrio fischeri-squid symbiosis. eLS. , 1-9 (2019).
- Mandel, M. J., Dunn, A. K. Impact and influence of the natural Vibrio-squid symbiosis in understanding bacterial-animal interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1982 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Boettcher, K., Ruby, E. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna Scolopes. Journal of Bacteriology. 172 (7), 3701-3706 (1990).
- Doino, J. A., McFall-Ngai, M. J. A transient exposure to symbiosis-competent bacteria induces light organ morphogenesis in the host squid. The Biological Bulletin. 189 (3), 347-355 (1995).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environmental Microbiology. 6 (7), 726-732 (2004).
- Koch, B., Jensen, L. E., Nybroe, O. A panel of Tn7-based vectors for insertion of the gfp marker gene or for delivery of cloned DNA into Gram-negative bacteria at a neutral chromosomal site. Journal of Microbiological Methods. 45 (3), 187-195 (2001).
- Peterson, B. W., Sharma, P. K., Van Der Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial cell surface damage due to centrifugal compaction. Applied and Environmental Microbiology. 78 (1), 120-125 (2012).
- Speare, L., Smith, S., Salvato, F., Kleiner, M., Septer, A. N. Environmental viscosity modulates interbacterial killing during habitat transition. MBio. 11 (1), (2020).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), 61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (34), 5044-5051 (2016).
- Bachmann, V., et al. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (8), 0004031 (2015).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and Immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15 (1), 36 (2015).
