Summary
Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.
Abstract
Entomopathogene schimmels (EPF) zijn een van de microbiële bestrijders voor geïntegreerde plaagbestrijding. Om lokale of invasieve plagen te bestrijden, is het belangrijk om inheemse EPF te isoleren en te selecteren. Daarom werd de bodemaasmethode in combinatie met het insectenaas (meelworm, Tenebrio molitor) -systeem in deze studie met enkele aanpassingen gebruikt. De geïsoleerde EPF werd vervolgens onderworpen aan de virulentietest tegen de landbouwplaag Spodoptera litura. Bovendien werden de potentiële EPF-stammen onderworpen aan morfologische en moleculaire identificaties. Daarnaast werden de conidiaproductie en thermotolerantietest uitgevoerd voor de veelbelovende EPF-stammen en vergeleken; deze gegevens werden verder vervangen door de formule van effectief conidia-nummer (ECN) voor laboratoriumrangschikking. Het bodemaasmeelwormsysteem en de ECN-formule kunnen worden verbeterd door insectensoorten te vervangen en meer stressfactoren te integreren voor de evaluatie van commercialisering en veldtoepassing. Dit protocol biedt een snelle en efficiënte aanpak voor EPF-selectie en zal het onderzoek naar biologische bestrijders verbeteren.
Introduction
Momenteel worden entomopathogene schimmels (EPF) veel gebruikt bij de microbiële bestrijding van landbouw-, bos- en tuinbouwplagen. De voordelen van EPF zijn het brede gastheerbereik, het goede aanpassingsvermogen van het milieu, de milieuvriendelijke aard en dat het kan worden gebruikt met andere chemicaliën om het synergetische effect voor geïntegreerde plaagbestrijding aan te tonen1,2. Voor de toepassing als ongediertebestrijder is het noodzakelijk om een groot aantal EPF te isoleren van zieke insecten of de natuurlijke omgeving.
De bemonstering van deze organismen van hun gastheren helpt bij het begrijpen van de geografische verspreiding en prevalentie van EPF in natuurlijke gastheren3,4,5. De verzameling van met schimmel geïnfecteerde insecten wordt echter meestal beperkt door omgevingsfactoren en insectenpopulaties in het veld4. Gezien het feit dat insectengastheren na EPF-infectie zullen sterven en vervolgens in de grond zullen vallen, kan isolatie van EPF uit bodemmonsters een stabiele hulpbron zijn3,6. Van saprofyten is bijvoorbeeld bekend dat ze de dode gastheer gebruiken als hun bron voor groei. De bodemaas- en selectieve mediumsystemen zijn op grote schaal gebruikt om EPF uit de bodem te detecteren en te isoleren3,4,7,8,9,10.
Bij de selectieve mediummethode wordt de verdunde bodemoplossing op een medium geplaatst dat breedspectrumantibiotica bevat (bijv. chlooramfenicol, tetracycline of streptomycine) om de groei van bacteriën te remmen2,3,9,11. Er is echter gemeld dat deze methode de diversiteit en dichtheid van de stam kan verstoren en een over- of onderschatting van veel microbiële gemeenschappen kan veroorzaken6. Bovendien zijn de geïsoleerde stammen minder pathogeen en concurreren ze tijdens isolatie met saprofyten. Het is moeilijk om EPF te isoleren uit de verdunde bodemoplossing3. In plaats van een selectief medium te gebruiken, isoleert de bodemaasmethode EPF van de geïnfecteerde dode insecten, die 2-3 weken kunnen worden bewaard, waardoor een efficiëntere en standaard EPF-scheidingsmethode wordt geboden3,4,7,6. Omdat de methode eenvoudig te bedienen is, kan men een verscheidenheid aan pathogene stammen isoleren tegen lage kosten4. Daarom wordt het veel gebruikt door veel onderzoekers.
Bij het vergelijken van de verschillende soorten insectenaassystemen zijn Beauveria bassiana en Metarhizium anisopliae de meest voorkomende EPF-soorten die worden aangetroffen in insecten die behoren tot de Hemiptera, Lepidoptera, Blattella en Coleoptera6,12,13,14. Onder deze insectenaas vertonen Galleria mellonella (orde Lepidoptera) en Tenebrio molitor (orde Coleoptera) hogere herstelpercentages van Beauveria en Metarhizium spp., in vergelijking met andere insecten. Daarom worden G. mellonella en T. molitor vaak gebruikt voor het lokken van insecten. In de loop der jaren heeft het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) een EPF-bibliotheek (Agricultural Research Service Collection of EPF-culturen, ARSEF) opgericht die een grote verscheidenheid aan soorten bevat, waaronder 4081 soorten Beauveria spp., 18 soorten Clonostachys spp., 878 soorten Cordyceps spp., 2473 soorten Metarhizium spp., 226 soorten Purpureocillium spp., en 13 soorten Pochonia spp. onder andere15. Een andere EPF-bibliotheek werd gebouwd door het Entomology Research Laboratory (ERL) van de Universiteit van Vermont in de Verenigde Staten voor c.a. 30 jaar. Het omvat 1345 stammen van EPF uit de Verenigde Staten, Europa, Azië, Afrika en het Midden-Oosten16.
Om lokale of invasieplagen in Taiwan te bestrijden, is isolatie en selectie van inheemse EPF vereist. Daarom hebben we in dit protocol de procedure van de bodemaasmethode aangepast en beschreven en gecombineerd met het insectenaas (meelworm, Tenebrio molitor) -systeem17. Op basis van dit protocol werd een EPF-bibliotheek opgericht. Twee screeningsrondes (kwantificering van inenting) werden uitgevoerd voor de voorlopige EPF-isolaten. EPF-isolaten vertoonden pathogeniciteit voor insecten. De potentiële stammen werden onderworpen aan morfologische en moleculaire identificaties en verder geanalyseerd door de thermotolerantie en conidiale productietest. Verder werd ook een concept van effectief conidia-nummer (ECN) voorgesteld. Met behulp van ECN-formule en principal component analysis (PCA) werden de potentiële stammen geanalyseerd onder gesimuleerde omgevingsdruk om het proces van het opzetten en screenen van de EPF-bibliotheek te voltooien. Vervolgens werd de pathogeniciteit van veelbelovende EPF-stammen getest op de doelplaag (bijv. Spodoptera litura). Het huidige protocol integreert thermotolerantie en conidiale productiegegevens in de ECN-formule en PCA-analyse, die kunnen worden gebruikt als een standaardrangschikkingssysteem voor EPF-gerelateerd onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het hele stroomdiagram is weergegeven in figuur 1.
1. Isolatie en selectie van potentiële entomopathogene schimmels (EPF)
- Verzamel het bodemmonster
- Verwijder 1 cm van de oppervlaktegrond en verzamel de grond vervolgens binnen de diepte van 5-10 cm met behulp van een schop van elke bemonsteringslocatie.
OPMERKING:Bemonsteringslocaties zouden een berg, bos of dunbevolkte gebieden zijn om de besmetting van kunstmatig besproeide EPF-stammen te voorkomen. Zorg ervoor dat gebieden voor het verzamelen van bodemmonsters op het oppervlak bedekt zijn met onkruid. Droge grond of vochtige grond is niet geschikt voor dit experiment. - Noteer de details van elke bemonsteringslocatie, inclusief GPS, hoogte, type veld, jaarlijkse temperatuur, jaarlijkse neerslag, verzameltijd (seizoen), bodemtype en pH-waarde.
- Verzamel 100 g van het bodemmonster in een plastic zak en bewaar het op kamertemperatuur als u het binnen 3 uur in het laboratorium aan het schimmelisolatieprotocol onderwerpt.
OPMERKING: Als het monster niet binnen 3 uur kan worden gebruikt, bewaar de grond dan bij kamertemperatuur in donkere omstandigheden. Als het experiment niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, kan het bodemmonster gedurende 1 week tot het begin van het protocol18,19 bij 4 °C worden bewaard.
- Verwijder 1 cm van de oppervlaktegrond en verzamel de grond vervolgens binnen de diepte van 5-10 cm met behulp van een schop van elke bemonsteringslocatie.
- Lok en isoleer de EPF met meelworm (Tenebrio molitor)
- Plaats 100 g van het bodemmonster in een plastic beker (dopdiameter = 8,5 cm, hoogte = 12,5 cm) en plaats vervolgens 5 meelwormen op het oppervlak van de grond bij kamertemperatuur in het donker gedurende 2 weken.
OPMERKING: Andere soorten plastic bekercontainers kunnen ook worden gebruikt. Als de grond te droog is (gebarsten of zanderig), spuit dan gesteriliseerde ddH2O (ongeveer 5-10 ml) op de grond. De lichaamslengte c.a. 2,5 cm (14e instar) van T. molitor larven helpt bij schimmelisolaatschermen20. - Observeer en registreer de larven dagelijks voor sterfte en mycose; bewaar de dode larven in de beker tot 2 weken voor schimmelisolatie.
OPMERKING: De schimmel conidia-sporen in de bodemmonsters zullen zich tijdens het bovenstaande proces aan de meelwormlarven hechten. De schimmelmycose zal worden waargenomen als de schimmeldraden uit het intersegmentale membraan groeien en vervolgens zal het hele lichaam bedekt zijn met het mycelium. Sporulatie begint na 7 dagen en de kleur van de schimmelinfectie zal veranderen in de kleur van de conidia-massa. - Breng de dode insecten over naar een schone bank en gebruik een steriele tandenstoker om de conidia te verzamelen. Streel ze op een kwart sterkte Sabouraud dextrose agar medium (1/4 SDA) plaat (55 mm) in het laboratorium21. Incubeer de kweekplaat bij 25 °C gedurende 7 dagen om de primaire kweek van schimmels te verkrijgen.
OPMERKING: De 1/4 SDA-plaat wordt als volgt bereid: Meng 1,5 g Sabouraud dextrose-bouillon en 3 g agar in 200 ml H2O en steriliseer vervolgens gedurende 20 minuten. Aliquot 1/4 SDA in elke 55 mm petrischaal voordat het stolt. De gestolde 1/4 SDA-platen worden tot gebruik bij 4 °C bewaard. - Streep elke primaire cultuurschimmel opnieuw op één 55 mm 1/4 SDA-plaat in een laminaire stroom en incubeer de kweekplaat bij 25 °C gedurende 7 dagen om enkele kolonies schimmels te verkrijgen.
- Herhaal deze herisolatie ~ 2-3 keer en observeer onder lichtmicroscopie om enkele en zuivere morfologische schimmelkolonies te verkrijgen.
OPMERKING: Isoleer alle EPF met behulp van T. molitor-bait en bewaar zoals beschreven in de volgende sectie. De scheiding, conservering, zuivere cultuur en strepering moeten in een laminaire stroom in de volgende secties worden uitgevoerd.
- Plaats 100 g van het bodemmonster in een plastic beker (dopdiameter = 8,5 cm, hoogte = 12,5 cm) en plaats vervolgens 5 meelwormen op het oppervlak van de grond bij kamertemperatuur in het donker gedurende 2 weken.
- Bewaar de EPF-isolaten
- Snijd 3 van de 5 mm agarblokken aan de rand van elke geïsoleerde zuivere schimmelgekweekte plaat met een kurkboorder en plaats deze in een microcentrifugebuis van 1,5 ml als één replica.
OPMERKING: Drie replicaties voor elk schimmelisolaat worden aanbevolen voor de opslag van de EPF-stammen na de 2e virulentietest. Moleculaire identificatie wordt ook aanbevolen als de opslagruimte beperkt is. - Voeg 250 μL 0,03% oppervlakteactieve stofoplossing (materiaaltabel) en 250 μL 60% glycerol toe aan de microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een micropipette; dan vortex gedurende 10 s.
- Sluit de microcentrifugebuis van 1,5 ml af met paraffinefilm en koel deze gedurende 24 uur voor in een koelkast van -20 °C. Breng vervolgens de voorgekoelde schimmelvoorraden over naar een koelkast van -80 °C voor cryopreservatie.
OPMERKING: Extra zuivere kalkkweekplaten (afgezien van de cryo-geconserveerde monsters) werden gebruikt in rubriek 1.4.
- Snijd 3 van de 5 mm agarblokken aan de rand van elke geïsoleerde zuivere schimmelgekweekte plaat met een kurkboorder en plaats deze in een microcentrifugebuis van 1,5 ml als één replica.
- 1e pathogeniteitsscreening voor schimmelisolaten
- Plaats vijf T. molitorlarven direct op het oppervlak van elke zuivere schimmelkweekplaat bij 25 °C.
- Observeer en registreer de mycose en mortaliteit gedurende 10 dagen. Selecteer het schimmelisolaat voor verdere analyse.
OPMERKING: Schimmelisolaten die 100% sterfte veroorzaken, worden geselecteerd voor de 2e virulentietest om hun virulentie voor T. molitorlarven te bevestigen. Als alternatief kan de onderzoeker de criteria aanpassen volgens zijn eigen studie.
- 2e virulentietest van schimmelisolaten
OPMERKING: Herstel op basis van het 1e pathogeniciteitsonderzoek de geselecteerde schimmelisolaten van -80 °C voor de 2e virulentietest. Het doel van de 2e virulentietest is het kwantificeren van de pathogeniciteit van de geselecteerde schimmelisolaten na de 1e screeningsronde.- Oogst conidia van elk schimmelisolaat door gedurende 1 minuut te vortexen en tel het aantal conidia met behulp van een hemocytometer.
- Stel de conidia-suspensie in op een concentratie van 1 x 107 conidia/ml in een oppervlakteactieve oplossing van 0,03% (materiaaltabel).
- Verdeel 10 μL van de schimmelsuspensie over 55 mm 1/4 SDA-platen en kweek gedurende 7 dagen bij 25 °C in het donker.
- Plaats vijf T. molitorlarven direct op het oppervlak van elke zuivere schimmelkweekplaat (c.a. 6 x 107 conidia). Sluit de platen af met paraffinefilm en incubeer bij 25 °C in het donker.
- Observeer en registreer de mycose en mortaliteit gedurende 10 dagen.
- Herhaal de test (van stap 1.51 tot 1.5.5) in drievoud voor elk schimmelisolaat.
OPMERKING: Schimmelisolaten die 100% sterfte veroorzaken, worden geselecteerd voor de 3e virulentietest om hun virulentie te bevestigen om de plaag aan te pakken.
- 3e virulentietest van schimmelisolaten voor doelplaag (Spodoptera litura als voorbeeld)
- Herhaal stap 1.5.2 tot en met 1.5.6 met geselecteerde isolaten uit de 2e virulentie om virulentie tegen doelplaag te testen.
- Bereken de LT50 van elk schimmelisolaat22.
OPMERKING: De LT50 van elk schimmelisolaat werd berekend door middel van gegeneraliseerde lineaire modellen (GLM's) met behulp van R studio (versie 3.4.1); de quasibinomiale foutverdeling en een loglinkfunctie kunnen worden gebruikt om rekening te houden met overdispersie.
2. Moleculaire identificatie van EPF
- Extractie van schimmel genomisch DNA
- Verzamel c.a. 1 cm2 EPF van de 7-daagse 1/4 SDA plaat.
- Extraheer het schimmelgenomische DNA met behulp van een schimmelgenomische DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant23 (Tabel met materialen).
- PCR-amplificatie en DNA-sequencing
- Versterk het ITS-gebied van Fungal met PCR van het DNA-monster21 met behulp van de PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R primer set24 (tabel 1) met het volgende PCR-programma: 94 °C gedurende 1 minuut en vervolgens 35 cycli van 94 °C voor 30 s, 55 °C voor 30 s en 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlenging van 7 minuten bij 72 °C.
OPMERKING: De ITS1F/ITS4R primer set is voor de identificatie op genusniveau. - Sequentieer de PCR door commerciële sequencingservice.
- Gebruik NCBI BLAST zoeken naar vergelijkbare schimmels in de NCBI-database en selecteer de relatieve schimmeltypesoorten voor fylogenetische analyse.
OPMERKING: De schimmelsoorten die behoren tot het geslacht Metarhizium of Beauveria moeten verder worden geïdentificeerd tot het soortniveau met tef-983F/tef-2218R primer set25 (herhaal stappen 2.1.1 tot 2.2.3). Voor schimmels die niet tot de geslachten Metarhizium of Beauveria behoren, kunnen andere moleculaire markers worden gebruikt om de soort te identificeren, waaronder DNA-lyase (APN2), bèta-tubuline (BTUB), RNA-polymerase II grootste subeenheid (RPB1), RNA polymerase II tweede grootste subeenheid (RPB2) en 3'-deel van translatie-elongatiefactor 1 alfa (TEF)25,26 .
- Versterk het ITS-gebied van Fungal met PCR van het DNA-monster21 met behulp van de PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R primer set24 (tabel 1) met het volgende PCR-programma: 94 °C gedurende 1 minuut en vervolgens 35 cycli van 94 °C voor 30 s, 55 °C voor 30 s en 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlenging van 7 minuten bij 72 °C.
- Fylogenetische analyse
- Gebruik ClustalX 2.1 software27 om de meerdere sequenties uit stap 2.2.2 en 2.2.3 uit te lijnen. Snijd het geconserveerde sequentiegebied handmatig bij met GeneDoc28.
- Voer de fylogenetische analyse uit met MEGA7 software29 op basis van de methoden minimale evolutie (ME), Neighbor-Joining (NJ) en maximale waarschijnlijkheid (ML).
OPMERKING: Het uitvoeren van alle drie de methoden kan helpen om de classificatiestatus te bevestigen en nauwkeurig af te ronden. De schimmelisolaten gescreend door de 1e pathogeniciteitsscreening worden gebruikt voor moleculaire identificatie op geslachtsniveau. De schimmelisolaten gescreend door de 2e virulentietest worden gebruikt voor de moleculaire en morfologische identificatie op soortniveau.
3. Morfologische identificatie van EPF
- Observatie van de morfologie van de schimmelkolonie
- Gebruik een camera om de groei van de schimmelcultuurkolonie gedurende 7 dagen vast te leggen en registreer de groei, vorm (pluizig, stevig) en kleur van de kolonies.
- Observatie van conidia en conidioforen
- Schraap conidia uit de zuivere cultuurschimmelkolonie met een inentingslus en breng de sporen over naar een glasplaat met 0,1% Tween 80-oplossing. Bedek vervolgens met een coverslip voor lichtmicroscopische observatie van conidia.
- Gebruik een scalpel om een 5 mm2 agarblok van de hyphalstreng aan de rand van de schimmelkolonie te snijden en breng het agarblok vervolgens over op een glazen dia.
- Voer de reiniging als volgt uit: Voeg de 0,1% Tween 80-oplossing toe aan het agarblok met een plastic druppelaar en was het grootste deel van de overtollige conidia af met een pincet. Bedek het vervolgens met een coverslip voor lichtmicroscopische observatie.
OPMERKING: 0,1% Tween 80 kan worden vervangen door een andere krachtigere oppervlakteactieve stof (Tabel van materialen), afhankelijk van schimmelsoorten en hydrofobiciteit. - Meet en noteer de breedte en lengte van de conidia en conidioforen om de verschillen tussen verschillende schimmelisolaten te vergelijken.
- Gebruik Welch's ANOVA-test en Games-Howell-test (post-hoc test) om de conidiale breedte en lengte van elke soort te analyseren met behulp van R studio (versie 3.4.1).
OPMERKING: Gegevensanalyse van morfologische tekens kan per geval worden aangepast. De schimmelisolaten gescreend met de 3e virulentietest worden gebruikt voor de fysiologische karakterisering en ECN-ranking in secties 4 en 5.
4. Onderzoek naar conidiale productiviteit en thermotolerantie
- Conidiale productietest
- Kweek het geselecteerde schimmelisolaat op 1/4 SDA medium bij 25 ± 1 °C in het donker gedurende 10 dagen.
- Bereid 1 ml van de conidiale suspensie van het schimmelisolaat in 0,03% oppervlakteactieve oplossing en pas aan tot 1 x 107 conidia / ml zoals hierboven beschreven.
- Laat drie druppels van 10 μL conidiale suspensie vallen op 1/4 SDA en incubeer bij 25 °C in het donker gedurende 7, 10 en 14 dagen om de sporulatie van schimmels te tellen.
OPMERKING: 10 μL is het beste volume om het blok van 5 mm te verzamelen met gelijkmatige schimmelsporulatie na schimmelgroei gedurende 7-14 dagen. - Gebruik de kurkboorder om het agarblok van 5 mm los te maken van het midden van de kolonie en over te brengen in 1 ml 0,03% oppervlakteactieve oplossing (materiaaltabel) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml op elk tijdstip.
- Vortex de buis bij 3.000 tpm bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en gebruik een hemocytometer om het aantal conidia te tellen.
OPMERKING: De formule die wordt gebruikt voor het tellen is het aantal conidia per 25 vierkanten van de kleinste cel (grootte = 0,025 mm2; kamerdiepte = 0,1 mm):
Totaal aantal conidia op 5 vierkanten ÷ 80 × (4 × 106) - Herhaal dit drie keer voor elke isolatie.
- Thermotolerance assay
- Kweek het geselecteerde schimmelisolaat op 1/4 SDA medium bij 25 ± 1 °C in het donker gedurende 10 dagen.
- Bereid 1 ml van de conidiale suspensie van schimmelisolaat in 0,03% oppervlakteactieve oplossing en pas aan tot 1 x 107 conidia / ml zoals hierboven beschreven.
- Vortex de conidiale suspensie en verwarm deze in een droog bad van 45 °C gedurende 0, 30, 60, 90 en 120 min. Laat drie druppels van 5 μL van de conidiale suspensie vallen op 55 mm 1/4 SDA-medium op elk tijdstip na blootstelling aan hitte en incubeer bij 25 ± 1 °C gedurende 18 uur.
OPMERKING: Vermijd het verspreiden van de schimmeldruppels om beter te kunnen focussen op het gebied. - Tel het aantal gekiemde conidia-sporen met vijf willekeurig geselecteerde velden onder 200x lichtmicroscopie om de kiemkracht te bepalen.
- Voer drie replicaties uit voor elk isolaat.
5. Effectieve conidia nummer (ECN) ranking
- ECN berekening
OPMERKING: Verkrijg de conidiale productie- en thermotolerantiegegevens van elke potentiële schimmelstam voordat u het totale ECN21 berekent.- Bereken de vouwverandering (FC) van conidiale productie op elk tijdstip:
waarbij x = tijdstip voor gegevensverzameling; ncp = aantal conidia na elke dag van groei; en I = beginnummer van gezaaide conidia. - Bereken het conidiagetal onder de stressbehandeling op elk tijdstip met behulp van de volgende formule:
waarbij, y = het ECN van het te behandelen tijdstip; TT0 = de kiemsnelheid van conidia die geen hittestress ondergaan (= kiemsnelheid van 0 min warmtebehandeling); TTz = spanningscoëfficiënt is de conidia kiemsnelheid op verschillende tijdstippen van warmtebehandeling (z). - Bereken het totale ECN met behulp van de volgende formule:
- Vergelijk het ECN van elke schimmelstam.
- Bereken de vouwverandering (FC) van conidiale productie op elk tijdstip:
- Principal component analysis (PCA) van schimmelstammen
OPMERKING:De PCA-analyse bevestigt de rangschikking van ECN en helpt bij het begrijpen van de correlatie tussen de fysiologische karakterwaarden. Vergelijk de ECN-waarden en selecteer EPF-isolaten met hogere ECN-waarden. - Gebruik R-software om PCA te maken door te coderen:
#Input PCA-gegevensbestand
a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)- # Verwerking van voorbeeldgegevens
row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
X=rij.namen(a)
df<- a[2:11] - #PCA berekening
pca <- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE)
vars <- (pca$sdev)^2
pc1_percent = vars[1] / som(vars)
pc2_percent = vars[2] / som(vars)
waarde = pca$x - #Output PCA visualisatie bestand
png(file = 'pca.png', hoogte = 2000, breedte = 2000, res = 300)
OPMERKING: Gebruik 7 tot 14 dagen conidiale productie en alle thermotolerantiegegevens om principal component analysis (PCA) uit te voeren voor het bevestigen van de ECN-ranking.
- # Verwerking van voorbeeldgegevens
- Selecteer de best presterende schimmelstammen op basis van ECN of PCA en voer de virulentietest van doelplagen uit voor verder onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolatie en selectie van potentiële entomopathogene schimmels (EPF)
Door gebruik te maken van de Tenebrio molitor-gemedieerde Entomopathogene schimmels (EPF) bibliotheekconstructiemethode, zou het aantal schimmels zonder insectendodende activiteit worden uitgesloten; zo zou de isolatie-efficiëntie en selectie van EPF grotendeels kunnen worden verhoogd. Tijdens de toepassing van deze methode werd de informatie over bemonsteringslocaties, bodemmonsters en de kiemkracht van schimmels geregistreerd (tabel 2). Op basis van onze eerdere gegevens werden in totaal 101 schimmelisolaten verkregen uit 172 bodemmonsters, wat wijst op een hoge isolatie-efficiëntie van 64%. Van de 101 schimmelisolaten vertoonden 26 isolaten insecticide activiteit tegen T. molitor (100% mortaliteit) na de 1e pathogeniciteitsscreening, vandaar dat de eliminatie van schimmelisolaten 26/101 = 25,7% was. In de 2e virulentietest werd de hoge virulentie van de 26 schimmelisolaten tegen T. molitor verder aangetoond, waarvan er 12 een hoge pathogeniciteit vertoonden tegen de T. molitorlarven (100% mortaliteit 5 dagen na inenting) (figuur 2A). Deze werden gebruikt om de virulentietest tegen de landbouwplaag te evalueren. Op basis van de gegevens van de 3e virulentieteststerfte en LT50 onthulden in totaal zes schimmelisolaten (NCHU-9, 11, 64, 69, 95 en 113) een snelle insectendodende activiteit tegen Spodoptera litura (LT50 = 2,94, 2,22, 2,84, 2,57, 2,96 en 1,13), beoordeeld met behulp van de fysiologische test en het effectieve conidiagetal (ECN) (figuur 2B).
Moleculaire identificatie van EPF
Om de taxonomische posities van schimmels beter te begrijpen, werden 26 isolaten uit de 1e pathogeniciteitsscreening onderworpen aan moleculaire analyse op basis van het ITS-gebied (figuur 3A). Het resultaat toonde aan dat deze schimmelisolaten duidelijk konden worden onderverdeeld in zeven geslachten, waaronder Beauveria, Clonostachys, Fusarium, Cordyceps, Penicillium, Purpureocillium en Metarhizium (figuur 3A). Op basis van het ITS1-5.8S-ITS2-gebied werd de geslachtsclassificatie van EPF nauwkeurig bevestigd, terwijl het soortniveau nog steeds niet van elkaar te onderscheiden is. Daarom wordt de volgorde van het tef-gebied gebruikt om het soortniveau voor 12 veelbelovende EPF-isolaten uit de virulentietest tegen de landbouwplaag duidelijk te classificeren. De moleculaire identificatie van de 12 isolaten toonde aan dat 11 isolaten tot Metarhizium behoren en vier soorten bevatten, waaronder M. lepidiotae (NCHU-9, NCHU-102), M. pinghaense (NCHU-10, NCHU-11, NCHU-30, NCHU-32, NCHU-64), M. brunneum (NCHU-27, NCHU-29) en M. anisopliae (NCHU-69, NCHU-95). Het resterende isolaat werd geïdentificeerd als B. australis (NCHU-113) (figuur 3B,C). Volgens het bovenstaande resultaat kan het sequentiegebied van tef het geslacht Metarhizium effectief onderscheiden op soortniveau, terwijl andere soorten andere sequentiegebieden moeten vinden als moleculaire markers om de soort te onderscheiden.
Morfologische identificatie van EPF
Door de reinigingsmethode (stap 3.2.3) van morfologische waarnemingen van schimmels konden de structuren van conidioforen duidelijk worden gezien met 0,1% Tween 80-oplossing (figuur 4A), en deze waarnemingen konden dienen als een benchmark om de grootte van de structuur te meten en een fotorecord te maken. De kleur, vorm en rangschikking van de conidia kan worden gezien door microscopische waarnemingen van de kolonie conidia (figuur 4B, C). Na observatie konden de maten conidia en conidiofore vormen verder worden gemeten en statistisch worden vergeleken (tabel 3).
Onderzoek naar conidiale productiviteit, thermotolerantie en ECN-ranking
De ECN-formule, die in het vorige rapport21 werd voorgesteld, zou kunnen helpen bij de selectie van een op EPF gebaseerde fysiologische aard met hoge stresstolerantie. Het ECN combineert de conidiaproductie- en thermotolerantiegegevens van elke EPF (figuur 5A,B), wat een hoge levensvatbaarheid van schimmelstam betekent wanneer de ECN-waarde hoog is (figuur 5). Bovendien werd de visualisatie van de principal component analysis (PCA) gebruikt om de resultaten van de ECN-formule te verifiëren. Het resultaat onthulde een hoge coördinatie tussen PCA en ECN, wat suggereert dat de ECN-formule kan worden gebruikt om de hiërarchie van levensvatbaarheidsgerelateerde parameters en ontwikkelingspotentieel van schimmels voor veldtoepassing en verdere commercialisering te evalueren (figuur 5C, D).
Figuur 1: Illustratie van tenebrio molitor-gemedieerde entomopathogene schimmels (EPF) bibliotheekconstructie. Deel 1: Schimmelisolatie uit bodemmonster; Deel 2: Screening op basis van pathogeniteit en virulentie en schimmelidentificatie; Deel 3. Fysiologische karakterisering en schimmelrangschikking. ECN = Effectief conidiagetal; en PCA = Principal component analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mortaliteit van meelwormen en Spodoptera litura voor selectie van veelbelovende entomopathogene schimmels (EPF) isolaten. (A) 26-geselecteerde schimmel 2e meelworm virulentietest; De mycosen van 12 sneldodende en hoge virulentie schimmelisolaten worden parallel weergegeven. (B) 12 schimmelisolaten werden geselecteerd voor virulentietest tegen S. litura. De test op elke schimmelstam werd drie keer herhaald. d.p.i. = dagen na inenting. Gewijzigde figuur en legende gereproduceerd met toestemming van de Fronteris21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De fylogenetische analyse van entomopathogene schimmels (EPF) stammen op (A) geslachtsniveau op basis van ITS-regio en (B-C) soortniveau op basis van tef. De fylogenetische analyse van ITS-regio en tef werd geconstrueerd met behulp van de maximale waarschijnlijkheid (ML), minimale evolutie (ME) en neighbor-joining (NJ) methoden. Bootstrap-analyses werden uitgevoerd om de robuustheid van de fylogenieën te evalueren met behulp van 1.000 replicaties, en bootstrapverhoudingen van meer dan 50% worden hierboven aangegeven. Vet = Ex-type soorten. De rode en groene pijlen geven de veelbelovende EPF aan. Gewijzigde figuur en legende gereproduceerd met toestemming van de Fronteris21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Microscopisch onderzoek van entomopathogene schimmels (EPF) (M. anisopliae) morfologie. Observatie van conidioforen (A) na het wassen. (B) De waarneming van conidia vorm en kleur. (C) Opstelling van conidia en bundels sporenreeksen (SS) van M. anisopliae; Cp = conidioforen; cc = cilindrisch conidia. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Fysiologische karakterisering van zes potentiaalisolaten en de effectieve conidiagetalanalyse (ECN). (A) Conidiale productietest. (B) Thermotolerance assay. (C) De staafplot van ECN-waarden. D) Uit de analyse van de belangrijkste componenten bleek de verdeling van elke stam. Gewijzigde figuur en legende gereproduceerd met toestemming van de Fronteris21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Primer naam | Amplicon Grootte (bp) | Volgorde(5'-3') | Regio | Referentie | |
| ITS1F | 550 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | ZIJN | 25 | |
| ITS4R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||||
| tef-983F | 1000 | GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT | Tef | 26, 27, 41, 42 | |
| TEF-2218R | ATGACACCRACRGCRACRGTYTG | ||||
Tabel 1: Primerparen voor schimmelidentificatie.
Tabel 2: De parameters die zijn vastgelegd voor de tenebrio molitor-gemedieerde EPF-bibliotheekconstructiemethode worden hieronder vermeld. NIU = de campus van de National Ilan University. NCHU = de campus van de National Chung Hsing University. Gewijzigde tabel en legenda gereproduceerd met toestemming van de Fronteris21. Klik hier om deze tabel te downloaden.
| Soort | Zeven | Phialides μm±SD* | Conidia μm±SD* |
| Metarhizium lepidiotae | | NCHU-9 | Cilindrisch, 7.3±0.67b×2.4±0.36a | Cilindrisch, 6.5±0.45a×2.7±0.13b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-11 | Cilindrisch, 8.6±0.68ab×2.6±0.30a | Cilindrisch, 6.3±0.41b×2.7±0.16b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-64 | Cilindrisch, 10.5±1.54a×2.4±0.32a | Cilindrisch, 6.8±0.53a×2.9±0.31a |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-69 | Cilindrisch, 9.4±1.58a×2.7±0.32a | Cilindrisch, 6.3±0.34b×2.6±0.19b |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-95 | Cilindrisch, 9.6±0.87a×2.6±0.29a | Cilindrisch, 6.0±0.82b×2.9±0.29a |
| Beauveria australis | NCHU-113 | Ellipsoïde, NA×2.6±0.57 | Globose, 2.3±0.24×2.3±0.24 |
| *Statistische analyse werd uitgevoerd op basis van de ANOVA-test van de Welch met behulp van R studio. | |||
| § Gewijzigde tabel en legenda gereproduceerd met toestemming van de Fronteris (23). | |||
Tabel 3: Een voorbeeld van morfologische waarnemingen van zes veelbelovende entomopathogene schimmelisolaten. Statistische analyse werd uitgevoerd op basis van de ANOVA-test van de Welch met behulp van R studio. Gewijzigde tabel en legenda gereproduceerd met toestemming van de Fronteris21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Entomopathogene schimmels (EPF) zijn gebruikt voor insectenbestrijding. Er zijn verschillende methoden om EPF30,31,32 te isoleren, selecteren en identificeren. Bij het vergelijken van de verschillende soorten insectenaasmethoden werden Beauveria bassiana en Metarhizium anisopliae vaak aangetroffen in insectenaas6,12,13,14. Onder deze insectenaas vertoonden Galleria mellonella en Tenebrio molitor hoge herstelpercentages van Beauveria en Metarhizium spp. In feite werd het nut van de meelworm (T. molitor)-aasmethode aangetoond als een gemaksmethode voor het isoleren van EPF uit bodemmonsters17,21. Niettemin is gemeld dat gebruikte insecten als aas de bias zouden vertonen om specifieke schimmelsoorten te isoleren3,33. Daarom kan een combinatie van verschillende insectensoorten (d.w.z. Galleria mellonella en T. molitor samen) om de EPF uit de bodemmonsters te lokken, de diversiteit van EPF34 vergroten.
Om de insectendodende activiteit te evalueren, zijn er twee screeningsrondes door meelworm (T. molitor) in het huidige protocol om de veelbelovende schimmelstammen te selecteren voor verder onderzoek. Na dit proces zou het aantal schimmelisolaten, die worden geïsoleerd uit bodemmonsters, drastisch kunnen worden verminderd en beperkt tot schimmelisolaten die na de 1e en 2e screening een hoge insecticide activiteit vertoonden. Grote reductie van de schimmelisolaten voor de volgende screeningsronde bespaart tijd kosten en arbeidsintensief. Er kan ook worden opgemerkt dat de geselecteerde schimmelisolaten vergelijkbare trends van pathogeniciteit vertoonden tussen meelworm (T. molitor) en tabakssnijworm (Spodoptera litura), wat een consistente test van pathogeniciteit van verschillende insectensoorten aantoont en verder kan worden uitgebreid tot andere gewasplagen21. Bovendien zou de berekening van het ECN op basis van de fysiologische tests de selectie van potentiële schimmelstammen voor gebruik in akkers kunnen vergemakkelijken. Soortgelijke selectieve methoden werden genoemd in andere rapporten, terwijl de factoren zoals abiotische en stamkenmerken niet zijn opgenomen12,8,31,35,36,37. Daarom kunnen deze stammen worden beïnvloed door omgevingsfactoren die resulteren in een invloed op de prestaties van schimmelkieming en daardoor moeilijk te commercialiseren. Dit gevolg is ook de belangrijkste reden voor de niet-toepasbaarheid van laboratoriumstammen in het veld38.
Vanuit de morfologische identificatie moeten verdere inspanningen worden gericht op het vinden van de duidelijke structuur van conidiofore en het observeren van de verschillende kenmerken van elke schimmelstam. Studies kunnen verschillende methoden omvatten voor het oplossen van de moeilijke morfologische identificatie39. De morfologische identificatie slaagt er echter niet in om nauw verwante schimmelsoorten te onderscheiden; daarom is het noodzakelijk om de gegevens van moleculaire identificatie te integreren. Het interne getranscribeerde spacer (ITS) -gebied toonde de discriminatie op geslachtsniveau, terwijl andere moleculaire markers (d.w.z. tef voor Metarhizium, blok voor Beauveria) nodig zijn voor de identificatie op soortniveau26,40,41.
In de fysiologische karakterisering, om de standaarddeviatie van de experimenten te verminderen, wordt de machine of handmatige vortex gedurende ten minste 10 minuten bij maximaal toerental voorgesteld21. Grondig gemengde conidia-suspensie zou de consistentie van de resultaten van de thermotolerantietest en conidiale productietest verhogen. Aan de andere kant, in de conidiale productietest, het getelde conidia-getal onder een vast gebied (5 mm blok in het centrale deel van de schimmelkolonie in deze studie) op de gekweekte plaat op verschillende tijdstippengroei, riep het probleem op dat verschillende schimmelsoorten en zelfs verschillende stammen verschillende prestaties van de groeicompactiviteit van de schimmeldraden onthulden, wat kan leiden tot de niet-representativiteit van de steekproef. Daarom kan een rigoureuze testmethode voor conidia-productie het probleem verbeteren, zoals het nauwkeurig tellen van het aantal conidia van de hele schimmelkolonie en normaliseren met het groeigebied42.
De effectieve conidia-getalformule (ECN) is ontworpen op basis van de invloed van omgevingsstress op EPF conidia, dat wil zeggen, simuleer conidia onder de conditie van een wilde omgeving om de veelbelovende schimmelstammen te selecteren voor commercialisering21. In dit protocol werden de gegevens van conidiaproductie en warmtebehandeling gebruikt voor de berekening van de totale ECN-waarde van elke veelbelovende schimmelstam, na de vorige studie21. Verder kunnen onder een natuurlijke omgeving, behalve de temperatuur, andere omgevingsstress, zoals vochtigheid, ultraviolette straling (UV) en gastheer de conidia-kieming beïnvloeden. Vooral de UV-stress is een belangrijke factor die de conidia-kieming beïnvloedt, omdat de hoogenergetische vrije radicalen (zoals peroxiden, hydroxylgroepen en singletzuurstof) die door UV worden gegenereerd, de pathogeniciteit en de persistentie van microbiële pesticiden kunnen verminderen43. Zo zou UV-stress in de toekomst verder in de ECN-formule kunnen worden opgenomen. Om UV-stress te voorkomen, moet de formule olie of natriumalginaat bevatten om de UV-tolerantie van conidia44,45,46 te verhogen, wat bevestigt dat potentiële stammen praktisch zijn voor ongediertebestrijding47.
Het huidige protocol voorzag in een methode voor snelle en nauwkeurige isolatie van potentiële EPF-stammen om de T. molitor-gemedieerde EPF-bibliotheek te construeren. Dit is de basis en is noodzakelijk voor de ontwikkeling van biologisch bestrijdingsonderzoek. Bovendien kan de ECN-formule flexibel worden verbeterd om onderzoekers te helpen het potentieel van EPF te begrijpen en het te ontwikkelen tot een grondstof voor gebruik in landbouwsystemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling bij dit werk.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , Frederiksberg Denmark. Department of Ecology 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The 'Galleria bait method'for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D. Manual of Techniques in Insect Pathology. Lacy, L. , Academic. Amsterdam. 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Fungal database WorldWide Collection of Entomopathogenic Fungi. University of Vermont. , Available from: http://www.uvm.edu/~entlab/Fungus.html (2019).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17. , Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- National Resource for Biomedical Supercomputing. GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Pittsburgh Supercomputing Center's National Resource for Biomedical Supercomputing. , Available from: http://www.nrbsc.org/downloads (1997).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -Y., Choi, J. -B., Bae, S. -M., Koo, H. -N., Woo, S. -D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method'as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. Manual of techniques in insect pathology. , Elsevier. 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
