Direkte kraftmålinger af subcellulære mekanikker i indespærring ved hjælp af optisk pincet

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at undersøge de intracellulære mekaniske egenskaber af isolerede embryonale zebrafiskceller i tredimensionel indespærring med direkte kraftmåling ved en optisk fælde.

Abstract

Under udviklingen af en flercellet organisme deler en enkelt befrugtet celle sig og giver anledning til flere væv med forskellige funktioner. Vævmorphogenese går i hånd med molekylære og strukturelle ændringer på enkeltcelleniveau, der resulterer i variationer af subcellulære mekaniske egenskaber. Som følge heraf modstår forskellige organeller og rum forskelligt i samme celle end mekaniske belastninger; og mechanotransduktionsveje kan aktivt regulere deres mekaniske egenskaber. En celles evne til at tilpasse sig mikromiljøet i vævsnicheren skyldes således til dels evnen til at sanse og reagere på mekaniske belastninger. Vi har for nylig foreslået en ny mekanosensation paradigme, hvor nuklear deformation og positionering gør det muligt for en celle at måle den fysiske 3D-miljø og udstyrer cellen med en følelse af proprioception at afkode ændringer i celleform. I denne artikel beskriver vi en ny metode til at måle de kræfter og materielle egenskaber, der former cellekernen inde i levende celler, eksemplificeret på klæbende celler og mekanisk lukkede celler. Målingerne kan udføres ikke-invasivt med optiske fælder inde i celler, og kræfterne er direkte tilgængelige gennem kalibreringsfri påvisning af lysmomentum. Dette gør det muligt at måle kernens mekanik uafhængigt af celleoverfladedeformationer og tillade dissektion af exteroceptive og interoceptive mechanotransduktionsveje. Vigtigere, fældefangst eksperiment kan kombineres med optisk mikroskopi til at undersøge cellulære respons og subcellulære dynamik ved hjælp af fluorescens billeddannelse af cytoskeleton, calciumioner, eller nuklear morfologi. Den præsenterede metode er ligetil at anvende, kompatibel med kommercielle løsninger til kraftmålinger og kan nemt udvides til at undersøge mekanikken i andre subcellulære rum, f.eks. mitokondrier, stressfibre og endosomes.

Introduction

Vævmorphogenese er en kompleks proces, hvor biokemiske signaler og fysiske kræfter er spatiotemporally koordineret. I det udviklende embryo dikterer gradienter af biokemiske signalfaktorer skæbnespecifikation og sikrer korrekt ^{vævsmønster1,2}. Samtidig spiller iboende og ydre kræfter en rolle i opbygningen af embryoets ^{arkitektur3,4}. Indflydelsen af celle cortex mekanik i denne sammenhæng er blevet undersøgt ^grundigt5,6. Den tætte sammenkobling mellem mechano-kemiske processer under morfogenese afhænger af enkelte cellers egenskaber til at sanse og reagere på mekaniske kræfter i deres vævsmikromiljø. Celler, derved afkode mekaniske signaler via tilstedeværelsen af kraftfølsomme subcellulære og molekylære elementer, der transduce mekaniske oplysninger i specifikke signalering veje kontrollere celle adfærd, celle skæbne, og celle mekanik.

Et kendetegn for udviklingsprocesser er, at celler organiserer sig som grupper for at opbygge flercellede strukturer. Som sådan, enkelte celler sjældent omarrangere og bevæge sig alene, men er forbundet i en stram sociotop, hvor de viser kollektiv adfærd såsom supracellular ^migration7, (un)jamming ^overgange8,9 eller blastocyst ^{komprimering10}. Mekaniske kræfter genereret i og mellem celler tjener som vigtige signaler til at instruere kollektiv celle ^dynamik7,11. Men selv når celler bevæger sig alene, såsom stamfaderceller, der klemmer sig vej mellem vævsplader eller smalle vævsnicher, oplever de omfattende anisotropiske mekaniske kræfter, når de navigerer i et tredimensionelt miljø. Disse mekaniske belastninger på celler har dybtgående konsekvenser for cellulær ^adfærd12,13. Flere mekanismer er blevet undersøgt, der konvergerer på kernen som et stort mechanotransduktionselement14,15, som passivt eller aktivt mekanisk element under migration inden for et tæt 3D-vævsmiljø15,16.

Vi har for nylig foreslået en mekanisme, der udstyrer celler til at måle form deformationer ved hjælp af kernen som en elastisk intracellulær mechano-gauge12. Kernen, der er den største organelle i en celle, gennemgår store deformationer, når cellerne polariserer, migrerer eller ændrer deres form under mekanisk strækning, indespærring eller osmotisk stress16,17,18,19. Vi fandt, at nukleare kuvert strække sammen med intracellulære positionering af kernen giver celler med oplysninger om omfanget og typen af celle deformation (såsom celle kompression versus celle hævelse). Strækning af kernen er forbundet med en udfoldning af den indre nukleare membran (INM), som fremmer calciumafhængig cPLA2 (cytosolic fosfolipase A2) lipaseaktivitet ved INM efterfulgt af frigivelse af arachidonsyre (AA) og hurtig aktivering af myosin II ved cellebarken. Dette fører til øget cellesammentrækning og amoeboid celle migration over en tærskel for kortikal ^{sammentrækning6}. Den mechanosensitive reaktion på celle deformation sker på mindre end et minut og er reversibel ved indespærring frigivelse, tyder på, at kernen fungerer som en stammemåler for cellulære proprioception regulere adaptive celle adfærd under mekaniske stress betingelser. Denne mechanosensitive vej har vist sig at være aktiv i stamfader stamceller stammer fra zebrafisk embryoner, både i pluripotente og afstamning-engagerede ^celler12 og er bevaret i forskellige arter og celle ^linjer20.

Ud over de nukleare egenskaber som en celle-mechanosensor, nukleare arkitektur og mekanik er iboende reguleret under udvikling og som reaktion på celle skæbne ^{specifikation21}, dermed tuning cellulære mechano-følsomhed22,23. Konsekvensen kan være en ændring i nuklear overholdelse, der giver mulighed for morfologiske ændringer og overgange fra en præmigratorisk til en migrerende stat og ^omvendt8.

Flere teknikker til at måle cellekernemekanik er blevet anvendt, såsom atomprøvesprængningsmikroskopi24,25, mikropipet ^{aspiration26,27}, mikrofluidisk ^teknologi28 og mikroneedles29. Men mange af disse teknikker er invasive i den forstand, at hele cellen skal deformeres, hvilket begrænser målingen af mekaniske egenskaber og kraftafhængige reaktioner i selve kernen. For at omgå den samtidige deformation af celleoverfladen og dens mechanosensitive celle ^cortex30 blev isolerede kerner undersøgt i forskellige ^{sammenhænge31,32}. Det kan imidlertid ikke udelukkes, at nuklear isolation er forbundet med en ændring i mekaniske kerneegenskaber og deres regulering (^reference24 og egne ikke-offentliggjorte observationer).

Optiske pincet (OT'er) er en alsidig teknologi, der har tilladt en overflod af eksperimenter i cellemekanobiologi og har været medvirkende til vores forståelse af, hvordan molekylære maskiner omdanner kemisk til mekanisk ^energi33,34. Optiske pincet bruge en stramt fokuseret laserstråle til at udøve optiske kræfter på dielektriske partikler, der har en brydning indeks højere end de omkringliggende ^medium33. Sådanne kræfter kan være i størrelsesordenen hundredvis af pico-Newtons og resultere i effektiv indespærring af partiklen i laserfælde fokus, muliggør manipulation af den fangede partikel i tre dimensioner. Brugen af lys har en vigtig fordel ved, at målingen kan udføres ikke-invasivt inde i levende celler. Optiske manipulationer er yderligere begrænset til fælden fokus laserstrålen. Derfor kan manipulationen udføres uden at stimulere de omgivende cellulære membraner og forstyrrer ikke actin cortex eller mechanosensitive processer ved plasmamembranen, såsom den kraftafhængige aktivering af ionkanaler.

Vanskeligheden ved den optiske pincet tilgang er præcist at bestemme de kræfter, der anvendes til mikrosfæren ved hjælp af klassiske tilgange, der er afhængige af indirekte kraft kalibrering baseret på equipartition sætning eller brugen af definerede Stokes-drag kræfter til at måle en laser-power afhængige flugt ^kraft35. Mens disse metoder er ligetil at implementere i et in vitro-eksperiment, kan de normalt ikke oversættes til et cellulært miljø. Flere strategier er blevet indført i marken, der er afhængige af en direkte kraft kalibrering, der stammer fra de første principper for momentum ^{bevarelse36,37}. I modsætning til andre kraftspektroskopimetoder udledes kraftmålinger fra en lokal lyskryds af lysmomentum med den vilkårligt formede fanget ^{partikel38,39}. I vores eksperimentelle set-up måles ændringer i lysmomentum som følge af optiske kræfter direkte uden behov for kalibrering af in situ trap40,41,42,43. Således bliver målingerne mulige i et tyktflydende miljø som cellens indre eller endda inden for et væv, og kræfter kan let kvantificeres ned til pN-niveauet.

I denne protokol beskriver vi en analyse for mekanisk at manipulere intracellulære organeller eller strukturer og kvantitativt vurdere deres mekaniske egenskaber ved en optisk pincet set-up. Denne opsætning er integreret i et roterende disklysstofrør, der muliggør parallel billeddannelse af cellulær adfærd eller intracellulær dynamik. Analysen giver mulighed for karakterisering af de mekaniske egenskaber af specifikke cellulære rum, såsom kernen, samtidig med at studere den mulige mechanoresponse og aktivering af molekylære signalering veje som følge af deformation selv. Desuden giver optisk staffage af injicerede mikroperler i cellerne mulighed for en stigning i indrykningskraften takket være et betydeligt højere brydningsindeks for polystyrenperen (n = 1,59) sammenlignet med den iboende brydningskontrast4 i kernen (n ~ 1,35) versus cytoplasma (n ~ 1,38). Den præsenterede strategi kan let tilpasses til studiet af andre intracellulære strukturer og organeller samt andre tilgange, der involverer aktiv mikrorheologi, brug af flere optiske fælder til at sondere de samme / forskellige subcellulære strukturer samtidigt og målinger rettet mod cellemekanobiologi i det levende embryo.

Protocol

Alle anvendte protokoller er godkendt af Den Institutionelle Komité for Dyrepleje og Anvendelsesetik (PRBB-IACUEC) og gennemført i henhold til nationale og europæiske bestemmelser. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med principperne i 3R. Zebrafisk (Danio rerio) blev opretholdt som tidligere beskrevet.

1. Fremstilling af isolerede primære embryonale zebrafisk stamfader stamceller

1. Mikropipette og agarosepræparat
   BEMÆRK: For en komplet mikroinjektionsprotokol for zebrafiskembryoinjektion henvises til ^reference45.
   1. Med en mikropipettetrækker trækkes en 1,0 mm glas kapillær for at få to ^nåle45. Opbevar de ubrugte nåle i en 150 mm petriskål, der er fastgjort til en legeskørn eller i en indvendig laboratorietapering for at beskytte den tynde spids mod skader under transport.
   2. Smelt 1% ultrapure agarose i E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4) i et standard køkken / lab mikrobølgeovn til 10 s. Varm blandingen gentagne gange i korte perioder (få sekunder), indtil agarose smelter.
   3. Når agarose er helt smeltet, lad det køle ned kort, og hæld det derefter i en 10 cm Petriskål. Tilsæt langsomt den trekantede mikroinjection skimmel (se Tabel over materialer) på toppen af agarose undgå udseendet af bobler. Skub ikke formen, så den forbliver på den agaroseoverflade.
   4. Når agarose størkner helt, fjerne den trekantede skimmel meget langsomt ved at udøve en blid kraft for at undgå brud i agarose. Pladen kan opbevares på hovedet ved 4 °C i 2-4 uger.
   5. 30 min før mikroinjektionen skal du tage pladen ud af køleskabet og tilsætte E3 førkrigt til 28 °C for at lade den stabilisere sig ved stuetemperatur.
2. Forberedelse af injektionsblandinger
   1. For at forberede injektionsblandingen fortyndes 1 μm mikroperler (polystyren, ikke-fluorescerende) i 1:5-forhold i RNasefrit vand.
   2. Udarbejde mRNA til forbigående udtryk for fluorescerende markører eller udtryk for rekombinant genkonstruktioner og/eller co-injektion af morpholino i den ønskede koncentration.
      BEMÆRK: En typisk injektionsblanding til samindsprøjtning af mikroperler sammen med 100 pg mRNA pr. embryo til etiket, f.eks. er kernen med H2A-mCherry: 1 μL perler + 1 μL mRNA (lagerkoncentrationen er 1 μg/μL) + 2,5 μL RNA frit vand + 0,5 μL phenolrød (lageropløsning 0,5%, phenolrød er ikke obligatorisk; fald er også synlig for en erfaren eksperimentator). RNA injektion kan også være nyttigt at vælge injicerede embryoner. Fluorescerende mikroperler kan injiceres, i stedet for ikke-fluorescerende, for at visualisere dem.
3. Mikroinjektionsnål belastning og kalibrering
   1. Tænd for mikroinjektoren ved hjælp af indstillingen Time-Gated . Denne indstilling er meget vigtig for at kalibrere injektionsvolumenet korrekt. Indstil gating-tiden til ca. 500 ms.
   2. 3 μL af injektionsblandingen i nålen ved hjælp af en mikrolæsserpipette.
   3. Sæt nålen ind i mikromanipulatoren og forsegl tæt. Kontroller, om mikromanipulatoren er i en god position og har tilstrækkelig frihed til at bevæge sig i x-y-retning på injektionspladen.
   4. Mål dråbestørrelsen ved hjælp af et mikrometer dias (5 mm/100 divisioner) med en dråbe mineralsk olie på ^top45 og skubbe en dråbe af injektion mix direkte ind i mineralsk olie.
   5. Beskær nålen med skarpe pincet i en stejl vinkel for at generere en skarp spids spids. Faldstørrelsen justeres til 0,1 mm, svarende til 0,5 nL indsprøjtet materiale.
      BEMÆRK: Hvis dette volumen overskrides ved at skære nålen, anbefales det at gentage kalibreringsproceduren med en ny nål. Mikroinjektorens gating tid kan justeres lidt, så den svarer til dråbevolumen; Korte gatingtider svarer dog til en stor nålediameter, som potentielt beskadiger embryonerne.
4. Mikroinjektion af zebrafisk embryoner på et-cellet stadium
   1. Saml zebrafisk embryoner kort efter befrugtning for mikroinjektion af perle blandingen direkte ind i encellet (zygote) fase embryo, før den første celle division opstår.
      BEMÆRK: Dette sikrer korrekt fordeling af mikrosfærer og et højt nok udbytte af isolerede blastomerer med mindst én mikrosfære pr. celle på senere udviklingsstadier, hvor der udføres eksperimenter (blastula-gastrula-stadium). Indrykningseksperimenter kan stadig udføres, hvis der er to kugler i cellen, men celler, der ikke har perler, bør udelukkes (selvom indrykning uden kugler er mulig). AB wildtype stammer blev brugt i denne protokol, men enhver anden stamme, f.eks TL kan bruges.
   2. Placer encellede fase embryoner (zygote) i en præwarmed trekantet-formet 1% agarose skimmel, som vist i figur 1A, ved hjælp af en plast Pasteur pipette.
   3. Fjern ekstra medium med den samme pipette for at undgå, at embryonerne flyder rundt. Skub forsigtigt embryonerne ind i den trekantede form via en børste. Hold plads mellem embryoner for at lette den korrekte orientering (figur 1B).
   4. Juster forsigtigt embryonerne med en børste, så embryonerne er orienteret sideværts, med den ene celle i zygoten er tydeligt synlig, som vist i figur 1B. En ideel orientering for mikroinjektion nås, når embryoets ene celle vender mod nåleretningen (injektion via embryoets dyrestang) eller på den modsatte måde mod æggeblommecellen (injektion via embryoets vegetabilske pol), som vist i figur 1C.
   5. Hold fadet med den ene hånd og brug den anden hånd til at placere nålespidsen ved hjælp af mikromanipulatorregulatoren. Sænk nålespidsen mod embryonerne.
   6. Pierce chorion og indtast encellet embryo med nålen, mens du overvåger proceduren gennem stereomikroskopet. Sørg for korrekt placering af nålen og, efter injektion, den korrekte placering af den injicerede dråbe som vist i figur 1C.
   7. Gentag for alle embryoner: Flyt nålen op, skub skålen med embryonerne, indtil det næste embryo er centreret, sænk nålen og indsprøjt den.
   8. Når hele sættet af embryoner er injiceret, fjerne embryoner fra agarose skimmel / Petri parabol ved at skylle nogle E3 og sætte dem i en ny Petri parabol ved hjælp af en plastik Pasteur pipette. Det anbefales at placere tilstrækkelige medier på injektionspladen for at undgå udtørring af embryoner under mikroinjektionsproceduren.
   9. Gentag proceduren, indtil det ønskede antal embryoner injiceres. Embryoner skal være på et cellestadium for at sikre maksimal og homogen spredning af perlerne.
      BEMÆRK: Denne procedure er optimeret til tidlige blastula embryoner og skal sandsynligvis optimeres, hvis forskellige udviklingsstadier skal undersøges.
   10. Anbring de injicerede embryoner inde i en inkubator ved 28-31 °C i ca. 4 timer eller indtil det ønskede stadium (figur 1D), før protokollen for primær cellekultur fortsættes.
       BEMÆRK: Lad eventuelt embryonerne udvikle sig ud over blastulastadiet (eller det ønskede måletidspunkt) for at sikre overlevelse og udelukke toksicitetsartefakter. I larvestadier monteres bedøvede larver med tricain i 0,75% agarose og billede fordelingen af mikrosfærer i forskellige væv. For at lave en lageropløsning blandes: 400 mg tricainpulver i 97,9 mL destilleret vand, ca. 2,1 mL 1 M TRIS-base (pH 9) og justeres til pH 7. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C. For at bruge tricain som bedøvelsesmiddel fortyndes 4,2 mL lageropløsning i 100 mL ægs medium (eller ønskede medier); I dette tilfælde blev E3 anvendt. Se ^reference46 for detaljer.

2. Enkeltcellet præparat og farvning

1. Placer kuglestadiet embryoner (4 hkf, timer efter befrugtning) i et glas skål ved hjælp af en plastik Pasteur pipette. Vælg de embryoner, der er positive for signalet fra de injicerede perler, og som udtrykker det fluorescerende protein i tilfælde af mRNA-injektion. Nogle embryoner kan vise høj perle klyngedannelse og kan udelukkes.
   1. Afkorionionere embryonerne manuelt ved hjælp af sammentrækninger. Overfør ca. 10-15 embryoner til 1,5 mL reaktionsbeholdere ved hjælp af en glas pasteurpipette.
      BEMÆRK: Når embryonerne dechorioneres, fastgøres de til plasten, og brugen af glasvarer er påkrævet. Som et alternativ til glaspladen kan der anvendes en plastik petriskål med et tyndt lag på 1% agarose. Manuel dechorionation bør foretrækkes frem for enzymatisk Pronasebehandling for at forhindre proteolytiske skader på celleoverfladeproteiner og potentielle ændringer i mekaniske celle- og vævsegenskaber, hvilket forhindrer forlængede ^{restitutionstider47}.
2. Fjern E3-mediet og tilsæt 500 μL forvarmet _{CO2-uafhængigt} vævskulturmedium (DMEM-F12; med L-glutamin og 15 mM HEPES uden natriumbicarbonat og phenolrød suppleret med 10 enheder penicillin og 10 mg/L streptomycin).
   BEMÆRK: Brug ikke _{CO2-afhængige} medier, medmindre der anvendes en mikroskopinkubator. Brugen af f.eks. RPMI i karbonatbuffere forårsager ændringer i mediernes pH-tilstand og kan påvirke celleoverlevelsen. Et andet centralt aspekt er at undgå kulturmedier, der indeholder serum. Serum kan indeholde Lysophosphatidsyre (LPA), en potent aktivator af Rho / ROCK-stien, der er i stand til at kontrollere cellulær kontraktilitet og motilitet i stamfaderstamceller6. Mediets osmolaritet bør opretholdes ved 300 mOsm for at undgå osmotiske udfordringer, der kan forstyrre nuklear morfologi eller ^mekanik12.
3. Fjern cellerne manuelt ved forsigtigt at ryste røret. Sørg for, at indholdet af røret bliver uklart uden store bidder synlige af øjet. Undgå dannelsen af bobler for at minimere skader og tab af celler.
4. Centrifuge ved 200 x g i 3 min. Pellet skal være tydeligt synlig.
5. Fjern supernatanten, og følg et af nedenstående trin.
   1. Hvis der ikke er behov for farvning, tilsættes 500 μL DMEM. Forsigtigt genbruges med en 200 μL pipette ved at målrette en flydende jet på pellet. Forskydningskraften må ikke udøves på cellerne. Skumdannelse indikerer skader på cellerne.
   2. Ved mærkning af kernen med DNA-farvestoffer som Hoechst blandes 0,5 μL DNA-Hoechst (lager 2 mg/mL) i 1.000 μL DMEM for at opnå 1 μg/mL af den endelige koncentration. Der tilsættes 500 μL af denne farvningsopløsning til cellerne, og genanvendes forsigtigt. Inkuber i 7 minutter i mørket.
   3. For at plette cellerne med en fluorescerende kemisk calciumindikator Calbryte-520, tilsættes Calbryte-520 til en 5 μM koncentration i DMEM. Inkuber i 20 minutter i mørket.
      BEMÆRK: De protokoller, der er angivet i trin 2.5.2 og 2.5.3, er optimeret til disse specifikke produkter. Andre farvning kan udføres ved hjælp af de protokoller, der er angivet af producenten.
6. Centrifuge igen ved hjælp af de samme indstillinger som i trin 2.4; fjern supernatanten og genanvender forsigtigt cellerne (for at undgå dannelse af klynger) i 50 μL DMEM til prøver i suspension eller 20 μL DMEM for celler i indespærring.

3. Fremstilling af optiske fældefangstkamre ved hjælp af polydimethylsiloxanafstand (PDMS)

BEMÆRK: Optiske kraftmålinger baseret på lysmomentering kræver optagelse af alt det lys, der kommer ud af de optiske ^fælder40. For at den invariante kalibreringsfaktor α (pN/V) er robust, skal lysfordelingen på BFP's (BFP) baglysningsplan (BFP) være forsynet med en nøjagtig overensstemmelse med fotonmomentumet. Dette bestemmer afstanden fra overfladen af opsamlingslinsen til diffuseringsplanet til ca. 2 mm, hvilket er den maksimale højde af de optiske fældefangstkamre.

1. PDMS spin-belægning af # 1,5 glas bund retter.
   BEMÆRK: Følgende opskrift er til rådighed for ca. 40 retter. Det resulterende mikrokammer vil have forskellige højder, afhængigt af om der skal udføres forsøg på ophængte eller lukkede celler (figur 1D).
   1. Bland 9 mL af basispolymeren PDMS og 1 mL PDMS-hærdningsmiddel i et 50 mL konisk rør. Bland de to produkter aktivt for at sikre korrekt distribution af hærdningsmidlet.
   2. Afgas blandingen for at undgå bobler ved hjælp af en vakuumpumpe. Indfør det koniske rør i en vakuumflaske og evakuer kammeret. Vent, indtil der ikke er bobler i blandingen.
      BEMÆRK: Åbn vakuumet langsomt for at forhindre skumdannelse og spild af PDMS ud af falkerøret.
   3. Placer glasbundsfadet på spin-coater chuck (Figur 2A). Vær forsigtig med ikke at ridse, fingeraftryk, eller få fadet snavset. Beskyt spin-coater boksen fra PDMS lækager med aluminiumsfolie.
   4. For OT-kamre til forsøg på celler i suspension tilsættes ca. 250 μL PDMS-blanding i midten af bundskålen og drejer den ved 750 o/min. Pdms-lagets højde vil være 50 μm ca. ⁴⁸.
   5. For OT-kamre til forsøg på lukkede celler tilsættes en lille dråbe PDMS (ca. 50 μL) og drejer den ved 4.000 o/min. Højden af PDMS-laget vil være 10 μm ca. Du kan finde en detaljeret protokol om, hvordan du får forskellige PDMS-tykkelser, i ^reference48.
   6. Optø de PDMS-coatede glasbundsfade ved 70 °C i 1 time.
   7. Skær en 1 x 1 cm firkantet på PDMS-laget med en skalpel og skræl den af med pincet (Figur 2C). I tilfælde af lukkede celler skal PDMS-snavs vaskes med isopropanol.
2. Kammerbelægning til forsøg med let fastgjorte celler i suspension
   1. Tilsæt 100 μL Concanavalin A (ConA) ved 0,5 mg/mL for at dække hele overfladen af det firkantede hulrum og lad det inkubere i 30 min.
      BEMÆRK: ConA er en lectin, der binder sig til celle overflade sukkerarter og par individuelle celler på coverglass overflade.
   2. Fjern ConA-dråben, og skyl overfladen forsigtigt med DMEM-medium uden at ridse den ConA-behandlede overflade.
   3. Der tilsættes 30 μL af den tidligere forberedte prøve (trin 2.6) i brønden og genanvendes forsigtigt for at slippe af med eventuelle celleklynger.
   4. Luk hulrummet ved forsigtigt at placere et 22 x 22 mm #1,5 dækglas oven på PDMS fælgene (undgå at lade det falde brat, brug sammenkrammer, hvis det er muligt, Figur 2B,C).
      BEMÆRK: Enhver dækseltykkelse ville fungere for det øverste glasdæksel (opsamlingslinsen har en arbejdsafstand på 2 mm).
3. Afdelingsforberedelse til forsøg med celler i indeslutning
   1. Sæt en 10 μL dråbe opløsning, der indeholder celler (trin 2.6) i det firkantede hulrum (figur 2B).
   2. Meget forsigtigt, sandwich prøven med en 22 x 22 mm dækglas således, at dråben spredes i hele området og ingen bobler observeres. Igen er det praktisk at bruge sammenkøjninger, som vist i figur 2C, for at forhindre dækglasset i at falde brat.

4. Alternative muligheder for OT kammerafstand

BEMÆRK: Disse trin kan følges, hvis der ikke er noget mikrofabrikationsværksted eller spin coater.

1. Kammerforberedelse til forsøg med celler i suspension
   BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen spin coater til rådighed, kan der laves en afstandsholder ved hjælp af normalt, dobbeltsidet scotch tape (ca. 100 μm i højden).
   1. Skær et stykke dobbeltsidet scotch tape med et ca. 10 cm x 10 cm firkantet hul i midten (samme dimensioner som i PDMS, Figur 2B).
   2. Fjern et af de beskyttende lag af båndet ved at skrælle det af og placere den udækkede side af båndet i midten af en # 1,5 H glasbundet skål. Tryk forsigtigt for at få hele overfladen klæbet til glasset, samtidig med at du undgår luftbobler, og fjern derefter det resterende beskyttende lag af båndet ved at skrælle det af.
   3. Følg vejledningen i trin 3.2.
2. Afdelingsforberedelse til forsøg med celler i indeslutning
   BEMÆRK: For præcist at begrænse celler kan monodisperse mikropartikler med en kendt diameter bruges som afstandsstykker mellem de to dækbriller.
   1. Tilsæt 10 μm polystyrenperler til ophængte celler i en koncentration på ¹⁰⁴ perler/μL.
   2. Sæt en 10 μL dråbe opløsning, der indeholder celler og perler på et 22 x 60 mm dækglas.
   3. Meget forsigtigt, sandwich prøven med en anden 22 x 60 mm dækglas således, at dråben spredes i hele området, og ingen bobler observeres. For at placere det øverste dækglas forsigtigt (undgå at det falder ned brat), er det praktisk at bruge sammenkæber.
   4. Da prøven kan tørre ud, anbefales det at udføre præparatet hurtigt.

5. Opsætning af den optiske fælde til intracellulære målinger

BEMÆRK: Følgende trin er optimeret til en kommerciel optisk pincetplatform, der omfatter et optisk mikromanipulationsmodul baseret på acoustooptisk afbøjning (AOD) og en optisk kraftsensor baseret på direkte påvisning af lysmomentumændringer (Figur 2, reference12,40,49). Detaljer og optiske komponenter i opsætningen findes i figur 2F. For at observere kraftinduceret deformation under de optiske pincetmanipulationer kobles et Nipkow-roterende diskkonfokalmikroskop ind i venstre port i det omvendte mikroskop til dual color fluorescensbilleddannelse. Uden den manglende almindelighed kan denne protokol anvendes med ethvert dynamisk OTs-system udstyret med direkte kraftmålinger baseret på lysmomentumdetektering. Detaljerede trinvise procedurer er tilgængelige for at konstruere homebuilt optiske gradient fælder til in vivo ^{applikationer50}. Dem baseret på AOD graduering skiller sig ud for eventuelle eksperimenter med flere fælder og hurtige ^{målinger51,52}. Der findes flere protokoller til konstruktion af et lys-momentum-baseret instrument i litteraturen36,39,40,53, og enhver anden billeddannelsesmodalitet (differentialinterferenskontrast, widefield fluorescens osv.) kan anvendes.

1. Optisk pincet opstart
   1. For at optimere for udgangseffektstabiliteten skal du tænde laseren ved betydeligt høj effekt (f.eks. 3 W) mindst 30 min før eksperimentet.
   2. Tænd elektronikmodulet i de optiske mikromanipulations- og kraftmålingsenheder.
      BEMÆRK: Anvend alle lasersikkerhedsforanstaltninger, og brug kun udstyr, der er godkendt af institutionsrådet. Brug aldrig okularerne på det optiske mikroskop, når laseren er tændt. Brug altid godkendte beskyttelsesbriller (OD7 i 950-1080 nm-området), bloker IR-laserlyset med lukkeren i epifluorescenceporten 2, og udfør ikke den optiske diffuseringssoftware, før den optiske kraftsensorjustering er afsluttet efter trin 5.3. Generelt skal du ikke bruge en meget reflekterende prøve, da bagrefleksionen kan forårsage skade på laseren.
   3. Styre fældeeffekten med det roterende HWP (Figur 2F) ved indgangen til det optiske mikromanipulationsmodul.
      BEMÆRK: Det kommercielle optiske mikromanipulationsmodul, der bruges i denne protokol, indeholder allerede denne funktion. For homebuilt optiske fældefangst systemer, integrere dette værktøj til strømstyring, så højere og mere stabile laserkræfter kan bruges.
2. Brug et tomt mikrokammer til kalibrering
   1. Skær en 1 x 1 cm firkant på en dobbeltsidet scotch tape og fastgør det på en 1 mm tyk mikroskop slide.
   2. Tilsæt vand i pladsen og luk det fra toppen med et # 1,5 dækglas (22 x 22 mm). Tilsætning af en lidt større mængde vand, f.eks. rådes 30-40 μL til at undgå bobler inde i det overdækkede kammer. Kalibreringskammeret tørres forsigtigt af i tilfælde af vand, der løber ud af det.
3. Justering af sensoren til optisk kraft
   1. Sæt en dråbe vand på 60x/1.2 vand nedsænkning mål. Anbring kalibreringskammeret på scenen med #1,5 dækglasset vendt mod målet. Fokuser på den nederste overflade, hvor celleprøverne i sidste ende vil være.
   2. Tilsæt en dråbe nedsænkningsolie oven på den øverste glasrutschebane, der dækker prøven (Figur 2D). Sænk kraftsensorenhedens opsamlingslinse forsigtigt, indtil den kommer i kontakt med oliedråben.
      BEMÆRK: Dråben skal være stor nok til, at den dækker hele linsen, der samler laserlyset, der kommer ud af fælderne. Normalt er 200 μL tilstrækkeligt til at dække hele overfladen og give en stabil nedsænkning kontakt. Vær konservativ og undgå overfyldning, da det kan lække ind i prøven.
   3. Efter producentens protokol for justering af den optiske kraftsensor skal du se på prøveplanbilledet på hjælpekameraet, der skal bruges til at placere OT'erne (AUX, Figur 2F). Sænk meget forsigtigt den optiske kraftsensor, indtil feltstoppet (FS, figur 2F-G) vises konjugeret på prøveplanet. Dette vil sikre korrekt direkte kraft målinger fra prøve-invariant påvisning af lys momentum ^ændringer40.
      BEMÆRK: Luk FS nok, så dets billede bliver mindre end synsfeltet (FOV), derfor synligt. Vær ekstra forsigtig og skub ikke opsamlingslinsen på den optiske kraftsensor mod prøven. Den optiske kraftsensors lodrette position kan alternativt bestemmes ud fra analyse af diffuseringslysfordelingen ved BFP for lys kegler med defineret numerisk blænde (NA).
   4. Sørg for, at der ikke er luftbobler i oliedråben. disse kan direkte påvirke kraftmålingerne. Hvis du vil kontrollere, om der er luftbobler, skal bertrandlinsen sættes på plads (BL, Figur 2G) og observere billeddannelsesstien gennem okularet. Hvis der er behov for snavs eller luftbobler, eller der er behov for mere olie (figur S1A), renses linsen og kammeret med støvfrit linsevæv, og proceduren gentages i trin 5.3.2 og 5.3.3. En uhindret optisk sti er afbildet i figur S1B.
   5. Ved hjælp af sideskruerne placeret på holderen af den optiske kraftsensor skal FS centrere ind i FOV. For nøjagtighed skal du åbne FS, så det næsten fylder FOV synlig på hjælpekameraet (AUX, Figur 2F).

6. Optisk pincet optimering

BEMÆRK: Målingen af direkte kraft afhænger udelukkende af ændringen af lysmomentum som følge af den kraft, der udøves på den fangede partikel, og derfor behøver fældestivhed i modsætning til indirekte metoder ikke at blive kalibreret før hvert eksperiment. Den instrumentspecifikke omdannelse af afbøjnings-/kraftfaktor (α; pN/V, ^reference41) kalibreres af fabrikanten og eksperimenterer derfor invariant. Men da laserpletten er manipuleret over et område på 70 μm x 70 μm, er trin 6.2-6.5 afgørende for at sikre optimal fældefangst og effektstabilitet. Følgende trin leveres i producentens software, så OT'erne optimeres over arbejdsområdet på en halvautomatisk måde.

1. Start OTs software og erhvervelse software til kamera AUX.
2. Træk den oprindelige spændingsbasislinje fra ved at klikke på trin 1: Elektronikforskydningstrinet i undermenuen Systemkalibrering af den optiske pincet-kørselssoftware.
3. Hvis du vil udføre udfladning af diffusering på tværs af OT-arbejdsområdet, skal du indstille diffuseringseffekten til halvdelen af den maksimale ved at rotere HWP i overensstemmelse hermed. Du må ikke ændre diffuseringseffekten ved at ændre laserudgangen, men med det roterende HWP (Figur 2F). Klik på trin 2: Power til at indlede den automatiserede rutine for fælde magt udfladning.
   BEMÆRK: Dette er et vigtigt skridt for at kompensere for variationen af fældeeffekten på tværs af OT'ernes arbejdsområde (figur S1D). En vellykket rutine bringer fælde magt variation ned til 2% på tværs af OTs arbejdsområde og konvergerer efter 2 min.
4. Hvis du vil udføre kalibrering af diffusering, skal du fjerne det infrarøde filter, så lyset fra laseren er synligt på kameraet. Find det IR-sted ved at indstille billedplanet fokuseret på mikrokammerets nedre overflade. Opnå den mindste IR stedet muligt ved at indstille billedet flyet (objektiv position) og histogramme kontrast i kameraet AUX erhvervelse software. Hvis det er nødvendigt, skal du reducere effekten af den optiske fælde ved at rotere HWP (Figur 2F). Klik på trin 3: Position til at starte den automatiserede rutine eller fælde positionering kalibrering.
   BEMÆRK: Denne rutine muliggør den præcise korrespondance af OT's positionskoordinater i kamera AUX til AOD-styrevinklerne. En vellykket rutine genererer vinkel-til-position kortlægning i flere sekunder.
5. Indledende momentum kompensation
   BEMÆRK: Den optiske fældes bevægelse på tværs af prøven forårsager variationer i lysmomentfordelingen ved BFP (figur S1E, F). Dette fører til kraft-uafhængige signalændringer relateret til laser position over arbejdsområdet, selv om fælden magt er blevet fladtrykt som i trin 6.3. Konsekvensen er en variation i kraft baseline på grund af position (uafhængig af en faktisk kraft, der virker på optisk fanget perle), der skal korrigeres før hvert eksperiment.
   1. Indstil den diffuseringseffekt, der skal bruges i forsøgene, ved at rotere HWP (Figur 2F).
   2. Klik på indstillingen Global forskydning i undermenuen Funktioner . Dette åbner forskydningsforlysningen af den optiske pincetsoftware, der korrigerer den oprindelige grundlinje for det oprindelige momentum.
   3. Klik på | Kompensere for at korrigere positionsvariantens indledende momentum.
      BEMÆRK: Hvis ingen ændring påvirker den optiske sti i de igangværende uger, forbliver trapeffektudfladningskortene (trin 6.3) og position (trin 6.4) kort invariant. Vi anbefaler derfor altid at bruge den samme kombination af optiske elementer (dichroic spejle, filtre, osv.), der kan påvirke laser fælde stien eller til at udføre en ny fælde magt udfladning rutine. Med hensyn til den indledende momentumkompensation (trin 6.5) giver producenten af OTs-platformen en kalibrering på farten, der skal ændres for hver ny fældefangstkraft og eksperimentel session. Trin 6.3 og 6.4 skal udføres på det tomme kalibreringsdias, der er beskrevet i trin 5.2. I en prøve, der indeholder celler eller andre objekter, skal trin 6.5 udføres uden genstande, der kan ændre lysspredningen i OT'ernes arbejdsområde.
6. Eventuelt, fælde en mikrosfære og flytte fælden med en kendt hastighed, mens du optager kraftsignalet. For eksempel skal du indstille fælden til at udføre en trekantet svingning: det registrerede kraftsignal vil være et firkantet signal.
   BEMÆRK: Kraftværdien skal øges lineært med hastigheden, i henhold til trækkraften, der virker på perlen. Denne test tjener som en positiv kontrol, at kraftmålinger udføres ^korrekt38. Alternativt kan den optiske kraftsensor anvendes til at opnå den optiske staffagestivhed, κ [pN/μm] og positionskalibreringsfaktoren, β [μm/V], fra ^{effektspektralanalyse35}. Under korrekt justering er fabrikantens invariante kalibreringsfaktor α = κ·β [pN/V].
   1. Start en realtidsaflæsning ved at klikke på Plot 1 i undermenuen Mål i producentens software. Dette vil give en læsning af den nuværende optiske fældefangst kraft og magt.
   2. Åbn dialogboksen Svingparametre fra undermenuen Funktioner . Angiv en trekantet bølgeformform i henholdsvis figur- og typevælgerne. Som et eksempel, sæt en amplitud på 10 μm og en frekvens på 3 Hz. Dette vil resultere i en tyktflydende kraft på ca. 1 pN på en mikroperle med en diameter på 1 ^μm38.
   3. Højreklik på mikroperleren i kameraets AUX-vindue, og vælg Start Oscillerende. Kraftaflæsningen bliver et firkantet kraftsignal med plateauer ved ±1 pN.
   4. Højreklik på mikroperle og vælg Stop Oscillerende.

7. Spinning disk konfokal mikroskopi

1. Tænd for spinning-disk konfokale mikroskop og tilbehør udstyr, de integrerede lasermotorer, og erhvervelse kameraer.
2. Start billedbehandlingssoftwaren.
3. Indstil billeddannelseskanaler for Hoechst farvning af kernen og GFP til celleplasmamembranen.
   1. Aktiver 405 nm og 488 nm excitation lasere linjer.
   2. Tilføj en multiband dichroic at afspejle excitation til prøven, og som gør det muligt udsendte lys til at passere til kameraerne.
   3. Split fluorescens emission med en 500 nm lang pass edge dichroic spejl.
   4. Brug DAPI/BFP -emissionsfiltrene (~445 nm) og GFP (~521 nm) foran de to anskaffelseskameraer. Se figur 2F,G.
   5. Angiv eksponeringstiden til 100 ms for hver kanal.
   6. Indstil laseremissionen for at opnå en effekt på 5 mW på prøveplanet. For at måle strømmen skal du bruge en kommerciel effektmåler.
4. Indstil billedprotokollen. For at undgå spektral blødning fra Hoechst-kanalen ind i GFP-kanalen skal de to farvestoffer afbildes sekventielt.
   BEMÆRK: Hvis der findes en hardwaresynkronisering mellem AOD'erne i den optiske diffusering og kameraets anskaffelse, skal du kontrollere, at udløserpolariteten er konfigureret korrekt. Hvis du er i tvivl, skal du kontakte din facility manager eller mikroskopproducent.

8. Udførelse af kerneindrykningseksperimenter

BEMÆRK: Sluk altid de optiske fælder - både ved hjælp af software og lukning af lukkeren på epifluorescence port 2-når du løfter kraftsensormodulet og ændrer prøven. Hvis ikke, kan der opstå alvorlig skade på optiske elementer og eksperimentatoren. Vær forsigtig med den laterale afstand mellem linseholderen og den nederste parabolkant, når du leder efter celler for at undgå at støde linsen ind i scene/kulturskålen (figur 2).

1. Sæt prøven i mikroskopet, og følg trin 5.3 i denne protokol.
2. Ved hjælp af den roterende HWP (Figur 2F) indstilles fældeeffekten til 200 mW som startværdi, hvis stivheden af kernen eller den undersøgte intracellulære struktur ikke er kendt. Oversæt OT'erne (ved hjælp af mikroskopstadiet) til et sted uden celler for at kompensere for den oprindelige momentum baseline gennem trin 6.5.
   BEMÆRK: Afhængigt af stivheden af den subcellulære struktur skal diffusseffektværdien justeres til lavere eller højere værdier for at opnå en lignende indrykningsdybde.
3. Brug mikroskop fase software controller, kigge efter en celle med en eller to perler gennem transmitteret brightfield mikroskopi (Figur 3A).
4. Definer en fældebane.
   1. Åbn dialogboksen Bane i undermenuen Funktioner , og vælg Forskydning i vælgerringen Banetype .
   2. Skriv forskydningen og klokkeslæt for hvert efterfølgende banetrin i det numeriske ark. Her er to eksempler.
   3. For en stress afslapning eksperiment, program trapezformede belastninger, som vist i figur 3B. I tabel S1 blev der anvendt to trapezformede fordybninger med en rejseafstand på 5 μm. hastighed på 5 μm/s ventetid før tilbagetrækning: 10 s.
   4. For et gentagen indrykningseksperiment med en konstant hastighed for at opnå en trekantet rutine uden at dvæle tid på kernen, skal du indstille bane amplituden, f.eks. 5 μm, og tiden for trinnet, f.eks. 2 s for en hastighed på 2,5 μm/s. I tabel S2 påføres dette otte gange med samme hastighed.
      BEMÆRK: Disse værdier skal bestemmes for hver celletype og eksperiment, men følgende parametre i en trapezrutine fanger den vigtigste dynamik i eksperimentet, der præsenteres her. Ventetiden skal være tilstrækkelig til, at kernen kan vise sin fuldstændige stressafspænding efter indrykning
5. Diffusering af en mikrosfære
   1. Indstil billedplanet lidt over perlen med mikroskopstadiets softwarecontroller.
   2. Aktiver fælder ved hjælp af OTs-softwaren, og klik på perlen i kameraets AUX-billedvindue (kalibreret efter trin 6.4). Vellykket indespærring af perlen ved den optiske fælde vil kraftigt reducere perlens bevægelse.
   3. Klik og træk perlen hen over cytoplasmaet, og placer den i en afstand af ~2 μm fra atomkonvolutten (figur 3A). Sørg for, at banen er indstillet, så perleindrykningen er vinkelret på atommembranen.
6. Hvis det er nødvendigt for at placere målinger af perlen i forhold til fælden, skal du eventuelt scanne fælden hen over perlen for at bestemme fældefangststivheden, k [pN/μm]⁵⁴ og dermed Δxbead = -F/k (se Diskussion). Det optiske mikromanipulationsmodul, der anvendes i denne protokol, har en indbygget rutine til dette formål.
   1. Åbn dialogboksen Partikelscanning i undermenuen Funktioner .
   2. Vælg den diffusering, du vil scanne, og Høj frekvens som scanningsmetode. Vælg retningen (x eller y) for indrykningsforløbet for perlescanningsmålingen.
   3. Der vises et vindue med målingen af fældefangststivheden. Træk de to markører i grafen for at markere det lineære diffuseringsområde, der svarer til F = -kx. Den lineære tilpasning til den valgte datadel opdateres automatisk.
      BEMÆRK: Indstil perlens udgangsposition langt fra cellemembranen (~5 μm), da lysmomentafbøjninger ved mellemcellegrænsefladen påvirker styrkens hensigtsmæssighed. Hvis kernen er placeret for tæt på cellemembranen, så prøv at indrykke kernen fra det modsatte sted. Kassér cellen, hvis det ikke er muligt.
7. Start billedopsamling ved at klikke på anskaffelsesknappen i billedsoftwaren.
8. Start trappositionen, og tving lagring af måledata ved at klikke på Data | Gem i realtidsaflæsningsvinduet (åbnet som i trin. 6.6.1).
   BEMÆRK: Den optiske fælde er udstyret med en triggerindgang, som kan tilsluttes kameraets timingudgang. Således er billed- og kraftdata hardware-synkroniseret, og den elektroniske er i stand til at kortlægge fældecyklusserne med antallet af billeder under erhvervelsen.
9. Start den tidligere indlæste bane ved at højreklikke på perlen og vælge Start bane.
10. Vent, indtil banen er færdig, og systemet stabiliseres.
11. Stop lagring af målingsdata for diffusering. Der vises en databesparelsesdialogboks.
    BEMÆRK: Hvis du vil optimere datalagring, kan data decimeres ved at vælge decimatingparameteren i denne dialogboks (10, 100 eller 1000).
12. Stop billedopsamlingen, og plot resultaterne i den efterbehandlingssoftware, som brugeren vælger.
13. Hvis mikrosfæren går tabt under rutinen, og kernen ikke kan indrykkes (figur S2), skal målingen kasseres og øge effekten. Bemærk, at trin 6.5 skal gentages. I vores hænder er mindst 95% af rutinerne afsluttet uden at miste perlen fra fælden.

Representative Results

Mikroinjektion af fældefangstperler:
Mikrosfærer injiceres i encellet zebrafisk embryo spredt over hele dyrehætten under morfogenese. For en klarere visualisering gentog vi injektionsprotokollen med røde fluorescerende mikroperler og tog volumetriske billeder med vores konfokale mikroskop på forskellige udviklingsstadier. I figur 4A-D visualiseres injicerede perler i cytoplasmaet af stamfaderstamceller in vivo ved 5 hfp. Senere dukkede mikrosfærer op spredt over hele embryoet ved 24 hkf (Figur 4E). Embryoner i begge faser udviklede sig normalt, og overlevelsesraten kunne sammenlignes med ikke-injicerede eller mock-injicerede embryoner (se figur S3). Dette er i overensstemmelse med andre undersøgelser, der rapporterer unperturbed overlevelse af perle-injicerede zebrafisk op til 5 dage efter ^{befrugtning55}.

Vores roterende disk konfokale mikroskop er kompatibelt med multi-kanal fluorescens mikrokopi. I figur 5A viser vi isolerede stamceller med en eller to perler i cytoplasmaet. Flere fluorescerende etiketter kan bruges til at undersøge forskellige aspekter af cellen (Figur 5B). Nuklear morfologi kan spores med et Hoechst farvestof eller ved hjælp af et H2A::mCherry mRNA-udtryk, mens indre atommembran kan analyseres med Lap2b-eGFP12. Dynamikken i actomyosin cortex, samt intracellulære calciumniveauer, kan observeres med en My12.1::eGFP transgen ^linje56 og Calbryte-520 inkubation, henholdsvis. Den protokol, der er blevet beskrevet her, har til formål at sammenligne cellekernemekanik af immobiliserede wildtypeceller på klæbende substrater (senere kaldet suspension) og i mekanisk indespærring. Isolerede stamceller, der var indesluttet i mikrokamre i 10 μm højde, udviste delvis udfoldning af den indre atommembran (INM) og en efterfølgende stigning i actomyosin ^{kontraktilitet12}. I figur 5C vises lukkede celler med en eller to perler i cytoplasmaet. Vellykket indespærring vil være synlig via flade, udvidede celler med et bredere tværsnit af kernen. Atommembranen udfoldes yderligere i lukkede celler og skal virke udglattet i forhold til celler i suspension (figur 5C).

Kraft-tid og kraft-deformation analyse
Analysen af de opnåede resultater afhænger stærkt af den undersøgte prøve og spørgsmålet om interesse, og derfor kan de ikke generaliseres her. Som et eksempel er en almindelig måde at analysere indrykningsmåling på at udtrække en Youngs modulus ved at montere en modificeret Hertz-model på ^{kraftindrykningsdata57}. Antagelsen om en sådan behandling skal dog vurderes nøje og kan ikke altid være korrekt begrundet (f.eks. at den undersøgte struktur er isotropisk, homogen, idet lineær elasticitet og fordybninger er mindre end perleradiusen). Vi betragter således kun modeluafhængige målinger her, der gør det muligt at sammenligne den undersøgte strukturs mekaniske adfærd mellem forskellige eksperimentelle scenarier.

Som udgangspunkt giver måling af hældningen af kraftforskydningskurven ved en bestemt indrykningsdybde et mål for en model uafhængig strukturel ^stivhed58 af kernen. Denne værdi kan derefter indsamles fra flere prøver og sammenlignes mellem forskellige eksperimentelle indstillinger og prøveforstyrrelser.

Indrykningsmåling
I de følgende linjer fokuserer vi på cellekernens mekaniske respons under celledeformation i indespærring. Forsøg i trin 8 i denne protokol fører typisk til krafttoppe på op til 200 pN for indrykningsdybder på ca. 2-3 μm. Disse værdier kan dog være stort set forskellige, afhængigt af celletypen og eksperimentelle forhold, med blødere kerner, der fører til lavere kraft for en given indrykning. Det er derfor nødvendigt præcist at måle den nukleare deformation sammen med kraft for en nøjagtig mekanisk karakterisering af cellekernen. I dette afsnit får vi cellens nukleare stivhed fra repræsentative kraftindrykningsmålinger.

I figur 6 viser vi deformationerne af de distale og proksimale sider af en kerne i en suspenderet og begrænset celle. En rig mekanisk adfærd kan observeres. I en typisk ophængt celle på et klæbende substrat blev kernen stærkt indrykket af perlen, men også lidt fortrængt ved gentagne skubbehændelser. Vi målte perleindrykningen på kernen ved at analysere kymograferne fra fluorescensbilleddannelse af Hoechst-farvede cellekerner. Kymographs blev let beregnet ved hjælp af Fijis Multi Kymograph plugin langs indrykningsretningen (Figur 6A, B) og importeret til Matlab (Version 2021, Mathworks) til videre behandling. En trinfunktion blev monteret på råintensitetsprofilen med det formål at spore kernens afgrænsningskanter langs indrykningsrutinens bane. Som det fremgår, indeholder den nøjagtige oplysninger om den nukleare formændring (figur 6 og figur S2). Vi brugte følgende dobbelt-sigmoid kurve som en analytisk version af et trin funktion:

(Ligning 1)

Her angiver _x1 og _x2 de distale og proksimale kanter af kernen, mens A og B er de maksimale og baggrund grå værdier af den blå kanal (Hoechst farvestof) af billedet (Figur 6B). Kantbredden er blevet taget i betragtning (_e0 = 0,25 mm). Mens den indrykkede, proksimale kernekant (_x2) fulgte den bane, der anvendes af den optiske fælde rutine efter mikrosfæren-kerne kontakt, den modsatte, distale kant (_x1) viser afslapning dynamik som forventet for en viskoelastic materiale såsom cytoplasma (Figur 6D). I modsætning hertil udviser kerner i celler, der er indesluttet i 10 μm høje mikrokamre, ikke en sådan translokaliseringsadfærd i kernen ved indrykning i cellen (figur 6B,D). Også vist i figur 6D, bagkanterne af kernerne forbliver uændret af perlen skubber fra den proksimale side, sandsynligvis på grund af stærkere kræfter som følge af celle sammentrækning og friktion, der virker mod indrykning kraft. For at få den korrekte deformationsdybde blev forskydningen x1 trukket fra det indrykkede målpunkt x2: Δx = x2 - _x1 (se også figur 6D).

Tving dataanalyse
Den kraft, der forårsagede nuklear deformation, blev målt fra ændringen i lysmomentumet, der opstod ved den optisk indespærrede mikroperle (figur 7A). Kraften ved at anvende trapezformede baner (trin 8.4.3, figur 7B) steg oprindeligt lineært, indtil fælden stoppede med at bevæge sig, men derefter afslappet til en stabil tilstandsværdi. Denne adfærd indikerede et viskoelastisk materiale, der udviser tab og opbevaringsmoduli. Lige efter indrykningshændelsen nåede kraften en topværdi, Fp, efterfulgt af en stressafspænding (Figur 7C):

(Ligning 2)

hvor F0 er den lagrede kraft for den elastiske komponent, og f(t) er en dimensionsfri afslapningsfunktion. Vi har analyseret denne adfærd på tre måder:

1. I betragtning af et standard lineært fast stof med eksponentiel stressafspænding, dvs. f(t) = ^e-t/τ, der er skematisk repræsenteret i figur 7C-indsat.

2. Brug af et generelt, dobbelt eksponentielt forfald:
F(t) = A + B1e-t^/τ1 + ^B2e-t/τ2.

3. Brug af en magt lov efterfulgt af en eksponentiel ^forfald59:
f(t) = ^t-pe-t/τ, der er monteret i figur 7C.

Mens pasformen til model 1 kan udføres ligetil, anbefaler vi at estimere de første gæt for (τ1, τ2) og (p, τ) for henholdsvis model 2 og 3. Dette kan udføres ved at tilpasse linjer på dataene i logaritmisk-versus lineære (figur 7D, venstre) og logaritmisk-versus-logaritmisk (Figur 7D, højre) skalaer. Tabel S3 opsummerer resultaterne for eksemplet analyseret i figur 7. I det følgende afsnit vil vi overveje kombinationen af en magtlov og en eksponentiel lov for karakterisering af cellekernemekanikken.

Force displacement relation
Ligeledes kan den beskrevne eksperimentelle set-up bruges til at opnå kraftforskydningsrelationen mellem flere indrykningshændelser. Ved at udføre trekantede rutiner (trin 8.4.4, figur 8A), er det muligt at relatere kraften til deformationen og plotte en kraftindrykningskurve. Et eksemplarisk resultat er vist i figur 8B, hvor en flad baseline jævnt ændret hældning, når perlen kom i kontakt med kernen. Det er en udfordring at identificere det sande kontaktpunkt i de støjende data, og det skal være en udfordring at se, om kontaktområdet er egnet til elastiske ^modeller60. I dette særlige eksperiment kan det også ses, at de efterfølgende ledationer resulterer i kurver med dybere kontaktpunkter, vejledende for for langsom nuklear formgenvinding efter perle tilbagetrækning og en ændring i den hysteriske cyklus defineret af kernens viskoelastiske materialeegenskaber (Figur 8C). Forskeren bør således være opmærksom på, om dette sker og indarbejder dette i den analytiske pipeline eller begrænser antallet af efterfølgende målinger, så denne effekt ikke ændrer målingen.

Kernemekanik i celler i suspension og under 10 μm indeslutning
Den ovennævnte tilgang blev brugt til at analysere dynamikken i kerne stress afslapning i suspenderede celler på klæbende substrater og lukkede celler. Vores resultater viser, at indespærringen resulterer i en udvidelse af det forventede område (figur 9A), men ubetydelig ændring i nuklear stivhed (figur 9B). Vi målte lignende afslapning med τ = 6,08 ± 1,1 s (ubefinderet) og τ = 4,00 ± 0,6 s (indeslutning), hvilket indikerer hurtig viskoelastic spredning, efterfulgt af en lagret kraftværdi, der svarer til kernens elastiske modulus. For at tage højde for eksperimentelle variationer, som kan produceres ved forskellige indledende forhold i indrykningsrutiner, blev målte lagrede kræfter normaliseret til indrykningsdybden som . Denne parameter tegner sig for kernen stivhed og beskriver den kraft, eller stress, der er nødvendig for en vis indrykning. Vi opnåede lignende stivhed under indespærring og i ikke-finerede celler: = 20,1 ± 12,6 pN/μm og = 24,6 ± 13,6 pN/μm (gennemsnitlig ± standardafvigelse).

Figur 1: Mikroinjektion af zebrafiskembryoner på etcellet (zygot) stadium. (A) Injektionsplade: Der anvendes en trekantet sprøjteplade til injektionen. Pladen er lavet af 1% ultrapure agarose i E3 (Egg's medium). Top- og sidevisninger vises til højre. b) Embryopositionering: Bryd embryonerne forsigtigt ved hjælp af en børste, og orienter, så encellen er tydeligt synlig og let tilgængelig med nålen. Vi foreslår at orientere embryonerne med cellen placeret i den modsatte side af nålen, som vist i skitsen. (C) Injektionsprocedure i etcellet fase embryo: gennembor chorion omkring embryoet og enkeltcellen med nålen. Sørg for, at spidsen af nålen er inde i cellen og slip trykket for at injicere. (D) Inkuberes embryonerne ved 28-31 °C, indtil de udvikler sig op til blastulastadiet (kuglestadiet) (4 hkf). Udfør celleisolationsprotokollen og cellefarvningen (trin 2), og forbered det optiske diffuseringskammer med isolerede celler i suspension og/eller indespærring kombineret med den tilsvarende substratoverfladebelægning (trin 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Forberedelse af det optiske pincetapparat. (A) Spin-belægningslag af PDMS med en defineret højde på glasbundsfade. PDMS-faldet vil sprede sig jævnt på grund af centrifugalkraften. B) Forberedelse af prøvekammeret ud af PDMS-laget. 1: skær en firkant med en skalpel, 2: coat den indre brønd med concanavalin A (ConA), vask og frøceller; 3: dække med et glas dias eller dække slip for at forsegle brønden. (C) Billede af den firkantede skæring med en skalpel og fjerne PDMS godt med sammenkrammer. (D) Montering af opsamlingslinsen på den optiske kraftsensor over fældefangstkammeret. En dråbe nedsænkning olie tjener som en nedsænkning medium mellem indsamling linse og den øverste glasdæksel. Skematisk ikke at skalere. Vær forsigtig, mens du sænker opsamlingslinsen for ikke at røre glasdækslet på prøveskålen. E) Billede af kraftdetekteringsenheden, der er i kontakt med prøven. (F) Skematisk for forsøgsopsætningen. Det optiske mikromanipulationsmodul bruger en kontinuerlig bølgelaserstråle (5W, λ = 1064 nm) med strømstyring gennem en halvbølgeplade (HWP) og en polariserende strålekløver (BS). Efter at være moduleret med et par AODs, er det koblet til den øvre epifluorescence port af en omvendt mikroskop. Laserstrålen reflekteres derefter af et 950 nm kortpas dichroic spejl (IR-DM), hvilket giver mulighed for transmission af fluorescens excitation og emission. Fældefangstlaseren føres ind i mikroskopets bagside, epifluorescenceport (øverste tårn). OT'erne er skabt på brændplan af en vand-nedsænkning objektiv linse (60x, NA = 1,2). Den optiske kraft sensor er udsat for mikroskop tårn og indfanger laserlys, der kommer ud af OTs med en høj-NA, olie-nedsænkning linse. Samtidig muliggør kraftsensoren lys-feltbelysning. Den roterende diskkonfokale enhed er koblet til venstre port. Den er udstyret med to integrerede lasermotorer (ILE), der styrer syv fluorescens excitation lasere og to back-belyst sCMOS kameraer, der muliggør dobbelt fluorophore billeddannelse i parallel Abb: TI, Transilluminator; FS, feltstop; AOD, acustooptical deflektor; HWP, halvbølgeplade; CAM, kamera (G) Fotografi af det optiske fældefangstudstyr. Rød cirkel angiver Bertrand-objektivet, der kan skiftes til den optiske sti manuelt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Valg af de rigtige prøver og parametre. (A) Repræsentativt billede af en isoleret zebrafisk stamcelle med en enkelt mikrosfære placeret tæt nok på kernen til at udføre indrykningseksperimentet. Skalastang = 10 μm. (B) Eksemplarisk fældebane; indrykningsdybde 5 μm; indrykningshastighed = 5 μm/s afslapningstid 10 s. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Mikroperle lokalisering inde zebrafisk embryoner under udvikling. 0,5 nL af 1 μm røde fluorescerende perler injiceres sammen med GPI-GFP mRNA (100 pg/embryo, plasmamembran) i WT embryoner for at visualisere perle lokaliseringer. (A-D) Fordeling af mikrosfæren 5 h efter injektion inde i et embryo monteret i 0,75% agarose. (A) Brightfield og fluorescens billede. Perlerne er homogent spredt over embryovævet som det ses i en konfokal mikrograf. (B) Maksimal projektion af konfokal fluorescens z-stack. Perlerne er farvekodet fra lilla til gul i henhold til deres z-position i billedet stakken. Lilla/magenta svarer til de mest ydre perler/celler (EVL; epitel omsluttende lag; eller stamfader stamceller placeret tæt på EVL overfladen), gul svarer til indre perler (stamfader dybe celler), som vist i skitsen til højre. (C) Snit og maksimal projektion af en understak på (B), der svarer til området i den orange boks: en stor del af de dybe celler indeholder 1-2 perler. (D) Klip og maksimal projektion af en understak af (B), der svarer til magentaboks: nogle EVL-celler indeholder 1-2 perler. (E) Brightfield billede og maksimal projektion af en z-stack af en 24 hkf embryo monteret i 0,75% agarose og bedøvet med tricain. Embryoner blev præinkuberet med tricain i 15 min. Fra venstre mod højre: mikrosfærer (1 μm diameter), GPI-GFP og billede overlapper hinanden. Perlerne fordelt over hele kroppen af embryoet. Scalebar dimension angivet i hvert panel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Isolerede zebrafisk stamfader stamceller med forskellige mærkning. (A) Transmission lys mikroskopi billede af suspension celler med 1 (top) eller 2 (nederst) injicerede perler. Cyanpile peger på perler. (B) Fluorescerende konfokale billeder af suspension celler med forskellige farvninger. Øverst til venstre: Lap2b-eGFP (indre atommembran, 80 pg/embryo) og H2A-mCherry. Øverst til højre: GPI-GFP (plasmamembran, 100 pg/embryo) og DNA-Hoechst (farves som beskrevet i afsnit 2). Nederst til venstre: MyI12.1-eGFP (transgen linje) og DNA-Hoechst. Nederst til højre: Calbryte488 og DNA-Hoechst (plettet som beskrevet i afsnit 2). (C) Transmission lys mikroskopi billede af indespærrede celler med 1 (top) eller 2 (nederst) injicerede perler. Cyanpile peger på perler. Skalalinjer = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Estimering af nuklear deformation fra roterende diskfilm. (A,B) Tid-bortfald af et indrykningseksperiment af kernen i (A) en ophængt celle og (B) en indesluttet celle. Skalastang 10 μm. Repræsentative snapshots af en Hoechst-mærket kerner vises 5 s før, under og 5 s efter indrykning med en optisk fanget mikrosfære (hvid pilespids). Kymografer langs indrykningssegmentet (rød linje, højre panel). _x1 og _x2 er de distale og proksimale (tæt på perlen) grænser for kernen under indrykning eksperiment udvundet fra pasformen af intensiteten profil til ligning 1. (C) Intensitetsprofiler langs indrykningssegmentet for tre forskellige rammer (før, under og efter indrykning) og monteret på ligning 1 for at vurdere de distale, _x1 og proksimale, _x2, positioner i kernekanterne. D) Repræsentative baner af _x1(t) i blåt og _x2(t) i rav under et indrykningseksperiment af ophængte og indespærrede celler (10 μm). Skraverede områder angiver indrykningen, afstanden mellem _x1 og _x2 angiver kernediameteren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: Kraft signalbehandling. (A) Skematisk af en optisk fanget mikrosfære, der deformerer cellekernen ved indrykning. Atommembran og optiske kræfter er angivet med de sorte pile. Ændringen i strålemomentum er angivet med den grønne pil _Pout. (B) Trap bane (top) og kraft (nederst) opleves af optisk fanget mikrosfæren under en gentagen nuklear indrykning eksperiment. (C) Force afslapning forfald efter kraften peak på den maksimale indrykning dybde. Indsat viser et skema over standard lineær fast stof, hvis dynamik omtrentlige de fænomenologiske observationer her. (D) Venstre: logaritme af den normaliserede kraft versus tid. De skyggeområder angiver den datadel, der bruges til at passe til det dobbelte eksponentielle forfald (røde linjer). Til højre: logaritme af den normaliserede kraft versus logaritmen af tid. Det skyggeområde angiver den datadel, der bruges til at passe til strømloven. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: Kraftindrykningsrutine med trekantede fældeforskydninger. (A) Repræsentativ bane af _x1(t) i blå og _x2(t) i rav under et trekantet indrykningseksperiment, der er taget på en celle i 10 μm indespærringshøjde. Øverst: Trap position. I midten: Nucleus form analyse. Afstanden mellem _x1 og _x2 angiver kernens diameter. Nederst: Kraftsignal. (B) Force vs trap position for otte på hinanden følgende led. (C) Udviklingen af spredningen, der er afledt af hysteresen mellem tilgangen og tilbagetrækningsdelen af f-d-kurven, af kernen for hver efterfølgende indrykningshændelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9. Nukleare egenskaber af celler i suspension (klæbende overflade) og indespærring fra trapezformede rutiner. A) Forventet område af kernen fra celler i suspension og under 10 μm indespærring. Sort bjælke repræsenterer medianen. B) Nuklear stivhed af celler i suspension og under indespærring. Sort bjælke repræsenterer medianen. P-værdier afledt af Kruskal-Wallis test ved hjælp af MatLab. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1: Trapezformet bane defineret af den optiske pincet software. Første (anden) række er x (y) afstanden, at fælden vil blive lineært fortrængt. På den tredje række angives varigheden af et givet trin i sekunder. Denne bane består af syv punkter og svarer til trapezen, der er indlæst to gange mod kernen i figur 7B. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Trekantet bane defineret af den optiske pincet software. Svarende til tabel 2 består denne bane af 16 punkter, svarende til otte indrykningshændelser i en dybde på 5 μm og en hastighed på 2,5 μm/s. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 3: Tilpasning af parametre for dataene i figur 7. IG: første gæt. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur S1: Optisk kraftsensorjustering og momentum baseline kompensation. (A) Field stop afbildet på hjælpekameraet (AUX, figur 2) gennem Bertrand-objektivet. En luftboble vises synlig i nedsænkningsolien, som ikke er synlig gennem okularet. (B) Rengør optisk sti. For nøjagtig justering skal du åbne feltstoppet og få det til at falde sammen med NA = 1,2 lyskegl. (C) Billede af prøveplanet. Den røde firkant angiver OT-arbejdsområdet. Skalastang: 20 μm. (D) Trapkraft målt over FOV, langs hvide dobbeltpile angivet i C. I rødt diffuseres effektvariation, når der ikke anvendes nogen rettelse. I blåt, fælde magt korrigeret over hele synsfeltet. (E) X-komponent i momentum baseline langs samme interval. Med rødt, ikke korrigeret spor. I blåt, spor korrigeret for fælde magt. I grønt, spor korrigeret for momentum baseline ved hjælp af Global Offset Kompensation i producentens software. (F) Samme som i E, for Y-komponenten. Bemærk, at under normal drift anvendes de skraverede komponenter til mekanik- og kraftmålinger, f.eks. x kraftkomponent under bevægelse langs x-koordinaten og y-kraftkomponenten under bevægelse langs y-aksen. Når alle rettelserne er implementeret, opnås en RMSD-støj fra <0,5 pN. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: En mislykket rutine på grund af svage fælder. (A) Kymograph viser en kerne indrykning fra en mislykket rutine. Kun korte, forbigående deformationer er synlige på grund af en flugt af perlen fra fælden. Det er vigtigt, at diffuseringslaseren stadig bevæger sig uden perle for at fuldføre den foruddefinerede bane (grøn prikket linje). Skalalinje = 10 μm. (B) Top: Trapposition kontra tid. Midt: Edge tracking resultat af indrykket proksimale og distale kerne kant. Bemærk, at distal kant ikke bevæger sig uden indrykning som almindeligt observeret for afsluttede rutiner på isolerede celler på klæbende substrater. Nederst: Kraft versus tid, der viser tabet af mikrosfæren angivet ved en reduktion i termisk støj og et pludseligt fald til nul kraft. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Overlevelse af injicerede embryoner. Embryoner injiceret med 1 μm perler og 100 pg/embryo af mRNA ved koncentrationer, der er skitseret i protokollen, blev sammenlignet med ikke-injicerede embryoner og viser ingen signifikante forskelle 24 timer efter befrugtning. Middel- og standardafvigelse af tre uafhængige forsøg med N > 21 embryoner pr. betingelse for hvert forsøg. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I denne protokol beskriver vi en unik metode til at afhøre cellekernekernes mekaniske egenskaber inde i de levende celler. I modsætning til andre kraftspektroskopiteknikker gav ikke-invasiv optisk fældefangst os mulighed for at afkoble cellemembranens og cytoskeletonets bidrag fra cellekernes stivhed. Vigtigere er optisk mikromanipulation kompatibel med multimodal mikroskopi, som vil gøre det muligt for eksperimentatoren at studere forskellige processer, der er involveret i celle nuklear mekanobiologi. Som et repræsentativt resultat brugte vi DNA-Hoechst farvning til at måle kernen deformation ved indrykning udført af kræfter i størrelsesordenen flere hundrede picoNewton.

Potentielle anvendelser af vores metode ud over de eksempler, der er skitseret i denne protokol
Muligheden for at udtrække kvantitative mekaniske oplysninger fra målinger inde i levende celler uden eksterne forstyrrelser muliggør en overflod af hidtil usete muligheder, der lige er begyndt at blive undersøgt. Således kan den præsenterede protokol for vores optiske mikromanipulationsplatform udvides til mere komplekse eksperimenter med stor alsidighed. Acousto-optiske deflektorer (AOD) kan generere flere optiske fælder til synkrone kraftmålinger på tværs af forskellige celleplaceringer samt kan bruges til aktiv mikrorheologi i et bredt ^{frekvensområde51,61}. Som det er blevet nævnt, kan kraftresponset ved indrykning overvinde den maksimale fældefangstkraft, hvilket fører til en flugt af perlen fra den optiske fælde. I dette tilfælde kan der konfigureres en kraftfeedback med AOD for at klemme den optiske kraft. Alt i alt kan flere mikrorheologiske tilgange, såsom stressafspænding, der er beskrevet i denne protokol, men også aktiv mikrorheologi eller krybeoverensstemmelse, eksperimentelt opnås med denne platform og grundigt analyseres af nye softwarepakker61,62,63,64,65 . Desuden er anvendelsen af kræfter ikke begrænset til kernen, men kan i princippet udføres for at måle forskellige intracellulære strukturer og i komplekse væv som påvist til fældefangst flydende røde blodlegemer inde i intakte ^blodkar66,67 eller fældefangst og deforme chloroplaster og mitokondrier68 . Lys-momentum kalibrering er uafhængig af formen og størrelsen af den indespærrede objekt, hvilket muliggør direkte kraft målinger på enhver kraft sonde med vilkårlig ^form38,39. Brugen af injicerede mikrosfærer gjorde det muligt for os at anvende høje kræfter på kernen med relativt lav laserkraft sammenlignet med direkte manipulation af cellulære strukturer69,70,71. Men i betragtning af en høj nok brydningsindeksforskel er det ikke nødvendigt med nogen eksternt anvendt kraftsonde, og intracellulære organeller kan manipuleres direkte uden injicerede perler (ikke-offentliggjorte observationer og ^reference70).

Potentielle ændringer af vores metode til at udvide applikationerne
Forskellige størrelser af mikroperler kan injiceres afhængigt af eksperimentet, men de relative kontroller skal udføres. For eksempel kan mindre perler injiceres for at studere celler på senere stadier. Dette vil reducere den maksimale kraft, der kan udøves af den optiske fælde (som vist i ^reference55). Større perler kan injiceres for at udøve højere kræfter, men disse kan påvirke embryo udvikling afhængigt af deres størrelse eller fase af interesse. I forsøg, hvor mikroperle injektion ikke er en mulighed, forskellige organeller viser brydningsindeks forskelle i forhold til cytoplasmaet kan stadig optisk manipuleres, hvilket giver anledning til optiske kræfter målbare fra lys momentum ^ændringer42. Som nævnt ovenfor, disse metoder er blevet anvendt af Bambardekar et al. at deformere celle-celle vejkryds i Drosophila ^embryo70. Ligeledes har cellens kerne et lavere brydningsindeks end det omgivende ^medium44, hvilket giver mulighed for perlefri indrykning (ikke-offentliggjorte observationer og ^reference72), selvom det er med en lavere fældefangststyrke. Kernen kan således ikke fanges let og undslipper fælden.

Den spin-coatede PDMS spacer er fremstillet via en bekvem og hurtig metode, men kan være uden for rækkevidde for laboratorier uden adgang til en mikro-/ nanofabrication facilitet eller engineering labs. Således kan afstandsrummet nemt samles fra laboratorietape eller parafilm (trin 4). Protokollen kan også tilpasses ved fremstilling af mikrofluidiske kanaler, der automatiserer leveringen af enkelte celler i foruddefinerede målebjerne eller ind i et kammer med en defineret højde for at estimere indespærringseffekten i samme prøve. Sådanne mikrofluidiske anordninger skal dog være konstrueret således, at de passer til mellemrummet mellem mikroskopmålet og opsamlingslinsen på den optiske kraftsensor på ca. 2 mm (se trin 3). Bemærk, at den optiske kraftsensor skal placeres i den passende højde, så ingen optiske afvigelser fra defokusering påvirker fotonmomentummålingen.

Andre ændringer kunne omfatte ændring af biologiske journalister. Vi fandt ud af, at Hoechst fluorescens spektralt bløder ind i GFP-kanalen, og vi favoriserer derfor kombinationen med mCherry-mærket histone som en nuklear markør til samtidig måling i to fluorescerende kanaler. Alternativt kan nuklear deformation nemt spores med en etiket rettet mod den indre nukleare membran som Lap2b-GFP (Figur 2).

Indrykning på cellekernen var i størrelsesordenen 2-3 mikron, som vi præcist kunne måle ved billedanalyse af diffraktions-begrænset spinning-disk konfokal mikroskopi. For de stivere kerner eller mindre kræfter vil indrykning næppe kunne måles ved hjælp af denne fremgangsmåde. Den absolutte kraftkalibrerede optiske pincet kan dog også kalibreres til positionsmålinger af den indespærrede perle på stedet ved hjælp af BFP interferometri med nanometerpræcished51. Ved hjælp af denne tilgang kan spændingssignalet og den optiske kraftsensor oversættes til den indespærrede sondes position gennem parameter β [nm/V], mens den invariante parameter α [pN/V] giver kraftværdier gennem ovennævnte lys-momentum kalibrering41 (se nedenfor for detaljer).

Fejlfinding
Vi konstaterede, at følgende udfordringer kunne opstå under eksperimentet:

Der dannes ingen stabil fælde, og mikrosfæren undslipper let
Snavs på mikroskopmålet eller en forkert justeret korrektionskrave kan føre til en fejl i en stabil fælde. Hvis der ikke findes en umiddelbar løsning, skal du måle punktspredningsfunktionen for objektivobjektivet. Hvis prøven af interesse er dybt inde i et optisk tæt væv, kan laserfokus opleve alvorlige optiske afvigelser, der fører til ustabil fældefangst (denne effekt er normalt ubetydelig i isolerede celler, men bliver mere tydelig i tykkere væv). For høj stivhed kan kernens genoprettende kraft overstige fældens flugtkraft, således at mikrosfæren går tabt, og indrykningsrutinen mislykkes. I første omgang bliver den nukleare membrankant, der er proksimale for den optiske fælde, næppe indrykket (figur S2A). Når dette sker, er diffuseringslaseren ikke længere påvirket af kraft og Brownian bevægelse, hvilket fører til et kraftfald til nul og et fald i signalstøjen (Figur S2B). Hvis dette sker, kan laserkraft øges for at have en stærkere fælde, amplituden af trapezformet bane, der skubber perlen ind i kernen, kan reduceres, eller den første position af den indespærrede mikroperle kan sættes længere væk fra kernen.

Cellen bevæger sig under stimuleringen
Hvis cellerne ikke er tilstrækkeligt fastgjort, vil den optiske gradientfælde flytte cellerne, mens de udfører den intracellulære indrykningsrutine, således at kernens kræfter og underliggende mekanik er artefaktiske. For at forhindre forskydning af hele cellen anbefaler vi at øge koncentrationen af celle vedhæsionsmolekyler på overfladen, f.eks.

Indledende momentum kompensation
Hvis der ikke er en indledende momentumkompensationsrutine tilgængelig på OTs-platformen (trin 6.5), skal der korrigeres et kunstigt, kraftuafhængigt basissignal. Dette er synligt som en hældning på kraftkurven, selv uden perle fanget (Figur S1E). For at udføre korrektionen skal den samme bane udføres uden en perle uden for cellen på nøjagtig samme position. Til dette skal du flytte cellen væk fra fælden ved hjælp af scenekontrolelementet. Som reference ændres kraftforskydningen 5 pN på tværs af FOV ved 200 mW i vores system; således bliver det ubetydeligt for korte baner. Alternativt kan en piezoscanningsfase bruges til at flytte cellerne på prøven, så laserpositionen er konstant.

Kritiske trin i den præsenterede protokol
Mikrosfærer bør injiceres i højre, 1-celle fase for at sikre maksimal fordeling over embryoet. Perler bør ikke være fluorescerende, således at der ikke udslip af lys i de fluorescerende kanaler, der anvendes til billeddannelse. For eksempel er selv typiske rød-fluorescerende perler tydeligt synlige i den blå kanal, der bruges til billeddannelse af cellekernen efter Hoechst farvning på grund af deres lysstyrke (excitation: 405 nm; emission: 445 nm). Stabil fastgørelse af cellen til substratet er afgørende for at forhindre sideforskydning under indrykningsrutinen. Hvis cellen bevæger sig under rutinen, undervurderes kræfterne. Hvis dette sker ofte, skal du optimere protokollen for vedhæftede filer. For vævskulturceller fører andre celle vedhæhæftningsproteiner, såsom fibronectin, kollagen eller poly-L-lysin, til tilfredsstillende vedhæftet fil (ikke-offentliggjorte observationer). Under indespærringen udsættes cellerne for en pludselig og alvorlig mekanisk stress. Dette kan forårsage skade på cellerne, og ofte vil eksperimentatoren støde på bristede celler, hvis proceduren ikke udføres omhyggeligt. Også, hvis indespærring højden er for lille, vil alle cellerne lider af nukleare omsluttelse brud eller uoprettelig skade. For at afbøde disse skal du sænke den øverste dæksel langsommere og/eller øge afstanden mellem dæksleren.

Begrænsninger af teknikken og forslag til at overvinde dem
En klar begrænsning af teknikken er laserlysets indtrængning i dybe dele af vævet, hvilket fører til afvigelser og ustabil fældefangst. En lavere grænse for penetrationsdybde afhænger således af prøvens klarhed, den afvigelseskorrektion, der kan ^anvendes73 , og den anvendte lasereffekt. Det skal tages i betragtning, at en højere lasereffekt fører til termisk excitation af prøven i nærheden af mikrosfæren. Opvarmningen af prøven, der stammer fra 1064 nm bølgelængde laser stedet er minimeret for at undgå plausibel varme-relaterede stress på vores biologiske ^prøver74.

En anden begrænsning er den maksimale kraft, der kan måles. Selv om direkte lys-momentum detektion muliggør kraftmålinger langt ud over den optiske ^trap40,41' lineære responsregime, er den maksimale anvendte kraft i størrelsesordenen et par hundrede picoNewtons. Dette er begrænset af laserkraft og den deraf følgende skadestærskel for blødt biologisk materiale og brydningsindeksforskellene, som normalt ikke er større end 0,1 eller ^0,344. Flere metoder er blevet foreslået at øge kraftdetekteringsgrænsen, f.eks. ved hjælp af struktureret ^lys75, antireflekterende belagt ^{mikrosfærer76}, højbrydningsindekspartikler77 eller meget dopede kvanteprikker78.

OT'er kan anvendes til nanometerskalapositionsmålinger gennem BFP-interferometri, således at perlens position i fælden er Δx = β Sx, hvor _Sx er sensorens spændingssignal, og β [μm/V] kan kalibreres on-the-fly efter forskellige ^{protokoller35,54}. For en optisk kraftsensor kan det bevises, at spændings-til-kraft-omregningsfaktoren α [pN/V] direkte vedrører β og fældestivheden, k [pN/μm], gennem α = kβ ³⁷) I forsøg med perleforskydninger, der er for små til at blive opdaget fra optisk billeddannelse, kan denne strategi bruges til at supplere kraftmålinger med lille positionsdetektering. Et eksempel er anvendelsen af de eksperimentelle rutiner, der præsenteres her på meget stive kerner, for hvilke kræfter ved rimelige laserkræfter (200-500 mW) ikke er tilstrækkelige til at fremkalde indrykningsværdier, der er store nok. I så fald skal perlen bringes i kontakt med kernen, og fældefangststivheden skal kalibreres før målingen (trin 8.6). Indrykning d af kernen som en funktion af kraft kan indirekte bestemmes som:

d = _xtrap - F/k

hvor xtrap er diffuseringspositionen. Forskellig fra den invariante lys-momentum faktor α [pN/V], faktor β [μm/V] skal kalibreres forud for hvert eksperiment, da det afhænger af mange lokale variabler bestemme fældefangst dynamik, såsom partikelstørrelse, optisk fælde spot size, og relative brydningsindekser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 22 mm cover glasses	Ted Pella	260148
#1.5 22x60 mm Coverglasses	Ted Pella	260152
#1.5H glass bottom dishes	Willco	GWST-5040
10-um beads	Supelco	72986
1-mm glass capillaries	Harvard Apparatus	30-0020 GC100F-15
1-um polystyrene microbeads	Sigma	89904
1-um red-fluorescent beads	ThermoFisher	F8816
Agar	ThermoFisher	16500500
Aqcuisition cameras sCMOS	Andor	Sona-4BV11-UNI
Auxiliary camera (Figure 3, AUX)	Blackfly, FLIR	BFS-U3-200S6M-C
Calbryte 520	AAT Bioquest	520 AM
Centrifuge	Eppendorf	5453000011
Concanavalin A	Sigma	C5275
DMEM	Sigma	D2906
DNA-Hoechst	ThermoFisher	33342
Double scotch tape	Biesse Adesivi
E3	5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4
Eclipse Ti2	Nikon
Forceps	Fine Science Tools	11252-20
GPI-GFP
H2A-mCh
Image acquisition software	Fusion-Andor
Immersion Oil	Cargille	Type B: 16484
IR protection googles	Thorlabs	LG1
Lap2b-eGFP
Micro loader pipette	Eppendorf	GELoader
Microinjector	World Precision Instruments	SYS-PV820
MicroManager 2.0
Micromiter slide	ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions
Mineral oil	Sigma	M3616
Motorized stage	ASI
Needle puller	Sutter instrument Co.	Model P-97
Optical tweezers platform	Impetux Optics	Sensocell
OTs software (LightAce)	Impetux Optics
PDMS	Sigma	Sylgard 184
PDMS Curing agent	Sigma	Sylgard 184
Post processing software (Matlab)	Mathworks
RNAse free water	Thermofisher	AM9937
Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)	Semrock	FF01-950/SP-25
Spin-coater	Specialty Coating Systems	Spincoat G3P-8
Spinning-disk confocal microscope	Andor	DragonFly 502
Stereomicroscope	Leica M80
Triangular microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU1
Universal oven	Memmert	UNB 200
Water immersion objective	Nikon	MRD07602