ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग कर कारावास में उपकोशिकीय यांत्रिकी के प्रत्यक्ष बल माप

Summary

यहां, हम एक ऑप्टिकल ट्रैप द्वारा प्रत्यक्ष बल माप के साथ तीन आयामी कारावास में अलग-थलग भ्रूण जेब्राफ़िश कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर यांत्रिक गुणों की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

एक बहुकोशिकीय जीव के विकास के दौरान, एक एकल निषेचित कोशिका विभाजित होती है और विविध कार्यों के साथ कई ऊतकों को जन्म देती है। ऊतक morphogenesis एकल सेल स्तर पर आणविक और संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ हाथ में चला जाता है जिसके परिणामस्वरूप उपकोशिकीय यांत्रिक गुणों की विविधताएं होती हैं। नतीजतन, यहां तक कि एक ही सेल के भीतर, विभिन्न ऑर्गेनेल और डिब्बे यांत्रिक तनाव के लिए अलग-अलग विरोध करते हैं; और mechanotransduction pathways सक्रिय रूप से उनके यांत्रिक गुणों को विनियमित कर सकते हैं। ऊतक आला के माइक्रोएन्वायरमेंट के अनुकूल होने के लिए एक सेल की क्षमता इस प्रकार यांत्रिक तनावों को समझने और प्रतिक्रिया करने की क्षमता के कारण भाग में है। हमने हाल ही में एक नया मेकेनोसेंसेशन प्रतिमान प्रस्तावित किया है जिसमें परमाणु विरूपण और पोजिशनिंग एक सेल को भौतिक 3 डी वातावरण को मापने में सक्षम बनाता है और सेल के आकार में परिवर्तन को डिकोड करने के लिए प्रोप्रियोसेप्शन की भावना के साथ सेल को संपन्न करता है। इस लेख में, हम उन बलों और भौतिक गुणों को मापने के लिए एक नई विधि का वर्णन करते हैं जो जीवित कोशिकाओं के अंदर सेल नाभिक को आकार देते हैं, जो अनुयायी कोशिकाओं और यांत्रिक रूप से सीमित कोशिकाओं पर उदाहरण देते हैं। माप को कोशिकाओं के अंदर ऑप्टिकल ट्रैप के साथ गैर-आक्रामक रूप से किया जा सकता है, और बल सीधे प्रकाश गति के अंशांकन-मुक्त पहचान के माध्यम से सुलभ होते हैं। यह कोशिका सतह विरूपण से स्वतंत्र रूप से नाभिक के यांत्रिकी को मापने और बहिर्ग्रहणशील और इंटरोसेप्टिव मेचानोट्रांसडक्शन मार्गों के विच्छेदन की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से, ट्रैपिंग प्रयोग को साइटोस्केलेटन, कैल्शियम आयनों या परमाणु आकृति विज्ञान के प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके सेलुलर प्रतिक्रिया और उपकोशिकीय गतिशीलता की जांच करने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा जा सकता है। प्रस्तुत विधि लागू करने के लिए सीधी है, बल माप के लिए वाणिज्यिक समाधानों के साथ संगत है, और आसानी से अन्य उपकोशिकीय डिब्बों के यांत्रिकी की जांच करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया, तनाव-फाइबर और एंडोसोम।

Introduction

ऊतक मॉर्फोजेनेसिस एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें जैव रासायनिक संकेतों और भौतिक बलों को spatiotemporally समन्वित किया जाता है। विकासशील भ्रूण में, जैव रासायनिक सिग्नलिंग कारकों के ग्रेडिएंट भाग्य विनिर्देशन को निर्देशित करते हैं और सही ऊतक पैटर्निंग ^1,2 सुनिश्चित करते हैं। एक ही समय में, आंतरिक और बाह्य बल भ्रूण ^3,4 की वास्तुकला के निर्माण में एक भूमिका निभाते ^हैं। इस संदर्भ में सेल कॉर्टेक्स यांत्रिकी के प्रभाव का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया ^है5,6। मॉर्फोजेनेसिस के दौरान मेचानो-रासायनिक प्रक्रियाओं के बीच तंग इंटरकनेक्शन एकल कोशिकाओं के गुणों पर निर्भर करता है ताकि वे अपने ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट में यांत्रिक बलों को समझ सकें और उनका जवाब दे सकें। कोशिकाएं, इस प्रकार बल-संवेदनशील उपकोशिकीय और आणविक तत्वों की उपस्थिति के माध्यम से यांत्रिक संकेतों को डीकोड करती हैं जो यांत्रिक जानकारी को सेल व्यवहार, सेल भाग्य और सेल यांत्रिकी को नियंत्रित करने वाले विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों में ट्रांसड्यूस करती हैं।

विकास प्रक्रियाओं की एक पहचान यह है कि कोशिकाएं बहुकोशिकीय संरचनाओं के निर्माण के लिए समूहों के रूप में व्यवस्थित होती हैं। इस प्रकार, एकल कोशिकाएं शायद ही कभी पुनर्व्यवस्थित होती हैं और अकेले चलती हैं, लेकिन एक तंग सोशियोटॉप में जुड़ी होती हैं जिसमें वे सामूहिक व्यवहार दिखाते हैं जैसे कि सुप्रासेलुलर माइग्रेशन ⁷, (संयुक्त राष्ट्र) जैमिंग ^{संक्रमण8,9} या ब्लास्टोसिस्ट संघनन ¹⁰। कोशिकाओं के भीतर और उनके बीच उत्पन्न यांत्रिक बल सामूहिक सेल गतिशीलता ^7,11 को निर्देश देने के लिए महत्वपूर्ण संकेतों के रूप में कार्य करते हैं। लेकिन यहां तक कि जब कोशिकाएं अकेले चलती हैं, जैसे कि पूर्वज कोशिकाएं जो ऊतक शीट या संकीर्ण ऊतक niches के बीच अपना रास्ता निचोड़ती हैं, तो वे तीन आयामी वातावरण को नेविगेट करते समय व्यापक अनिसोट्रोपिक यांत्रिक बलों का अनुभव करते हैं। कोशिकाओं पर इन यांत्रिक तनावों के सेलुलर व्यवहार पर गहरा परिणाम होता ^है12,13। कई तंत्रों की जांच की गई है जो नाभिक पर एक प्रमुख मेचानोट्रांसडक्शन तत्व ^14,15 के रूप में अभिसरण करते हैं, एक घने 3 डी ऊतक वातावरण ^15,16 के भीतर प्रवास के दौरान निष्क्रिय या सक्रिय यांत्रिक तत्व के रूप में।

हमने हाल ही में एक तंत्र प्रस्तावित किया है जो कोशिकाओं को एक लोचदार इंट्रासेल्युलर मेचानो-गेज ¹² के रूप में नाभिक का उपयोग करके आकार विरूपण को मापने के लिए लैस करता है। नाभिक, एक कोशिका में सबसे बड़ा ऑर्गेनेल होने के नाते, बड़े विरूपण से गुजरता है जब कोशिकाएं ध्रुवीकरण करती हैं, माइग्रेट करती हैं, या यांत्रिक खिंचाव, कारावास, या आसमाटिक तनाव ^{16,17,18,19 के} तहत अपने आकार को बदल देती ^हैं। हमने पाया कि नाभिक की इंट्रासेल्युलर स्थिति के साथ-साथ परमाणु लिफाफा खिंचाव कोशिकाओं को कोशिका विरूपण के परिमाण और प्रकार (जैसे सेल संपीड़न बनाम सेल सूजन) के बारे में जानकारी प्रदान करता है। नाभिक का खिंचाव आंतरिक परमाणु झिल्ली (आईएनएम) के एक खुलासे के साथ जुड़ा हुआ है, जो आईएनएम में कैल्शियम-निर्भर सीपीएलए 2 (साइटोसोलिक फॉस्फोलिपिस ए 2) लाइपेस गतिविधि को बढ़ावा देता है, जिसके बाद अराकिडोनिक एसिड (एए) की रिहाई और सेल कॉर्टेक्स में मायोसिन II की तेजी से सक्रियण होती है। यह कॉर्टिकल संकुचन ⁶ की दहलीज से ऊपर सेल संकुचन और अमीबोइड सेल माइग्रेशन में वृद्धि की ओर जाता है। सेल विरूपण के लिए mechanosensitive प्रतिक्रिया एक मिनट से भी कम समय में होती है और कारावास रिलीज पर प्रतिवर्ती होती है, यह सुझाव देते हुए कि नाभिक यांत्रिक तनाव की स्थिति में अनुकूली सेल व्यवहार को विनियमित करने वाले सेलुलर प्रोप्रियोसेप्शन के लिए एक तनाव गेज के रूप में कार्य करता है। इस mechanosensitive मार्ग को ज़ेब्राफ़िश भ्रूण से व्युत्पन्न पूर्वज स्टेम कोशिकाओं में सक्रिय दिखाया गया है, दोनों प्लुरिपोटेंट और वंश-प्रतिबद्ध कोशिकाओं में ¹² और विभिन्न प्रजातियों और सेल लाइनों ²⁰ में संरक्षित है।

एक सेल-मेचानोसेंसर के रूप में परमाणु गुणों के अलावा, परमाणु वास्तुकला और यांत्रिकी को विकास के दौरान और सेल भाग्य विनिर्देश ²¹ के जवाब में आंतरिक रूप से विनियमित किया जाता है, इसलिए सेलुलर मेचानो-संवेदनशीलता ^22,23 को ट्यूनिंग किया जाता ^है। परिणाम परमाणु अनुपालन में एक परिवर्तन हो सकता है जो एक प्रवासी राज्य में एक पूर्वव्यापी से रूपात्मक परिवर्तन और संक्रमण की अनुमति देता है और इसके विपरीत^।

सेल नाभिक यांत्रिकी को मापने के लिए कई तकनीकों को लागू किया गया है, जैसे कि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी ^24,25, माइक्रोपिपेट आकांक्षा ^26,27, माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी ²⁸, और माइक्रोनीडल29। हालांकि, इनमें से कई तकनीकें इस अर्थ में आक्रामक हैं कि पूरे सेल को विकृत किया जाना चाहिए, यांत्रिक विशेषताओं और नाभिक की बल-निर्भर प्रतिक्रियाओं के माप को सीमित करना। सेल की सतह और इसके मेकानोसेंसिटिव सेल कॉर्टेक्स ³⁰ के एक साथ विरूपण को दरकिनार करने के लिए, विभिन्न संदर्भों ^31,32 में अलग-थलग नाभिक का अध्ययन किया गया था। हालांकि, इस बात से इनकार नहीं किया जा सकता है कि परमाणु अलगाव यांत्रिक नाभिक गुणों और उनके विनियमन (संदर्भ ²⁴ और स्वयं के अप्रकाशित अवलोकनों) में बदलाव के साथ जुड़ा हुआ है।

ऑप्टिकल चिमटी (ओटी) एक बहुमुखी तकनीक है जिसने सेल मेचानोबायोलॉजी में प्रयोगों की अधिकता की अनुमति दी है और हमारी समझ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कि आणविक मशीनें रासायनिक को यांत्रिक ऊर्जा में कैसे परिवर्तित करती ^{हैं33,34}। ऑप्टिकल चिमटी एक कसकर केंद्रित लेजर बीम का उपयोग ढांकता हुआ कणों पर ऑप्टिकल बलों को लागू करने के लिए करती है जिसमें आसपास के माध्यम ³³ की तुलना में एक अपवर्तक सूचकांक अधिक होता है। इस तरह के बल सैकड़ों पिको-न्यूटन के क्रम के हो सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप लेजर ट्रैप फोकस के भीतर कण का प्रभावी कारावास हो सकता है, जिससे तीन आयामों में फंसे हुए कण के हेरफेर को सक्षम किया जा सकता है। प्रकाश के उपयोग का एक महत्वपूर्ण लाभ है कि माप को जीवित कोशिकाओं के अंदर गैर-आक्रामक रूप से किया जा सकता है। ऑप्टिकल जोड़तोड़ आगे लेजर बीम के जाल फोकस तक सीमित हैं। इसलिए, हेरफेर आसपास के सेलुलर झिल्ली को उत्तेजित किए बिना किया जा सकता है और प्लाज्मा झिल्ली पर एक्टिन कॉर्टेक्स या मेकेनोसेंसिटिव प्रक्रियाओं को परेशान नहीं करता है, जैसे कि आयन चैनलों का बल-निर्भर सक्रियण।

ऑप्टिकल चिमटी दृष्टिकोण की कठिनाई शास्त्रीय दृष्टिकोण का उपयोग करके माइक्रोस्फीयर पर लागू बलों को ठीक से निर्धारित करना है जो समविभाजन प्रमेय के आधार पर अप्रत्यक्ष बल अंशांकन पर भरोसा करते हैं या लेजर-पावर निर्भर भागने के बल को मापने के लिए परिभाषित स्टोक्स-ड्रैग बलों के उपयोग पर भरोसा करते ^हैं। जबकि ये तरीके इन विट्रो प्रयोग में लागू करने के लिए सरल हैं, उन्हें आमतौर पर सेलुलर वातावरण में अनुवाद ति नहीं किया जा सकता है। इस क्षेत्र में कई रणनीतियों को पेश किया गया है जो एक प्रत्यक्ष बल अंशांकन पर भरोसा करते हैं, जो गति संरक्षण के पहले सिद्धांतों से व्युत्पन्न ^{हैं36,37}। अन्य बल स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोणों के विपरीत, बल माप को मनमाने ढंग से आकार के फंसे हुए कण ^38,39 के साथ प्रकाश गति के स्थानीय इंटरचेंज से निकाला जाता ^है। हमारे प्रयोगात्मक सेट-अप में, ऑप्टिकल बलों से उत्पन्न प्रकाश संवेग में परिवर्तन को सीधे सीटू ट्रैप कैलिब्रेशन ^40,41,42,43 की आवश्यकता के बिना मापा जाता ^है। इस प्रकार, माप एक चिपचिपा वातावरण में संभव हो जाते हैं जैसे कि सेल के इंटीरियर या यहां तक कि एक ऊतक के भीतर भी, और बलों को आसानी से पीएन स्तर तक मापा जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक परख का वर्णन करने के लिए यंत्रवत् इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल या संरचनाओं में हेरफेर और मात्रात्मक रूप से एक ऑप्टिकल चिमटी सेट-अप द्वारा उनके यांत्रिक गुणों का आकलन. इस सेट-अप को एक कताई डिस्क फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में एकीकृत किया जाता है जो सेलुलर व्यवहार या इंट्रासेल्युलर गतिशीलता के समानांतर इमेजिंग को सक्षम करता है। परख विशिष्ट सेलुलर डिब्बों के यांत्रिक गुणों के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, जैसे कि नाभिक, जबकि एक साथ विरूपण के परिणामस्वरूप आणविक सिग्नलिंग मार्गों के संभावित मेकेनोरेस्पोन्स और सक्रियण का अध्ययन करता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के भीतर इंजेक्ट किए गए माइक्रोबीड्स के ऑप्टिकल ट्रैपिंग नाभिक के आंतरिक ^{अपवर्तक विपरीत (} एन ~ 1.35) बनाम साइटोप्लाज्म (एन ~ 1.38) की तुलना में पॉलीस्टीरीन मनका (एन = 1.59) के काफी अधिक अपवर्तक सूचकांक के लिए इंडेंटेशन बल में वृद्धि की अनुमति देता है। प्रस्तुत रणनीति को अन्य इंट्रासेल्युलर संरचनाओं और ऑर्गेनेल के अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही साथ सक्रिय माइक्रोरहोलॉजी से जुड़े अन्य दृष्टिकोण, एक ही / विभिन्न उप-सेलुलर संरचनाओं की एक साथ जांच करने के लिए कई ऑप्टिकल ट्रैप का उपयोग, और जीवित भ्रूण में सेल मेकेनोबायोलॉजी को लक्षित करने वाले माप।

Protocol

उपयोग किए गए सभी प्रोटोकॉल को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग नैतिक समिति (PRBB-IACUEC) द्वारा अनुमोदित किया गया है और राष्ट्रीय और यूरोपीय नियमों के अनुसार लागू किया गया है। सभी प्रयोग3आर के सिद्धांतों के अनुसार किए गए थे। Zebrafish (Danio rerio) को बनाए रखा गया था जैसा कि पहले वर्णित किया गया था।

1. पृथक प्राथमिक भ्रूण zebrafish पूर्वज स्टेम कोशिकाओं की तैयारी

1. Micropipette और agarose तैयारी
   नोट:: एक पूर्ण zebrafish भ्रूण microinjection प्रोटोकॉल के लिए, ^reference45 देखें।
   1. एक माइक्रोपिपेट खींचने के साथ, दो सुइयों को प्राप्त करने के लिए एक 1.0 मिमी ग्लास केशिका ^{खींचें45}। परिवहन के दौरान पतली नोक को नुकसान से बचाने के लिए एक प्लेडोग कुशन से जुड़े 150 मिमी पेट्री डिश में या एक इनसाइड-आउट लैब टेप रिंग में अप्रयुक्त सुइयों को स्टोर करें।
   2. E3 में 1% ultrapure agarose पिघल (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM _CaCl2, 0.33 mM _MgSO4) 10 s के लिए एक मानक रसोई / प्रयोगशाला माइक्रोवेव में। मिश्रण को बार-बार कम समय (कुछ सेकंड) के लिए गर्म करें जब तक कि एगरोज पिघल न जाए।
   3. जब agarose पूरी तरह से पिघल जाता है, तो इसे संक्षेप में ठंडा होने दें, और फिर इसे 10 सेमी पेट्री डिश में डालें। धीरे-धीरे त्रिकोणीय microinjection मोल्ड जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) agarose बुलबुले की उपस्थिति से बचने के शीर्ष पर. मोल्ड को धक्का न दें, यह सुनिश्चित करें कि यह agarose सतह पर रहता है।
   4. जब agarose पूरी तरह से solidifies, त्रिकोणीय मोल्ड बहुत धीरे धीरे एक कोमल बल लगाकर agarose में किसी भी ब्रेक से बचने के लिए हटा दें। प्लेट को 2-4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा संग्रहीत किया जा सकता है।
   5. माइक्रोइंजेक्शन से 30 मिनट पहले, प्लेट को फ्रिज से बाहर निकालें और कमरे के तापमान पर स्थिर होने देने के लिए 28 डिग्री सेल्सियस तक ई 3 प्रीवस्ट्रेड जोड़ें।
2. इंजेक्शन मिश्रण तैयारी
   1. इंजेक्शन मिश्रण तैयार करने के लिए, RNase मुक्त पानी में 1: 5 अनुपात में 1 μm microbeads (polystyrene, गैर-फ्लोरोसेंट) पतला।
   2. फ्लोरोसेंट मार्करों की क्षणिक अभिव्यक्ति या पुनः संयोजक जीन निर्माणों की अभिव्यक्ति और / या वांछित एकाग्रता पर मॉर्फोलिनो के सह-इंजेक्शन के लिए एमआरएनए तैयार करें।
      नोट: लेबल करने के लिए प्रति भ्रूण mRNA के 100 पीजी के साथ माइक्रोबीड्स के सह-इंजेक्शन के लिए एक विशिष्ट इंजेक्शन मिश्रण, उदाहरण के लिए, H2A-mCherry के साथ नाभिक है: मोतियों का 1 μL + mRNA का 1 μL (स्टॉक एकाग्रता 1 μg / μL है) + आरएनए मुक्त पानी का 2.5 μL + फिनोल लाल का 0.5 μL (स्टॉक समाधान 0.5%, फिनोल लाल अनिवार्य नहीं है; इसका उपयोग इंजेक्शन ड्रॉप के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया जाता है। ड्रॉप एक अनुभवी प्रयोगकर्ता के लिए भी दिखाई देता है)। आरएनए इंजेक्शन इंजेक्शन भ्रूण का चयन करने के लिए भी उपयोगी हो सकता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोबीड्स को गैर-फ्लोरोसेंट के बजाय इंजेक्ट किया जा सकता है, ताकि उन्हें कल्पना की जा सके।
3. Microinjection सुई लोड हो रहा है और अंशांकन
   1. समय-गेटेड विकल्प का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्टर को चालू करें। इंजेक्शन की मात्रा को ठीक से कैलिब्रेट करने के लिए यह सेटिंग बहुत महत्वपूर्ण है। लगभग 500 ms पर गेटिंग समय सेट करें।
   2. एक माइक्रो लोडर पिपेट का उपयोग करके सुई में इंजेक्शन मिश्रण के 3 μL लोड करें।
   3. माइक्रोमैनिपुलेटर में सुई डालें और कसकर सील करें। जांचें कि क्या माइक्रोमैनिपुलेटर एक अच्छी स्थिति में है और इंजेक्शन प्लेट पर एक्स-वाई दिशा में जाने के लिए पर्याप्त स्वतंत्रता है।
   4. एक माइक्रोमीटर स्लाइड (5 मिमी / 100 डिवीजनों) का उपयोग करके ड्रॉप आकार को मापें, जिसमें शीर्ष ⁴⁵ पर खनिज तेल की एक बूंद होती है और सीधे खनिज तेल में इंजेक्शन मिश्रण की एक बूंद निकलती है।
   5. एक तेज नुकीली नोक उत्पन्न करने के लिए एक खड़ी कोण पर तेज संदंश के साथ सुई फसल। ड्रॉप आकार को 0.1 मिमी तक समायोजित करें, जो इंजेक्ट की गई सामग्री के 0.5 nL के अनुरूप है।
      नोट:: यदि सुई को काटकर, यह मात्रा पार हो जाती है, तो यह एक नई सुई के साथ अंशांकन प्रक्रिया को फिर से करने के लिए अनुशंसित है। माइक्रोइंजेक्टर के गेटिंग समय को ड्रॉप वॉल्यूम से मेल खाने के लिए थोड़ा समायोजित किया जा सकता है; हालांकि, छोटे गेटिंग समय एक बड़े सुई व्यास के अनुरूप होते हैं, जो संभावित रूप से भ्रूण को नुकसान पहुंचाता है।
4. एक कोशिका चरण में ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन
   1. पहली कोशिका विभाजन होने से पहले सीधे एक-कोशिका (युग्मनज) चरण भ्रूण में मनका मिश्रण के माइक्रोइंजेक्शन के लिए निषेचन के तुरंत बाद ज़ेब्राफ़िश भ्रूण एकत्र करें।
      नोट: यह माइक्रोस्फीयर का उचित वितरण और बाद के विकास के चरणों में प्रति सेल कम से कम एक माइक्रोस्फीयर के साथ अलग-थलग ब्लास्टोमेरेस की एक उच्च पर्याप्त उपज सुनिश्चित करता है जिसमें प्रयोग किए जाते हैं (ब्लास्टुला-गैस्ट्रुला चरण)। इंडेंटेशन प्रयोगों को अभी भी किया जा सकता है यदि सेल के भीतर दो गोले हैं, लेकिन जिन कोशिकाओं में कोई मोती नहीं है, उन्हें बाहर रखा जाना चाहिए (भले ही गोले के बिना इंडेंटेशन संभव हो)। इस प्रोटोकॉल में एबी वाइल्डटाइप उपभेदों का उपयोग किया गया था, लेकिन किसी भी अन्य तनाव, उदाहरण के लिए, टीएल का उपयोग किया जा सकता है।
   2. एक सेल चरण भ्रूण (युग्मनज) को एक पूर्वव्यापी त्रिकोणीय आकार के 1% एगारोज़ मोल्ड में रखें, जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है, एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके।
   3. चारों ओर तैरने वाले भ्रूण से बचने के लिए एक ही पिपेट के साथ अतिरिक्त माध्यम निकालें। धीरे से एक ब्रश के माध्यम से त्रिकोणीय मोल्ड में भ्रूण धक्का. सही अभिविन्यास की सुविधा के लिए भ्रूण के बीच में कुछ जगह रखें (चित्रा 1 बी)।
   4. धीरे से भ्रूण को ब्रश के साथ संरेखित करें ताकि भ्रूण पार्श्व रूप से उन्मुख हो सकें, युग्मनज की एक कोशिका स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही है, जैसा कि चित्र 1 बी में दिखाया गया है। माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक आदर्श अभिविन्यास तक पहुंच जाता है जब भ्रूण की एक कोशिका सुई की दिशा (भ्रूण के पशु ध्रुव के माध्यम से इंजेक्शन) का सामना कर रही होती है या विपरीत तरीके से जर्दी सेल (भ्रूण के वनस्पति ध्रुव के माध्यम से इंजेक्शन) का सामना करती है, जैसा कि चित्र 1 सी में दिखाया गया है।
   5. एक हाथ से पकवान पकड़ो और माइक्रोमैनिपुलेटर नियंत्रक का उपयोग करके सुई की नोक को स्थिति में रखने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें। भ्रूण की ओर सुई की नोक को कम करें।
   6. कोरियन को पियर्स करें और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के माध्यम से प्रक्रिया की निगरानी करते हुए सुई के साथ एक-कोशिका भ्रूण में प्रवेश करें। सुई का सही प्लेसमेंट सुनिश्चित करें और इंजेक्शन लगाने के बाद, इंजेक्ट किए गए ड्रॉप का सही स्थान जैसा कि चित्र 1 C में दिखाया गया है।
   7. सभी भ्रूणों के लिए दोहराएं: सुई को ऊपर ले जाएं, अगले भ्रूण के केंद्रित होने तक भ्रूण के साथ पकवान को स्लाइड करें, सुई को कम करें, और इसे इंजेक्ट करें।
   8. एक बार जब भ्रूण के पूरे सेट को इंजेक्ट किया जाता है, तो कुछ ई 3 को फ्लश करके एगारोज़ मोल्ड / पेट्री डिश से भ्रूण को हटा दें और उन्हें प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके एक नए पेट्री डिश में डालें। माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान भ्रूण के सूखने से बचने के लिए इंजेक्शन प्लेट पर पर्याप्त मीडिया रखने की सिफारिश की जाती है।
   9. प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि भ्रूण की वांछित संख्या इंजेक्ट न हो जाए। बीड्स के अधिकतम और सजातीय प्रसार को सुनिश्चित करने के लिए भ्रूण को एक सेल चरण में होना चाहिए।
      नोट: इस प्रक्रिया को प्रारंभिक ब्लास्टुला भ्रूण के लिए अनुकूलित किया गया है और यदि विभिन्न विकास ता्मक चरणों की जांच की जानी है तो संभवतः अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
   10. प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले इंजेक्ट किए गए भ्रूण को लगभग 4 घंटे के लिए या वांछित चरण (चित्रा 1 डी) तक 28-31 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर के अंदर रखें।
       नोट: वैकल्पिक रूप से, भ्रूण को जीवित रहने और विषाक्तता कलाकृतियों को बाहर निकालने के लिए ब्लास्टुला चरण (या वांछित माप समय बिंदु) से परे विकसित होने दें। लार्वा चरणों में, 0.75% agarose में tricaine के साथ anesthetized लार्वा माउंट और विभिन्न ऊतकों में microspheres के वितरण की छवि। स्टॉक समाधान बनाने के लिए, मिश्रण करें: आसुत पानी के 97.9 मिलीलीटर में 400 मिलीग्राम ट्राइकेन पाउडर, 1 एम ट्राइस-बेस (पीएच 9) के लगभग 2.1 एमएल, और पीएच 7 को समायोजित करें। इस समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। एक संवेदनाहारी के रूप में ट्राइकेन का उपयोग करने के लिए, अंडे के माध्यम (या वांछित मीडिया) के 100 मिलीलीटर में स्टॉक समाधान के 4.2 मिलीलीटर को पतला करें; इस मामले में, E3 का उपयोग किया गया था। विवरण के लिए संदर्भ ⁴⁶ से परामर्श करें।

2. एकल सेल तैयारी और धुंधला

1. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके कांच के पकवान में गोले चरण भ्रूण (4 hpf, निषेचन के बाद घंटे) रखें। उन भ्रूणों का चयन करें जो इंजेक्ट किए गए मोतियों के संकेत के लिए सकारात्मक हैं, और जो एमआरएनए इंजेक्शन के मामले में फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं। कुछ भ्रूण उच्च मनका क्लस्टरिंग दिखा सकते हैं और उन्हें बाहर रखा जा सकता है।
   1. संदंश का उपयोग करके भ्रूण को मैन्युअल रूप से डिकोरियोनेट करें। एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके लगभग 10-15 भ्रूण को 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया कंटेनरों में स्थानांतरित करें।
      नोट: जब भ्रूण dechorionated हैं, वे प्लास्टिक के लिए संलग्न हैं, और कांच के बर्तन के उपयोग की आवश्यकता है। ग्लास प्लेट के विकल्प के रूप में, 1% एगारोज़ की पतली परत के साथ एक प्लास्टिक पेट्री डिश का उपयोग किया जा सकता है। मैन्युअल dechorionation एंजाइमेटिक Pronase उपचार पर पसंद किया जाना चाहिए सेल सतह प्रोटीन और यांत्रिक सेल और ऊतक गुणों में संभावित परिवर्तन ों को प्रोटियोलिटिक क्षति को रोकने के लिए, विस्तारित वसूली समय को रोकने के ^लिए47.
2. E3 मीडिया को हटा दें और पूर्व-गर्म _{CO2-स्वतंत्र} ऊतक संस्कृति माध्यम (DMEM-F12; L-glutamine और 15 mM HEPES के साथ, सोडियम बाइकार्बोनेट और फिनोल लाल के बिना 10 इकाइयों पेनिसिलिन और 10 मिलीग्राम / एल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) के 500 μL जोड़ें।
   नोट:: जब तक एक माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर का उपयोग किया जाता है _{CO2-निर्भर} मीडिया का उपयोग न करें। का उपयोग, उदाहरण के लिए, कार्बोनेट-बफ़र्ड स्थितियों में RPMI मीडिया के पीएच में परिवर्तन का कारण बनता है और सेल अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है। एक और महत्वपूर्ण पहलू संस्कृति मीडिया से बचना है जिसमें सीरम होता है। सीरम में लाइसोफॉस्फेटिडिक एसिड (एलपीए) हो सकता है, जो Rho / ROCK मार्ग का एक शक्तिशाली उत्प्रेरक है, जो पूर्वज स्टेम कोशिकाओं में सेलुलर संकुचन और गतिशीलता को नियंत्रित करने में सक्षम ^है। आसमाटिक चुनौतियों से बचने के लिए माध्यम की ऑस्मोलेरिटी को 300 mOsm पर बनाए रखा जाना चाहिए जो परमाणु आकृति विज्ञान या यांत्रिकी ¹² के साथ हस्तक्षेप कर सकता है।
3. मैन्युअल रूप से ट्यूब को धीरे से हिलाकर कोशिकाओं को अलग करें। सुनिश्चित करें कि ट्यूब की सामग्री आंख से दिखाई देने वाले कोई बड़े हिस्से के साथ टर्बिड हो जाती है। कोशिकाओं की क्षति और हानि को कम करने के लिए बुलबुले के गठन से बचें।
4. 3 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। गोली स्पष्ट रूप से दिखाई देनी चाहिए।
5. supernatant निकालें और नीचे दिए गए चरणों में से एक का पालन करें।
   1. यदि कोई धुंधला करने की आवश्यकता नहीं है, तो DMEM के 500 μL जोड़ें। गोली पर एक तरल जेट को लक्षित करके धीरे से एक 200 μL पिपेट के साथ resuspend. कोशिकाओं पर अत्यधिक कतरनी बल न लगाएं। फोमिंग कोशिकाओं को नुकसान का संकेत देता है।
   2. Hoechst जैसे डीएनए रंगों के साथ नाभिक को लेबल करने के लिए, अंतिम एकाग्रता के 1,μg / mL प्राप्त करने के लिए DMEM के 1,000 μL में डीएनए-Hoechst (स्टॉक 2 मिलीग्राम / एमएल) के 0.5 μL को मिलाएं। कोशिकाओं के लिए इस धुंधला समाधान के 500 μL जोड़ें और धीरे से resuspend. अंधेरे में 7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
   3. एक फ्लोरोसेंट रासायनिक कैल्शियम संकेतक Calbryte-520 के साथ कोशिकाओं को दाग करने के लिए, DMEM में 5 μM एकाग्रता के लिए Calbryte-520 जोड़ें। अंधेरे में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट:: चरण 2.5.2 और 2.5.3 में इंगित प्रोटोकॉल इन विशिष्ट उत्पादों के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है। निर्माता द्वारा इंगित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अन्य धुंधला किया जा सकता है।
6. सेंट्रीफ्यूज फिर से चरण 2.4 के रूप में एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर; supernatant को हटाने के लिए, और धीरे से कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए नमूनों के लिए DMEM के 50 μL या कारावास में कोशिकाओं के लिए DMEM के 20 μL में (क्लस्टर के गठन से बचने के लिए) resuspend.

3. polydimethylsiloxane (PDMS) रिक्ति का उपयोग कर ऑप्टिकल फँसाने कक्षों की तैयारी

नोट: प्रकाश संवेग का पता लगाने के आधार पर ऑप्टिकल बल माप ऑप्टिकल ट्रैप्स ⁴⁰ से उभरने वाले सभी प्रकाश के कैप्चर की आवश्यकता होती है। अपरिवर्तनीय अंशांकन कारक α (पीएन / वी) की मजबूती के लिए, ऑप्टिकल फोर्स सेंसर के बैक फोकल प्लेन (बीएफपी) पर प्रकाश वितरण को फोटॉन गति के लिए एक सटीक पत्राचार सहन करना चाहिए। यह संग्रह लेंस की सतह से फँसाने वाले विमान से लगभग 2 मिमी की दूरी निर्धारित करता है, जो ऑप्टिकल ट्रैपिंग कक्षों की अधिकतम ऊंचाई है।

1. पीडीएमएस स्पिन # 1.5 ग्लास नीचे व्यंजन की कोटिंग.
   नोट: निम्नलिखित नुस्खा लगभग 40 व्यंजनों के लिए प्रदान किया जाता है। परिणामी माइक्रोचैंबर में इस बात पर निर्भर करते हुए अलग-अलग ऊंचाइयां होंगी कि क्या प्रयोगों को निलंबित या सीमित कोशिकाओं (चित्रा 1 डी) पर आयोजित किया जाना है।
   1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में आधार बहुलक PDMS के 9 mL और PDMS इलाज एजेंट के 1 mL मिश्रण। इलाज एजेंट के उचित वितरण को सुनिश्चित करने के लिए दो उत्पादों को सक्रिय रूप से मिलाएं।
   2. एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर बुलबुले से बचने के लिए मिश्रण degas. एक वैक्यूम बोतल में शंक्वाकार ट्यूब का परिचय दें और कक्ष को खाली करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि मिश्रण में कोई बुलबुले मौजूद न हों।
      नोट: फाल्कन ट्यूब से बाहर PDMS के foaming और spills को रोकने के लिए वैक्यूम धीरे-धीरे खोलें।
   3. स्पिन-कोटर चक (चित्रा 2 ए) पर ग्लास बॉटम डिश रखें। खरोंच, फिंगरप्रिंट, या पकवान को गंदा करने के लिए कोमल न रहें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ PDMS लीक से स्पिन-कोटर बॉक्स की रक्षा करें।
   4. निलंबन में कोशिकाओं पर प्रयोगों के लिए ओटी कक्षों के लिए, नीचे के पकवान के केंद्र में पीडीएमएस मिश्रण के लगभग 250 μL जोड़ें और इसे 1 मिनट के लिए 750 आरपीएम पर स्पिन करें। PDMS परत की ऊंचाई लगभग 50 μm लगभग ⁴⁸ होगी।
   5. सीमित कोशिकाओं पर प्रयोगों के लिए ओटी कक्षों के लिए, पीडीएमएस (लगभग 50 μL) की एक छोटी सी बूंद जोड़ें और इसे 5 मिनट के लिए 4,000 आरपीएम पर स्पिन करें। PDMS परत की ऊंचाई लगभग 10 μm होगी। विभिन्न PDMS मोटाई प्राप्त करने के तरीके पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, ^reference48 देखें।
   6. PDMS-लेपित ग्लास-बॉटम व्यंजनों को 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
   7. एक स्केलपेल के साथ पीडीएमएस परत पर एक 1 x 1 सेमी वर्ग काटें और इसे चिमटी के साथ छील लें (चित्रा 2 सी)। सीमित कोशिकाओं के मामले में, ISOpropanol के साथ PDMS मलबे धोएं।
2. निलंबन में हल्के से संलग्न कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के लिए चैंबर कोटिंग
   1. वर्ग गुहा की पूरी सतह को कवर करने के लिए 0.5 मिलीग्राम / एमएल पर कोनकानावलिन ए (कोना) के 100 μL जोड़ें और इसे 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट होने दें।
      नोट: कोना एक लेक्टिन है जो सेल सतह शर्करा और जोड़ों को कवरग्लास सतह पर अलग-अलग कोशिकाओं को बांधता है।
   2. कोना ड्रॉप निकालें और कोना इलाज की सतह scratching बिना DMEM माध्यम के साथ ध्यान से सतह कुल्ला.
   3. पहले से तैयार नमूने (चरण 2.6) के 30 μL को अच्छी तरह से जोड़ें और किसी भी सेल क्लस्टर से छुटकारा पाने के लिए धीरे से पुन: निलंबित करें।
   4. पीडीएमएस रिम के शीर्ष पर धीरे से 22 x 22 मिमी # 1.5 कवर ग्लास रखकर गुहा को बंद करें (इसे अचानक गिरने से बचें, यदि संभव हो तो संदंश का उपयोग करें, चित्रा 2 बी, सी)।
      नोट: किसी भी coverslip मोटाई ऊपरी ग्लास कवर के लिए काम करेगा (संग्रह लेंस 2 मिमी की एक काम दूरी है).
3. कारावास में कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के लिए चैंबर तैयारी
   1. वर्ग गुहा (चित्रा 2B) में कोशिकाओं (चरण 2.6) युक्त समाधान की एक 10 μL बूंद रखो।
   2. बहुत धीरे से, एक 22 x 22 मिमी कवर ग्लास के साथ नमूने को सैंडविच करें जैसे कि बूंद पूरे क्षेत्र में फैलती है और कोई बुलबुले नहीं देखे जाते हैं। फिर से, संदंश का उपयोग करना सुविधाजनक है, जैसा कि चित्रा 2 सी में दिखाया गया है, कवर ग्लास को अचानक गिरने से रोकने के लिए।

4. ओटी कक्ष रिक्ति के लिए वैकल्पिक विकल्प

नोट:: इन चरणों का पालन किया जा सकता है यदि कोई microfabrication कार्यशाला या स्पिन कोटर उपलब्ध है।

1. निलंबन में कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के लिए चैंबर की तैयारी
   नोट: यदि कोई स्पिन कोटर उपलब्ध नहीं है, तो सामान्य, डबल-साइडेड स्कॉच टेप (ऊंचाई में लगभग 100 μm) का उपयोग करके एक स्पेसर बनाया जा सकता है।
   1. केंद्र में लगभग 10 सेमी x 10 सेमी वर्ग छेद के साथ डबल-साइडेड स्कॉच टेप का एक टुकड़ा काटें (पीडीएमएस, चित्रा 2 बी के समान आयाम)।
   2. इसे छीलकर टेप की सुरक्षात्मक परतों में से एक को हटा दें और # 1.5 एच ग्लास-बॉटम डिश के केंद्र में टेप के खुला पक्ष को रखें। हवा के बुलबुले से बचने के दौरान कांच से चिपके हुए सभी सतह को प्राप्त करने के लिए धीरे से दबाएं, और फिर इसे छीलकर टेप की शेष सुरक्षात्मक परत को हटा दें।
   3. चरण 3.2 में दिए गए निर्देशों का पालन करें।
2. कारावास में कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के लिए चैंबर तैयारी
   नोट: ठीक से कोशिकाओं को सीमित करने के लिए, एक ज्ञात व्यास के साथ monodispersed सूक्ष्म कणों दो कवर चश्मे के बीच spacers के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
   1. ¹⁰⁴ मोतियों / μL की एकाग्रता पर निलंबित कोशिकाओं के लिए 10 μm polystyrene मोती जोड़ें।
   2. एक 22 x 60 मिमी कवर ग्लास पर कोशिकाओं और मोतियों युक्त समाधान की एक 10 μL बूंद रखो।
   3. बहुत धीरे से, एक और 22 x 60 मिमी कवर ग्लास के साथ नमूने को सैंडविच करें जैसे कि बूंद पूरे क्षेत्र में फैलती है और कोई बुलबुले नहीं देखे जाते हैं। ऊपरी कवर ग्लास को धीरे से रखने के लिए (इससे बचें कि यह अचानक नीचे गिर जाता है), संदंश का उपयोग करना सुविधाजनक है।
   4. जैसा कि नमूना सूख सकता है, तैयारी को तेजी से करने की सिफारिश की जाती है।

5. इंट्रासेल्युलर माप के लिए ऑप्टिकल जाल की स्थापना

नोट: निम्नलिखित चरणों को एक वाणिज्यिक ऑप्टिकल चिमटी मंच के लिए अनुकूलित किया गया है जिसमें एक ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन मॉड्यूल शामिल है जो एकोस्टो-ऑप्टिक विक्षेपण (एओडी) पर आधारित है और प्रकाश संवेग परिवर्तनों का प्रत्यक्ष पता लगाने के आधार पर एक ऑप्टिकल बल सेंसर (चित्रा 2, संदर्भ 12,40,49)। सेट-अप के विवरण और ऑप्टिकल घटकों को चित्र 2F में पाया जा सकता है। ऑप्टिकल चिमटी जोड़तोड़ के दौरान बल-प्रेरित विरूपण का निरीक्षण करने के लिए, एक निपको कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप को दोहरे रंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप के बाएं बंदरगाह में युग्मित किया जाता है। व्यापकता की कमी के बिना, इस प्रोटोकॉल को प्रकाश गति का पता लगाने के आधार पर प्रत्यक्ष बल माप से लैस किसी भी गतिशील ओटी सिस्टम के साथ लागू किया जा सकता है। विस्तृत चरण-दर-चरण प्रक्रियाएं विवो अनुप्रयोगों ⁵⁰ में के लिए होमबिल्ट ऑप्टिकल ग्रेडिएंट ट्रैप का निर्माण करने के लिए उपलब्ध हैं। एओडी मॉडुलन पर आधारित लोग कई जाल और तेजी से माप ^51,52 के साथ अंतिम प्रयोगों के लिए बाहर खड़े हैं। एक प्रकाश-संवेग आधारित उपकरण के निर्माण के लिए कई प्रोटोकॉल साहित्य ^36,39,40,53 में मौजूद हैं, और किसी भी अन्य इमेजिंग पद्धति (विभेदक हस्तक्षेप विपरीत, वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति, आदि) को नियोजित किया जा सकता है।

1. ऑप्टिकल चिमटी स्टार्ट-अप
   1. आउटपुट पावर स्थिरता के लिए अनुकूलित करने के लिए, प्रयोग से कम से कम 30 मिनट पहले काफी उच्च शक्ति (जैसे, 3 डब्ल्यू) पर लेजर को चालू करें।
   2. ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन और बल माप इकाइयों के इलेक्ट्रॉनिक्स मॉड्यूल को चालू करें।
      नोट: सभी लेजर सुरक्षा उपायों को लागू करें और केवल संस्थागत बोर्ड द्वारा अनुमोदित उपकरणों का उपयोग करें। लेजर चालू होने पर कभी भी ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के आईपीस का उपयोग न करें। हमेशा अनुमोदित IR सुरक्षा चश्मे (950-1080 एनएम रेंज में OD7) का उपयोग करें, epifluorescence पोर्ट 2 में शटर के साथ IR लेजर प्रकाश को ब्लॉक करें, और चरण 5.3 के बाद ऑप्टिकल बल सेंसर संरेखण को समाप्त करने तक ऑप्टिकल ट्रैपिंग सॉफ़्टवेयर को निष्पादित न करें। सामान्य तौर पर, अत्यधिक चिंतनशील नमूने का उपयोग न करें, क्योंकि बैक-रिफ्लेक्शन लेजर को नुकसान पहुंचा सकता है।
   3. ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन मॉड्यूल के प्रवेश द्वार पर घूर्णन HWP (चित्रा 2F) के साथ जाल शक्ति को नियंत्रित करें।
      नोट:: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन मॉड्यूल पहले से ही इस सुविधा को शामिल करता है। होमबिल्ट ऑप्टिकल ट्रैपिंग सिस्टम के लिए, पावर कंट्रोल के लिए इस टूल को एकीकृत करें ताकि उच्च और अधिक स्थिर लेजर शक्तियों का उपयोग किया जा सके।
2. अंशांकन के लिए एक खाली माइक्रोचैंबर का उपयोग करें
   1. एक डबल-साइडेड स्कॉच टेप पर एक 1 x 1 सेमी वर्ग काटें और इसे 1 मिमी मोटी माइक्रोस्कोप स्लाइड पर संलग्न करें।
   2. वर्ग में पानी जोड़ें और इसे # 1.5 कवर ग्लास (22 x 22 मिमी) के साथ शीर्ष से बंद करें। पानी की थोड़ी अधिक मात्रा को जोड़ना, उदाहरण के लिए, 30-40 μL को कवर किए गए कक्ष के अंदर बुलबुले से बचने की सलाह दी जाती है। अंशांकन कक्ष को धीरे से पोंछें यदि पानी बाहर निकलता है।
3. ऑप्टिकल बल संवेदक का संरेखण
   1. 60x/1.2 जल विसर्जन उद्देश्य पर पानी की एक बूंद रखो। # 1.5 कवर ग्लास उद्देश्य का सामना करना पड़ के साथ मंच पर अंशांकन कक्ष जगह. निचली सतह पर ध्यान केंद्रित करें, जहां सेल के नमूने अंततः होंगे।
   2. नमूना (चित्रा 2 डी) को कवर करने वाले ऊपरी ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें। बल सेंसर इकाई के संग्रह लेंस को सावधानीपूर्वक कम करें जब तक कि यह तेल की बूंद से संपर्क न करे।
      नोट: ड्रॉपलेट काफी बड़ा होना चाहिए ताकि यह पूरे लेंस को कवर कर सके जो जाल से उभरने वाले लेजर प्रकाश को इकट्ठा करता है। आमतौर पर, 200 μL पूरी सतह को कवर करने और एक स्थिर विसर्जन संपर्क प्रदान करने के लिए पर्याप्त है। रूढ़िवादी बनें और ओवरफिलिंग से बचें क्योंकि यह नमूने में रिसाव हो सकता है।
   3. ऑप्टिकल फोर्स सेंसर संरेखण के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, सहायक कैमरे पर नमूना विमान छवि को देखें जिसका उपयोग ओटी (AUX, चित्रा 2F) की स्थिति के लिए किया जाएगा। बहुत धीरे से, ऑप्टिकल बल सेंसर को कम करें जब तक कि फ़ील्ड स्टॉप (एफएस, चित्रा 2 एफ-जी) नमूना विमान पर संयुग्मित दिखाई न दे। यह प्रकाश संवेग ^{परिवर्तन40} के नमूना-अपरिवर्तनीय पहचान से उचित प्रत्यक्ष बल माप सुनिश्चित करेगा।
      नोट:: FS पर्याप्त रूप से बंद करें ताकि इसकी छवि दृश्य के क्षेत्र (FOV) से छोटी हो जाए, इसलिए, दृश्यमान हो। अतिरिक्त सावधान रहें और नमूने के खिलाफ ऑप्टिकल फोर्स सेंसर के संग्रह लेंस को धक्का न दें। ऑप्टिकल फोर्स सेंसर की ऊर्ध्वाधर स्थिति को वैकल्पिक रूप से परिभाषित संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ प्रकाश शंकु के लिए बीएफपी पर ट्रैपिंग प्रकाश वितरण के विश्लेषण से निर्धारित किया जा सकता है।
   4. सुनिश्चित करें कि तेल की बूंद में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं; ये सीधे बल माप को प्रभावित कर सकते हैं। हवा के बुलबुले की जांच करने के लिए, बर्ट्रेंड लेंस को जगह में रखें (बीएल, चित्रा 2 जी) और आईपीस के माध्यम से इमेजिंग पथ का निरीक्षण करें। यदि कोई गंदगी या हवा के बुलबुले दिखाई दे रहे हैं या अधिक तेल की आवश्यकता है (चित्रा S1A), तो धूल मुक्त लेंस ऊतक के साथ लेंस और कक्ष को साफ करें और चरण 5.3.2 और 5.3.3 में प्रक्रिया को दोहराएं। एक अबाधित ऑप्टिकल पथ को चित्र S1B में दर्शाया गया है।
   5. ऑप्टिकल फोर्स सेंसर के धारक पर रखे गए पार्श्व शिकंजा का उपयोग करते हुए, एफओवी में एफएस को केंद्र में रखें। सटीकता के लिए, एफएस खोलें ताकि यह लगभग सहायक कैमरे (AUX, चित्रा 2F) पर दिखाई देने वाले FOV को भर दे।

6. ऑप्टिकल चिमटी अनुकूलन

नोट: प्रत्यक्ष बल माप पूरी तरह से फंसे हुए कण पर लगाए गए बल से उत्पन्न प्रकाश गति के परिवर्तन पर निर्भर करता है, और इस प्रकार, अप्रत्यक्ष तरीकों के विपरीत, ट्रैप कठोरता को प्रत्येक प्रयोग से पहले कैलिब्रेट करने की आवश्यकता नहीं होती है। विक्षेपण/बल कारक (α; pN/V, ^reference41) का उपकरण-विशिष्ट रूपांतरण निर्माता द्वारा कैलिब्रेट किया जाता है और इस प्रकार प्रयोग अपरिवर्तनीय है। हालांकि, क्योंकि लेजर स्पॉट को 70 μm x 70 μm के क्षेत्र में हेरफेर किया जाता है, इसलिए चरण 6.2-6.5 इष्टतम फँसाने और शक्ति स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। निम्न चरणों को निर्माता सॉफ़्टवेयर में प्रदान किया जाता है ताकि OTs एक अर्ध-स्वचालित तरीके से कार्य क्षेत्र पर अनुकूलित हो जाएं।

1. OTs सॉफ्टवेयर और कैमरा AUX के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
2. चरण 1 पर क्लिक करके प्रारंभिक वोल्टेज आधार रेखा घटाएं: ऑप्टिकल चिमटी ड्राइविंग सॉफ़्टवेयर के सिस्टम अंशांकन सबमेनू में इलेक्ट्रॉनिक्स ऑफसेट चरण।
3. ओटी कार्य क्षेत्र में जाल शक्ति समतल करने के लिए, तदनुसार एचडब्ल्यूपी को घुमाकर ट्रैप पावर को अपने अधिकतम के आधे हिस्से पर सेट करें। लेजर आउटपुट को बदलकर जाल शक्ति को न बदलें, लेकिन घूर्णन एचडब्ल्यूपी (चित्रा 2 एफ) के साथ। चरण 2 पर क्लिक करें : ट्रैप पावर फ्लैटिंग के लिए स्वचालित दिनचर्या शुरू करने की शक्ति।
   नोट:: यह OTs कार्य क्षेत्र (चित्रा S1D) भर में ट्रैप पावर की भिन्नता के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। एक सफल दिनचर्या ओटी कार्य क्षेत्र में जाल शक्ति भिन्नता को 2% तक नीचे लाती है और 2 मिनट के बाद अभिसरण करती है।
4. ट्रैप स्थिति अंशांकन करने के लिए, IR फ़िल्टर को निकालें ताकि लेजर से प्रकाश कैमरे पर दिखाई दे। माइक्रोचैंबर की निचली सतह पर केंद्रित छवि विमान को सेट करके आईआर स्पॉट का पता लगाएं। छवि विमान (उद्देश्य स्थिति) और कैमरा AUX अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में हिस्टोग्राम कंट्रास्ट ट्यूनिंग द्वारा संभव सबसे छोटा IR स्पॉट प्राप्त करें। यदि आवश्यक हो, तो HWP (चित्रा 2F) को घुमाकर ऑप्टिकल ट्रैप की शक्ति को कम करें। चरण 3 पर क्लिक करें: स्वचालित दिनचर्या या ट्रैप पोजिशनिंग अंशांकन शुरू करने की स्थिति।
   नोट:: यह रूटीन AOD स्टीयरिंग कोण के लिए कैमरा AUX में OT की स्थिति निर्देशांक के सटीक पत्राचार सक्षम बनाता है। एक सफल दिनचर्या कई सेकंड में कोण-से-स्थिति मैपिंग उत्पन्न करती है।
5. प्रारंभिक गति मुआवजा
   नोट: नमूने भर में ऑप्टिकल ट्रैप के आंदोलन BFP (चित्रा S1E, F) पर प्रकाश-संवेग वितरण में भिन्नता का कारण बनता है। यह कार्य क्षेत्र पर लेजर स्थिति से संबंधित बल-स्वतंत्र संकेत परिवर्तनों की ओर जाता है, भले ही ट्रैप पावर को चरण 6.3 के रूप में चपटा कर दिया गया हो। परिणाम स्थिति के कारण बल बेसलाइन में एक भिन्नता है (ऑप्टिकल रूप से फंसे मनका पर अभिनय करने वाले वास्तविक बल से स्वतंत्र) जिसे प्रत्येक प्रयोग से पहले सही करने की आवश्यकता होती है।
   1. HWP (चित्रा 2F) को घुमाकर, प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली जाल शक्ति सेट करें।
   2. उपकरण सबमेनू में वैश्विक ऑफसेट विकल्प पर क्लिक करें। यह प्रारंभिक गति आधार रेखा को सही करता है जो ऑप्टिकल चिमटी सॉफ़्टवेयर के ऑफसेट रद्द करें सहायक खोल देगा।
   3. ऑफसेट | पर क्लिक करें स्थिति-संस्करण प्रारंभिक गति को सही करने के लिए क्षतिपूर्ति करें।
      नोट:: यदि कोई संशोधन चल रहे हफ्तों के दौरान ऑप्टिकल पथ को प्रभावित करता है, तो ट्रैप पावर समतल (चरण 6.3) और स्थिति (चरण 6.4) मानचित्र अपरिवर्तनीय रहेंगे। इसलिए हम हमेशा ऑप्टिकल तत्वों (डाइक्रोइक दर्पण, फिल्टर, आदि) के एक ही संयोजन का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो लेजर ट्रैप पथ को प्रभावित कर सकते हैं या एक नया जाल शक्ति समतल दिनचर्या कर सकते हैं। प्रारंभिक गति मुआवजे (चरण 6.5) के बारे में, ओटी प्लेटफ़ॉर्म का निर्माता एक ऑन-द-फ्लाई अंशांकन प्रदान करता है जिसे हर नए ट्रैपिंग पावर और प्रयोगात्मक सत्र के लिए बदला जाना चाहिए। चरण 6.3 और 6.4 चरण 5.2 में वर्णित रिक्त अंशांकन स्लाइड पर किया जाना चाहिए। कोशिकाओं या अन्य वस्तुओं वाले नमूने में, चरण 6.5 को उन वस्तुओं से मुक्त किया जाना चाहिए जो ओटी कार्य क्षेत्र में प्रकाश प्रकीर्णन को बदल सकते हैं।
6. वैकल्पिक रूप से, एक माइक्रोस्फीयर को ट्रैप करें और बल सिग्नल को रिकॉर्ड करते समय एक ज्ञात वेग पर जाल को स्थानांतरित करें। उदाहरण के लिए, एक त्रिकोणीय दोलन करने के लिए जाल सेट करें: रिकॉर्ड किया गया बल संकेत एक वर्ग संकेत होगा।
   नोट:: बल मान को मनका पर कार्य करने वाले ड्रैग बल के अनुसार, वेग के साथ रैखिक रूप से बढ़ना चाहिए। यह परीक्षण एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है कि बल माप सही ढंग से किए जा रहे ^हैं38। वैकल्पिक रूप से, ऑप्टिकल बल सेंसर का उपयोग ऑप्टिकल ट्रैपिंग कठोरता प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, π [pN / μm], और स्थिति अंशांकन कारक, β [μm / V], पावर स्पेक्ट्रल विश्लेषण ³⁵ से। सही संरेखण के तहत, निर्माता द्वारा प्रदान किया गया अपरिवर्तनीय अंशांकन कारक α = π ·β [pN / V] है।
   1. निर्माता सॉफ़्टवेयर में उपाय सबमेनू में प्लॉट 1 पर क्लिक करके एक वास्तविक समय बल पढ़ने की शुरुआत करें। यह वर्तमान ऑप्टिकल फँसाने बल और शक्ति का एक पढ़ने प्रदान करेगा।
   2. उपकरण सबमेनू से दोलन पैरामीटर संवाद खोलें। क्रमशः आकृति और प्रकार चयनकर्ता छल्ले में एक त्रिकोणीय-स्थान तरंग आकृति सेट करें. एक उदाहरण के रूप में, 10 μm का आयाम और 3 हर्ट्ज की आवृत्ति सेट करें। इसके परिणामस्वरूप 1 ^μm38 के व्यास के साथ एक माइक्रोबीड पर लगभग 1 pN का चिपचिपा बल होगा।
   3. कैमरे की AUX विंडो पर, माइक्रोबीड पर राइट-क्लिक करें और प्रारंभ Oscillating का चयन करें। बल पठन ±1 pN पर पठारों के साथ एक वर्ग बल संकेत बन जाएगा।
   4. माइक्रोबीड पर राइट-क्लिक करें और रोकें Oscillating का चयन करें।

7. कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी

1. कताई-डिस्क confocal माइक्रोस्कोप और गौण उपकरण, एकीकृत लेजर इंजन, और अधिग्रहण कैमरों को चालू करें।
2. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें।
3. कोशिका प्लाज्मा झिल्ली के लिए नाभिक और जीएफपी के Hoechst धुंधला के लिए इमेजिंग चैनल सेट करें।
   1. 405 एनएम और 488 एनएम उत्तेजना लेजर लाइनों को सक्रिय करें।
   2. नमूने के लिए उत्तेजना को प्रतिबिंबित करने के लिए एक मल्टीबैंड डाइक्रोइक जोड़ें और जो उत्सर्जित प्रकाश को कैमरों को पारित करने की अनुमति देता है।
   3. एक 500 एनएम लंबे पास किनारे dichroic दर्पण के साथ प्रतिदीप्ति उत्सर्जन विभाजित.
   4. DAPI / BFP (~ 445 nm) और GFP (~ 521 nm) उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग क्रमशः दो अधिग्रहण कैमरों के सामने करें। चित्र 2F, G को देखें।
   5. प्रत्येक चैनल के लिए 100 ms करने के लिए एक्सपोज़र समय सेट करें।
   6. नमूना विमान पर 5 mW की शक्ति प्राप्त करने के लिए लेजर उत्सर्जन सेट करें। बिजली को मापने के लिए, एक वाणिज्यिक पावर मीटर का उपयोग करें।
4. इमेजिंग प्रोटोकॉल सेट करें. GFP चैनल में Hoechst चैनल से वर्णक्रमीय रक्तस्राव से बचने के लिए, दो रंजक को क्रमिक रूप से चित्रित करने की आवश्यकता होती है।
   नोट:: यदि कोई हार्डवेयर सिंक्रनाइज़ेशन ऑप्टिकल ट्रैप और कैमरा अधिग्रहण के AODs के बीच मौजूद है, तो सुनिश्चित करें कि ट्रिगर polarity ठीक से सेट किया गया है। यदि संदेह है, तो अपने सुविधा प्रबंधक या माइक्रोस्कोप निर्माता से परामर्श करें।

8. नाभिक इंडेंटेशन प्रयोगों का प्रदर्शन

नोट: हमेशा ऑप्टिकल ट्रैप को बंद करें- दोनों सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके और एपिफ्लोरेसेंस पोर्ट 2 पर शटर को बंद कर दें- जब बल सेंसर मॉड्यूल को उठाते हैं और नमूना बदलते हैं। यदि नहीं, तो ऑप्टिकल तत्वों और प्रयोगकर्ता को गंभीर नुकसान हो सकता है। लेंस धारक और नीचे डिश किनारे के बीच पार्श्व दूरी के साथ सावधान रहें जब कोशिकाओं की तलाश में चरण / संस्कृति पकवान (चित्रा 2) में लेंस को टक्कर देने से बचने के लिए।

1. नमूना माइक्रोस्कोप में रखें और इस प्रोटोकॉल के चरण 5.3 का पालन करें।
2. घूर्णन HWP (चित्रा 2F) का उपयोग करते हुए, जाल शक्ति को 200 mW पर एक प्रारंभिक मूल्य के रूप में सेट करें यदि जांच की गई नाभिक या इंट्रासेल्युलर संरचना की कठोरता ज्ञात नहीं है। चरण 6.5 के माध्यम से प्रारंभिक गति आधार रेखा के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए कोशिकाओं से मुक्त एक स्थान पर OTs कार्य क्षेत्र (माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग करके) का अनुवाद करें।
   नोट:: उपकोशिकीय संरचना की कठोरता के आधार पर, ट्रैप पावर मान को एक समान इंडेंटेशन गहराई प्राप्त करने के लिए कम या उच्च मानों के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
3. माइक्रोस्कोप स्टेज सॉफ़्टवेयर नियंत्रक का उपयोग करके, प्रेषित ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3 ए) के माध्यम से एक या दो मोतियों के साथ एक सेल की तलाश करें।
4. एक जाल प्रक्षेपवक्र को परिभाषित करें।
   1. उपकरण सबमेनू में प्रक्षेपवक्र संवाद खोलें और प्रक्षेपवक्र प्रकार चयनकर्ता रिंग में विस्थापन चुनें.
   2. संख्यात्मक पत्रक में, प्रत्येक बाद के प्रक्षेपवक्र चरण के विस्थापन और समय को लिखें। यहाँ दो उदाहरण हैं।
   3. एक तनाव विश्राम प्रयोग के लिए, प्रोग्राम ट्रेपोज़ॉइडल लोड, जैसा कि चित्र 3 बी में दिखाया गया है। तालिका S1 में, दो trapezoidal indentations 5 μm की यात्रा दूरी के साथ लागू किए गए थे; 5 μm/s का वेग; पीछे हटने से पहले प्रतीक्षा समय: 10 s.
   4. नाभिक पर रहने के समय के बिना एक त्रिकोणीय दिनचर्या प्राप्त करने के लिए एक स्थिर वेग पर दोहराए जाने वाले इंडेंटेशन प्रयोग के लिए, प्रक्षेपवक्र आयाम सेट करें, उदाहरण के लिए, 5 μm, और चरण के लिए समय, उदाहरण के लिए, 2.5 μm / s के वेग के लिए 2 s। तालिका S2 में, इसे एक ही वेग पर आठ बार लागू किया जाता है।
      नोट:: इन मानों को प्रत्येक सेल प्रकार और प्रयोग के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है, लेकिन एक trapezoidal रूटीन के निम्नलिखित पैरामीटर यहाँ प्रस्तुत प्रयोग में सबसे महत्वपूर्ण गतिशीलता कैप्चर। प्रतीक्षा समय नाभिक के लिए इंडेंटेशन के बाद अपने पूर्ण तनाव छूट को दिखाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए
5. एक माइक्रोस्फीयर को फँसाना
   1. माइक्रोस्कोप चरण सॉफ्टवेयर नियंत्रक के साथ मनका के ऊपर थोड़ा ऊपर छवि विमान सेट करें।
   2. OTs सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर जाल सक्रिय करें और कैमरा AUX इमेजिंग विंडो में मनका पर क्लिक करें (चरण 6.4 के बाद कैलिब्रेटेड)। ऑप्टिकल ट्रैप द्वारा मनका का सफल कारावास दृढ़ता से मनका की गति को कम कर देगा।
   3. साइटोप्लाज्म में मनका को क्लिक करें और खींचें और इसे परमाणु लिफाफे (चित्रा 3 ए) से ~ 2 μm की दूरी पर रखें। सुनिश्चित करें कि प्रक्षेपवक्र सेट किया गया है ताकि मनका इंडेंटेशन परमाणु झिल्ली के लंबवत हो।
6. वैकल्पिक रूप से, यदि जाल के सापेक्ष मनका की स्थिति माप के लिए आवश्यक हो, तो फँसाने की कठोरता को निर्धारित करने के लिए मनका के पार जाल को स्कैन करें, k [pN /μm]⁵⁴, जिससे Πxbead = -F/k (चर्चा देखें)। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन मॉड्यूल में इस उद्देश्य के लिए एक अंतर्निहित दिनचर्या है।
   1. उपकरण सबमेनू में कण स्कैन संवाद खोलें।
   2. उस ट्रैप का चयन करें जिसे आप स्कैन करना चाहते हैं और स्कैनिंग विधि के रूप में उच्च आवृत्ति। मनका स्कैनिंग माप के लिए इंडेंटेशन प्रक्षेपवक्र की दिशा (x या y) का चयन करें.
   3. एक खिड़की फँसाने कठोरता के माप के साथ दिखाई देगा। ग्राफ में, F = -kx के अनुरूप रैखिक फँसाने वाले क्षेत्र का चयन करने के लिए दो कर्सर खींचें। चयनित डेटा भाग के लिए रैखिक फ़िट स्वचालित रूप से ताज़ा हो जाएगा.
      नोट: सेल झिल्ली (~ 5 μm) से दूर मनका की प्रारंभिक स्थिति सेट करें, क्योंकि मध्यम-सेल इंटरफ़ेस पर प्रकाश-संवेग विक्षेपण बल माप की उपयुक्तता को प्रभावित करते हैं। यदि नाभिक कोशिका झिल्ली के बहुत करीब स्थित है, तो विपरीत साइट से नाभिक को इंडेंट करने का प्रयास करें। यदि संभव न हो तो कक्ष को छोड़ दें.
7. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में अधिग्रहण बटन पर क्लिक करके छवि अधिग्रहण प्रारंभ करें.
8. ट्रैप स्थिति प्रारंभ करें और डेटा | पर क्लिक करके मापन डेटा सहेजने के लिए मजबूर करें वास्तविक समय बल पठन विंडो में सहेजें (चरण 6.6.1 के रूप में खोला गया)।
   नोट: ऑप्टिकल ट्रैप एक ट्रिगर इनपुट से सुसज्जित है जिसे कैमरे के टाइमिंग आउटपुट से जोड़ा जा सकता है। इस प्रकार, छवि और बल डेटा हार्डवेयर-सिंक्रनाइज़ होते हैं और इलेक्ट्रॉनिक अधिग्रहण के दौरान छवियों के फ्रेम की संख्या के साथ जाल चक्रों को मैप करने में सक्षम होता है।
9. मनका पर राइट-क्लिक करके और प्रारंभ प्रक्षेपवक्र का चयन करके पहले से लोड किए गए प्रक्षेपवक्र को प्रारंभ करें.
10. प्रक्षेपवक्र समाप्त होने तक प्रतीक्षा करें और सिस्टम स्थिर न हो जाए।
11. ट्रैप बल माप डेटा की बचत रोकें. एक डेटा बचत संवाद पॉप अप होगा।
    नोट:: डेटा संग्रहण को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, इस संवाद (10, 100, या 1000) में डिसिमेटिंग पैरामीटर का चयन करके डेटा को नष्ट किया जा सकता है.
12. छवि अधिग्रहण को रोकें और उपयोगकर्ता की पसंद के पोस्टप्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर में परिणामों को प्लॉट करें।
13. यदि माइक्रोस्फीयर रूटीन के दौरान खो जाता है और नाभिक को इंडेंट नहीं किया जा सकता है (चित्रा S2), तो माप को छोड़ दें और शक्ति को बढ़ाएं। ध्यान दें कि चरण 6.5 दोहराया जाना चाहिए। हमारे हाथों में, कम से कम 95% दिनचर्या जाल से मनका खोने के बिना सफलतापूर्वक पूरी हो जाती है।

Representative Results

फँसाने वाले मोतियों का माइक्रोइंजेक्शन:
माइक्रोस्फियर को मॉर्फोजेनेसिस के दौरान पूरे पशु टोपी पर फैले एक-सेल ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है। एक स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, हमने लाल फ्लोरोसेंट माइक्रोबीड्स के साथ इंजेक्शन प्रोटोकॉल को दोहराया और विभिन्न विकास चरणों में हमारे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ वॉल्यूमेट्रिक छवियों को लिया। चित्रा 4ए-डी में, इंजेक्ट किए गए मोतियों को 5 एचएफपी पर विवो में पूर्वज स्टेम कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में देखा जाता है। बाद में, माइक्रोस्फीयर पूरे भ्रूण पर 24 hpf (चित्रा 4E) पर फैले हुए दिखाई दिए। सामान्य रूप से विकसित दोनों चरणों में भ्रूण और जीवित रहने की दर नियंत्रण गैर-इंजेक्शन या मॉक-इंजेक्टेड भ्रूण के साथ तुलनीय थी (चित्रा S3 देखें)। यह अन्य अध्ययनों के अनुरूप है जो निषेचन के बाद 5 दिनों तक मनका-इंजेक्टेड ज़ेब्राफ़िश के अविचलित अस्तित्व की रिपोर्ट ^{करते हैं}।

हमारे कताई-डिस्क confocal माइक्रोस्कोप बहु चैनल प्रतिदीप्ति microcopy के साथ संगत है. चित्रा 5ए में, हम साइटोप्लाज्म में एक या दो मोतियों के साथ अलग-थलग स्टेम कोशिकाओं को दिखाते हैं। एकाधिक फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग सेल के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 5 बी)। परमाणु आकृति विज्ञान को एक Hoechst डाई के साथ या H2A::mCherry mRNA अभिव्यक्ति का उपयोग करके ट्रैक किया जा सकता है, जबकि आंतरिक परमाणु झिल्ली का विश्लेषण Lap2b-eGFP12 के साथ किया जा सकता है। एक्टोमायोसिन कॉर्टेक्स की गतिशीलता, साथ ही इंट्रासेल्युलर कैल्शियम के स्तर को क्रमशः My12.1: eGFP ट्रांसजेनिक लाइन ⁵⁶ और कैलब्राइट -520 इनक्यूबेशन के साथ देखा जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उद्देश्य चिपकने वाले सब्सट्रेट्स (बाद में निलंबन के रूप में संदर्भित) और यांत्रिक कारावास में स्थिर वाइल्डटाइप कोशिकाओं के सेल नाभिक यांत्रिकी की तुलना करना है। 10 μm ऊंचाई के माइक्रोचैंबर्स में सीमित पृथक स्टेम कोशिकाओं ने आंतरिक परमाणु झिल्ली (INM) के आंशिक खुलासे और एक्टोमायोसिन संकुचन में बाद में वृद्धि का प्रदर्शन ^{किया।} चित्रा 5 C में, साइटोप्लाज्म में एक या दो मोतियों के साथ सीमित कोशिकाओं को दिखाया गया है। सफल कारावास नाभिक के व्यापक क्रॉस सेक्शन के साथ चपटी, विस्तारित कोशिकाओं के माध्यम से दिखाई देगा। परमाणु झिल्ली को आगे सीमित कोशिकाओं में प्रकट किया जाता है और निलंबन में कोशिकाओं की तुलना में चिकना दिखाई देना चाहिए (चित्रा 5 सी)।

बल-समय और बल-विरूपण विश्लेषण
प्राप्त परिणामों का विश्लेषण दृढ़ता से जांच किए गए नमूने और ब्याज के सवाल पर निर्भर करता है और इस प्रकार उन्हें यहां सामान्यीकृत नहीं किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, इंडेंटेशन माप का विश्लेषण करने का एक सामान्य तरीका बल-इंडेंटेशन डेटा ⁵⁷ के लिए एक संशोधित हर्ट्ज मॉडल को फिट करके यंग के मापांक को निकालना है। हालांकि, इस तरह के उपचार के लिए धारणा का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करने की आवश्यकता है और हमेशा ठीक से उचित नहीं ठहराया जा सकता है (जैसे कि जांच की गई संरचना आइसोट्रोपिक, समरूप, रैखिक लोच और इंडेंटेशन मनका त्रिज्या से छोटी होने के साथ)। इस प्रकार हम केवल मॉडल स्वतंत्र माप पर विचार करते हैं जो जांच की गई संरचना के यांत्रिक व्यवहार को विभिन्न प्रयोगात्मक परिदृश्यों के बीच तुलना करने की अनुमति देते हैं।

एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, एक निश्चित इंडेंटेशन गहराई पर बल-विस्थापन वक्र की ढलान को मापना नाभिक के एक मॉडल स्वतंत्र ^{संरचनात्मक कठोरता का} एक उपाय प्रदान करता है। इस मान को तब कई नमूनों से एकत्र किया जा सकता है और अलग-अलग प्रयोगात्मक सेटिंग्स और नमूना गड़बड़ी के बीच तुलना की जा सकती है।

इंडेंटेशन मापन
निम्नलिखित पंक्तियों में, हम कारावास में सेल विरूपण के दौरान सेल नाभिक की यांत्रिक प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इस प्रोटोकॉल के चरण 8 में प्रयोग आमतौर पर लगभग 2-3 μm की इंडेंटेशन गहराई के लिए 200 pN तक की चोटियों को मजबूर करते हैं। हालांकि, ये मान काफी हद तक अलग हो सकते हैं, सेल प्रकार और प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर, नरम नाभिक के साथ एक दिए गए इंडेंटेशन के लिए कम बल के लिए अग्रणी। इस प्रकार कोशिका नाभिक के सटीक यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए बल के साथ परमाणु विरूपण को सटीक रूप से मापने की आवश्यकता होती है। इस अनुभाग में, हम प्रतिनिधि बल इंडेंटेशन माप से सेल परमाणु कठोरता प्राप्त करेंगे।

चित्रा 6 में, हम एक निलंबित और सीमित कोशिका में एक नाभिक के दूरस्थ और समीपस्थ पक्षों के विरूपण दिखाते हैं। एक समृद्ध यांत्रिक व्यवहार देखा जा सकता है। एक चिपकने वाले सब्सट्रेट पर एक विशिष्ट निलंबित सेल में, नाभिक को मनका द्वारा दृढ़ता से इंडेंट किया गया था, लेकिन दोहराए जाने वाली घटनाओं पर थोड़ा विस्थापित भी किया गया था। हमने Hoechst-दाग सेल नाभिक के प्रतिदीप्ति इमेजिंग से प्राप्त kymographs का विश्लेषण करके नाभिक पर मनका इंडेंटेशन को मापा। Kymographs आसानी से इंडेंटेशन दिशा (चित्रा 6A, B) के साथ फिजी के मल्टी Kymograph प्लगइन का उपयोग करके गणना की गई थी और आगे के प्रसंस्करण के लिए Matlab (संस्करण 2021, Mathworks) में आयात किया गया था। इंडेंटेशन रूटीन के प्रक्षेपवक्र के साथ नाभिक के सीमांकन किनारों को ट्रैक करने के उद्देश्य से कच्चे तीव्रता प्रोफ़ाइल में एक कदम फ़ंक्शन फिट किया गया था। जैसा कि देखा जा सकता है, यह आकार में परमाणु परिवर्तन (चित्रा 6 और चित्रा S2) पर सटीक जानकारी रखता है। हमने एक चरण फ़ंक्शन के विश्लेषणात्मक संस्करण के रूप में निम्नलिखित डबल-सिग्मॉइड वक्र का उपयोग किया:

(समीकरण 1)

यहां, _x1 और _x2 नाभिक के डिस्टल और समीपस्थ किनारों को दर्शाते हैं, जबकि ए और बी छवि के नीले चैनल (होचस्ट डाई) के अधिकतम और पृष्ठभूमि ग्रे मान हैं (चित्रा 6 बी)। किनारे की चौड़ाई पर विचार किया गया है (_e0 = 0.25 मिमी)। जबकि इंडेंटेड, समीपस्थ नाभिक किनारे (_x2) ने माइक्रोस्फीयर-नाभिक संपर्क के बाद ऑप्टिकल ट्रैप रूटीन द्वारा लागू प्रक्षेपवक्र का पालन किया, विपरीत, डिस्टल एज (_x1) साइटोप्लाज्म (चित्रा 6 डी) जैसे व्हिस्कोइलिस्टिक सामग्री के लिए अपेक्षित विश्राम गतिशीलता प्रदर्शित करता है। इसके विपरीत, 10 μm उच्च माइक्रोचैंबर्स में सीमित कोशिकाओं में नाभिक सेल के भीतर इंडेंटेशन पर नाभिक के इस तरह के स्थानांतरण व्यवहार को प्रदर्शित नहीं करते हैं (चित्रा 6 बी, डी)। चित्रा 6 डी में भी दिखाया गया है, नाभिक के पीछे के किनारे समीपस्थ पक्ष से धक्का देने वाले मनका द्वारा अपरिवर्तित रहते हैं, सबसे अधिक संभावना सेल संकुचन और इंडेंटेशन बल के खिलाफ कार्य करने वाले घर्षण से उत्पन्न मजबूत बलों के कारण होती है। सही विरूपण गहराई प्राप्त करने के लिए, विस्थापन x1 को इंडेंटेड माप x2 से घटाया गया था: Πx = x2 - _x1 (चित्र 6D भी देखें)।

बल डेटा विश्लेषण
परमाणु विरूपण पैदा करने वाले बल को ऑप्टिकल रूप से फंसे माइक्रोबीड (चित्रा 7 ए) पर उत्पन्न प्रकाश संवेग में परिवर्तन से मापा गया था। ट्रेपोज़ॉइडल प्रक्षेपवक्र (चरण 8.4.3, चित्रा 7 बी) को लागू करने पर बल शुरू में रैखिक रूप से बढ़ गया जब तक कि जाल ने आगे बढ़ना बंद नहीं कर दिया, लेकिन फिर एक स्थिर राज्य मूल्य पर आराम किया। इस व्यवहार ने नुकसान और भंडारण मोडुली को प्रदर्शित करने वाली एक व्हिस्कोइलिस्टिक सामग्री का संकेत दिया। इंडेंटेशन ईवेंट के ठीक बाद, बल एक चरम मान, एफपी तक पहुंच गया, जिसके बाद एक तनाव छूट (चित्रा 7 सी):

(समीकरण 2)

जहां F0 लोचदार घटक के लिए संग्रहीत बल है और f(t) एक आयाम-कम विश्राम फ़ंक्शन है। हमने इस व्यवहार का तीन तरीकों से विश्लेषण किया है:

1. एक घातीय तनाव छूट के साथ एक मानक रैखिक ठोस को ध्यान में रखते हुए, अर्थात्, f(t) = ^e-t/π, योजनाबद्ध रूप से चित्रा 7C इनसेट में दर्शाया गया है।

2. एक सामान्य, डबल घातीय क्षय का उपयोग करना:
F(t) = A + B1e-t^/π1 + ^B2e-t/π2

3. एक घातीय क्षय ⁵⁹ के बाद एक शक्ति कानून का उपयोग करना:
f(t) = ^t-pe-t/π, चित्र 7C में फिट किया गया है।

जबकि मॉडल 1 के लिए फिट सीधे तौर पर किया जा सकता है, हम क्रमशः मॉडल 2 और 3 के लिए (_π1, _π2) और (पी, π) के लिए प्रारंभिक अनुमानों का अनुमान लगाने की सलाह देते हैं। यह क्रमशः, लॉगरिदमिक-बनाम-रैखिक (चित्रा 7 डी, बाएं) और लॉगरिदमिक-बनाम-लॉगरिदमिक (चित्रा 7 डी, दाएं) तराजू में डेटा पर लाइनों को फिट करके किया जा सकता है। तालिका S3 चित्र 7 में विश्लेषण किए गए उदाहरण के लिए परिणामों को सारांशित करती है। निम्नलिखित अनुभाग में, हम सेल नाभिक यांत्रिकी के लक्षण वर्णन के लिए एक शक्ति कानून और एक घातीय कानून के संयोजन पर विचार करेंगे।

बल विस्थापन संबंध
इसी तरह, वर्णित प्रयोगात्मक सेट-अप का उपयोग कई इंडेंटेशन घटनाओं के बल-विस्थापन संबंध को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। त्रिकोणीय दिनचर्या (चरण 8.4.4, चित्रा 8A) का प्रदर्शन करके, बल को विरूपण से संबंधित करना और बल-इंडेंटेशन वक्र को प्लॉट करना संभव है। चित्रा 8 बी में एक अनुकरणीय परिणाम दिखाया गया है, जिसमें एक फ्लैट बेसलाइन आसानी से ढलान को बदल देती है जब मनका नाभिक के संपर्क में आ जाता है। शोर डेटा में सच्चे संपर्क बिंदु की पहचान करना एक चुनौती है, और यह देखने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि संपर्क क्षेत्र लोचदार मॉडल ⁶⁰ के लिए फिट है या नहीं। इस विशेष प्रयोग में, यह भी देखा जा सकता है कि बाद के इंडेंटेशन के परिणामस्वरूप गहरे संपर्क बिंदुओं के साथ घटता है, जो मनका वापस लेने के बाद बहुत धीमी गति से परमाणु आकार वसूली के लिए संकेत देता है और नाभिक विस्कोइलिस्टिक सामग्री गुणों द्वारा परिभाषित हाइस्टेरेटिक चक्र में बदलाव (चित्रा 8 सी)। इस प्रकार, शोधकर्ता को पता होना चाहिए कि क्या ऐसा होता है और इसे विश्लेषणात्मक पाइपलाइन में शामिल करें, या बाद के मापों की संख्या को प्रतिबंधित करें जैसे कि यह प्रभाव माप को संशोधित नहीं करता है।

निलंबन में कोशिकाओं में नाभिक यांत्रिकी और 10 μm कारावास के तहत
उपर्युक्त दृष्टिकोण का उपयोग चिपकने वाले सब्सट्रेट और सीमित कोशिकाओं पर निलंबित कोशिकाओं में नाभिक तनाव छूट की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। हमारे परिणामों से पता चलता है कि कारावास के परिणामस्वरूप अनुमानित क्षेत्र (चित्रा 9 ए) का विस्तार होता है, लेकिन परमाणु कठोरता में महत्वहीन परिवर्तन (चित्रा 9 बी)। हमने इसी तरह के विश्राम को π = 6.08 ± 1.1 s (असीमित) और π = 4.00 ± 0.6 s (कारावास) के साथ मापा, जो तेजी से विस्कोइलिस्टिक अपव्यय को इंगित करता है, इसके बाद एक संग्रहीत बल मान होता है जो नाभिक के लोचदार मापांक से मेल खाता है। प्रयोगात्मक विविधताओं के लिए खाते में, जो इंडेंटेशन रूटीन में विभिन्न प्रारंभिक स्थितियों द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, मापा संग्रहीत बलों को इंडेंटेशन गहराई तक सामान्यीकृत किया गया था, जैसा कि । यह पैरामीटर नाभिक कठोरता के लिए खाता है और एक निश्चित इंडेंटेशन के लिए आवश्यक बल, या तनाव का वर्णन करता है। हमने कारावास के तहत और असीमित कोशिकाओं में समान कठोरता प्राप्त की: = 20.1 ± 12.6 pN / μm और = 24.6 ± 13.6 pN / μm (मानक विचलन ± मतलब), क्रमशः।

चित्र1: एक-कोशिका (युग्मनज) चरण में ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन. (A) इंजेक्शन प्लेट: इंजेक्शन के लिए एक त्रिकोणीय आकार की इंजेक्शन प्लेट का उपयोग किया जाता है। प्लेट E3 (अंडे के माध्यम) में 1% ultrapure agarose से बना है। दाईं ओर ऊपर और साइड दृश्य दिखाए गए हैं। (बी) भ्रूण की स्थिति: धीरे से एक ब्रश का उपयोग करके भ्रूण को उन्मुख करें और इस तरह से उन्मुख करें कि एक-कोशिका स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही है और सुई के साथ आसानी से सुलभ है। हम सुई के विपरीत पक्ष में स्थित कोशिका के साथ भ्रूण को उन्मुख करने का सुझाव देते हैं, जैसा कि स्केच में दिखाया गया है। (सी) एक-कोशिका चरण भ्रूण में इंजेक्शन प्रक्रिया: भ्रूण के चारों ओर कोरियन और सुई के साथ एकल कोशिका को छेदना। सुनिश्चित करें कि सुई की नोक सेल के अंदर है और इंजेक्ट करने के लिए दबाव जारी करें। (डी) भ्रूण को 28-31 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि वे ब्लास्टुला (गोले) चरण (4 एचपीएफ) तक विकसित न हो जाएं। सेल अलगाव प्रोटोकॉल और सेल स्टेनिंग (चरण 2) का प्रदर्शन करें और संबंधित सब्सट्रेट सतह कोटिंग (चरण 3) के साथ संयुक्त निलंबन और / या कारावास में अलग-थलग कोशिकाओं के साथ ऑप्टिकल ट्रैपिंग चैंबर तैयार करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2: ऑप्टिकल चिमटी उपकरण की तैयारी. (ए) कांच के नीचे के व्यंजनों पर एक परिभाषित ऊंचाई के साथ पीडीएमएस की स्पिन-कोटिंग परतें। पीडीएमएस ड्रॉप केन्द्रापसारक बल के कारण समान रूप से फैल जाएगा। (बी) पीडीएमएस परत से नमूना कक्ष की तैयारी। 1: एक scalpel, 2 के साथ एक वर्ग में कटौती: concanavalin ए (ConA), धोने और बीज कोशिकाओं के साथ आंतरिक अच्छी तरह से कोट; 3: अच्छी तरह से सील करने के लिए एक ग्लास स्लाइड या कवर स्लिप के साथ कवर करें। (सी) एक स्केलपेल के साथ वर्ग काटने और संदंश के साथ पीडीएमएस को अच्छी तरह से हटाने की तस्वीर। (डी) फँसाने कक्ष पर ऑप्टिकल बल संवेदक के संग्रह लेंस बढ़ते. विसर्जन तेल की एक बूंद संग्रह लेंस और ऊपरी ग्लास कवर के बीच एक विसर्जन माध्यम के रूप में कार्य करती है। स्केल करने के लिए योजनाबद्ध नहीं है। नमूना पकवान के ग्लास कवर को छूने के लिए एकत्र लेंस को कम करते समय सावधान रहें। (ई) नमूने के संपर्क में बल का पता लगाने वाली इकाई का चित्र। (च) प्रयोगात्मक सेट-अप की योजनाबद्ध। ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन मॉड्यूल एक निरंतर तरंग लेजर बीम (5W, π = 1064 एनएम) का उपयोग करता है जिसमें एक अर्ध-तरंग प्लेट (HWP) और एक ध्रुवीकरण बीम विभाजक (बीएस) के माध्यम से बिजली नियंत्रण होता है। AODs की एक जोड़ी के साथ modulated होने के बाद, यह एक उल्टे माइक्रोस्कोप के ऊपरी epifluorescence बंदरगाह के लिए युग्मित है। लेजर बीम को तब 950 एनएम शॉर्ट-पास डाइक्रोइक मिरर (आईआर-डीएम) द्वारा परिलक्षित किया जाता है, जो प्रतिदीप्ति उत्तेजना और उत्सर्जन के संचरण के लिए अनुमति देता है। फँसाने लेजर को माइक्रोस्कोप (ऊपरी बुर्ज) के पीछे, एपिफ्लोरेसेंस पोर्ट में निर्देशित किया जाता है। ओटी को पानी-विसर्जन उद्देश्य लेंस (60x, एनए = 1.2) के फोकल प्लेन में बनाया गया है। ऑप्टिकल फोर्स सेंसर को माइक्रोस्कोप बुर्ज द्वारा अधीन किया जाता है और एक उच्च-एनए, तेल-विसर्जन लेंस के साथ ओटी से उभरने वाले लेजर प्रकाश को कैप्चर करता है। उसी समय, बल सेंसर उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी को सक्षम बनाता है। कताई-डिस्क confocal इकाई बाएँ पोर्ट के लिए युग्मित है। यह दो एकीकृत लेजर इंजन (ILE) से सुसज्जित है जो सात प्रतिदीप्ति उत्तेजना लेजर और दो बैक-प्रबुद्ध एससीएमओएस कैमरों को नियंत्रित करता है, जो समानांतर एबीबी में दोहरी फ्लोरोफोर इमेजिंग के लिए सक्षम करता है: टीआई, ट्रांसिल्यूमिनेटर; एफएस, फ़ील्ड स्टॉप; AOD, acustooptical deflector; HWP, आधा लहर प्लेट; कैम, कैमरा (जी) ऑप्टिकल फँसाने उपकरण की तस्वीर. लाल सर्कल बर्ट्रेंड लेंस को इंगित करता है, जिसे मैन्युअल रूप से ऑप्टिकल पथ में स्विच किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3: सही नमूनों और मापदंडों का चयन करना। (ए) इंडेंटेशन प्रयोग करने के लिए नाभिक के काफी करीब स्थित एक एकल माइक्रोस्फीयर के साथ एक अलग जेब्राफ़िश पूर्वज स्टेम सेल की प्रतिनिधि छवि। स्केल बार = 10 μm. (बी) अनुकरणीय जाल प्रक्षेपवक्र; इंडेंटेशन गहराई 5 μm; इंडेंटेशन गति = 5 μm / s; विश्राम समय 10 s. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 4: विकास के दौरान ज़ेबराफ़िश भ्रूण के अंदर माइक्रोबीड स्थानीयकरण। 1 μm लाल फ्लोरोसेंट मोतियों के 0.5 nL को डब्ल्यूटी भ्रूण में जीपीआई-जीएफपी एमआरएनए (100 पीजी / भ्रूण, प्लाज्मा झिल्ली) के साथ एक साथ इंजेक्ट किया जाता है ताकि मनका स्थानीयकरण की कल्पना की जा सके। (A-D) 0.75% agarose में घुड़सवार एक भ्रूण के अंदर माइक्रोस्फीयर 5 ज पोस्ट इंजेक्शन का वितरण। (ए) ब्राइटफील्ड और प्रतिदीप्ति छवि। मोतियों को भ्रूण ऊतक में समरूप रूप से फैलाया जाता है जैसा कि एक कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ में देखा गया है। (बी) कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति जेड-स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण। मोतियों को छवि स्टैक में उनकी जेड-स्थिति के अनुसार बैंगनी से पीले रंग में रंग-कोडित किया जाता है। बैंगनी / मैजेंटा सबसे बाहरी मोतियों / कोशिकाओं (ईवीएल; उपकला आवरण परत; या ईवीएल सतह के करीब स्थित पूर्वज स्टेम कोशिकाओं) से मेल खाती है, पीला आंतरिक मोतियों (पूर्वज गहरी कोशिकाओं) से मेल खाता है, जैसा कि दाईं ओर स्केच में दिखाया गया है। (सी) नारंगी बॉक्स में क्षेत्र के अनुरूप (बी) के एक उप-स्टैक का कट और अधिकतम प्रक्षेपण: गहरी कोशिकाओं के एक बड़े अंश में 1-2 मोती होते हैं। (डी) मैजेंटा बॉक्स के अनुरूप (बी) के एक उप-स्टैक का कट और अधिकतम प्रक्षेपण: कुछ ईवीएल कोशिकाओं में 1-2 मोती होते हैं। (ई) ब्राइटफील्ड छवि और 24 एचपीएफ भ्रूण के जेड-स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण 0.75% एगारोज़ में घुड़सवार और ट्राइकेन के साथ एनेस्थेटिक। भ्रूण को 15 मिनट के लिए ट्राइकेन के साथ पूर्व-ऊष्मायन किया गया था। बाएं से दाएं: माइक्रोस्फियर (1 μm व्यास), GPI-GFP और छवि ओवरलैप। भ्रूण के पूरे शरीर में वितरित किए गए मोतियों। स्केलबार आयाम प्रत्येक पैनल में इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 5: अलग-अलग लेबलिंग के साथ अलग-अलग ज़ेबराफ़िश पूर्वज स्टेम कोशिकाएं। (ए) 1 (शीर्ष) या 2 (नीचे) इंजेक्ट किए गए मोतियों के साथ निलंबन कोशिकाओं की संचरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि। सियान तीर मोतियों पर इंगित करते हैं। (बी) विभिन्न धुंधला के साथ निलंबन कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट confocal छवियों. ऊपर-बाएँ: Lap2b-eGFP (आंतरिक परमाणु झिल्ली, 80 पीजी / भ्रूण) और H2A-mCherry। शीर्ष-दाएं: जीपीआई-जीएफपी (प्लाज्मा झिल्ली, 100 पीजी / भ्रूण) और डीएनए-होचस्ट (खंड 2 में वर्णित के रूप में दाग)। नीचे-बाएँ: MyI12.1-eGFP (ट्रांसजेनिक लाइन) और डीएनए-Hoechst. नीचे-दाएं: Calbryte488 और डीएनए-Hoechst (अनुभाग 2 में वर्णित के रूप में दाग)। (C) 1 (शीर्ष) या 2 (नीचे) इंजेक्ट किए गए मोतियों के साथ सीमित कोशिकाओं की संचरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि। सियान तीर मोतियों पर इंगित करते हैं। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्र 6: कताई डिस्क फिल्मों से परमाणु विरूपण का अनुमान लगाना। (A,B) (A) एक निलंबित कोशिका और (B) एक सीमित कोशिका में नाभिक के इंडेंटेशन प्रयोग का समय-अंतराल। स्केल बार 10 μm. एक Hoechst-लेबल नाभिक के प्रतिनिधि स्नैपशॉट एक ऑप्टिकल रूप से फंसे माइक्रोस्फीयर (सफेद एरोहेड) के साथ इंडेंटेशन के बाद 5 s पहले, दौरान, और 5 s दिखाए जाते हैं। इंडेंटेशन सेगमेंट (लाल रेखा, दाएं पैनल) के साथ Kymographs। _x1 और _x2 समीकरण 1 के लिए तीव्रता प्रोफ़ाइल के फिट से निकाले गए इंडेंटेशन प्रयोग के दौरान नाभिक की दूरस्थ और समीपस्थ (मनका के करीब) सीमाएं हैं। (सी) तीन अलग-अलग फ्रेम (इंडेंटेशन से पहले, दौरान और बाद में) के लिए इंडेंटेशन सेगमेंट के साथ तीव्रता प्रोफाइल और नाभिक किनारों के डिस्टल, एक्स ₁ और समीपस्थ, एक्स ₂, पदों का आकलन करने के लिए समीकरण 1 में फिट किया गया है। (डी) निलंबित और सीमित कोशिकाओं (₁₀ μm) के इंडेंटेशन प्रयोग के दौरान एम्बर में x1 (t) और एम्बर में _x2 (t) के प्रतिनिधि प्रक्षेपवक्र। छायांकित क्षेत्र इंडेंटेशन को इंगित करते हैं, _x1 और _x2 के बीच की दूरी नाभिक व्यास को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 7: बल संकेत प्रसंस्करण। (A) एक ऑप्टिकल रूप से फंसे हुए माइक्रोस्फीयर की योजनाबद्ध, जो इंडेंटेशन पर सेल नाभिक को विकृत करती है। परमाणु झिल्ली और ऑप्टिकल बलों को काले तीरों द्वारा इंगित किया जाता है। बीम संवेग में परिवर्तन हरे तीर _पाउट द्वारा इंगित किया गया है। (बी) ट्रैप प्रक्षेपवक्र (ऊपर) और बल (नीचे) एक बार-बार परमाणु इंडेंटेशन प्रयोग के दौरान ऑप्टिकल रूप से फंसे माइक्रोस्फीयर द्वारा अनुभव किया जाता है। (c) अधिकतम इंडेंटेशन गहराई पर बल शिखर के बाद बल छूट क्षय। इनसेट मानक रैखिक ठोस की एक योजनाबद्ध दिखाता है जिसकी गतिशीलता यहां phenomenological टिप्पणियों का अनुमान लगाती है। (डी) बाएं: सामान्यीकृत बल बनाम समय का लघुगणक। छायांकित क्षेत्र डबल घातीय क्षय (लाल रेखाओं) को फिट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा भाग को इंगित करते हैं। दाएँ: समय के लघुगणक बनाम सामान्यीकृत बल का लघुगणक। छायांकित क्षेत्र पावर कानून को फिट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा भाग को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 8: त्रिकोणीय जाल विस्थापन के साथ बल इंडेंटेशन रूटीन। (A) ₁₀ μm कारावास ऊंचाई में एक सेल पर लिए गए त्रिकोणीय इंडेंटेशन प्रयोग के दौरान नीले रंग में x1 (t) और एम्बर में _x2 (t) का प्रतिनिधि प्रक्षेपवक्र। शीर्ष: जाल की स्थिति. मध्य: नाभिक आकार विश्लेषण। _x1 और _x2 के बीच की दूरी नाभिक व्यास को इंगित करती है। नीचे: बल संकेत. (बी) लगातार आठ इंडेंटेशन के लिए बल बनाम जाल की स्थिति। (सी) अपव्यय का विकास, प्रत्येक बाद की इंडेंटेशन घटना के लिए नाभिक के एफ-डी वक्र के दृष्टिकोण और वापसी भाग के बीच हिस्टैरिसिस से व्युत्पन्न। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 9. निलंबन (चिपकने वाली सतह) में कोशिकाओं के परमाणु गुण और ट्रेपोज़ॉइडल रूटीन से कारावास। (ए) निलंबन में कोशिकाओं से नाभिक का अनुमानित क्षेत्र और 10 μm कारावास के तहत। काली पट्टी माध्यिका का प्रतिनिधित्व करती है। (बी) निलंबन और कारावास के तहत कोशिकाओं की परमाणु कठोरता। काली पट्टी माध्यिका का प्रतिनिधित्व करती है। Kruskal-Wallis परीक्षण MatLab का उपयोग कर से व्युत्पन्न पी मूल्यों. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: ऑप्टिकल चिमटी सॉफ्टवेयर द्वारा परिभाषित ट्रेपोज़ॉइडल प्रक्षेपवक्र। पहली (दूसरी) पंक्ति x (y) दूरी है कि जाल रैखिक रूप से विस्थापित हो जाएगा। तीसरी पंक्ति पर, किसी दिए गए चरण की अवधि सेकंड में सेट की जाती है। यह प्रक्षेपवक्र सात बिंदुओं से बना है और चित्रा 7 बी में नाभिक के खिलाफ दो बार लोड किए गए ट्रेपोज़ॉइड से मेल खाता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: ऑप्टिकल चिमटी सॉफ्टवेयर द्वारा परिभाषित त्रिकोणीय प्रक्षेपवक्र। तालिका 2 के अनुरूप, यह प्रक्षेपवक्र 16 बिंदुओं से बना है, जो 5 μm की गहराई और 2.5 μm/ s के वेग पर आठ इंडेंटेशन घटनाओं के अनुरूप है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 3: चित्रा 7 में डेटा के लिए फिटिंग पैरामीटर। आईजी: प्रारंभिक अनुमान। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा S1: ऑप्टिकल बल सेंसर संरेखण और गति बेसलाइन मुआवजा. (ए) फील्ड स्टॉप को बर्ट्रेंड लेंस के माध्यम से सहायक कैमरे (AUX, चित्रा 2) पर चित्रित किया गया है। विसर्जन तेल में एक हवा का बुलबुला दिखाई देता है, जो आईपीस के माध्यम से दिखाई नहीं देता है। (बी) स्वच्छ ऑप्टिकल पथ। सटीक संरेखण के लिए, फ़ील्ड स्टॉप को खोलें और इसे NA = 1.2 प्रकाश शंकु के साथ मेल खाएं। (c) नमूना विमान की छवि। लाल वर्ग ओटी कार्य क्षेत्र को इंगित करता है। स्केल बार: 20 μm. (D) ट्रैप पावर को FOV में मापा जाता है, जिसमें C में इंगित सफेद डबल तीर होते हैं। लाल रंग में, जाल शक्ति भिन्नता जब कोई सुधार लागू किया जाता है। नीले रंग में, जाल शक्ति दृश्य के पूरे क्षेत्र पर सही है। (ई) एक ही सीमा के साथ संवेग आधार रेखा का एक्स-घटक। लाल रंग में, गैर-सही ट्रेस। नीले रंग में, ट्रेस जाल शक्ति के लिए सही है. हरे रंग में, ट्रेस निर्माता के सॉफ़्टवेयर में वैश्विक ऑफसेट क्षतिपूर्ति का उपयोग कर गति आधार रेखा के लिए सही है। (एफ) वाई-घटक के लिए ई के समान। ध्यान दें कि सामान्य संचालन के तहत, छायांकित घटकों का उपयोग यांत्रिकी और बल माप के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए, एक्स समन्वय के साथ आंदोलन के दौरान एक्स बल घटक और वाई-अक्ष के साथ आंदोलन के दौरान वाई बल घटक। सभी सुधारों को लागू करने के बाद, <0.5 पीएन का एक आरएमएसडी शोर प्राप्त होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S2: कमजोर जाल के कारण एक असफल दिनचर्या। (ए) एक असफल दिनचर्या से नाभिक इंडेंटेशन दिखाने वाला काइमोग्राफ। जाल से मनका के भागने के कारण केवल छोटे, क्षणिक विरूपण दिखाई देते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, फँसाने वाला लेजर अभी भी पूर्वनिर्धारित प्रक्षेपवक्र (हरी बिंदीदार रेखा) को पूरा करने के लिए मनका के बिना चलता है। स्केल बार = 10 μm. (बी) शीर्ष: जाल स्थिति बनाम समय. मध्य: इंडेंटेड समीपस्थ और डिस्टल नाभिक किनारे के किनारे ट्रैकिंग परिणाम। ध्यान दें कि डिस्टल एज इंडेंटेशन के बिना नहीं चल रहा है जैसा कि आमतौर पर चिपकने वाले सब्सट्रेट पर अलग-थलग कोशिकाओं पर पूर्ण दिनचर्या के लिए मनाया जाता है। नीचे: बल बनाम समय थर्मल शोर में कमी और शून्य बल के लिए अचानक गिरावट द्वारा इंगित माइक्रोस्फीयर के नुकसान को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S3: इंजेक्ट किए गए भ्रूण की उत्तरजीविता। प्रोटोकॉल में उल्लिखित सांद्रता में 1 μm मोतियों और mRNA के 100 pg / भ्रूण के साथ इंजेक्ट किए गए भ्रूण की तुलना बिना इंजेक्शन वाले भ्रूण से की गई थी और निषेचन के बाद कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया गया था। प्रत्येक प्रयोग के लिए प्रति शर्त 21 भ्रूण > एन के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों का माध्य और मानक विचलन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम जीवित कोशिकाओं के अंदर कोशिका नाभिक के यांत्रिक गुणों से पूछताछ करने के लिए एक अनूठी विधि का वर्णन करते हैं। अन्य बल स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीकों के लिए अलग, गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल ट्रैपिंग ने हमें सेल परमाणु कठोरता से सेल झिल्ली और साइटोस्केलेटन के योगदान को कम करने की अनुमति दी। महत्वपूर्ण रूप से, ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन मल्टीमॉडल माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है, जो प्रयोगकर्ता को सेल परमाणु मेचानोबायोलॉजी में शामिल विभिन्न प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देगा। एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, हमने कई सैकड़ों पिकोन्यूटन के आदेश के बलों द्वारा किए गए इंडेंटेशन पर नाभिक विरूपण को मापने के लिए डीएनए-होचस्ट स्टेनिंग का उपयोग किया।

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित उदाहरणों से परे हमारी विधि के संभावित अनुप्रयोग
बाहरी बाधाओं के बिना जीवित कोशिकाओं के अंदर माप से मात्रात्मक यांत्रिक जानकारी निकालने की संभावना अभूतपूर्व अवसरों की अधिकता को सक्षम करती है जो अभी-अभी पता लगाना शुरू कर रहे हैं। इस प्रकार, हमारे ऑप्टिकल माइक्रोमैनिपुलेशन प्लेटफ़ॉर्म के प्रस्तुत प्रोटोकॉल को महान बहुमुखी प्रतिभा के साथ अधिक जटिल प्रयोगों तक बढ़ाया जा सकता है। Acousto-ऑप्टिक deflectors (AOD) विभिन्न सेल स्थानों में तुल्यकालिक बल माप के लिए कई ऑप्टिकल जाल उत्पन्न कर सकते हैं, साथ ही साथ एक विस्तृत आवृत्ति रेंज ^51,61 में सक्रिय माइक्रोरहोलॉजी के लिए उपयोग किया जा सकता है। जैसा कि उल्लेख किया गया है, इंडेंटेशन पर बल प्रतिक्रिया अधिकतम फँसाने वाले बल को दूर कर सकती है, जिससे ऑप्टिकल ट्रैप से मनका का पलायन हो सकता है। इस मामले में, ऑप्टिकल बल को क्लैंप करने के लिए एओडी के साथ एक बल प्रतिक्रिया को कॉन्फ़िगर किया जा सकता है। कुल मिलाकर, कई माइक्रोरियोलॉजिकल दृष्टिकोण, जैसे कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित तनाव छूट, लेकिन सक्रिय माइक्रोरहोलॉजी या रेंगना अनुपालन भी, इस मंच के साथ प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त किया जा सकता है और उपन्यास सॉफ़्टवेयर ^{पैकेज61,62,63,64,65} द्वारा पूरी तरह से विश्लेषण किया जा सकता ^है। . इसके अलावा, बलों का अनुप्रयोग नाभिक तक सीमित नहीं है, लेकिन सिद्धांत रूप में विविध इंट्रासेल्युलर संरचनाओं को मापने के लिए और जटिल ऊतकों में किया जा सकता है जैसा कि बरकरार रक्त वाहिकाओं के अंदर बहने वाली लाल रक्त कोशिकाओं को फँसाने के लिए प्रदर्शित किया गया ^है66,67 या क्लोरोप्लास्ट और माइटोकॉन्ड्रिया को फँसाने और विकृत करने के लिए प्रदर्शित किया गया ^है68 . प्रकाश-संवेग अंशांकन फंसी हुई वस्तु के आकार और आकार से स्वतंत्र है, इसलिए मनमाने ढंग से आकार ^38,39 के साथ किसी भी बल जांच पर प्रत्यक्ष बल माप को सक्षम करता ^है। इंजेक्ट किए गए माइक्रोस्फीयर के उपयोग ने हमें सेलुलर संरचनाओं के प्रत्यक्ष हेरफेर की तुलना में अपेक्षाकृत कम लेजर शक्ति के साथ नाभिक पर उच्च बलों को लागू करने की अनुमति दी69,70,71। हालांकि, एक उच्च पर्याप्त अपवर्तक सूचकांक अंतर को देखते हुए, कोई बाहरी रूप से लागू बल जांच आवश्यक नहीं है और इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल को इंजेक्ट किए गए मोतियों (अप्रकाशित टिप्पणियों और संदर्भ ⁷⁰) के बिना सीधे हेरफेर किया जा सकता है।

अनुप्रयोगों का विस्तार करने के लिए हमारी विधि के संभावित संशोधनों
प्रयोग के आधार पर माइक्रोबीड्स के विभिन्न आकारों को इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन सापेक्ष नियंत्रण किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, बाद के चरणों में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए छोटे मोतियों को इंजेक्ट किया जा सकता है। यह ऑप्टिकल ट्रैप द्वारा लगाए जा सकने वाले अधिकतम बल को कम कर देगा (जैसे कि संदर्भ ⁵⁵ में दिखाया गया है)। बड़े मोतियों को उच्च बलों को लागू करने के लिए इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन ये उनके आकार या रुचि के चरण के आधार पर भ्रूण के विकास को प्रभावित कर सकते हैं। प्रयोगों में जहां माइक्रोबीड इंजेक्शन एक विकल्प नहीं है, साइटोप्लाज्म की तुलना में अपवर्तक सूचकांक अंतर प्रदर्शित करने वाले विभिन्न ऑर्गेनेल को अभी भी ऑप्टिकल रूप से हेरफेर किया जा सकता है, जिससे प्रकाश गति परिवर्तन ⁴² से औसत दर्जे के ऑप्टिकल बलों को जन्म मिलता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, इन विधियों को ड्रोसोफिला भ्रूण ⁷⁰ में सेल-सेल जंक्शनों को विकृत करने के लिए बंबार्डेकर एट अल द्वारा नियोजित किया गया है। इसी तरह, सेल के नाभिक में आसपास के माध्यम ⁴⁴ की तुलना में कम अपवर्तक सूचकांक होता है, जो मनका-मुक्त इंडेंटेशन (अप्रकाशित टिप्पणियों और संदर्भ ⁷²) के लिए अनुमति देता है, भले ही कम फँसाने की ताकत के साथ। इस प्रकार, नाभिक को आसानी से नहीं फंसाया जा सकता है और जाल से बच जाता है।

स्पिन-लेपित पीडीएमएस स्पेसर एक सुविधाजनक और तेज विधि के माध्यम से गढ़ा गया है, लेकिन एक माइक्रो-/ नैनोफैब्रिकेशन सुविधा या इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं तक पहुंच के बिना प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच से बाहर हो सकता है। इस प्रकार, स्पेसर को आसानी से प्रयोगशाला टेप या पैराफिल्म (चरण 4) से इकट्ठा किया जा सकता है। प्रोटोकॉल को माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के निर्माण द्वारा भी अनुकूलित किया जा सकता है जो एकल कोशिकाओं के वितरण को पूर्वनिर्धारित माप कुओं में या एक ही नमूने के भीतर कारावास प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए एक परिभाषित ऊंचाई वाले कक्ष में स्वचालित करते हैं। हालांकि, इस तरह के माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को डिज़ाइन किया जाना चाहिए ताकि वे माइक्रोस्कोप उद्देश्य और ऑप्टिकल फोर्स सेंसर के संग्रह लेंस के बीच की जगह को फिट कर सकें, लगभग 2 मिमी (चरण 3 देखें)। ध्यान दें कि ऑप्टिकल बल सेंसर को उचित ऊंचाई पर तैनात किया जाना चाहिए ताकि डीफोकसिंग से कोई ऑप्टिकल विपथन फोटॉन संवेग माप को प्रभावित न करे।

अन्य संशोधनों में जैविक पत्रकारों का परिवर्तन शामिल हो सकता है। हमने पाया कि Hoechst प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय रूप से GFP चैनल में खून बहता है और हम इस प्रकार दो फ्लोरोसेंट चैनलों में एक साथ माप के लिए एक परमाणु मार्कर के रूप में mCherry-टैग हिस्टोन के साथ संयोजन का पक्ष लेते हैं। वैकल्पिक रूप से, परमाणु विरूपण को आसानी से आंतरिक परमाणु झिल्ली जैसे Lap2b-GFP (चित्रा 2) के लिए लक्षित लेबल के साथ ट्रैक किया जा सकता है।

सेल नाभिक पर इंडेंटेशन 2-3 माइक्रोन के क्रम का था, जिसे हम विवर्तन-सीमित कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के छवि विश्लेषण द्वारा सटीक रूप से माप सकते थे। stiffer नाभिक या छोटे बलों के मामले के लिए, इंडेंटेशन इस दृष्टिकोण का उपयोग करके मुश्किल से औसत दर्जे का होगा। हालांकि, निरपेक्ष बल-कैलिब्रेटेड ऑप्टिकल चिमटी को नैनोमीटर सटीकता ⁵¹ के साथ बीएफपी इंटरफेरोमेट्री का उपयोग करके सीटू में फंसे मनके की स्थिति माप के लिए भी कैलिब्रेट किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, वोल्टेज सिग्नल और ऑप्टिकल फोर्स सेंसर को पैरामीटर β [nm / V] के माध्यम से फंसे हुए जांच की स्थिति में अनुवादित किया जा सकता है, जबकि अपरिवर्तनीय पैरामीटर α [pN / V] उपर्युक्त प्रकाश-संवेग अंशांकन ⁴¹ के माध्यम से बल मूल्यों की पैदावार करता है (विवरण के लिए नीचे देखें)।

समस्या निवारण
हमने पाया कि प्रयोग के दौरान निम्नलिखित चुनौतियां हो सकती हैं:

कोई स्थिर जाल नहीं बनता है और माइक्रोस्फीयर आसानी से बच जाता है
माइक्रोस्कोप उद्देश्य या एक misaligned सुधार कॉलर पर किसी भी गंदगी एक स्थिर जाल की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यदि कोई तात्कालिक समाधान नहीं मिलता है, तो उद्देश्य लेंस के बिंदु-प्रसार फ़ंक्शन को मापें। यदि ब्याज का नमूना ऑप्टिकल रूप से घने ऊतक के अंदर गहरा है, तो लेजर फोकस गंभीर ऑप्टिकल विपथन का अनुभव कर सकता है जिससे अस्थिर फँसाया जा सकता है (यह प्रभाव आमतौर पर अलग-थलग कोशिकाओं में नगण्य होता है लेकिन मोटे ऊतकों में अधिक स्पष्ट हो जाता है)। उच्च कठोरता के लिए, नाभिक का पुनर्स्थापना बल जाल के भागने के बल से अधिक हो सकता है, जैसे कि माइक्रोस्फीयर खो जाता है और इंडेंटेशन रूटीन विफल हो जाता है। प्रारंभ में, ऑप्टिकल ट्रैप के निकटस्थ परमाणु झिल्ली किनारे को शायद ही इंडेंट किया जाता है (चित्रा S2A)। जब ऐसा होता है, तो फँसाने वाला लेजर अब बल और ब्राउनियन गति से प्रभावित नहीं होता है, जो शून्य तक बल ड्रॉप और सिग्नल शोर (चित्रा S2B) की कमी की ओर जाता है। यदि ऐसा होता है, तो लेजर शक्ति को एक मजबूत जाल के लिए बढ़ाया जा सकता है, नाभिक में मनका को धक्का देने वाले ट्रेपोज़ॉइडल प्रक्षेपवक्र के आयाम को कम किया जा सकता है, या फंसे हुए माइक्रोबीड की प्रारंभिक स्थिति को नाभिक से आगे सेट किया जा सकता है।

उत्तेजना के दौरान कोशिका चल रही है
यदि कोशिकाएं पर्याप्त रूप से जुड़ी नहीं हैं, तो ऑप्टिकल ग्रेडिएंट ट्रैप इंट्रासेल्युलर इंडेंटेशन रूटीन का प्रदर्शन करते समय कोशिकाओं को स्थानांतरित कर देगा, जैसे कि नाभिक के बल और अंतर्निहित यांत्रिकी कलाकृतियों हैं। पूरे सेल के विस्थापन को रोकने के लिए, हम सतह पर सेल आसंजन अणुओं की एकाग्रता बढ़ाने की सलाह देते हैं, उदाहरण के लिए, कोना।

प्रारंभिक गति मुआवजा
यदि OTs प्लेटफ़ॉर्म (चरण 6.5) में एक प्रारंभिक संवेग मुआवजा रूटीन उपलब्ध नहीं है, तो एक कृत्रिम, बल-स्वतंत्र बेसलाइन सिग्नल को सही करने की आवश्यकता होती है। यह बल वक्र पर एक ढलान के रूप में दिखाई देता है, यहां तक कि कोई मनका फंस (चित्रा S1E) के साथ भी। सुधार करने के लिए, एक ही प्रक्षेपवक्र को एक मनका के बिना प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है, सेल के बाहर बिल्कुल उसी स्थिति में। इसके लिए, चरण नियंत्रण का उपयोग करके सेल को जाल से दूर ले जाएं। एक संदर्भ के रूप में, बल ऑफसेट हमारे सिस्टम में 200 mW पर FOV भर में 5 pN बदलता है; इस प्रकार, यह छोटे प्रक्षेपवक्रों के लिए नगण्य हो जाता है। वैकल्पिक रूप से, नमूने पर कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक पीजो स्कैन चरण का उपयोग किया जा सकता है, जिससे लेजर स्थिति स्थिर हो जाती है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरण
भ्रूण पर अधिकतम वितरण सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्फियर को दाईं ओर, 1-सेल चरण में इंजेक्ट किया जाना चाहिए। मोतियों को फ्लोरोसेंट नहीं होना चाहिए ताकि इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट चैनलों में कोई प्रकाश लीक न हो। उदाहरण के लिए, यहां तक कि विशिष्ट लाल-फ्लोरोसेंट मोती भी नीले चैनल में स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं जो उनकी चमक के कारण होचस्ट स्टेनिंग के बाद सेल नाभिक को इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है (उत्तेजना: 405 एनएम; उत्सर्जन: 445 एनएम)। सब्सट्रेट के लिए सेल का स्थिर लगाव इंडेंटेशन रूटीन के दौरान पार्श्व विस्थापन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि सेल दिनचर्या के दौरान चलता है, तो बलों को कम करके आंका जाता है। क्या यह अक्सर होता है, अनुलग्नक प्रोटोकॉल को ऑप्टिमाइज़ करें। ऊतक संस्कृति कोशिकाओं के लिए, अन्य सेल आसंजन प्रोटीन, जैसे कि फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन, या पॉली-एल-लाइसिन संतोषजनक लगाव (अप्रकाशित अवलोकन) का कारण बनते हैं। कारावास के दौरान, कोशिकाओं को अचानक और गंभीर यांत्रिक तनाव के अधीन किया जाता है। यह कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है और अक्सर प्रयोगकर्ता को फटी हुई कोशिकाओं का सामना करना पड़ेगा यदि प्रक्रिया सावधानीसे नहीं की जाती है। इसके अलावा, यदि कारावास की ऊंचाई बहुत छोटी है, तो सभी कोशिकाएं परमाणु आवरण टूटने या अपरिवर्तनीय क्षति से पीड़ित होंगी। इन्हें कम करने के लिए, ऊपरी कवरस्लिप को अधिक धीरे-धीरे कम करें और / या कवरस्लिप के बीच की दूरी को बढ़ाएं।

तकनीक की सीमाएं और उन्हें दूर करने के लिए सुझाव
तकनीक की एक स्पष्ट सीमा ऊतक के गहरे वर्गों में लेजर प्रकाश का प्रवेश है, जो विपथन और अस्थिर फँसाने की ओर जाता है। इस प्रकार, प्रवेश गहराई की एक निचली सीमा नमूने की स्पष्टता पर निर्भर करती है, विपथन सुधार जिसे नियोजित किया जा सकता ^है73 और लागू लेजर शक्ति। यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि एक उच्च लेजर शक्ति माइक्रोस्फीयर के आसपास के क्षेत्र में नमूने के थर्मल उत्तेजना की ओर ले जाती है। हालांकि, 1064 एनएम तरंग दैर्ध्य लेजर स्पॉट द्वारा उत्पन्न नमूने के हीटिंग को हमारे जैविक नमूनों पर प्रशंसनीय गर्मी से संबंधित तनाव से बचने के लिए कम से कम किया जाता ^है74।

एक अन्य सीमा अधिकतम बल है जिसे मापा जा सकता है। भले ही प्रत्यक्ष प्रकाश-संवेग का पता लगाने से ऑप्टिकल ट्रैप ^40,41 के रैखिक प्रतिक्रिया शासन से परे बल माप को सक्षम बनाता है, अधिकतम लागू बल कुछ सौ पिकोनिउटन्स के क्रम में है। यह लेजर शक्ति और नरम जैविक सामग्री की परिणामी क्षति सीमा और अपवर्तक सूचकांक अंतर द्वारा सीमित है, जो आमतौर पर 0.1 या ^0.344 से बड़ा नहीं होता है। बल का पता लगाने की सीमा को बढ़ाने के लिए कई तरीकों का प्रस्ताव किया गया है, उदाहरण के लिए, संरचित प्रकाश ⁷⁵, एंटी-रिफ्लेक्टिव लेपित माइक्रोस्फियर76, उच्च-अपवर्तक सूचकांक ^कण77 या अत्यधिक डोप्ड क्वांटम डॉट्स ⁷⁸ का उपयोग करके।

BFP इंटरफेरोमेट्री के माध्यम से नैनोमीटर-स्केल स्थिति माप के लिए OTs का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि जाल के भीतर मनका की स्थिति Πx = β _Sx है, जहां _Sx सेंसर का वोल्टेज सिग्नल है, और β [μm / V] को विभिन्न प्रोटोकॉल ^35,54 के बाद ऑन-द-फ्लाई कैलिब्रेट किया जा सकता है। ऑप्टिकल फोर्स सेंसर के लिए, यह साबित किया जा सकता है कि वोल्टेज-टू-फोर्स अपरिवर्तनीय रूपांतरण कारक α [पीएन / वी] सीधे β और जाल कठोरता से संबंधित है, k [pN / μm], α = k ^{π 37}) मनका विस्थापन के साथ प्रयोगों में जो ऑप्टिकल इमेजिंग से पता लगाने के लिए बहुत छोटे हैं, इस रणनीति का उपयोग छोटी स्थिति का पता लगाने के साथ बल माप को पूरक करने के लिए किया जा सकता है। एक उदाहरण यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक दिनचर्या का आवेदन है जो यहां बहुत कठोर नाभिक पर प्रस्तुत किया गया है, जिसके लिए उचित लेजर शक्तियों (200-500 mW) पर बल पर्याप्त रूप से इंडेंटेशन मूल्यों को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं। उस मामले में, मनका को नाभिक के संपर्क में लाने की आवश्यकता होती है और माप (चरण 8.6) से पहले फँसाने की कठोरता को कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। बल के एक कार्य के रूप में नाभिक के इंडेंटेशन डी को अप्रत्यक्ष रूप से इस रूप में निर्धारित किया जा सकता है:

d = _xtrap - F/k

जहां _xtrap जाल की स्थिति है। [पीएन / वी] α अपरिवर्तनीय प्रकाश-संवेग कारक से अलग, कारक β [μm / V] को प्रत्येक प्रयोग से पहले कैलिब्रेट करने की आवश्यकता होती है क्योंकि यह कई स्थानीय चरों पर निर्भर करता है जो फँसाने की गतिशीलता का निर्धारण करते हैं, जैसे कि कण आकार, ऑप्टिकल ट्रैप स्पॉट आकार, और सापेक्ष अपवर्तक सूचकांक।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 22 mm cover glasses	Ted Pella	260148
#1.5 22x60 mm Coverglasses	Ted Pella	260152
#1.5H glass bottom dishes	Willco	GWST-5040
10-um beads	Supelco	72986
1-mm glass capillaries	Harvard Apparatus	30-0020 GC100F-15
1-um polystyrene microbeads	Sigma	89904
1-um red-fluorescent beads	ThermoFisher	F8816
Agar	ThermoFisher	16500500
Aqcuisition cameras sCMOS	Andor	Sona-4BV11-UNI
Auxiliary camera (Figure 3, AUX)	Blackfly, FLIR	BFS-U3-200S6M-C
Calbryte 520	AAT Bioquest	520 AM
Centrifuge	Eppendorf	5453000011
Concanavalin A	Sigma	C5275
DMEM	Sigma	D2906
DNA-Hoechst	ThermoFisher	33342
Double scotch tape	Biesse Adesivi
E3	5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4
Eclipse Ti2	Nikon
Forceps	Fine Science Tools	11252-20
GPI-GFP
H2A-mCh
Image acquisition software	Fusion-Andor
Immersion Oil	Cargille	Type B: 16484
IR protection googles	Thorlabs	LG1
Lap2b-eGFP
Micro loader pipette	Eppendorf	GELoader
Microinjector	World Precision Instruments	SYS-PV820
MicroManager 2.0
Micromiter slide	ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions
Mineral oil	Sigma	M3616
Motorized stage	ASI
Needle puller	Sutter instrument Co.	Model P-97
Optical tweezers platform	Impetux Optics	Sensocell
OTs software (LightAce)	Impetux Optics
PDMS	Sigma	Sylgard 184
PDMS Curing agent	Sigma	Sylgard 184
Post processing software (Matlab)	Mathworks
RNAse free water	Thermofisher	AM9937
Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)	Semrock	FF01-950/SP-25
Spin-coater	Specialty Coating Systems	Spincoat G3P-8
Spinning-disk confocal microscope	Andor	DragonFly 502
Stereomicroscope	Leica M80
Triangular microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU1
Universal oven	Memmert	UNB 200
Water immersion objective	Nikon	MRD07602