Direkte kraftmålinger av subcellulær mekanikk i innesperring ved bruk av optiske pinsett

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å undersøke de intracellulære mekaniske egenskapene til isolerte embryonale sebrafiskceller i tredimensjonal innesperring med direkte kraftmåling ved en optisk felle.

Abstract

Under utviklingen av en multicellulær organisme deler en enkelt befruktet celle og gir opphav til flere vev med forskjellige funksjoner. Vevsmorfogenese går i hånd med molekylære og strukturelle endringer på enkeltcellenivå som resulterer i variasjoner av subcellulære mekaniske egenskaper. Som en konsekvens, selv innenfor samme celle, motstår forskjellige organeller og rom annerledes enn mekaniske påkjenninger; og mekanaltransduksjonsveier kan aktivt regulere sine mekaniske egenskaper. Evnen til en celle til å tilpasse seg mikromiljøet i vevsnisjen skyldes dermed delvis evnen til å føle og reagere på mekaniske påkjenninger. Vi foreslo nylig et nytt mekanosenasjonsparadigme der kjernefysisk deformasjon og posisjonering gjør det mulig for en celle å måle det fysiske 3D-miljøet og gir cellen en følelse av proprioception for å dekode endringer i celleform. I denne artikkelen beskriver vi en ny metode for å måle kreftene og materialegenskapene som former cellekjernen inne i levende celler, eksemplifisert på tilhengerceller og mekanisk begrensede celler. Målingene kan utføres ikke-invasivt med optiske feller inne i celler, og kreftene er direkte tilgjengelige gjennom kalibreringsfri deteksjon av lysmoment. Dette gjør det mulig å måle mekanikken til kjernen uavhengig av celleoverflatedeformasjoner og tillate disseksjon av eksteroceptive og interoceptive mekanotransduksjonsveier. Det er viktig at fangsteksperimentet kombineres med optisk mikroskopi for å undersøke cellulær respons og subcellulær dynamikk ved hjelp av fluorescensavbildning av cytoskjelett, kalsiumioner eller kjernemorfologi. Den presenterte metoden er enkel å bruke, kompatibel med kommersielle løsninger for kraftmålinger, og kan enkelt utvides for å undersøke mekanikken til andre subcellulære rom, for eksempel mitokondrier, stressfibre og endosomer.

Introduction

Vevsmorfogenese er en kompleks prosess der biokjemiske signaler og fysiske krefter er romlig koordinert. I det utviklende embryoet dikterer gradienter av biokjemiske signalfaktorer skjebnespesifikasjon og sikrer riktig ^{vevsmønster1,2}. Samtidig spiller iboende og ekstrinsiske krefter en rolle i å bygge arkitekturen til ^embryoet3,4. Påvirkningen av cellebarkmekanikk i denne sammenhengen har blitt studert ^mye5,6. Den tette forbindelsen mellom mekanokjemiske prosesser under morfogenese er avhengig av egenskapene til enkeltceller for å føle og reagere på mekaniske krefter i vevsmikromiljøet. Celler dekoder dermed mekaniske signaler via tilstedeværelsen av kraftfølsomme subcellulære og molekylære elementer som transduserer mekanisk informasjon til spesifikke signalveier som kontrollerer celleadferd, celle skjebne og cellemekanikk.

Et kjennetegn ved utviklingsprosesser er at celler organiseres som grupper for å bygge multicellulære strukturer. Som sådan omorganiserer og beveger enkeltceller seg sjelden alene, men er forbundet i en tett sosiotop der de viser kollektiv oppførsel som supracellulær ^migrasjon7, (un)jamming ^{overganger8,9} eller blastocyst ^{komprimering10}. Mekaniske krefter generert i og mellom celler tjener som viktige signaler for å instruere kollektiv ^{celledynamikk7,11}. Men selv når celler beveger seg alene, for eksempel stamceller som klemmer seg mellom vevsark eller smale vevsnisjer, opplever de omfattende anisotrope mekaniske krefter når de navigerer i et tredimensjonalt miljø. Disse mekaniske påkjenningene på celler har dype konsekvenser for cellulær ^atferd12,13. Flere mekanismer har blitt undersøkt som konvergerer på kjernen som et stort mekanotransduksjonselement14,15, som passivt eller aktivt mekanisk element under migrasjon i et tett 3D-vevsmiljø15,16.

Vi foreslo nylig en mekanisme som utstyrer celler til å måle formdeformasjoner ved hjelp av kjernen som en elastisk intracellulær mekano-gauge12. Kjernen, som er den største organellen i en celle, gjennomgår store deformasjoner når celler polariserer, migrerer eller endrer form under mekanisk strekk, innesperring eller osmotisk stress16,17,18,19. Vi fant at kjernefysisk konvolutt strekker seg sammen med den intracellulære plasseringen av kjernen gir celler informasjon om størrelsen og typen celledeformasjon (for eksempel cellekompresjon versus celle hevelse). Strekking av kjernen er forbundet med en utfoldelse av den indre kjernefysiske membranen (INM), som fremmer kalsiumavhengig cPLA2 (cytosomisk fosfolipase A2) lipaseaktivitet ved INM etterfulgt av frigjøring av arakidonsyre (AA) og rask aktivering av myosin II ved cellebarken. Dette fører til økt cellekontraktilitet og amoeboid cellemigrering over en terskel for kortikale kontraktilitet6. Den mekanosensitive responsen på celledeformasjon skjer på mindre enn ett minutt og er reversibel ved frigjøring av innesperring, noe som tyder på at kjernen fungerer som en strekkmåler for cellulær proprioception som regulerer adaptiv celleadferd under mekaniske stressforhold. Denne mekanosensitive banen er vist å være aktiv i stamceller av stamceller avledet fra sebrafiskembryoer, både i pluripotente og avstamningsbesatte ^celler12 og er bevart i forskjellige arter og ^{cellelinjer20}.

I tillegg til de kjernefysiske egenskapene som celle-mekanosensor, er kjernefysisk arkitektur og mekanikk iboende regulert under utvikling og som svar på celle skjebne ^{spesifikasjon21}, derav tuning cellulær mekano-følsomhet22,23. Konsekvensen kan være en endring i kjernefysisk etterlevelse som åpner for morfologiske endringer og overganger fra en forvandrer til en trekkstat og ^omvendt8.

Flere teknikker for å måle cellekjernemekanikk har blitt brukt, for eksempel atomkraftmikroskopi24,25, mikropipetteaspirasjon26,27, mikrofluidisk ^teknologi28 og mikroneedler29. Imidlertid er mange av disse teknikkene invasive i den forstand at hele cellen må deformeres, noe som begrenser målingen av mekaniske egenskaper og kraftavhengige responser av kjernen selv. For å omgå samtidig deformasjon av celleoverflaten og dens mekanosensitive celle ^cortex30, ble isolerte kjerner studert i ulike ^{sammenhenger31,32}. Det kan imidlertid ikke utelukkes at kjernefysisk isolasjon er forbundet med en endring i mekaniske kjerneegenskaper og deres regulering (^referanse24 og egne upubliserte observasjoner).

Optisk pinsett (OT) er en allsidig teknologi som har tillatt en mengde eksperimenter i cellemekanobiologi og har vært medvirkende i vår forståelse av hvordan molekylære maskiner omdanner kjemisk til mekanisk ^energi33,34. Optisk pinsett bruker en tett fokusert laserstråle for å utøve optiske krefter på dielektriske partikler som har en brytningsindeks høyere enn det omkringliggende ^mediet33. Slike krefter kan være i størrelsesorden hundrevis av pico-Newtons og resultere i effektiv innesperring av partikkelen i laserfellefokuset, noe som muliggjør manipulering av den fangede partikkelen i tre dimensjoner. Bruk av lys har en viktig fordel ved at målingen kan utføres ikke-invasivt inne i levende celler. Optiske manipulasjoner er ytterligere begrenset til laserstrålens fellefokus. Derfor kan manipulasjonen utføres uten å stimulere de omkringliggende cellulære membranene og perturberer ikke aktinbarken eller mekanosensitive prosesser ved plasmamembranen, for eksempel den kraftavhengige aktiveringen av ionkanaler.

Vanskeligheten med den optiske pinsetttilnærmingen er å nøyaktig bestemme kreftene som brukes på mikrosfæren ved hjelp av klassiske tilnærminger som er avhengige av indirekte kraftkalibrering basert på utstyrsteoremet eller bruken av definerte Stokes-drag-krefter for å måle en lasereffektavhengig ^{rømningskrafteffekt35}. Mens disse metodene er enkle å implementere i et in vitro-eksperiment, kan de vanligvis ikke oversettes til et mobilmiljø. Flere strategier er innført i feltet som er avhengige av en direkte kraftkalibrering, avledet fra de første prinsippene for momentumbevaring36,37. I motsetning til andre kraftspektroskopitilnærminger, utledes kraftmålinger fra en lokal utveksling av lysmoment med den vilkårlig formede fanget ^{partikkelen38,39}. I vårt eksperimentelle oppsett måles endringer i lysmoment som oppstår fra optiske krefter direkte uten behov for in situ trap calibration40,41,42,43. Dermed blir målingene mulig i et viskøs miljø som det indre av cellen eller til og med i et vev, og krefter kan lett kvantifiseres ned til pN-nivået.

I denne protokollen beskriver vi en analyse for å mekanisk manipulere intracellulære organeller eller strukturer og kvantitativt vurdere deres mekaniske egenskaper ved et optisk pinsettoppsett. Dette oppsettet er integrert i et roterende diskfluorescerende mikroskop som muliggjør parallell avbildning av cellulær oppførsel eller intracellulær dynamikk. Analysen gjør det mulig å karakterisere de mekaniske egenskapene til bestemte cellulære rom, for eksempel kjernen, samtidig som den studerer mulig mekanorespons og aktivering av molekylære signalveier som følge av selve deformasjonen. Videre tillater optisk fangst av injiserte mikrober i celler en økning i innrykkskraften takket være en betydelig høyere brytningsindeks for polystyrenperlen (n = 1,59) sammenlignet med den iboende brytningskontrasten44 av kjernen (n ~ 1,35) versus cytoplasma (n ~ 1,38). Den presenterte strategien kan enkelt tilpasses studiet av andre intracellulære strukturer og organeller, samt andre tilnærminger som involverer aktiv mikroheologi, bruk av flere optiske feller for å sondere de samme / forskjellige subcellulære strukturer samtidig, og målinger rettet mot cellemekanobiologi i det levende embryoet.

Protocol

Alle protokollene som brukes er godkjent av Institutional Animal Care and Use Ethic Committee (PRBB-IACUEC) og implementert i henhold til nasjonale og europeiske forskrifter. Alle eksperimenter ble utført i samsvar med prinsippene i 3Rs. Sebrafisk (Danio rerio) ble opprettholdt som tidligere beskrevet.

1. Fremstilling av isolerte primære embryonale sebrafisk stamceller

1. Mikropipetter og agarosepreparat
   MERK: For en komplett sebrafisk embryomikroinjeksjonsprotokoll, se ^referanse45.
   1. Med en mikropipettetrekker trekker du en 1,0 mm glasskapillær for å få to ^nåler45. Oppbevar de ubrukte kanylene i en 150 mm Petri-tallerken festet til en gjennomspillingspute eller i en innvendig labbåndring for å beskytte den tynne spissen mot skade under transport.
   2. Smelt 1% ultrapure agarose i E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4) i et standard kjøkken / lab mikrobølgeovn i 10 s. Varm blandingen gjentatte ganger i korte perioder (få sekunder) til agarose smelter.
   3. Når agarose er helt smeltet, la den avkjøles kort, og hell den deretter i en 10 cm Petri-tallerken. Tilsett langsomt den trekantede mikroinjeksjonsformen (se Materialtabell) på toppen av agaroseen og unngå utseendet på bobler. Ikke skyv formen, sørg for at den forblir på agaroseoverflaten.
   4. Når agarose størkner helt, fjern den trekantede formen veldig sakte ved å utøve en mild kraft for å unngå brudd i agarose. Platen kan oppbevares opp ned ved 4 °C i 2-4 uker.
   5. 30 min før mikroinjeksjonen, ta platen ut av kjøleskapet og tilsett E3 forvarsel til 28 °C for å la den stabilisere seg ved romtemperatur.
2. Klargjøring av injeksjonsblanding
   1. For å forberede injeksjonsblandingen, fortynn 1 μm mikrober (polystyren, ikke-fluorescerende) i 1: 5-forhold i RNase fritt vann.
   2. Forbered mRNA for forbigående uttrykk for fluorescerende markører eller uttrykk for rekombinante genkonstruksjoner og/eller co-injeksjon av morpholino ved ønsket konsentrasjon.
      MERK: En typisk injeksjonsblanding for koinjeksjon av mikrober sammen med 100 pg mRNA per embryo for å merke, For eksempel er kjernen med H2A-mCherry: 1 μL perler + 1 μL mRNA (lagerkonsentrasjonen er 1 μg /μL) + 2,5 μL RNA fritt vann + 0,5 μL fenolrød (lagerløsning 0,5%, fenolrød er ikke obligatorisk; den brukes til en bedre visualisering av den injiserte dråpen, men den ikke-merkede injeksjonen dråpe er også synlig for en erfaren eksperimenter). RNA injeksjon kan også være nyttig for å velge injiserte embryoer. Fluorescerende mikrober kan injiseres, i stedet for ikke-fluorescerende, for å visualisere dem.
3. Mikroinjeksjon nål lasting og kalibrering
   1. Slå på mikroinjektoren ved hjelp av alternativet Tidsporten . Denne innstillingen er svært viktig for å kalibrere injeksjonsvolumet riktig. Still inn gatingtiden på ca. 500 ms.
   2. Last 3 μL av injeksjonsblandingen inn i kanylen ved hjelp av en mikrolasterpipette.
   3. Sett nålen inn i mikromanipulatoren og tett godt. Kontroller om mikromanipulatoren er i god posisjon og har nok frihet til å bevege seg i x-y-retning på injeksjonsplaten.
   4. Mål fallstørrelsen ved hjelp av en mikrometersklie (5 mm/100 divisjoner) med en dråpe mineralolje på ^toppen45 og kast ut en dråpe injeksjonsblanding direkte inn i mineraloljen.
   5. Beskjær nålen med skarpe tang i bratt vinkel for å generere en skarp spiss spiss. Juster fallstørrelsen til 0,1 mm, tilsvarende 0,5 nL injisert materiale.
      MERK: Hvis dette volumet overskrides ved å kutte nålen, anbefales det å gjøre om kalibreringsprosedyren med en ny nål. Gatingtiden til mikroinjektoren kan justeres litt for å matche fallvolumet; Korte gatingtider tilsvarer imidlertid en stor nåleediameter, noe som potensielt skader embryoene.
4. Mikroinjeksjon av sebrafiskembryoer på encellet stadium
   1. Samle sebrafisk embryoer kort tid etter befruktning for mikroinjeksjon av perleblandingen direkte inn i encellet (zygote) stadium embryo før første celledeling oppstår.
      MERK: Dette sikrer riktig fordeling av mikrosfærer og et høyt nok utbytte av isolerte blastomerer med minst en mikrosfære per celle i senere utviklingsstadier der eksperimenter utføres (blastula-gastrula stadium). Innrykkseksperimenter kan fortsatt utføres hvis det er to sfærer i cellen, men celler som ikke har perler, bør utelates (selv om innrykk uten sfærer er mulig). AB wildtype stammer ble brukt i denne protokollen, men enhver annen stamme, for eksempel, TL kan brukes.
   2. Plasser encellede embryoer (zygote) i en forhåndsvarslet trekantet 1% agaroseform, som vist i figur 1A, ved hjelp av en pasteurpipette i plast.
   3. Fjern ekstra medium med samme pipette for å unngå at embryoene flyter rundt. Skyv embryoene forsiktig inn i den trekantede formen via en børste. Hold litt avstand mellom embryoer for å lette riktig orientering (figur 1B).
   4. Juster embryoene forsiktig etter en børste slik at embryoene orienteres sidelengs, med den ene cellen i zygoten tydelig synlig, som vist i figur 1B. En ideell orientering for mikroinjeksjon nås når den ene cellen i embryoet vender mot nåleretningen (injeksjon via embryoets dyrestang) eller på motsatt måte vendt mot eggeplommecellen (injeksjon via embryoets vegetalstang), som vist i figur 1C.
   5. Hold fatet med den ene hånden og bruk den andre hånden til å plassere nålespissen ved hjelp av mikromanipulatorkontrolleren. Senk nålespissen mot embryoene.
   6. Pierce koret og gå inn i encellet embryo med nålen mens du overvåker prosedyren gjennom stereomikroskopet. Sørg for riktig plassering av kanylen og, etter injisering, riktig plassering av den injiserte dråpen som vist i figur 1C.
   7. Gjenta for alle embryoer: Flytt nålen opp, skyv parabolen med embryoene til neste embryo er sentrert, senk nålen og injiser den.
   8. Når hele settet med embryoer er injisert, fjern embryoene fra agarose mold / Petri parabolen ved å skylle noen E3 og legg dem i en ny Petri-tallerken ved hjelp av en plast Pasteur pipette. Det anbefales å plassere tilstrekkelige medier på injeksjonsplaten for å unngå å tørke ut embryoer under mikroinjeksjonsprosedyren.
   9. Gjenta prosedyren til ønsket antall embryoer injiseres. Embryoer må være på ett cellestadium for å sikre maksimal og homogen spredning av perlene.
      MERK: Denne prosedyren er optimalisert for tidlige blastula embryoer og må sannsynligvis optimaliseres hvis forskjellige utviklingsstadier skal undersøkes.
   10. Plasser de injiserte embryoene inne i en inkubator ved 28-31 °C i ca. 4 timer eller til ønsket stadium (figur 1D) før du fortsetter med protokollen for primærcellekultur.
       MERK: La eventuelt embryoene utvikle seg utover blastulastadiet (eller ønsket måletidspunkt) for å sikre overlevelse og utelukke toksisitetsartefakter. På larvestadier monteres bedøvede larver med trikain i 0,75% agarose og bilde fordelingen av mikrosfærer i ulike vev. For å lage en lagerløsning, bland: 400 mg trikainpulver i 97,9 ml destillert vann, ca. 2,1 ml 1 M TRIS-base (pH 9), og juster til pH 7. Denne oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C. For å bruke trikain som bedøvelse, fortynn 4,2 ml lagerløsning i 100 ml eggens medium (eller ønsket media); I dette tilfellet ble E3 brukt. Se ^referanse46 hvis du vil ha mer informasjon.

2. Forberedelse og farging av enkeltceller

1. Plasser sfæren scenen embryoer (4 hpf, timer etter befruktning) i en glassfat ved hjelp av en plast Pasteur pipette. Velg embryoene som er positive for signalet til de injiserte perlene, og som uttrykker det fluorescerende proteinet i tilfelle mRNA-injeksjon. Noen embryoer kan vise høy perle klynger og kan utelukkes.
   1. Dekorioner embryoene manuelt ved hjelp av tang. Overfør ca. 10-15 embryoer til 1,5 ml reaksjonsbeholdere ved hjelp av en pasteurpipette i glass.
      MERK: Når embryoene er dechorionated, festes de til plasten, og bruk av glass er nødvendig. Som et alternativ til glassplaten kan en plast Petri-tallerken med et tynt lag på 1% agarose brukes. Manuell dechorionation bør foretrekkes fremfor enzymatisk Pronase behandling for å forhindre proteolytisk skade på celle overflate proteiner og potensielle endringer i mekaniske celle og vev egenskaper, forhindre utvidet utvinning ^ganger47.
2. Fjern E3-mediet og tilsett 500 μL for forhåndsvarmet _{CO2-uavhengig} vevskulturmedium (DMEM-F12; med L-glutamin og 15 mM HEPES, uten natriumbikarbonat og fenolrød supplert med 10 enheter penicillin og 10 mg/L streptomycin).
   MERK: Ikke bruk _{CO2-avhengige} medier med mindre det brukes en mikroskopinkubator. Bruk av for eksempel RPMI i karbonatbufrede forhold forårsaker endringer i mediets pH og kan påvirke celleoverlevelsen. Et annet viktig aspekt er å unngå kulturmedier som inneholder serum. Serum kan inneholde lysofosfatidsyre (LPA), en kraftig aktivator av Rho/ROCK-banen, som er i stand til å kontrollere cellulær kontraktilitet og bevegelighet i ^stamceller6. Mediets osmolaritet bør opprettholdes på 300 mOsm for å unngå osmotiske utfordringer som kan forstyrre kjernefysisk morfologi eller ^mekanikk12.
3. Fjern celler manuelt ved å riste røret forsiktig. Forsikre deg om at innholdet i røret blir uklart uten store biter som er synlige ved øyet. Unngå dannelse av bobler for å minimere skade og tap av celler.
4. Sentrifuge ved 200 x g i 3 min. Pellet må være tydelig synlig.
5. Fjern supernatanten og følg et av trinnene som er beskrevet nedenfor.
   1. Hvis det ikke er behov for flekker, tilsett 500 μL DMEM. Resuspend forsiktig med en 200 μL pipette ved å målrette en væskestråle på pellets. Ikke utøv overdreven skjærkraft på cellene. Skumming indikerer skade på cellene.
   2. For merking av kjernen med DNA-fargestoffer som Hoechst, bland 0,5 μL DNA-Hoechst (lager 2 mg/ml) i 1000 μL DMEM for å oppnå 1 μg/ml endelig konsentrasjon. Tilsett 500 μL av denne fargingsløsningen til cellene og resuspend forsiktig. Inkuber i 7 min i mørket.
   3. For å flekke cellene med en fluorescerende kjemisk kalsiumindikator Calbryte-520, legg Calbryte-520 til en 5 μM konsentrasjon i DMEM. Inkuber i 20 min i mørket.
      MERK: Protokollene som er angitt i trinn 2.5.2 og 2.5.3, er optimalisert for disse spesifikke produktene. Andre flekker kan utføres ved hjelp av protokollene som er angitt av produsenten.
6. Sentrifuge igjen med de samme innstillingene som i trinn 2.4; fjern supernatanten, og resuspend cellene forsiktig (for å unngå dannelse av klynger) i 50 μL DMEM for prøver i suspensjon eller 20 μL DMEM for celler i innesperring.

3. Fremstilling av optiske fangstkamre ved hjelp av polydimetylsiloksan (PDMS) avstand

MERK: Optiske kraftmålinger basert på lysmomentdeteksjon krever at alt lyset kommer ut av de optiske ^fellene40. For robustheten til den konstante kalibreringsfaktoren α (pN/V) må lysfordelingen på bakre brennplan (BFP) til den optiske kraftsensoren ha en nøyaktig korrespondanse med fotonmomentet. Dette bestemmer avstanden fra overflaten på oppsamlingslinsen til overlappingsplanet til ca. 2 mm, som er den maksimale høyden på de optiske fangstkamrene.

1. PDMS spin-belegg på # 1,5 glassbunnsretter.
   MERK: Følgende oppskrift er gitt for ca. 40 retter. Den resulterende mikrochamberen vil ha forskjellige høyder avhengig av om eksperimenter skal utføres på suspenderte eller begrensede celler (figur 1D).
   1. Bland 9 ml av basepolymeren PDMS og 1 ml PDMS herdemiddel i et 50 ml konisk rør. Bland de to produktene aktivt for å sikre riktig distribusjon av herdemiddelet.
   2. Degas blandingen for å unngå bobler ved hjelp av en vakuumpumpe. Introduser konisk rør i en vakuumflaske og evakuer kammeret. Vent til det ikke er noen bobler til stede i blandingen.
      MERK: Åpne vakuumet langsomt for å forhindre skumming og søl av PDMS ut av falkerøret.
   3. Legg glassbunnfatet på spin-coater chucken (figur 2A). Vær forsiktig så du ikke klør, fingeravtrykk eller skitne til retten. Beskytt spin-coater-boksen mot PDMS-lekkasjer med aluminiumsfolie.
   4. For OT-kamre for eksperimenter på celler i suspensjon, tilsett ca. 250 μL PDMS-blanding i midten av bunnfatet og spinn det ved 750 rpm i 1 min. Høyden på PDMS-laget vil være 50 μm ca. ⁴⁸.
   5. For OT-kamre for eksperimenter på begrensede celler, legg til en liten dråpe PDMS (ca. 50 μL) og spinn den ved 4000 rpm i 5 minutter. Høyden på PDMS-laget vil være 10 μm omtrent. Hvis du vil ha en detaljert protokoll om hvordan du får tak i ulike PDMS-tykkelser, kan du se ^referanse48.
   6. Herd de PDMS-belagte glassbunnsrettene ved 70 °C i 1 time.
   7. Klipp en firkant på 1 x 1 cm på PDMS-laget med en skalpell og skrell den av med pinsett (figur 2C). I tilfelle av begrensede celler, vask PDMS rusk med isopropanol.
2. Kammerbelegg for eksperimenter med lett vedlagte celler i suspensjon
   1. Tilsett 100 μL Concanavalin A (ConA) ved 0,5 mg/ml for å dekke hele overflaten av det firkantede hulrommet og la det inkubere i 30 minutter.
      MERK: ConA er et lectin som binder seg til celleoverflatesukker og parer individuelle celler på dekkglassoverflaten.
   2. Fjern ConA-fallet og skyll overflaten forsiktig med DMEM-medium uten å skrape den ConA-behandlede overflaten.
   3. Tilsett 30 μL av den tidligere forberedte prøven (trinn 2.6) i brønnen og forsiktig resuspend for å kvitte seg med celleklynger.
   4. Lukk hulrommet ved å plassere et 22 x 22 mm #1,5 dekselglass på toppen av PDMS-felgene (unngå å la det falle brått, bruk tang hvis mulig, figur 2B,C).
      MERK: Alle deksler vil fungere for det øvre glassdekselet (oppsamlingslinsen har en arbeidsavstand på 2 mm).
3. Kammerforberedelse for eksperimenter med celler i innesperring
   1. Sett en 10 μL dråpe løsning som inneholder celler (trinn 2.6) inn i firkanthulen (figur 2B).
   2. Smør prøven forsiktig med et 22 x 22 mm dekselglass slik at dråpen sprer seg i hele området og ingen bobler observeres. Igjen er det praktisk å bruke tang, som vist i figur 2C, for å forhindre at dekkglasset faller brått.

4. Alternative alternativer for OT-kammeravstand

MERK: Disse trinnene kan følges hvis ingen mikrofabrikasjonsverksted eller spinnfrakker er tilgjengelig.

1. Kammerforberedelse for eksperimenter med celler i suspensjon
   MERK: I tilfelle ingen spinnfrakker er tilgjengelig, kan en avstandsstykke gjøres med normalt, dobbeltsidig scotch tape (ca. 100 μm i høyden).
   1. Klipp et stykke dobbeltsidig scotch tape med et omtrent 10 cm x 10 cm firkantet hull i midten (samme dimensjoner som i PDMS, figur 2B).
   2. Fjern et av de beskyttende lagene på båndet ved å skrelle det av og plassere den avdekkede siden av båndet i midten av en # 1,5 H glassbunnsfat. Trykk forsiktig for å feste hele overflaten til glasset samtidig som du unngår luftbobler, og fjern deretter det gjenværende beskyttende laget av båndet ved å skrelle det av.
   3. Følg instruksjonene i trinn 3.2.
2. Kammerforberedelse for eksperimenter med celler i innesperring
   MERK: For å begrense celler nøyaktig, kan monodisperse mikropartikler med kjent diameter brukes som avstandsstykker mellom de to dekselbrillene.
   1. Tilsett 10 μm polystyrenperler til suspenderte celler i en konsentrasjon på ¹⁰⁴ perler / μL.
   2. Sett en 10 μL dråpe løsning som inneholder celler og perler på et 22 x 60 mm dekselglass.
   3. Smør prøven forsiktig med et annet 22 x 60 mm dekselglass slik at dråpen sprer seg i hele området og ingen bobler observeres. For å plassere det øvre dekselglasset forsiktig (unngå at det faller brått ned), er det praktisk å bruke tang.
   4. Siden prøven kan tørke ut, anbefales det å utføre preparatet raskt.

5. Sette opp den optiske fellen for intracellulære målinger

MERK: Følgende trinn er optimalisert for en kommersiell optisk pinsettplattform som består av en optisk mikromanipuleringsmodul basert på acoustooptisk avbøyning (AOD) og en optisk kraftsensor basert på direkte deteksjon av lysmomentendringer (figur 2, referanse12,40,49). Detaljer og optiske komponenter i oppsettet finner du i figur 2F. For å observere kraftindusert deformasjon under de optiske pinsettmanipulasjonene, kobles et Nipkow spinning-disk konfokalt mikroskop inn i venstre port på det inverterte mikroskopet for dobbel fargefluorescensavbildning. Uten mangel på generalitet kan denne protokollen brukes med ethvert dynamisk OTs-system utstyrt med direkte kraftmålinger basert på lysmomentdeteksjon. Detaljerte trinnvise prosedyrer er tilgjengelige for å konstruere hjemmebygde optiske gradientfeller for in vivo-applikasjoner50. De som er basert på AOD-modulering skiller seg ut for eventuelle eksperimenter med flere feller og raske ^{målinger51,52}. Det finnes flere protokoller for å konstruere et lett momentumbasert instrument i litteraturen36,39,40,53, og enhver annen bildemodalitet (differensialinterferenskontrast, widefield fluorescence, etc.) kan brukes.

1. Oppstart av optiske pinsett
   1. For å optimalisere for utgangseffektstabiliteten, slå på laseren med betydelig høy effekt (f.eks. 3 W) minst 30 minutter før eksperimentet.
   2. Slå på elektronikkmodulen til de optiske mikromanipulerings- og kraftmålingsenhetene.
      MERK: Bruk alle lasersikkerhetstiltak og bruk kun utstyr som er godkjent av institusjonsstyret. Bruk aldri okularene på det optiske mikroskopet når laseren er på. Bruk alltid godkjente IR-beskyttelsesbriller (OD7 i området 950-1080 nm), blokker IR-laserlyset med lukkeren i epifluorescence-porten 2, og ikke utfør programvaren for optisk overlapping før du er ferdig med den optiske kraftsensorjusteringen etter trinn 5.3. Generelt, ikke bruk en svært reflekterende prøve, da bakrefleksjonen kan forårsake skade på laseren.
   3. Kontroller felleeffekten med den roterende HWP (figur 2F) ved inngangen til den optiske mikromanipuleringsmodulen.
      MERK: Den kommersielle optiske mikromanipuleringsmodulen som brukes i denne protokollen, inneholder allerede denne funksjonen. For hjemmebygde optiske fangstsystemer integrerer du dette verktøyet for strømkontroll slik at høyere og mer stabile laserkrefter kan brukes.
2. Bruk en tom mikrokammer for kalibrering
   1. Klipp en firkant på 1 x 1 cm på et dobbeltsidig scotch tape og fest den på en 1 mm tykk mikroskopsklie.
   2. Tilsett vann i firkanten og lukk det fra toppen med et #1,5 dekselglass (22 x 22 mm). Tilsetning av et litt høyere volum vann, for eksempel 30-40 μL anbefales å unngå bobler inne i det tildekkede kammeret. Tørk kalibreringskammeret forsiktig i tilfelle vann som søler ut av det.
3. Justering av den optiske kraftsensoren
   1. Sett en dråpe vann på 60x/ 1.2 vann nedsenking mål. Plasser kalibreringskammeret på scenen med dekkglasset #1.5 vendt mot målet. Fokuser på den nedre overflaten, hvor celleprøvene til slutt vil være.
   2. Tilsett en dråpe nedsenkningsolje på toppen av den øvre glasssklie som dekker prøven (figur 2D). Senk oppsamlingslinsen til kraftsensorenheten forsiktig til den kommer i kontakt med oljedråpen.
      MERK: Dråpen må være stor nok til at den dekker hele objektivet som samler laserlyset som kommer ut av fellene. Vanligvis er 200 μL tilstrekkelig til å dekke hele overflaten og gi en stabil nedsenkningskontakt. Vær konservativ og unngå overfylling, da det kan lekke inn i prøven.
   3. Etter produsentens protokoll for justering av optisk kraftsensor, se på prøveplanbildet på hjelpekameraet som skal brukes til å plassere OTene (AUX, figur 2F). Senk den optiske kraftsensoren svært forsiktig til feltstoppet (FS, figur 2F-G) vises konjugert på prøveplanet. Dette vil sikre riktige direkte kraftmålinger fra prøveinvariant deteksjon av ^{lysmomentendringer40}.
      MERK: Lukk FS nok slik at bildet blir mindre enn synsfeltet (FOV), derfor synlig. Vær ekstra forsiktig og ikke skyv oppsamlingslinsen til den optiske kraftsensoren mot prøven. Den vertikale posisjonen til den optiske kraftsensoren kan alternativt bestemmes ut fra analyse av overlappingslysfordelingen ved BFP for lyskjegler med definert numerisk blenderåpning (NA).
   4. Pass på at det ikke er luftbobler i oljedråpen; Disse kan direkte påvirke kraftmålingene. For å se etter luftbobler, sett Bertrand-objektivet på plass (BL, figur 2G) og følg bildebanen gjennom okularet. Hvis det er behov for smuss eller luftbobler eller mer olje (figur S1A), rengjør linsen og kammeret med støvfritt linsevev og gjenta prosedyren i trinn 5.3.2 og 5.3.3. En uhindret optisk bane er avbildet i figur S1B.
   5. Bruk sideskruene som er plassert på holderen på den optiske kraftsensoren, og sentrer FS inn i FOV. For nøyaktighet, åpne FS slik at den nesten fyller FOV synlig på hjelpekameraet (AUX, figur 2F).

6. Optisk pinsettoptimalisering

MERK: Den direkte kraftmålingen er utelukkende avhengig av endringen av lysmoment som oppstår fra kraften som utøves på den fangede partikkelen, og dermed, i motsetning til indirekte metoder, trenger ikke fellestivhet å kalibreres før hvert eksperiment. Den instrumentspesifikke konverteringen av avbøyning/kraftfaktor (α; pN/V, ^referanse41) kalibreres av produsenten og eksperimenteres dermed konstant. Men fordi laserpunktet manipuleres over et område på 70 μm x 70 μm, er trinn 6,2-6,5 avgjørende for å sikre optimal overlapping og strømstabilitet. Følgende trinn følger med i produsentprogramvaren, slik at OTene optimaliseres over arbeidsområdet på en halvautomatisk måte.

1. Start OTs-programvaren og anskaffelsesprogramvaren for kameraets AUX.
2. Trekk fra den opprinnelige spenningsgrunnlinjen ved å klikke på trinnet Trinn 1: Elektronikkforskyvning på undermenyen Systemkalibrering på den optiske pinsettkjøringsprogramvaren.
3. For å utføre fellekraft som flater ut over OT-arbeidsområdet, sett fellekraften til halvparten av maksimumet ved å rotere HWP tilsvarende. Ikke endre felleeffekten ved å endre laserutgangen, men med den roterende HWP (figur 2F). Klikk på Trinn 2: Strøm for å starte den automatiserte rutinen for sammenslåing av fellekraft.
   MERK: Dette er et kritisk skritt for å kompensere for variasjonen av fellekraften på tvers av OT-arbeidsområdet (figur S1D). En vellykket rutine bringer fellekraftvariasjon ned til 2% på tvers av OTs arbeidsområde og konvergerer etter 2 min.
4. Hvis du vil utføre kalibrering av felleposisjon, fjerner du IR-filteret slik at lyset fra laseren er synlig på kameraet. Finn IR-punktet ved å sette bildeplanet fokusert på mikrochamberens nedre overflate. Få det minste IR-stedet som er mulig ved å justere bildeplanet (objektiv posisjon) og histogramkontrasten i kameraets AUX-oppkjøpsprogramvare. Reduser om nødvendig kraften til den optiske fellen ved å rotere HWP (figur 2F). Klikk på Trinn 3: Posisjon for å starte den automatiserte rutinen eller felleposisjoneringskalibreringen.
   MERK: Denne rutinen muliggjør presis korrespondanse av OT posisjonskoordinater i kameraet AUX til AOD styringsvinkler. En vellykket rutine genererer vinkel-til-posisjon-tilordningen på flere sekunder.
5. Innledende momentumkompensasjon
   MERK: Bevegelsen av den optiske fellen over prøven forårsaker variasjoner i lysmomentfordelingen ved BFP (figur S1E, F). Dette fører til kraftuavhengige signalendringer knyttet til laserposisjon over arbeidsområdet, selv om felleeffekten er flatet ut som i trinn 6.3. Konsekvensen er en variasjon i kraft baseline på grunn av posisjon (uavhengig av en faktisk kraft som virker på den optisk fanget perle) som må korrigeres før hvert eksperiment.
   1. Still inn felleeffekten som skal brukes i forsøkene, ved å rotere HWP (figur 2F).
   2. Klikk alternativet Global forskyvning på undermenyen Verktøy . Dette åpner Offset Cancel-assistenten for programvaren for optisk pinsett som korrigerer den opprinnelige momentum-grunnlinjen.
   3. Klikk på Forskyvning | Kompenser for å korrigere den opprinnelige momentumet for posisjonsvarianten.
      MERK: Hvis ingen modifikasjon påvirker den optiske banen i løpet av de pågående ukene, vil sammenslåingen av felleeffekten (trinn 6.3) og posisjonskartene (trinn 6.4) forbli konstante. Vi anbefaler derfor alltid å bruke den samme kombinasjonen av optiske elementer (dikroiske speil, filtre, etc.) som kan påvirke laserfellebanen eller utføre en ny rutine for sammenslåing av fellekraft. Når det gjelder den første momentumkompensasjonen (trinn 6.5), gir produsenten av OTs-plattformen en flybasert kalibrering som må endres for hver nye fangstkraft og eksperimentelle økt. Trinn 6.3 og 6.4 må utføres på den tomme kalibreringsskuffen som er beskrevet i trinn 5.2. I en prøve som inneholder celler eller andre objekter, bør trinn 6.5 utføres uten gjenstander som kan endre lysspredning i OTs arbeidsområde.
6. Du kan eventuelt fange en mikrosfære og flytte fellen med en kjent hastighet mens du registrerer kraftsignalet. For eksempel, sett fellen til å utføre en trekantet oscillasjon: det registrerte kraftsignalet vil være et firkantet signal.
   MERK: Kraftverdien skal øke lineært med hastigheten, i henhold til drakraften som virker på perlen. Denne testen fungerer som en positiv kontroll at kraftmålinger utføres ^riktig38. Alternativt kan den optiske kraftsensoren brukes til å oppnå optisk fangststivhet, κ [pN/μm], og posisjonskalibreringsfaktoren, β [μm/V], fra ^{effektspektralanalyse35}. Under riktig justering er den konstante kalibreringsfaktoren fra produsenten α = κ·β [pN/V].
   1. Start en sanntids kraftavlesning ved å klikke på Plott 1 på undermenyen Mål i produsentprogramvaren. Dette vil gi en avlesning av den nåværende optiske fangstkraften og kraften.
   2. Åpne dialogboksen Oscillasjonsparametere på undermenyen Verktøy . Angi en bølgeformfigur med trekantet rom i henholdsvis figur- og typevelgerringene. Som et eksempel, sett en amplitude på 10 μm og en frekvens på 3 Hz. Dette vil resultere i en viskøs kraft på ca. 1 pN på en mikrobead med en diameter på 1 ^μm38.
   3. Høyreklikk mikrobeaden i kameraets AUX-vindu, og velg Start oscillerende. Kraftavlesningen vil bli et firkantet kraftsignal med platåer på ±1 pN.
   4. Høyreklikk på mikrobeaden og velg Stopp oscillerende.

7. Spinnende disk konfektmikroskopi

1. Slå på det roterende diskkonfiskemikroskopet og tilbehørsutstyret, de integrerte lasermotorene og oppkjøpskameraene.
2. Start bildebehandlingsprogramvaren.
3. Angi bildekanaler for Hoechst-farging av kjernen og GFP for celleplasmamembranen.
   1. Aktiver eksitasjonslaserlinjene på 405 nm og 488 nm.
   2. Legg til en multibanddikrom for å gjenspeile eksitasjonen til prøven, og som gjør at avgitt lys kan passere til kameraene.
   3. Del fluorescensutslippet med et 500 nm langt passkantdiktropisk speil.
   4. Bruk utslippsfiltrene DAPI/BFP (~445 nm) og GFP (~521 nm) foran de to oppkjøpskameraene. Se figur 2F,G.
   5. Still eksponeringstiden til 100 ms for hver kanal.
   6. Still inn laserutslipp for å oppnå en effekt på 5 mW ved prøveplanet. For å måle kraften, bruk en kommersiell kraftmåler.
4. Angi bildebehandlingsprotokollen. For å unngå spektralblødning fra Hoechst-kanalen til GFP-kanalen, må de to fargestoffene avbildes sekvensielt.
   MERK: Hvis det finnes en maskinvaresynkronisering mellom AODene til den optiske fellen og kameraanskaffelsen, må du kontrollere at utløserpolariteten er riktig konfigurert. Hvis du er i tvil, ta kontakt med produsenten av anlegget eller mikroskopet.

8. Utføre nukleusinnrykksforsøkene

MERK: Slå alltid av de optiske fellene både ved hjelp av programvare og lukk lukkeren på epifluorescence port 2-når du løfter kraftsensormodulen og endrer prøven. Hvis ikke, kan det oppstå alvorlig skade på optiske elementer og eksperimentet. Vær forsiktig med sideavstanden mellom linseholderen og kanten på bunnretten når du ser etter celler for å unngå å støte linsen inn i scene-/kulturfatet (figur 2).

1. Plasser prøven i mikroskopet, og følg trinn 5.3 i denne protokollen.
2. Bruk den roterende HWP (figur 2F) til å sette felleeffekten til 200 mW som startverdi hvis stivheten til kjernen eller den intracellulære strukturen som undersøkes, ikke er kjent. Oversett OTs arbeidsområde (ved hjelp av mikroskopstadiet) til et sted uten celler for å kompensere for det første momentumet til og med trinn 6.5.
   MERK: Avhengig av stivheten til den subcellulære strukturen, bør overlappingseffektverdien justeres til lavere eller høyere verdier for å oppnå en lignende innrykksdybde.
3. Bruk programvarekontrolleren for mikroskopstadiet til å se etter en celle med en eller to perler gjennom overført brightfieldmikroskopi (figur 3A).
4. Definer en fellebane.
   1. Åpne dialogboksen Bane på undermenyen Verktøy , og velg Forskyvning i velgerringen Banetype .
   2. Skriv forskyvningen og tiden for hvert etterfølgende banetrinn i det numeriske arket. Her er to eksempler.
   3. For et stressavslappingseksperiment, programmer trapesformede belastninger, som vist i figur 3B. I tabell S1 ble to trapesformede innrykk brukt med en reiseavstand på 5 μm; hastighet på 5 μm / s; ventetid før tilbaketrekking: 10 s.
   4. For et repeterende innrykkseksperiment med konstant hastighet for å oppnå en trekantet rutine uten oppholdstid på kjernen, still inn baneamplituden, for eksempel 5 μm, og tiden for trinnet, for eksempel 2 s for en hastighet på 2,5 μm / s. I tabell S2 påføres dette åtte ganger med samme hastighet.
      MERK: Disse verdiene må bestemmes for hver celletype og eksperiment, men følgende parametere i en trapesformet rutine fanger opp den viktigste dynamikken i eksperimentet som presenteres her. Ventetiden bør være tilstrekkelig for kjernen til å vise sin fullstendige stressavslapping etter innrykk
5. Fange en mikrosfære
   1. Still inn bildeplanet litt over perlen med programvarekontrolleren for mikroskopstadiet.
   2. Aktiver feller ved hjelp av OTs-programvaren og klikk på perlen i kameraets AUX-bildevindu (kalibrert etter trinn 6.4). Vellykket innesperring av perlen ved den optiske fellen vil sterkt redusere beadens bevegelse.
   3. Klikk og dra perlen over cytoplasma og plasser den i en avstand på ~ 2 μm fra atomkonvolutten (figur 3A). Pass på at banen er satt slik at perleinnrykk er vinkelrett på atommembranen.
6. Eventuelt, om nødvendig for posisjonsmålinger av perlen i forhold til fellen, skann fellen over perlen for å bestemme overlappingsstivheten, k [pN/μm]⁵⁴, og dermed Δxbead = -F/k (se Diskusjon). Den optiske mikromanipuleringsmodulen som brukes i denne protokollen har en innebygd rutine for dette formålet.
   1. Åpne dialogboksen Partikkelskanning på undermenyen Verktøy .
   2. Velg overlappingen du vil skanne, og Høy frekvens som skannemetode. Velg retningen (x eller y) for innrykksbanen for bead-skannemålet.
   3. Det vises et vindu med mål for overlappingsstivheten. I diagrammet drar du de to markørene for å merke det lineære overlappingsområdet som tilsvarer F = -kx. Den lineære tilpasningen til den valgte datadelen oppdateres automatisk.
      MERK: Still inn den opprinnelige posisjonen til perlen langt fra cellemembranen (~ 5 μm), da lys-momentum avbøyninger ved mellomcellegrensesnittet påvirker hensiktsmessigheten av kraftmålinger. Hvis kjernen er plassert for nær cellemembranen, kan du prøve å rykke inn kjernen fra det motsatte stedet. Forkast cellen hvis det ikke er mulig.
7. Start bildeanskaffelse ved å klikke på anskaffelsesknappen i bildebehandlingsprogramvaren.
8. Start overlappingsposisjon og tving målingsdata til å lagre ved å klikke data | Lagre i sanntid kraft lesevinduet (åpnet som i trinn 6.6.1).
   MERK: Den optiske fellen er utstyrt med en utløserinngang som kan kobles til kameraets tidsberegning. Dermed er bilde- og kraftdata maskinvaresynkroniserte, og elektronikken er i stand til å kartlegge fellesyklusene med antall rammer av bildene under oppkjøpet.
9. Start den tidligere lastede banen ved å høyreklikke på perlen og velge Start bane.
10. Vent til banen er ferdig og systemet stabiliserer seg.
11. Stopp lagring av data for måling av overlappingskraft. Det dukker opp en dialogboks for datalagring.
    MERK: For å optimalisere datalagringen kan data desimeres ved å velge desimeringsparameteren i denne dialogboksen (10, 100 eller 1000).
12. Stopp bildeanskaffelse og plott resultatene i etterbehandlingsprogramvaren etter brukerens valg.
13. Hvis mikrosfæren går tapt under rutinen og kjernen ikke kan rykkes inn (figur S2), kast målingen og øk kraften. Vær oppmerksom på at trinn 6.5 må gjentas. I våre hender fullføres minst 95% av rutinene uten å miste perlen fra fellen.

Representative Results

Mikroinjeksjon av fangstperler:
Mikrosfærer injisert i encellet sebrafiskembryo spredt over hele dyrehetten under morfogenese. For en klarere visualisering gjentok vi injeksjonsprotokollen med røde fluorescerende mikrober og tok volumetriske bilder med vårt konfokale mikroskop på forskjellige utviklingsstadier. I figur 4A-D visualiseres injiserte perler i cytoplasma av stamceller in vivo ved 5 hfp. Senere oppstod mikrosfærer spredt over hele embryoet ved 24 hkf (figur 4E). Embryoer i begge stadier utviklet normalt og overlevelsesraten var sammenlignbar med kontroll ikke-injiserte eller mock-injiserte embryoer (se figur S3). Dette er i samsvar med andre studier som rapporterer uforstyrret overlevelse av perleinjisert sebrafisk opptil 5 dager etter ^{befruktning55}.

Vårt konfiskeringsmikroskop med spinneskive er kompatibelt med flerkanals fluorescensmikrokopi. I figur 5A viser vi isolerte stamceller med en eller to perler i cytoplasma. Flere fluorescerende etiketter kan brukes til å undersøke ulike aspekter av cellen (figur 5B). Kjernemorfologi kan spores med hoechst-fargestoff eller ved hjelp av et H2A::mCherry mRNA-uttrykk, mens indre kjernefysisk membran kan analyseres med Lap2b-eGFP12. Dynamikken i actomyosin cortex, samt intracellulære kalsiumnivåer, kan observeres med henholdsvis my12.1::eGFP transgen ^linje56 og Calbryte-520 inkubasjon. Protokollen som er beskrevet her tar sikte på å sammenligne cellekjernemekanikk av immobiliserte wildtype celler på lim substrater (senere referert til som suspensjon) og i mekanisk innesperring. Isolerte stamceller begrenset i mikrochambers av 10 μm høyde viste delvis utfoldelse av den indre kjernefysiske membranen (INM) og en påfølgende økning i actomyosin ^{kontraktility12}. I figur 5C vises begrensede celler med en eller to perler i cytoplasma. Vellykket innesperring vil være synlig via flate, utvidede celler med et bredere tverrsnitt av kjernen. Kjernemembranen utfoldes videre i trange celler og skal se utjevnet i forhold til celler i suspensjon (figur 5C).

Krafttids- og kraftdeformasjonsanalyse
Analysen av de oppnådde resultatene avhenger sterkt av den undersøkte prøven og spørsmålet om interesse, og dermed kan de ikke generaliseres her. Som et eksempel er en vanlig måte å analysere innrykksmåling på å trekke ut en Youngs modul ved å tilpasse en modifisert Hertz-modell til kraftinnrykksdataene57. Antagelsen for en slik behandling må imidlertid vurderes nøye og er kanskje ikke alltid riktig begrunnet (for eksempel at den undersøkte strukturen er isotropisk, homogen, med lineær elastisitet og innrykk som er mindre enn perleradiusen). Vi vurderer derfor bare modelluavhengige målinger her som gjør at den mekaniske oppførselen til den undersøkte strukturen kan sammenlignes mellom forskjellige eksperimentelle scenarier.

Som utgangspunkt gir måling av hellingen av kraftforskyvningskurven ved en viss innrykksdybde et mål på en modelluavhengig strukturell ^stivhet58 av kjernen. Denne verdien kan deretter samles inn fra flere prøver og sammenlignes mellom ulike eksperimentelle innstillinger og prøveperturbasjoner.

Mål for innrykk
I de følgende linjene fokuserer vi på den mekaniske responsen til cellekjernen under celledeformasjon i innesperring. Eksperimenter i trinn 8 i denne protokollen fører vanligvis til krafttopper på opptil 200 pN for innrykksdybder på ca. 2-3 μm. Imidlertid kan disse verdiene i stor grad være forskjellige, avhengig av celletype og eksperimentelle forhold, med mykere kjerner som fører til lavere kraft for en gitt innrykk. Det er dermed nødvendig å nøyaktig måle atomdeformasjonen, sammen med kraft, for en nøyaktig mekanisk karakterisering av cellekjernen. I denne delen vil vi få celle kjernefysisk stivhet fra representative kraftinnrykksmålinger.

I figur 6 viser vi deformasjonene av de distale og proksimale sidene av en kjerne i en suspendert og begrenset celle. En rik mekanisk oppførsel kan observeres. I en typisk suspendert celle på et limsubstrat ble kjernen sterkt rykket inn av perlen, men også litt forskjøvet ved repeterende skyvehendelser. Vi målte perleinnrykk på kjernen ved å analysere kymografiene hentet fra fluorescensavbildning av Hoechst-farget cellekjerner. Kymografier ble enkelt beregnet ved hjelp av Fijis Multi Kymograph plugin langs innrykksretningen (figur 6A, B) og importert til Matlab (versjon 2021, Mathworks) for videre behandling. En trinnfunksjon ble montert på råintensitetsprofilen med sikte på å spore avgrensningskantene på kjernen langs banen til innrykksrutinen. Som det fremgår, bærer den nøyaktig informasjon om atomendringen i form (figur 6 og figur S2). Vi brukte følgende dobbelt-sigmoidkurve som en analytisk versjon av en trinnfunksjon:

(Formel 1)

Her betegner _x1 og _x2 de distale og proksimale kantene på kjernen, mens A og B er maksimums- og bakgrunnsgråverdiene til den blå kanalen (Hoechst-fargestoffet) i bildet (figur 6B). Kantbredden er vurdert (_e0 = 0,25 mm). Mens den innrykkede, proksimale kjernekanten (_x2) fulgte banen som ble brukt av den optiske fellerutinen etter mikrosfærens kjernekontakt, viser den motsatte, distale kanten (_x1) avslapningsdynamikk som forventet for et viskoelastisk materiale som cytoplasma (figur 6D). I motsetning viser ikke kjerner i celler som er begrenset i 10 μm høye mikrochambers slik omdisponeringsatferd av kjernen ved innrykk i cellen (figur 6B,D). Også vist i figur 6D forblir de bakre kantene på kjernen uendret av perlen som skyver fra den proksimale siden, mest sannsynlig på grunn av sterkere krefter som oppstår fra cellekontraktilitet og friksjon som virker mot innrykkskraften. For å få riktig deformasjonsdybde ble forskyvningen x1 trukket fra det innrykkede målet x2: Δx = _x2 - _x1 (se også figur 6D).

Fremtving dataanalyse
Kraften som forårsaket kjernefysisk deformasjon ble målt fra endringen i lysmomentet som oppsto ved den optisk fanget mikrobeaden (figur 7A). Kraften ved påføring av trapesformede baner (trinn 8.4.3, figur 7B) økte i utgangspunktet lineært til fellen sluttet å bevege seg, men deretter avslappet til en jevn tilstandsverdi. Denne virkemåten indikerte et viskoelastisk materiale som viste tap og lagringsmoduli. Rett etter innrykkshendelsen nådde kraften en toppverdi, Fp, etterfulgt av en stressavslapping (figur 7C):

(Formel 2)

der F0 er den lagrede kraften for den elastiske komponenten og f(t) er en dimensjonsfri avslapningsfunksjon. Vi har analysert denne virkemåten på tre måter:

1. Med tanke på en standard lineær heldekkende med eksponentiell stressavslapping, det vil si f(t) = ^e-t/τ, skjematisk representert i figur 7C-innfelt.

2. Bruk av et generelt, dobbelteksponentielt forfall:
F(t) = A + B1e-t^/τ1 + ^B2e-t/τ2.

3. Bruk av en maktlov etterfulgt av et eksponentielt ^forfall59:
f(t) = ^t-pe-t/τ, montert i figur 7C.

Mens passformen for modell 1 kan utføres enkelt, anbefaler vi å estimere de første gjetningene for henholdsvis (τ1, τ2) og (p, τ) for modellene 2 og 3. Dette kan utføres ved å tilpasse linjer til dataene i logaritmisk-mot-lineære (figur 7D, venstre) og logaritmisk-versus-logaritmiske (figur 7D, høyre) skalaer. Tabell S3 oppsummerer resultatene for eksemplet som er analysert i figur 7. I det følgende avsnittet vil vi vurdere kombinasjonen av en maktlov og en eksponentiell lov for karakterisering av cellekjernemekanikken.

Relasjon mellom tvangsforskyvning
På samme måte kan det beskrevne eksperimentelle oppsettet brukes til å oppnå kraftforskyvningsrelasjonen mellom flere innrykkshendelser. Ved å utføre trekantede rutiner (trinn 8.4.4, figur 8A), er det mulig å relatere kraften til deformasjonen og plotte en kraftinnrykkskurve. Et eksemplarisk utfall er vist i figur 8B, der en flat basislinje jevnt endret skråning når perlen kom i kontakt med kjernen. Det er en utfordring å identifisere det sanne kontaktpunktet i støyende data, og det må tas hensyn til om kontaktområdet er egnet til elastiske ^modeller60. I dette spesielle eksperimentet kan det også ses at de påfølgende innrykkene resulterer i kurver med dypere kontaktpunkter, indikativ for for langsom kjerneformgjenvinning etter bead retraction og en endring i hysteretisk syklus definert av kjernen viscoelastic materialegenskaper (figur 8C). Forskeren bør derfor være klar over om dette skjer og innlemme dette i den analytiske rørledningen, eller begrense antall påfølgende målinger slik at denne effekten ikke endrer målingen.

Nukleusmekanikk i celler i suspensjon og under 10 μm innesperring
Den nevnte tilnærmingen ble brukt til å analysere dynamikken i kjernestressavslapping i suspenderte celler på limsubstrater og begrensede celler. Våre resultater viser at innesperringen resulterer i en utvidelse av det projiserte området (figur 9A), men ubetydelig endring i kjernefysisk stivhet (figur 9B). Vi målte lignende avslapning med τ = 6,08 ± 1,1 s (udefinert) og τ = 4,00 ± 0,6 s (innesperring), noe som indikerer rask viskoelastisk spredning, etterfulgt av en lagret kraftverdi som tilsvarer kjernens elastiske modulus. For å gjøre rede for eksperimentelle variasjoner, som kan produseres av ulike innledende forhold i innrykksrutinene, ble målte lagrede krefter normalisert til innrykksdybden, som . Denne parameteren står for kjernens stivhet og beskriver kraften, eller stresset, som er nødvendig for en viss innrykk. Vi oppnådde lignende stivhet under innesperring og i udefinerte celler: = 20,1 ± 12,6 pN/μm og = 24,6 ± henholdsvis 13,6 pN/μm (gjennomsnittlig ± standardavvik).

Figur 1: Mikroinjeksjon av sebrafiskembryoer på encellet (zygote) stadium. (A) Injeksjonsplate: En trekantet form injeksjonsplate brukes til injeksjonen. Platen er laget av 1% ultrapure agarose i E3 (Egg medium). Topp- og sidevisninger vises til høyre. (B) Embryoposisjonering: Orienter embryoene forsiktig ved hjelp av en børste og orienter slik at encellen er tydelig synlig og lett tilgjengelig med nålen. Vi foreslår å orientere embryoene med cellen som ligger på motsatt side av nålen, som vist i skissen. (C) Injeksjonsprosedyre i encellet stadium embryo: pierce koreksjonen rundt embryoet og enkeltcellen med nålen. Pass på at spissen av nålen er inne i cellen og slipp trykket for å injisere. (D) Inkuber embryoene ved 28-31 °C til de utvikler seg opp til blastulastadiet (4 hkf). Utfør celleisolasjonsprotokollen og cellefargingen (trinn 2) og klargjør det optiske overlappingskammeret med isolerte celler i suspensjon og/eller innesperring kombinert med det tilsvarende underlagsoverflatebelegget (trinn 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Klargjøring av det optiske pinsettapparatet. (A) Spin-belegglag av PDMS med definert høyde på glassbunnsretter. PDMS-fallet vil spre seg jevnt på grunn av sentrifugalkraften. (B) Klargjøring av prøvekammeret ut av PDMS-laget. 1: klipp en firkant med en skalpell, 2: belegge den indre brønnen med concanavalin A (ConA), vask og frøceller; 3: dekk med en glasssklie eller dekselglidning for å forsegle brønnen. (C) Bilde av firkantskjæringen med en skalpell og fjerning av PDMS godt med tang. (D) Montering av oppsamlingslinsen til den optiske kraftsensoren over overlappingskammeret. En dråpe nedsenkningsolje fungerer som et nedsenkingsmedium mellom oppsamlingslinsen og det øvre glassdekselet. Skjematisk må ikke skaleres. Vær forsiktig når du senker oppsamlingslinsen for ikke å berøre glassdekselet på prøvefatet. (E) Bilde av kraftdeteksjonsenheten i kontakt med prøven. (F) Skjematisk for det eksperimentelle oppsettet. Den optiske mikromanipuleringsmodulen bruker en kontinuerlig bølgelaserstråle (5W, λ = 1064 nm) med kraftkontroll gjennom en halvbølgeplate (HWP) og en polariserende strålesplitter (BS). Etter å ha blitt modulert med et par AODer, er det koblet til den øvre epifluorescence-porten til et invertert mikroskop. Laserstrålen reflekteres deretter av et 950 nm kortpassisk dikroisk speil (IR-DM), noe som muliggjør overføring av fluorescenseksitasjon og utslipp. Fangstlaseren styres inn i mikroskopets epifluorescenceport (øvre tårn). OTene opprettes ved fokusplanet til en objektiv linse for vanninnlevelse (60x, NA = 1,2). Den optiske kraftsensoren blir utsatt for mikroskoptårnet og fanger laserlyset som kommer ut av OTene med en høy-NA, olje-nedsenkningslinse. Samtidig muliggjør kraftsensoren lysfeltbelysning. Den roterende disk confocal enheten er koblet til venstre port. Den er utstyrt med to integrerte lasermotorer (ILE) som kontrollerer syv fluorescenseksitasjonslasere og to bakbelyste sCMOS-kameraer, noe som muliggjør dobbel fluoroforavbildning parallelt med Abb: TI, Transilluminator; FS, feltstopp; AOD, acustooptical deflektor; HWP, halv bølgeplate; CAM, kamera (G) Fotografi av det optiske fangstutstyret. Rød sirkel indikerer Bertrand-objektivet, som kan byttes inn i den optiske banen manuelt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Velge riktige prøver og parametere. (A) Representativt bilde av en isolert sebrafisk stamcelle med en enkelt mikrosfære plassert nær nok kjernen til å utføre innrykksforsøket. Skalastang = 10 μm. (B) Eksemplarisk fellebane; innrykksdybde 5 μm; innrykkshastighet = 5 μm/s; avslapningstid 10 s. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Lokalisering av mikrobead inne i sebrafiskembryoer under utvikling. 0,5 nL 1 μm røde fluorescerende perler injiseres sammen med GPI-GFP mRNA (100 pg/embryo, plasmamembran) i WT-embryoer for å visualisere lokaliseringer av perler. (A-D) Distribusjon av mikrosfære 5 h postinjeksjon inne i et embryo montert i 0,75% agarose. (A) Brightfield og fluorescens bilde. Perlene spres homogent over embryovevet sett i en konfokal mikrograf. (B) Maksimal projeksjon av konfekt fluorescens z-stack. Perlene er fargekodet fra lilla til gul i henhold til deres z-posisjon i bildestakken. Lilla/magenta tilsvarer de mest ytre perler/celler (EVL; epitel enveloping lag; eller forfedre stamceller som ligger nær EVL overflaten), gule tilsvarer indre perler (forfedre dype celler), som vist i skissen til høyre. (C) Klipp ut og maksimal projeksjon av en understakk av (B) som tilsvarer området i den oransje boksen: En stor brøkdel av dype celler inneholder 1-2 perler. (D) Klipp ut og maksimal projeksjon av en understakk av (B) som tilsvarer magentaboksen: Noen EVL-celler inneholder 1-2 perler. (E) Brightfield bilde og maksimal projeksjon av en z-stack av en 24 HPF embryo montert i 0,75% agarose og bedøvet med trikain. Embryoer ble pre-inkubert med trikain i 15 min. Fra venstre mot høyre: mikrosfærer (1 μm diameter), GPI-GFP og bildeoverlapping. Perlene fordelt over hele embryoets kropp. Skalalinjedimensjon angitt i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Isolerte stamceller for sebrafiskforfeder med forskjellig merking. (A) Overføring lys mikroskopi bilde av suspensjon celler med 1 (topp) eller 2 (bunn) injiserte perler. Cyan piler peker på perler. (B) Fluorescerende konfektbilder av suspensjonsceller med forskjellige flekker. Øverst til venstre: Lap2b-eGFP (indre kjernefysisk membran, 80 pg/embryo) og H2A-mCherry. Øverst til høyre: GPI-GFP (plasmamembran, 100 pg/embryo) og DNA-Hoechst (farget som beskrevet i avsnitt 2). Nederst til venstre: MyI12.1-eGFP (transgen linje) og DNA-Hoechst. Nederst til høyre: Calbryte488 og DNA-Hoechst (farget som beskrevet i avsnitt 2). (C) Overføring lys mikroskopi bilde av begrensede celler med 1 (topp) eller 2 (bunn) injiserte perler. Cyan piler peker på perler. Skalastenger = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Estimere kjernefysisk deformasjon fra roterende platefilmer. (A,B) Tidsforløp for et innrykkseksperiment av kjernen i (A) en suspendert celle og (B) en begrenset celle. Skala bar 10 μm. Representative øyeblikksbilder av en Hoechst-merket kjerne vises 5 s før, under og 5 s etter innrykk med en optisk fanget mikrosfære (hvit pilspiss). Kymografier langs innrykkssegmentet (rød linje, høyre panel). _x1 og _x2 er de distale og proksimale (nær perlen) grensene til kjernen under innrykkseksperimentet trukket ut fra passformen til intensitetsprofilen til ligning 1. (C) Intensitetsprofiler langs innrykkssegmentet for tre forskjellige rammer (før, under og etter innrykk) og montert på ligning 1 for å vurdere de distale, _x1 og proksimale, _x2, posisjonene til kjernekantene. (D) Representative baner på _x1(t) i blått og _x2(t) i gult under et innrykkseksperiment av suspenderte og begrensede celler (10 μm). Skyggelagte områder angir innrykket, avstanden mellom _x1 og _x2 indikerer kjernediameteren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Kraftsignalbehandling. (A) Skjematisk for en optisk fanget mikrosfære som deformerer cellekjernen ved innrykk. Kjernefysisk membran og optiske krefter er indikert av de svarte pilene. Endringen i strålemomentet indikeres av den grønne pilen _Pout. (B) Fellebane (topp) og kraft (bunn) opplevd av den optisk fanget mikrosfæren under et gjentatt kjernefysisk innrykkseksperiment. (C) Fremtving avslapningsforfall etter krafttoppen på maksimal innrykksdybde. Inset viser et skjematisk av standard lineært faststoff hvis dynamikk tilnærmer seg fenomenologiske observasjoner her. (D) Venstre: logaritme av normalisert kraft versus tid. De skyggelagte områdene angir datadelen som brukes til å passe til det doble eksponentielle forfallet (røde linjer). Høyre: logaritme for normalisert kraft kontra tidens logaritme. Det skyggelagte området angir datadelen som brukes til å passe til strømloven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Fremtving innrykksrutine med trekantede felleforskyvninger. (A) Representativ bane på _x1(t) i blått og _x2(t) i gult under et trekantet innrykkseksperiment tatt på en celle i 10 μm innesperringshøyde. Topp: Overlappingsposisjon. Midten: Analyse av nukleusform. Avstanden mellom _x1 og _x2 indikerer kjernediameteren. Bunn: Kraftsignal. (B) Fremtving vs felleposisjon for åtte påfølgende innrykk. (C) Utviklingen av dissipasjonen, avledet fra hysteresen mellom tilnærmings- og abstinensdelen av f-d-kurven, av kjernen for hver etterfølgende innrykkshendelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9. Kjernefysiske egenskaper til celler i suspensjon (limoverflate) og innesperring fra trapesformede rutiner. (A) Projisert område av kjernen fra celler i suspensjon og under 10 μm innesperring. Svart stolpe representerer medianen. (B) Kjernestivhet av celler i suspensjon og under innesperring. Svart stolpe representerer medianen. P-verdier avledet fra Kruskal-Wallis test ved hjelp av MatLab. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende tabell 1: Trapesformet bane definert av programvaren for optisk pinsett. Første (andre) rad er x (y)-avstanden som overlappingen vil bli lineært forskjøvet. I den tredje raden angis varigheten for et gitt trinn i sekunder. Denne banen består av syv punkter og tilsvarer trapesformet lastet to ganger mot kjernen i figur 7B. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: Trekantet bane definert av programvaren for optisk pinsett. I tillegg til tabell 2 består denne banen av 16 punkter, tilsvarende åtte innrykkshendelser med en dybde på 5 μm og en hastighet på 2,5 μm/s. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 3: Montering av parametere for dataene i figur 7. IG: første gjetning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende figur S1: Optisk kraftsensorjustering og kompensasjon for momentum baseline. (A) Feltstopp avbildet ved hjelpekameraet (AUX, figur 2) gjennom Bertrand-objektivet. En luftboble vises synlig i nedsenkningsoljen, som ikke er synlig gjennom okularet. (B) Rengjør den optiske banen. For nøyaktig justering, åpne feltstoppet og få det til å falle sammen med NA = 1.2 lyskjegle. (C) Bilde av prøveplanet. Den røde firkanten indikerer OT-arbeidsområdet. Skalastang: 20 μm. (D) Fellekraft målt over FOV, langs hvite doble piler angitt i C. I rødt kan du bruke overtrykkseffektvariasjon når ingen korrigering brukes. I blått korrigeres overlappingskraften over hele synsfeltet. (E) X-komponent av momentum baseline langs samme område. I rød, ikke-korrigert sporing. I blått, spor korrigert for fellekraft. I grønt, spor korrigert for momentum baseline ved hjelp av Global Offset Compensation i produsentens programvare. (F) Samme som i E, for Y-komponenten. Vær oppmerksom på at de skyggelagte komponentene under normal drift brukes til mekanikk- og kraftmålinger, for eksempel x kraftkomponent under bevegelse langs x-koordinaten og y force-komponenten under bevegelse langs y-aksen. Etter at alle rettelsene er implementert, oppnås en RMSD-støy på <0,5 pN. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: En mislykket rutine på grunn av svake feller. (A) Kymografi som viser en kjerneinnrykk fra en mislykket rutine. Bare korte, forbigående deformasjoner er synlige på grunn av en flukt av perlen fra fellen. Det er viktig at overlappingslaseren fortsatt beveger seg uten perle for å fullføre den forhåndsdefinerte banen (grønn stiplet linje). Skalastang = 10 μm. (B) Topp: Felleposisjon kontra tid. Midten: Kantsporingsresultatet av den innrykkede proksimale og distale kjernekanten. Vær oppmerksom på at den distale kanten ikke beveger seg uten innrykk som vanlig observert for fullførte rutiner på isolerte celler på limsubstrater. Bunn: Kraft kontra tid som viser tap av mikrosfæren indikert av en reduksjon i termisk støy og et plutselig fall til null kraft. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S3: Overlevelse av injiserte embryoer. Embryoer injisert med 1 μm perler og 100 pg / embryo av mRNA ved konsentrasjoner skissert i protokollen ble sammenlignet med uinjiserte embryoer og viser ingen signifikante forskjeller 24 timer etter befruktning. Gjennomsnittlig og standardavvik for tre uavhengige eksperimenter med N > 21 embryoer per tilstand for hvert eksperiment. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I denne protokollen beskriver vi en unik metode for å forhøre de mekaniske egenskapene til cellekjernen inne i levende celler. Forskjellig fra andre kraftspektroskopiteknikker, tillot ikke-invasiv optisk fangst oss å koble fra bidraget fra cellemembranen og cytoskjelettet fra cellens kjernefysiske stivhet. Det er viktig at optisk mikromanipulering er kompatibel med multimodal mikroskopi, noe som gjør at eksperimentet kan studere forskjellige prosesser involvert i celle kjernefysisk mekanobiologi. Som et representativt resultat brukte vi DNA-Hoechst-farging for å måle kjernedeformasjonen ved innrykk utført av krefter i rekkefølgen til flere hundre picoNewton.

Potensielle anvendelser av vår metode utover eksemplene som er skissert i denne protokollen
Muligheten til å trekke ut kvantitativ mekanisk informasjon fra målinger inne i levende celler uten eksterne perturbasjoner muliggjør en mengde enestående muligheter som bare begynner å bli utforsket. Dermed kan den presenterte protokollen til vår optiske mikromanipuleringsplattform utvides til mer komplekse eksperimenter med stor allsidighet. Acousto-optiske deflektorer (AOD) kan generere flere optiske feller for synkrone kraftmålinger på tvers av forskjellige celleplasseringer, samt kan brukes til aktiv mikroheologi i et bredt ^{frekvensområde51,61}. Som nevnt kan kraftresponsen ved innrykk overvinne den maksimale fangstkraften, noe som fører til en flukt av perlen fra den optiske fellen. I dette tilfellet kan en krafttilbakemelding konfigureres med AOD for å klemme den optiske kraften. Alt i alt kan flere mikroheologiske tilnærminger, for eksempel stressavslapning beskrevet i denne protokollen, men også aktiv mikroheologi eller krypsamsvar, eksperimentelt oppnås med denne plattformen og grundig analysert av nye programvarepakker61,62,63,64,65 . Videre er anvendelsen av krefter ikke begrenset til kjernen, men kan i prinsippet utføres for å måle ulike intracellulære strukturer og i komplekse vev som demonstrert for fangst av flytende røde blodlegemer inne i intakte ^blodkar66,67 eller fangst og deformerende kloroplaster og mitokondrier68 . Lys-momentum kalibrering er uavhengig av formen og størrelsen på det fangede objektet, og muliggjør dermed direkte kraftmålinger på enhver kraftsonde med vilkårlig ^form38,39. Bruken av injiserte mikrosfærer tillot oss å bruke høye krefter på kjernen med relativt lav laserkraft sammenlignet med direkte manipulering av cellulære strukturer69,70,71. Men gitt en høy nok brytningsindeksforskjell, er det ikke nødvendig med ekstern anvendt kraftsonde, og intracellulære organeller kan manipuleres direkte uten injiserte perler (upubliserte observasjoner og ^referanse70).

Potensielle modifikasjoner av vår metode for å utvide applikasjonene
Ulike størrelser av mikrober kan injiseres avhengig av eksperimentet, men de relative kontrollene må gjøres. For eksempel, for å studere celler på senere stadier kan mindre perler injiseres. Dette vil redusere den maksimale kraften som kan utøves av den optiske fellen (for eksempel vist i ^referanse55). Større perler kan injiseres for å utøve høyere krefter, men disse kan påvirke embryoutviklingen avhengig av størrelse eller interessestadium. I eksperimenter der mikrobeadinjeksjon ikke er et alternativ, kan ulike organeller som viser brytningsindeksforskjeller sammenlignet med cytoplasma fortsatt manipuleres optisk, noe som gir opphav til optiske krefter målbare fra ^{lysmomentendringer42}. Som nevnt ovenfor har disse metodene blitt brukt av Bambardekar et al. for å deformere cellecellekryss i Drosophila-embryoet70. På samme måte har cellens kjerne en lavere brytningsindeks enn det omkringliggende ^mediet44, noe som gir mulighet for perlefri innrykk (upubliserte observasjoner og ^referanse72) selv om den har lavere overlappingsstyrke. Dermed kan kjernen ikke fanges lett og unnslipper fellen.

Den spin-belagte PDMS-avstandsstykken er fremstilt via en praktisk og rask metode, men kan være utenfor rekkevidde for laboratorier uten tilgang til et mikro-/nanofabrikasjonsanlegg eller ingeniørlaboratorier. Dermed kan avstandsstykken enkelt monteres fra laboratoriebånd eller parafilm (trinn 4). Protokollen kan også tilpasses ved å produsere mikrofluidiske kanaler som automatiserer levering av enkeltceller til forhåndsdefinerte målebrønner eller inn i et kammer med en definert høyde for å estimere innesperringseffekten innenfor samme prøve. Imidlertid må slike mikrofluidiske enheter utformes slik at de passer til rommet mellom mikroskopmålet og oppsamlingslinsen til den optiske kraftsensoren, på rundt 2 mm (se trinn 3). Vær oppmerksom på at den optiske kraftsensoren må plasseres i riktig høyde, slik at ingen optiske avvik fra defokusering påvirker målingen av fotonmomentet.

Andre modifikasjoner kan omfatte endring av biologiske reportere. Vi fant ut at Hoechst fluorescens blør spektralt inn i GFP-kanalen, og vi favoriserer dermed kombinasjonen med mCherry-merket histone som en kjernefysisk markør for samtidig måling i to fluorescerende kanaler. Alternativt kan kjernefysisk deformasjon enkelt spores med en etikett rettet mot den indre atommembranen som Lap2b-GFP (figur 2).

Innrykk på cellekjernen var i rekkefølgen 2-3 mikron, som vi nøyaktig kunne måle ved bildeanalyse av diffraksjonsbegrenset spinnende disk konfektmikroskopi. For tilfelle av stivere kjerner eller mindre krefter, vil innrykk være knapt målbar ved hjelp av denne tilnærmingen. Imidlertid kan de absolutte kraftkalibrerte optiske pinsettene også kalibreres for posisjonsmålinger av den fangede perlen in situ ved hjelp av BFP-interferometri med nanometernøyaktighet51. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan spenningssignalet og den optiske kraftsensoren oversettes til posisjonen til den fangede sonden gjennom parameteren β [nm/V], mens den konstante parameteren α [pN/V] gir kraftverdier gjennom den nevnte lysmomentkalibreringen41 (se nedenfor for detaljer).

Feilsøking
Vi fant ut at følgende utfordringer kunne oppstå under eksperimentet:

Ingen stabil felle dannes og mikrosfæren unnslipper lett
Eventuelt smuss på mikroskopmålet eller en feiljustert korreksjonskrage kan føre til svikt i en stabil felle. Hvis en umiddelbar løsning ikke blir funnet, måler du punktspredningsfunksjonen til objektivlinsen. Hvis prøven av interesse er dypt inne i et optisk tett vev, kan laserfokuset oppleve alvorlige optiske avvik som fører til ustabil fangst (denne effekten er vanligvis ubetydelig i isolerte celler, men blir tydeligere i tykkere vev). For høy stivhet kan gjenopprettekraften til kjernen overstige rømningskraften til fellen, slik at mikrosfæren går tapt og innrykksrutinen svikter. I utgangspunktet blir den kjernefysiske membrankanten proksimal til den optiske fellen knapt rykket inn (figur S2A). Når dette skjer, påvirkes ikke overlappingslaseren lenger av kraft og brownsk bevegelse, noe som fører til et kraftfall til null og en reduksjon av signalstøyen (figur S2B). I tilfelle dette skjer, kan laserkraften økes for å ha en sterkere felle, amplituden til trapesformet bane som skyver perlen inn i kjernen, kan reduseres, eller den opprinnelige posisjonen til den fanget mikrobeaden kan settes lenger av kjernen.

Cellen beveger seg under stimuleringen
Hvis cellene ikke er tilstrekkelig festet, vil den optiske gradientfellen flytte cellene mens du utfører den intracellulære innrykksrutinen, slik at kreftene og underliggende mekanikken til kjernen er gjenstand. For å forhindre forskyvning av hele cellen, anbefaler vi å øke konsentrasjonen av celleadhesjonsmolekyler på overflaten, for eksempel ConA.

Innledende momentumkompensasjon
Hvis en innledende momentumkompensasjonsrutine ikke er tilgjengelig i OTs-plattformen (trinn 6.5), må et kunstig, kraftuavhengig basislinjesignal korrigeres for. Dette er synlig som en skråning på kraftkurven selv uten perle fanget (figur S1E). For å gjøre korreksjonen må den samme banen utføres uten perle, utenfor cellen i nøyaktig samme posisjon. For dette flytter du cellen bort fra overlappingen ved hjelp av fasekontrollen. Som referanse endres kraftforskyvningen 5 pN over FOV ved 200 mW i systemet vårt; Dermed blir det ubetydelig for korte baner. Alternativt kan et piezo-skannestadium brukes til å flytte cellene på prøven, slik at laserposisjonen er konstant.

Kritiske trinn i den presenterte protokollen
Mikrosfærer bør injiseres til høyre, 1-cellers stadium for å sikre maksimal fordeling over embryoet. Perler bør ikke være fluorescerende slik at det ikke lekker lys inn i fluorescerende kanaler som brukes til avbildning. For eksempel er selv typiske rød-fluorescerende perler tydelig synlige i den blå kanalen som brukes til å avbilde cellekjernen etter Hoechst-farging på grunn av lysstyrken (eksitasjon: 405 nm; utslipp: 445 nm). Stabil tilknytning av cellen til substratet er avgjørende for å forhindre lateral forskyvning under innrykksrutinen. Hvis cellen beveger seg under rutinen, blir krefter undervurdert. Hvis dette skjer ofte, optimaliserer du vedleggsprotokollen. For vevskulturceller fører andre celleadhesjonsproteiner, for eksempel fibronectin, kollagen eller poly-L-lysin, til tilfredsstillende vedlegg (upubliserte observasjoner). Under innesperringen blir celler utsatt for et plutselig og alvorlig mekanisk stress. Dette kan forårsake skade på cellene, og ofte vil eksperimentet støte på sprengte celler hvis prosedyren ikke utføres nøye. Også, hvis innesperringshøyden er for liten, vil alle cellene lide av kjernefysisk innhylling brudd eller irreversibel skade. For å redusere disse, senk de øvre dekslene langsommere og/eller øk avstanden mellom dekslene.

Begrensninger i teknikken og forslag for å overvinne dem
En klar begrensning av teknikken er penetrasjonen av laserlyset i dype deler av vevet, noe som fører til avvik og ustabil fangst. Dermed avhenger en lavere grense for penetrasjonsdybde av klarheten i prøven, avvikskorreksjonen som kan ^brukes73 og den påførte laserkraften. Det bør tas i betraktning at en høyere lasereffekt fører til termisk eksitasjon av prøven i nærheten av mikrosfæren. Oppvarming av prøven stammer imidlertid fra 1064 nm bølgelengde laser flekk er minimert for å unngå plausibel varmerelatert stress på våre biologiske ^prøver74.

En annen begrensning er den maksimale kraften som kan måles. Selv om direkte lys-momentum deteksjon muliggjør kraftmålinger langt utover det lineære responsregimet til den optiske ^fellen40,41, er den maksimale anvendte kraften i størrelsesorden noen få hundre picoNewtons. Dette begrenses av laserkraft og følgeskadeterskelen for mykt biologisk materiale og brytningsindeksforskjellene, som normalt ikke er større enn 0,1 eller ^0,344. Det er foreslått flere metoder for å øke kraftdeteksjonsgrensen, for eksempel ved hjelp av strukturerte ^lys75, antirefleksbelagte mikrosfærer76, høyrefleksindekspartikler77 eller svært dopede kvanteprikker78.

OTer kan brukes til nanometer-skala posisjonsmålinger gjennom BFP interferometri, slik at posisjonen til perlen i fellen er Δx = β _Sx, hvor _Sx er sensorens spenningssignal, og β [μm / V] kan kalibreres underveis etter forskjellige ^{protokoller35,54}. For en optisk kraftsensor kan det bevises at spenning-til-kraft invariant konverteringsfaktor α [pN / V] direkte er relatert til β og fellestivheten, k [pN / μm], gjennom α = kβ ³⁷) I eksperimenter med perleforskyvninger som er for små til å bli oppdaget fra optisk avbildning, kan denne strategien brukes til å utfylle kraftmålinger med små posisjonsdeteksjon. Et eksempel er anvendelsen av de eksperimentelle rutinene som presenteres her på svært stive kjerner, for hvilke krefter med rimelige laserkrefter (200-500 mW) ikke er tilstrekkelige til å indusere innrykksverdier store nok. I så fall må perlen bringes i kontakt med kjernen, og fangststivheten må kalibreres før målingen (trinn 8.6). Innrykk d av kjernen som en funksjon av kraft kan indirekte bestemmes som:

d = _xtrap - F/k

der _xtrap er overlappingsposisjonen. Forskjellig fra den konstante lysmomentfaktoren α [pN/V], må faktor β [μm/V] kalibreres før hvert eksperiment, siden det avhenger av mange lokale variabler som bestemmer overlappingsdynamikken, for eksempel partikkelstørrelse, optisk fellepunktstørrelse og relative brytningsindekser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 22 mm cover glasses	Ted Pella	260148
#1.5 22x60 mm Coverglasses	Ted Pella	260152
#1.5H glass bottom dishes	Willco	GWST-5040
10-um beads	Supelco	72986
1-mm glass capillaries	Harvard Apparatus	30-0020 GC100F-15
1-um polystyrene microbeads	Sigma	89904
1-um red-fluorescent beads	ThermoFisher	F8816
Agar	ThermoFisher	16500500
Aqcuisition cameras sCMOS	Andor	Sona-4BV11-UNI
Auxiliary camera (Figure 3, AUX)	Blackfly, FLIR	BFS-U3-200S6M-C
Calbryte 520	AAT Bioquest	520 AM
Centrifuge	Eppendorf	5453000011
Concanavalin A	Sigma	C5275
DMEM	Sigma	D2906
DNA-Hoechst	ThermoFisher	33342
Double scotch tape	Biesse Adesivi
E3	5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4
Eclipse Ti2	Nikon
Forceps	Fine Science Tools	11252-20
GPI-GFP
H2A-mCh
Image acquisition software	Fusion-Andor
Immersion Oil	Cargille	Type B: 16484
IR protection googles	Thorlabs	LG1
Lap2b-eGFP
Micro loader pipette	Eppendorf	GELoader
Microinjector	World Precision Instruments	SYS-PV820
MicroManager 2.0
Micromiter slide	ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions
Mineral oil	Sigma	M3616
Motorized stage	ASI
Needle puller	Sutter instrument Co.	Model P-97
Optical tweezers platform	Impetux Optics	Sensocell
OTs software (LightAce)	Impetux Optics
PDMS	Sigma	Sylgard 184
PDMS Curing agent	Sigma	Sylgard 184
Post processing software (Matlab)	Mathworks
RNAse free water	Thermofisher	AM9937
Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)	Semrock	FF01-950/SP-25
Spin-coater	Specialty Coating Systems	Spincoat G3P-8
Spinning-disk confocal microscope	Andor	DragonFly 502
Stereomicroscope	Leica M80
Triangular microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU1
Universal oven	Memmert	UNB 200
Water immersion objective	Nikon	MRD07602