Summary
Her præsenterer vi en protokol baseret på melorme (Tenebrio molitor)-agn system, der blev brugt til at isolere og vælge entomopathogene svampe (EPF) fra jordprøver. En effektiv conidia nummer (ECN) formel bruges til at vælge høj stresstolerant EPF baseret på fysiologiske egenskaber for skadedyr mikrobiel kontrol i marken.
Abstract
Entomopatogene svampe (EPF) er et af de mikrobielle kontrolmidler til integreret skadedyrsbekæmpelse. For at kontrollere lokale eller invasive skadedyr er det vigtigt at isolere og vælge indfødte EPF. Derfor blev jord agnmetoden kombineret med insekt agn (melorme, Tenebrio molitor) system brugt i denne undersøgelse med nogle ændringer. Den isolerede EPF blev derefter underkastet virulenstesten mod landbrugs skadedyret Spodoptera litura. Desuden blev de potentielle EPF-stammer udsat for morfologiske og molekylære identifikationer. Desuden blev conidia-produktionen og termotoleranceanalysen udført for de lovende EPF-stammer og sammenlignet; disse data blev yderligere erstattet af formlen for effektivt conidianummer (ECN) for laboratorierangering. Jord agn-melorme system og ECN formel kan forbedres ved at erstatte insektarter og integrere flere stressfaktorer til evaluering af kommercialisering og anvendelse af marken. Denne protokol giver en hurtig og effektiv tilgang til EPF-udvælgelse og vil forbedre forskningen i biologiske kontrolmidler.
Introduction
I øjeblikket er entomopatogene svampe (EPF) meget udbredt i den mikrobielle kontrol af landbrugs-, skov- og gartneri skadedyr. Fordelene ved EPF er dens brede udvalg, god miljømæssig tilpasningsevne, miljøvenlig natur, og at den kan bruges sammen med andre kemikalier for at vise den synergistiske effekt for integreret skadedyrsbekæmpelse1,2. Til påføring som skadedyrsbekæmpelsesmiddel er det nødvendigt at isolere et stort antal EPF fra enten syge insekter eller det naturlige miljø.
Prøveudtagningen af disse organismer fra deres værter hjælper med at forstå den geografiske fordeling og prævalens af EPF i naturlige værter3,4,5. Imidlertid er samlingen af svampeinficerede insekter normalt begrænset af miljømæssige faktorer og insektpopulationer i marken4. I betragtning af at insekt værter vil dø efter EPF-infektion og derefter falde i jorden, isolering af EPF fra jordprøver kan være en stabil ressource3,6. For eksempel er saprofitter kendt for at bruge den døde vært som deres ressource til vækst. Jord agn og selektive medium systemer er blevet meget brugt til at opdage og isolere EPF fra jorden3,4,7,8,9,10.
I den selektive mediummetode er den fortyndede jordopløsning belagt på et medium, der indeholder bredspektrede antibiotika (f.eks. chloramphenicol, tetracyklin eller streptomycin) for at hæmme væksten af bakterier2,3,9,11. Det er dog blevet rapporteret, at denne metode kan fordreje stammens mangfoldighed og tæthed og kan forårsage en over- eller undervurdering af mange mikrobielle samfund6. Desuden er de isolerede stammer mindre patogene og konkurrerer med saprofytter under isolation. Det er vanskeligt at isolere EPF fra den fortyndede jordopløsning3. I stedet for at bruge et selektivt medium isolerer jord agnmetoden EPF fra de inficerede døde insekter, som kan opbevares i 2-3 uger, hvilket giver en mere effektiv og standard EPF-adskillelsesmetode3,4,7,6. Fordi metoden er let at betjene, kan man isolere en række patogene stammer til en lav pris4. Derfor er det meget udbredt af mange forskere.
Ved sammenligning af de forskellige typer af insekt agn systemer, Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae er de mest almindelige EPF arter, der findes i insekter, der tilhører Hemiptera, Lepidoptera, Blattella, og Coleoptera6,12,13,14. Blandt disse insekt lokkemad, Galleria mellonella (bestil Lepidoptera) og Tenebrio molitor (ordre Coleoptera) viser højere inddrivelse satser beauveria og Metarhizium spp., sammenlignet med andre insekter. Derfor er G. mellonella og T. molitor almindeligt anvendt til insekt baiting. I årenes løb har United States Department of Agriculture (USDA) etableret et EPF-bibliotek (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF), der indeholder en bred vifte af arter, herunder 4081 arter af Beauveria spp., 18 arter af Clonostachys spp., 878 arter af Cordyceps spp., 2473 arter af Metarhizium spp., 226 arter af Purpureocillium spp., og 13 arter af Pochonia spp. blandt andre15. Et andet EPF-bibliotek blev bygget af Entomology Research Laboratory (ERL) fra University of Vermont i USA i ca. 30 år. Det omfatter 1345 stammer af EPF fra USA, Europa, Asien, Afrika og Mellemøsten16.
For at kontrollere lokale eller invasion skadedyr i Taiwan, isolation og udvælgelse af indfødte EPF er påkrævet. Derfor har vi i denne protokol ændret og beskrevet proceduren for jordens agnmetode og kombineret den med insekt agn (melorme, Tenebrio molitor) system17. På grundlag af denne protokol blev der oprettet et EPF-bibliotek. Der blev udført to screeningsrunder (kvantificering af podning) for de foreløbige EPF-isolater. EPF-isolater viste sygdomsfremkaldende for insekter. De potentielle stammer blev udsat for morfologiske og molekylære identifikationer og yderligere analyseret af termotolerance og konidial produktion assay. Desuden blev der også foreslået et begreb om et effektivt conidianummer (ECN). Ved hjælp af ECN-formel og hovedkomponentanalyse (PCA) blev de potentielle stammer analyseret under simuleret miljøtryk for at fuldføre processen med at etablere og screene EPF-biblioteket. Efterfølgende blev patogenitet af lovende EPF-stammer testet for mål skadedyr (f.eks Spodoptera litura). Den nuværende protokol integrerer termotolerance- og konidiale produktionsdata i ECN-formlen og PCA-analysen, som kan bruges som standardrangeringssystem for EPF-relateret forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Hele rutediagrammet er vist i figur 1.
1. Isolering og udvælgelse af potentielle entomopatogene svampe (EPF)
- Saml jordprøven
- Fjern 1 cm af overfladejorden, og saml derefter jorden inden for 5-10 cm dybden ved hjælp af en skovl fra hvert prøvetagningssted.
BEMÆRK:Prøvetagningssteder ville være et bjerg, en skov eller tyndt befolkede områder for at undgå forurening af kunstigt sprøjtede EPF-stammer. Sørg for, at arealer til opsamling af jordprøver er dækket af ukrudt på overfladen. Tør jord eller fugtig jord er ikke egnet til dette eksperiment. - Registrer detaljerne for hvert prøvetagningssted, herunder GPS, højde, felttype, årlig temperatur, årlig nedbør, indsamlingstid (sæson), jordtype og pH-værdi.
- 100 g af jordprøven opsamles i en plastikpose, og den skal vedligeholdes ved stuetemperatur, hvis den udsættes for svampeisolationsprotokollen i laboratoriet inden for 3 timer.
BEMÆRK: Hvis prøven ikke kan anvendes inden for 3 timer, skal jorden opbevares ved stuetemperatur under mørke forhold. Hvis forsøget ikke udføres med det samme, kan jordprøven opbevares ved 4 °C i 1 uge indtil protokollens begyndelse18,19.
- Fjern 1 cm af overfladejorden, og saml derefter jorden inden for 5-10 cm dybden ved hjælp af en skovl fra hvert prøvetagningssted.
- Agn og isolere EPF med melorme (Tenebrio molitor)
- Placer 100 g af jordprøven i en plastikkop (hættediameter = 8,5 cm, højde = 12,5 cm), og placer derefter 5 melorme på jordens overflade ved stuetemperatur i mørke i 2 uger.
BEMÆRK: Andre typer plast kop containere kan også bruges. Hvis jorden er for tør (revnet eller sandet), spray steriliseret ddH2O (ca. 5-10 mL) på jorden. Kropslængden ca. 2,5 cm (14. instar) af T. molitor larver hjælper med svampeisolat skærme20. - Overhold og registrer larverne dagligt for dødelighed og mykose; hold de døde larver i koppen indtil 2 uger for svampeisolering.
BEMÆRK: Svampekonidiasporen i jordprøverne vil fastgøres til melormelarverne under ovenstående proces. Svampemykosen vil blive observeret, når hyfanen vokser fra den intersegmentale membran, og så vil hele kroppen blive dækket af myceliet. Sporulation vil starte efter 7 dage, og farven på svampeinfektionen vil ændre sig til farven på conidiamassen. - Overfør de døde insekter til en ren bænk og brug en steril tandstikker til at indsamle conidia. Stime dem på en kvart styrke Sabouraud dextrose agar medium (1/4 SDA) plade (55 mm) i laboratoriet21. Inkuberes kulturpladen ved 25 °C i 7 dage for at opnå den primære svampekultur.
BEMÆRK: 1/4 SDA-pladen er fremstillet som følger: Bland 1,5 g Sabouraud dextrose bouillon og 3 g agar i 200 mL H2O, og steriliser derefter i 20 min. Aliquot 1/4 SDA i hver 55 mm Petriskål før størkning. De størknede 1/4 SDA-plader opbevares ved 4 °C, indtil de anvendes. - Re-streak hver primær kultur svampe på en 55 mm 1/4 SDA plade i en laminar flow og inkubere kulturpladen ved 25 °C i 7 dage for at opnå enkelt kolonier af svampe.
- Gentag denne re-isolation ~ 2-3 gange og observere under lys mikroskopi for at opnå enkelt og ren morfologisk svampe kolonier.
BEMÆRK: Isoler al EPF ved hjælp af T. molitor-agn og opbevar som beskrevet i det følgende afsnit. Adskillelsen, bevarelsen, den rene kultur og striberne skal udføres i et laminarflow i de efterfølgende afsnit.
- Placer 100 g af jordprøven i en plastikkop (hættediameter = 8,5 cm, højde = 12,5 cm), og placer derefter 5 melorme på jordens overflade ved stuetemperatur i mørke i 2 uger.
- Gem EPF-isolaterne
- Skær 3 af de 5 mm agar blokke på kanten af hver isoleret ren svampekulturel plade med en kork borer og placere den i en 1,5 mL mikrocentrifuge rør som en replikere.
BEMÆRK: Tre gentagelser for hvert svampeisolat anbefales til EPF-stammernes opbevaring efter anden virulenstest. Molekylær identifikation anbefales også, hvis lagerpladsen er begrænset. - Der tilsættes 250 μL 0,03% overfladeaktiv opløsning (materialetabel) og 250 μL på 60 % glycerol i 1,5 mL mikrocentrifugerøret ved hjælp af en mikropipette. derefter hvirvler i 10 s.
- Forsegl 1,5 mL mikrocentrifugerøret med paraffinfilm, og forkøl det i et -20 °C køleskab i 24 timer. Overfør derefter de forkølede svampelagre til et -80 °C køleskab til kryopræservering.
BEMÆRK: Der blev anvendt ekstra rene svampekulturplader (bortset fra de kryokonserverede prøver) i punkt 1.4.
- Skær 3 af de 5 mm agar blokke på kanten af hver isoleret ren svampekulturel plade med en kork borer og placere den i en 1,5 mL mikrocentrifuge rør som en replikere.
- 1. patogenitet skærm for svampe isolater
- Placer fem T. molitorlarver direkte på overfladen af hver ren svampekulturplade ved 25 °C.
- Overhold og registrer mykosen og dødeligheden i 10 dage. Vælg svampeisolat til yderligere analyse.
BEMÆRK: Svampeisolater, der forårsager 100% dødelighed, udvælges til 2. virulenstest for at bekræfte deres virulens over for T. molitorlarver . Alternativt kan forskeren justere kriterierne i henhold til deres egen undersøgelse.
- 2. virulens test af svampe isolater
BEMÆRK: Baseret på 1. patogenitetsskærm genvindes de udvalgte svampeisolater fra -80 °C til 2. virulenstest. Formålet med anden virulenstest er at kvantificere patogeneligheden af de udvalgte svampeisoller efter 1. screeningsrunde .- Høst conidia af hver svampeisolat ved hvirvlende i 1 min og tælle antallet af conidia ved hjælp af et hæmocytometer.
- Conidiaaffjedringen justeres til en koncentration på 1 x 107 conidia/mL i en 0,03% overfladeaktiv opløsning (Materialetabel).
- 10 μL af svampeophænget fordeles på 55 mm 1/4 SDA-plader og vokse i 7 dage ved 25 °C i mørke.
- Placer fem T. molitorlarver direkte på overfladen af hver ren svampekulturplade (ca. 6 x 107 conidia). Forsegl pladerne med paraffinfilm og inkuberes ved 25 °C i mørke.
- Overhold og registrer mykosen og dødeligheden i 10 dage.
- Testen gentages (fra trin 1.51 til 1.5.5) i tredotel for hvert svampeisolat.
BEMÆRK: Svampeisolater, der forårsager 100% dødelighed, vælges til 3. virulenstest for at bekræfte deres virulens for at målrette skadedyret.
- 3. virulenstest af svampeisolater til mål skadedyr (Spodoptera litura som et eksempel)
- Gentag trin 1.5.2 til 1.5.6 med udvalgte isolater fra 2. virulens for at teste virulens mod mål skadedyr.
- Beregn LT50 for hvert svampeisolat22.
BEMÆRK: LT50 for hvert svampeisolat blev beregnet gennem generelle lineære modeller (GLMs) ved hjælp af R-studie (version 3.4.1); kvasibinomial fejlfordelingen og en log linkfunktion kan bruges til at tegne sig for overdispersion.
2. Molekylær identifikation af EPF
- Ekstraktion af svampegenomisk DNA
- SDA-pladen opsamles ca.a. 1 cm2 fra den 7-dages 1/4 SDA-plade.
- Uddrag svampegenom DNA ved hjælp af et svampegenomISK DNA-ekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger23 (Materialetabel).
- PCR-forstærkning og DNA-sekventering
- Forstærke svampe ITS-regionen ved HJÆLP AF DNA-prøven21 ved hjælp af PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R primer set24 (tabel 1) med følgende PCR-program: 94 °C i 1 min og derefter 35 cyklusser på 94 °C i 30 s, 55 °C i 30 s og 72 °C i 1 min, efterfulgt af en 7 min endelige forlængelse ved 72 °C.
BEMÆRK: ITS1F/ITS4R primer-sættet er til identifikation af slægtsniveau. - Sekvenser PCR efter kommerciel sekventeringstjeneste.
- Brug NCBI BLAST-søgning efter lignende svampe i NCBI-databasen, og vælg de relative svampetypearter til fylogenetisk analyse.
BEMÆRK: Svampearten, der tilhører Metarhiziums eller Beauverias slægt, bør identificeres yderligere til artsniveau med tef-983F/tef-2218R primer set25 (gentag trin 2.1.1 til 2.2.3). For svampe, der ikke tilhører slægten Metarhizium eller Beauveria, kan andre molekylære markører anvendes til at identificere arten, herunder DNA-lyase (APN2), beta tubulin (BTUB), RNA polymerase II største underenhed (RPB1), RNA polymerase II næststørste underenhed (RPB2) og 3' del af oversættelsesforlængelsesfaktor 1 alpha (TEF)25,26 .
- Forstærke svampe ITS-regionen ved HJÆLP AF DNA-prøven21 ved hjælp af PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R primer set24 (tabel 1) med følgende PCR-program: 94 °C i 1 min og derefter 35 cyklusser på 94 °C i 30 s, 55 °C i 30 s og 72 °C i 1 min, efterfulgt af en 7 min endelige forlængelse ved 72 °C.
- Fylogenetisk analyse
- Brug ClustalX 2.1-software27 til at justere de flere sekvenser fra trin 2.2.2 og 2.2.3. Trim området med bevarede sekvenser manuelt med GeneDoc28.
- Udfør den fylogenetiske analyse af MEGA7 software29 baseret på den mindste udvikling (ME), Neighbor-Joining (NJ) og maksimal sandsynlighed (ML) metoder.
BEMÆRK: Hvis du udfører alle tre metoder, kan det hjælpe med at bekræfte og præcist afslutte klassificeringsstatus. Svampeisolater screenet af 1st patogenitet skærmen bruges til molekylær identifikation på slægten niveau. Svampeisolater screenet ved 2. virulenstest anvendes til artsniveau molekylær og morfologisk identifikation.
3. Morfologisk identifikation af EPF
- Observation af svampekolonimorfologien
- Brug et kamera til at fange svampekulturkolonivæksten i 7 dage, og registrer koloniernes vækst, form (fluffy, fast) og farve.
- Observation af conidia og conidiophores
- Skrab conidia fra den rene kultur svampekoloni med en podningsløkke og overfør sporerne til en glasrutschebane med 0,1% Tween 80 opløsning. Derefter dække med en coverlip for lys mikroskopisk observation af conidia.
- Brug en skalpel til at skære en 5 mm2 agar blok af hyphal strengen i kanten af svampekolonien, og overfør derefter agarblokken til en glasrutschebane.
- Udfør rengøringen som følger: Tilsæt 0,1% Tween 80-opløsningen på agarblokken med en plastikdråber og vask det meste af den overskydende conidia af ved hjælp af pincet. Derefter dække det med en coverlip for lightmicroscopic observation.
BEMÆRK: 0,1% Mellem 80 kan erstattes med et andet mere potent overfladeaktivt middel (Materialetabel) afhængigt af svampearter og hydrofobicity. - Mål og registrere bredden og længden af conidia og conidiophores at sammenligne forskellene mellem forskellige svampe isolater.
- Brug Welchs ANOVA-test og Games-Howell-test (post-hoc-test) til at analysere den konidielle bredde og længde af hver stamme ved hjælp af R-studie (version 3.4.1).
BEMÆRK: Dataanalyse af morfologiske tegn kan justeres efter tilfælde. Svampeisolater screenet med 3rd virulens test anvendes til den fysiologiske karakterisering og ECN ranking i afsnit 4 og 5.
4. Undersøgelse af sympatisk produktivitet og termotolerance
- Konidial produktion assay
- Kultur det valgte svampeisolat på 1/4 SDA-medium ved 25 ± 1 °C i mørke i 10 dage.
- 1 mL af svampeiserolen i 0,03% overfladeaktiv opløsning forberedes i 0,03% overfladeaktiv opløsning, og justers til 1 x 107 conidia/mL som beskrevet ovenfor.
- Drop tre dråber på 10 μL konidial suspension på 1/4 SDA og inkuberes ved 25 °C i mørke i 7, 10 og 14 dage for at tælle sporuleringen af svampe.
BEMÆRK: 10 μL er det bedste volumen til at opsamle 5 mm-blokken med jævn svampesporulation efter svampevækst i 7-14 dage. - Brug korkboreren til at løsne 5 mm agarblok fra midten af kolonien og overføre til 1 mL 0,03% overfladeaktiv opløsning (Materialetabel) i et 1,5 mL mikrocentrifugerør på hvert tidspunkt.
- Vortex røret ved 3.000 rpm ved stuetemperatur i 15 min og bruge et hæmocytometer til at tælle antallet af conidia.
BEMÆRK: Den formel, der anvendes til optælling, er antallet af conidia pr. 25 kvadrater af den mindste celle (størrelse = 0,025 mm2; kammerdybde = 0,1 mm):
Samlet antal conidia på 5 kvadrater ÷ 80 × (4 × 106) - Gentag tre gange for hver isolere.
- Termotolerance assay
- Kultur det valgte svampeisolat på 1/4 SDA-medium ved 25 ± 1 °C i mørke i 10 dage.
- 1 mL af den konidiale suspension af svampeisolat i 0,03% overfladeaktiv opløsning og juster til 1 x 107 conidia/mL som beskrevet ovenfor.
- Hvirvle den konidielle suspension og varme det i en 45 ° C tørt bad i 0, 30, 60, 90 og 120 min. Drop tre dråber på 5 μL af den konidiale suspension på 55 mm 1/4 SDA medium på hvert tidspunkt efter varmeeksponering og inkuberes ved 25 ± 1 °C i 18 timer.
BEMÆRK: Undgå at sprede svampedråberne for bedre at kunne fokusere på området. - Tæl antallet af spirede conidiasporer med fem tilfældigt udvalgte felter under 200x lysmikroskopi for at bestemme spiringshastigheden.
- Udfør tre repliker for hver isolere.
5. Effektiv conidia nummer (ECN) ranking
- ECN-beregning
BEMÆRK: Få de konidielle produktions- og termotolerancedata for hver potentiel svampestamme, før du beregner det samlede ECN21.- Beregn fold-change (FC) af konidial produktion på hvert tidspunkt:
hvor, x = tidspunkt for dataindsamling ncp = antal konidier efter hver vækstdag og jeg = indledende antal seedede conidia. - Konidianummeret beregnes under stressbehandlingen på hvert tidspunkt ved hjælp af følgende formel:
Hvor, y = ECN af det tidspunkt, der er under behandling; TT0 = spiringshastigheden for konidia, der ikke er under varmebelastning (= spiringshastighed på 0 min varmebehandling); TTz = stresskoefficient er conidia spiringshastigheden på forskellige tidspunkter af varmebehandling (z). - Beregn det samlede ECN ved hjælp af følgende formel:
- Sammenlign ECN af hver svampestamme.
- Beregn fold-change (FC) af konidial produktion på hvert tidspunkt:
- Hovedkomponentanalyse (PCA) af svampestammer
BEMÆRK:PCA-analysen bekræfter placeringen af ECN og hjælper med at forstå sammenhængen mellem de fysiologiske karakterværdier. Sammenlign ECN-værdierne, og vælg EPF-isolater med højere ECN-værdier. - Brug R-software til at oprette PCA ved at kode:
#Input PCA-datafil
a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)- # Behandling af eksempeldata
row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
X=række.navne(a)
df<- a[2:11] - #PCA beregning
pca <- prcomp(df, center = TRUE, skala = SAND)
vars <- (pca$sdev)^2
pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
værdi = pca$x - #Output PCA-visualiseringsfil
png(fil = 'pca.png', højde = 2000, bredde = 2000, res = 300)
BEMÆRK: Brug 7 til 14 dages konidial produktion og alle termotolerancedata til at udføre pca (Principal Component Analysis) til at bekræfte ECN-rangeringen.
- # Behandling af eksempeldata
- Vælg de bedst ydende svampestammer baseret på ECN eller PCA og udfør virulenstesten af mål skadedyr til yderligere forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering og udvælgelse af potentielle entomopatogene svampe (EPF)
Ved at anvende den Tenebrio molitormedierede entomopathogenic fungi (EPF) bibliotekskonstruktionsmetode ville antallet af svampe uden insektdræbende aktivitet blive udelukket; således kan isolationseffektiviteten og udvælgelsen af EPF øges i vid udstrækning. Under anvendelsen af denne metode blev der registreret oplysninger om prøvetagningssteder, jordprøver og svampespiringshastighederne (tabel 2). Baseret på vores tidligere data blev der opnået i alt 101 svampeisolater fra 172 jordprøver, hvilket indikerer en høj isolationseffektivitet på 64%. Blandt de 101 svampeisolater viste 26 isolater insekticid aktivitet mod T. molitor (100% dødelighed) efter 1. patogenitetsscreening , og derfor var elimineringen af svampeisolater 26/101 = 25,7%. I den anden virulenstest blev den høje virulens af de 26 svampeisolater mod T. molitor yderligere påvist, hvoraf 12 viste høj patogenitet mod T. molitorlarver (100% dødelighed ved 5 dage efter podning) (Figur 2A). Disse blev brugt til at evaluere virulenstesten mod landbrugs skadedyret. Baseret på data fra 3rd virulens test dødelighed og LT50, i alt seks svampe isolater (NCHU-9, 11, 64, 69, 95 og 113) afslørede hurtig insekt-drab aktivitet mod Spodoptera litura (LT50 = 2,94, 2,22, 2,84, 2,57, 2,96, og 1,13), vurderet ved hjælp af den fysiologiske analyse og effektive conidia nummer (ECN) (figur 2B).
Molekylær identifikation af EPF
For bedre at forstå svampeskattemæssig position blev 26 isolater fra 1. patogenitetsscreening underkastet molekylær analyse baseret på ITS-regionen (figur 3A). Resultatet viste, at disse svampe isolater klart kunne opdeles i syv slægter, herunder Beauveria, Clonostachys, Fusarium, Cordyceps, Penicillium, Purpureocillium, og Metarhizium (Figur 3A). Baseret på ITS1-5.8S-ITS2-regionen blev slægtsklassifikationen af EPF nøjagtigt bekræftet, mens artsniveauet stadig ikke kan skelnes. Derfor anvendes rækkefølgen af tef-regionen til klart at klassificere artsniveauet for 12 lovende EPF-isolater fra virulenstesten mod landbrugs skadedyret. Den molekylære identifikation af de 12 isolater viste, at 11 isolater tilhører Metarhizium og indeholdt fire arter, herunder M. lepidiotae (NCHU-9, NCHU-102), M. pinghaense (NCHU-10, NCHU-11, NCHU-30, NCHU-32, NCHU-64), M. brunneum (NCHU-27, NCHU-29) og M. anisopliae (NCHU-69, NCHU-95). Den resterende isolere blev identificeret som B. australis (NCHU-113) (figur 3B,C). Ifølge ovenstående resultat kan sekvensområdet tef effektivt skelne slægten Metarhizium på artsniveau, mens andre arter skal finde andre sekvensområder som molekylære markører for at skelne arten.
Morfologisk identifikation af EPF
Gennem rengøringsmetoden (trin 3.2.3) af svampemorfologiske observationer kunne konstruktionerne af conidiophores ses tydeligt med 0,1% Tween 80-opløsning (figur 4A), og disse observationer kunne tjene som benchmark til at måle strukturens størrelse og tage en fotopost. Farven, formen og arrangementet af conidia kan ses gennem mikroskopiske observationer af kolonien conidia (Figur 4B, C). Efter observation kan størrelsen af conidia- og conidiophoreformer måles yderligere og sammenlignes statistisk (tabel 3).
Undersøgelse af konidial produktivitet, termotolerance og ECN ranking
ECN-formlen, som blev foreslået i den foregående rapport21, kunne hjælpe med udvælgelsen af en EPF-baseret fysiologisk karakter med høj stresstolerance. ECN kombinerer conidia-produktions- og termotolerancedata for hver EPF (figur 5A,B), hvilket betyder høj levedygtighed af svampestamme, når ECN-værdien er høj (figur 5). Desuden blev visualisering af hovedkomponentanalyse (PCA) anvendt til at verificere resultaterne fra ECN-formlen. Resultatet afslørede en høj koordinering mellem erhvervskontrolmål og ECN, hvilket tyder på, at ECN-formlen kunne anvendes til at evaluere hierarkiet af levedygtighedsrelaterede parametre og udviklingspotentialet for svampe til feltanvendelse og yderligere kommercialisering (figur 5C, D).
Figur 1: Illustration af Tenebrio molitor-medieret Entomopathogenic svampe (EPF) bibliotek konstruktion. Del 1: Svampeisolation fra jordprøve; Del 2: Sygdomsfremkaldende og virulensbaseret screening og svampeidentifikation; Del 3. Fysiologisk karakterisering og svamperangering. ECN = Effektivt conidianummer; og PCA = Hovedkomponentanalyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dødelighed af melorme og Spodoptera litura til udvælgelse af lovende entomopatogene svampe (EPF) isolater. (A) 26 udvalgte svampe 2nd melorme virulens test; Mykoserne af 12 hurtige drab og høj virulens svampe isolater er vist parallelt. B) der blev udvalgt 12 svampeisolater til virulenstest mod S. litura. Test på hver svampestamme blev gentaget tre gange. d.p.i. = dage efter podning. Modificeret figur og forklaring gengivet med tilladelse fra Fronteris21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Den fylogenetiske analyse af entomopatogene svampestammer (EPF) stammer på (A) Slægtsniveau baseret på ITS-regionen og (B-C) Artsniveau baseret på tef. Den fylogenetiske analyse af ITS-regionen og tef blev konstrueret ved hjælp af den maksimale sandsynlighed (ML), minimum evolution (ME) og nabo-sammenføjning (NJ) metoder. Bootstrap analyser blev udført for at evaluere robustheden af fysiologer ved hjælp af 1.000 replikerer, og bootstrap proportioner større end 50% er angivet ovenfor grene. Fed = Tidligere stammer. De røde og grønne pile angiver den lovende EPF. Modificeret figur og forklaring gengivet med tilladelse fra Fronteris21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mikroskopisk undersøgelse af entomopatogene svampe (EPF) (M. anisopliae) morfologi. Observation af conidiophores (A) efter vask. (B) Observation af conidia form og farve. C) Arrangement af conidia og bundter af sporstrenge (SS) af M. anisopliae Cp = conidiophores; cc = cylindrisk conidia. Skalalinje = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Fysiologisk karakterisering af seks potentielle isolater og den effektive analyse af conidianummer (ECN). b) Termotoleranceanalyse. (C) Søjleplottet for ECN-værdier. (D) Analysen af de vigtigste komponenter viste fordelingen af hver stamme. Modificeret figur og forklaring gengivet med tilladelse fra Fronteris21. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer navn | Amplicon størrelse (bp) | Sekvens(5'-3') | Region | Henvisning | |
| ITS1F | 550 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | DENS | 25 | |
| ITS4R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||||
| tef-983F | 1000 | GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT | tef | 26, 27, 41, 42 | |
| tef-2218R | ATGACACCRACRGCRACRGTYTG | ||||
Tabel 1: Primer par til svampe identifikation.
Tabel 2: De parametre, der er registreret for Tenebrio molitor-medieret EPF bibliotek byggemetode er angivet nedenfor. NIU = campus af National Ilan University. NCHU = campus af National Chung Hsing University. Ændret tabel og forklaring gengivet med tilladelse fra Fronteris21. Klik her for at downloade denne tabel.
| Art | Stamme | Phialider μm±SD* | Conidia μm±SD* |
| Metarhizium lepidiotae | NCHU-9 | Cylindrisk, 7,3±0,67b×2,4±0.36a | Cylindrisk, 6,5±0.45a×2.7±0.13b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-11 | Cylindrisk, 8,6±0,68ab×2.6±0.30a | Cylindrisk, 6,3±0.41b×2.7±0.16b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-64 | Cylindrisk, 10,5±1.54a×2.4±0.32a | Cylindrisk, 6,8±0,53a×2.9±0.31a |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-69 | Cylindrisk, 9,4±1.58a×2.7±0.32a | Cylindrisk, 6.3±0.34b×2.6±0.19b |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-95 | Cylindrisk, 9,6±0.87a×2.6±0.29a | Cylindrisk, 6,0±0,82b×2,9±0.29a |
| Beauveria australis | NCHU-113 | Ellipsoid, NA×2.6±0.57 | Globose, 2.3±0.24×2.3±0.24 |
| * Statistisk analyse blev udført baseret på Welch's ANOVA test ved hjælp af R studie. | |||
| § Ændret tabel og forklaring gengivet med tilladelse fra Fronteris (23). | |||
Tabel 3: Et eksempel på morfologiske observationer af seks lovende entomopatogene svampeisolater. Statistisk analyse blev udført baseret på Welch's ANOVA test ved hjælp af R studie. Ændret tabel og forklaring gengivet med tilladelse fra Fronteris21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Entomopatogene svampe (EPF) er blevet anvendt til insektbekæmpelse. Der er flere metoder til at isolere, vælge og identificere EPF30,31,32. Ved at sammenligne de forskellige typer insekt agn metoder, Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae var almindeligt forekommende i insekt lokkemad6,12,13,14. Blandt disse insekt lokkemad, Galleria mellonella og Tenebrio molitor viste høje inddrivelse satser beauveria og Metarhizium spp. Faktisk blev nytten af melormen (T. molitor)-agnmetoden demonstreret som en bekvemmelighedsmetode til isolering af EPF fra jordprøver17,21. Ikke desto mindre er det blevet rapporteret, at brugte insekter som agn ville vise bias til at isolere specifikke svampearter3,33. Derfor kan kombinationen af forskellige insektarter (dvs. Galleria mellonella og T. molitor sammen) til agn EPF fra jordprøverne øge mangfoldigheden af EPF34.
For at evaluere insektdræbende aktivitet er der to runder screening med melorme (T. molitor) i den nuværende protokol for at vælge de lovende svampestammer til yderligere undersøgelse. Efter denne proces kunne antallet af svampeisolater, som er isoleret fra jordprøver, reduceres dramatisk og begrænses til svampeisolater, der viste høj insekticid aktivitet efter 1. og 2. screening. Stor reduktion af svampe isolater til den næste runde af screening spare tid omkostninger og arbejdskrævende. Det skal også bemærkes, at de udvalgte svampeisolater viste lignende tendenser af patogenitet mellem melorme (T. molitor) og tobaksskærorm (Spodoptera litura), hvilket viste en konsekvent test af patogenitet af forskellige insektarter og kunne udvides yderligere til andre skadedyrsbeskærelser21. Desuden kan beregningen af ECN på grundlag af de fysiologiske test gøre det lettere at udvælge potentielle svampestammer, der skal anvendes i afgrødemarker. Lignende selektive metoder blev nævnt af andre rapporter, mens faktorer som abiotiske og stammeegenskaber ikke er medtaget12,8,31,35,36,37. Derfor kan disse stammer blive påvirket af miljømæssige faktorer, der resulterer i en indflydelse på svampespiringens ydeevne og dermed vanskeligheder med at blive kommercialiseret. Denne konsekvens er også hovedårsagen til uanvendeligheden af laboratoriestammer i marken38.
Fra den morfologiske identifikation bør der gøres en yderligere indsats for at finde den klare struktur af conidiophore og observere de forskellige egenskaber ved hver svampestamme. Undersøgelser kan omfatte forskellige metoder til løsning af den vanskelige morfologiske identifikation39. Den morfologiske identifikation skelner imidlertid ikke mellem nært beslægtede svampearter; Det er derfor nødvendigt at integrere data om molekylær identifikation. Den interne transskriberede spacer (ITS) region viste slægtsniveau diskrimination, mens andre molekylære markører (dvs. tef for Metarhizium, blok for Beauveria) er nødvendige for identifikation på arten niveau26,40,41.
I den fysiologiske karakterisering, for at reducere standardafvigelsen af forsøgene, foreslås enten maskinen eller manuel vortex i mindst 10 minutter ved max rpm21. Grundigt blandet conidia suspension ville øge konsistensen af resultaterne af termotolerance assay og konidial produktion assay. På den anden side, i den konidiale produktion assay, det tælles conidia nummer under et fast område (5 mm blok i den centrale del af svampe koloni i denne undersøgelse) på den kultiverede plade på forskellige tidspunkter vækst rejst det problem, at forskellige svampearter og endda forskellige stammer afslørede forskellige resultater af væksten kompakthed af hyfan, hvilket kan føre til, at stikprøven ikke er repræsentativ. Derfor kan en streng testmetode til conidiaproduktion forbedre problemet, såsom nøjagtigt at tælle antallet af conidia af hele svampekoloni og normalisere med vækstområdet42.
Den effektive conidia nummer (ECN) formel er designet baseret på påvirkning af miljøbelastning mod EPF conidia, det vil sige simulere conidia under forudsætning af vilde miljø til at vælge de lovende svampestammer til kommercialisering21. I denne protokol blev dataene om conidiaproduktion og varmebehandling anvendt til beregning af den samlede ECN-værdi for hver lovende svampestamme efter den foregående undersøgelse21. Endvidere, under et naturligt miljø, undtagen temperaturen, andre miljømæssige stress, såsom fugtighed, ultraviolet stråling (UV), og vært kunne påvirke conidia spiring. Især UV-stress er en vigtig faktor, der påvirker conidia spiring, fordi højenergi frie radikaler (såsom peroxider, hydroxyl grupper, og singlet ilt) genereret af UV kan reducere patogenitet og vedholdenhed af mikrobielle pesticider43. Uv-stress kan således medtages yderligere i ECN-formlen i fremtiden. For at undgå UV-stress bør formlen indeholde olie eller natriumalginat for at øge UV-tolerancen for conidia44,45,46, hvilket bekræfter, at potentielle stammer har praktisk anvendelighed til skadedyrsbekæmpelse47.
Denne protokol indeholdt en metode til hurtig og præcis isolering af potentielle EPF-stammer til at konstruere T. molitor-medieret EPF-bibliotek. Dette er grundlaget og er nødvendigt for udviklingen af biologisk bekæmpelsesforskning. Desuden kan ECN-formlen forbedres fleksibelt for at hjælpe forskerne med at forstå EPF's potentiale og udvikle den til en vare til brug i landbrugssystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt involveret i dette arbejde.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , Frederiksberg Denmark. Department of Ecology 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The 'Galleria bait method'for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D. Manual of Techniques in Insect Pathology. Lacy, L. , Academic. Amsterdam. 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Fungal database WorldWide Collection of Entomopathogenic Fungi. University of Vermont. , Available from: http://www.uvm.edu/~entlab/Fungus.html (2019).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17. , Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- National Resource for Biomedical Supercomputing. GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Pittsburgh Supercomputing Center's National Resource for Biomedical Supercomputing. , Available from: http://www.nrbsc.org/downloads (1997).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -Y., Choi, J. -B., Bae, S. -M., Koo, H. -N., Woo, S. -D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method'as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. Manual of techniques in insect pathology. , Elsevier. 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
