Summary
Her presenterer vi en protokoll basert på måltidsorm (Tenebrio molitor)-agnsystem som ble brukt til å isolere og velge entomopathogene sopp (EPF) fra jordprøver. En effektiv conidia nummer (ECN) formel brukes til å velge høy stress tolerant EPF basert på fysiologiske egenskaper for mikrobiell kontroll i feltet.
Abstract
Entomopathogene sopp (EPF) er et av de mikrobielle kontrollmidlene for integrert skadedyrshåndtering. For å kontrollere lokale eller invasive, er det viktig å isolere og velge urfolk EPF. Derfor ble jordagnmetoden kombinert med insektet agn (mealworm, Tenebrio molitor) -systemet brukt i denne studien med noen modifikasjoner. Den isolerte EPF ble deretter utsatt for virulenstesten mot landbruksskaden Spodoptera litura. Videre ble de potensielle EPF-stammene utsatt for morfologiske og molekylære identifikasjoner. I tillegg ble conidiaproduksjonen og termototoleranseanalysen utført for de lovende EPF-stammene og sammenlignet; Disse dataene ble videre erstattet i formelen for effektivt conidia-nummer (ECN) for laboratorierangering. Jordagn-måltidsormsystemet og ECN-formelen kan forbedres ved å erstatte insektarter og integrere flere stressfaktorer for evaluering av kommersialisering og feltapplikasjon. Denne protokollen gir en rask og effektiv tilnærming for EPF-seleksjon og vil forbedre forskningen på biologiske kontrollmidler.
Introduction
For tiden er entomopathogene sopp (EPF) mye brukt i mikrobiell kontroll av landbruks-, skog- og hagebruk. Fordelene med EPF er dets brede vertsområder, god miljøtilpasning, miljøvennlig natur, og at den kan brukes med andre kjemikalier for å vise den synergistiske effekten for integrert skadedyrshåndtering1,2. For applikasjonen som skadedyrsbekjempelsesmiddel er det nødvendig å isolere et stort antall EPF fra enten syke insekter eller det naturlige miljøet.
Prøvetakingen av disse organismene fra vertene bidrar til å forstå den geografiske utbredelsen og prevalensen av EPF hos naturlige verter3,4,5. Imidlertid er samlingen av soppinfiserte insekter vanligvis begrenset av miljøfaktorer og insektpopulasjoner i feltet4. Tatt i betraktning at insektverter vil dø etter EPF-infeksjon og deretter falle i jorden, kan isolering av EPF fra jordprøver være en stabil ressurs3,6. For eksempel er saprofytter kjent for å bruke den døde verten som sin ressurs for vekst. Jordagn og selektive mediumsystemer har blitt mye brukt til å oppdage og isolere EPF fra jorda3,4,7,8,9,10.
I den selektive mediummetoden er den fortynnede jordløsningen belagt på et medium som inneholder bredspektret antibiotika (f.eks. kloramfenikol, tetracyklin eller streptomycin) for å hemme veksten av bakterier2,3,9,11. Det har imidlertid blitt rapportert at denne metoden kan forvrenge stammens mangfold og tetthet og kan forårsake en over- eller underestimering av mange mikrobielle samfunn6. Videre er de isolerte stammene mindre patogene og konkurrerer med saprofytter under isolasjon. Det er vanskelig å isolere EPF fra den fortynnede jordløsningen3. I stedet for å bruke et selektivt medium, isolerer jordagnmetoden EPF fra de infiserte døde insekter, som kan lagres i 2-3 uker, og gir dermed en mer effektiv og standard EPF-separasjonsmetode3,4,7,6. Fordi metoden er enkel å betjene, kan man isolere en rekke patogene stammer til en lav pris4. Derfor er det mye brukt av mange forskere.
Ved sammenligning av de forskjellige typer insektagnsystemer er Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae de vanligste EPF-artene som finnes i insekter som tilhører Hemiptera, Lepidoptera, Blattella og Coleoptera6,12,13,14. Blant disse insekt baits, Galleria mellonella (rekkefølge Lepidoptera) og Tenebrio molitor (orden Coleoptera) viser høyere utvinning rater av Beauveria og Metarhizium spp., sammenlignet med andre insekter. Derfor brukes G. mellonella og T. molitor ofte til insekt baiting. Gjennom årene har USAs landbruksdepartement (USDA) etablert et EPF-bibliotek (Agricultural Research Service Collection av EPF-kulturer, ARSEF) som inneholder et bredt utvalg av arter, inkludert 4081 arter av Beauveria spp., 18 arter av Clonostachys spp., 878 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., og 13 arter av Pochonia spp. blant andre15. Et annet EPF-bibliotek ble konstruert av Entomology Research Laboratory (ERL) fra University of Vermont i USA i ca. 30 år. Det inkluderer 1345 stammer av EPF fra USA, Europa, Asia, Afrika og Midtøsten16.
For å kontrollere lokale eller invasjon i Taiwan, er det nødvendig med isolasjon og valg av urfolk EPF. Derfor, i denne protokollen, har vi modifisert og beskrevet prosedyren for jordagnmetoden og kombinert den med insektet agn (mealworm, Tenebrio molitor) system17. Basert på denne protokollen ble det opprettet et EPF-bibliotek. To runder med screening (kvantifisering av inokulering) ble utført for de foreløpige EPF-isolasjonene. EPF-isolasjoner viste patogenitet til insekter. De potensielle stammene ble utsatt for morfologiske og molekylære identifikasjoner og videre analysert av termototoleranse og konidial produksjonsanalyse. Videre ble det også foreslått et konsept med effektivt conidia-nummer (ECN). Ved hjelp av ECN-formel og hovedkomponentanalyse (PCA) ble de potensielle stammene analysert under simulert miljøtrykk for å fullføre prosessen med å etablere og screene EPF-biblioteket. Deretter ble patogenisitet av lovende EPF-stammer testet for målskade (f.eks. Spodoptera litura). Den nåværende protokollen integrerer termototoleranse og konidiale produksjonsdata i ECN-formelen og PCA-analysen, som kan brukes som et standard rangeringssystem for EPF-relatert forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Hele flytskjemaet vises i figur 1.
1. Isolasjon og utvalg av potensielle entomopathogene sopp (EPF)
- Samle jordprøven
- Fjern 1 cm av overflatejorden, og samle deretter jorda innenfor 5-10 cm dybde ved hjelp av en spade fra hvert prøvetakingssted.
MERK: Prøvetakingssteder vil være et fjell, en skog eller tynt befolkede områder for å unngå forurensning av kunstig sprayede EPF-stammer. Sørg for at arealer til jordprøvene er dekket med ugress på overflaten. Tørr jord eller fuktig jord er ikke egnet for dette eksperimentet. - Registrer detaljene for hvert prøveområde, inkludert GPS, høyde, felttype, årlig temperatur, årlig nedbør, innsamlingstid (sesong), jordtype og pH-verdi.
- Samle 100 g av jordprøven i en plastpose og vedlikehold den ved romtemperatur hvis den utsettes for soppisolasjonsprotokollen i laboratoriet innen 3 timer.
MERK: Hvis prøven ikke kan brukes innen 3 timer, må du oppbevare jorda ved romtemperatur under mørke forhold. Hvis eksperimentet ikke utføres umiddelbart, kan jordprøven lagres ved 4 °C i 1 uke til starten av protokollen18,19.
- Fjern 1 cm av overflatejorden, og samle deretter jorda innenfor 5-10 cm dybde ved hjelp av en spade fra hvert prøvetakingssted.
- Agn og isoler EPF med måltidsorm (Tenebrio molitor)
- Legg 100 g jordprøve i en plastkopp (cap diameter = 8,5 cm, høyde = 12,5 cm), og legg deretter 5 måltidsorm på jordens overflate ved romtemperatur i mørket i 2 uker.
MERK: Andre typer plastkoppbeholdere kan også brukes. Hvis jord er for tørr (sprukket eller sandaktig), spray sterilisert ddH2O (ca. 5-10 ml) på jorden. Kroppslengden c.a. 2,5 cm (14. instar) av T. molitor larver hjelper i sopp isolere skjermer20. - Observer og registrer larver daglig for dødelighet og mykose; hold de døde larver i koppen til 2 uker for soppisolasjon.
MERK: Svampekonidiasporen i jordprøvene festes til måltidsorm larver under prosessen ovenfor. Sopp mykose vil bli observert som hyphae vokse fra intersegmental membran, og da hele kroppen vil bli dekket med mycelium. Sporulering vil starte etter 7 dager, og fargen på soppinfeksjonen vil endres til fargen på conidiamassen. - Overfør de døde insekter til en ren benk og bruk en steril tannpirker for å samle conidia. Strekk dem på en kvart styrke Sabouraud dextrose agar medium (1/4 SDA) plate (55 mm) i laboratoriet21. Inkuber kulturplaten ved 25 °C i 7 dager for å oppnå den primære soppkulturen.
MERK: 1/4 SDA-platen fremstilles på følgende måte: Bland 1,5 g Sabouraud dextrose buljong og 3 g agar i 200 ml H2O, og steriliser deretter i 20 minutter. Aliquot 1/4 SDA i hver 55 mm Petri-tallerken før størkning. De størknede 1/4 SDA-platene lagres ved 4 °C til bruk. - Re-stripe hver primærkultur sopp på en 55 mm 1/4 SDA plate i en laminær strømning og inkubere kulturplaten ved 25 °C i 7 dager for å oppnå enkeltkolonier av sopp.
- Gjenta denne reisolasjonen ~ 2-3 ganger og observere under lysmikroskopi for å oppnå enkle og rene morfologiske soppkolonier.
MERK: Isoler all EPF ved hjelp av T. molitor-agn og oppbevar som beskrevet i følgende avsnitt. Separasjon, bevaring, ren kultur og striper må utføres i en laminær strømning i de etterfølgende seksjonene.
- Legg 100 g jordprøve i en plastkopp (cap diameter = 8,5 cm, høyde = 12,5 cm), og legg deretter 5 måltidsorm på jordens overflate ved romtemperatur i mørket i 2 uker.
- Lagre EPF-isolasjonene
- Klipp 3 av de 5 mm agarblokkene på kanten av hver isolerte rene soppkulturerte plate med korkborer og legg den i et 1,5 ml mikrosentrifugerør når man replikerer.
MERK: Tre replikeringer for hver soppisolasjon anbefales for EPF-stammenes lagring etter andre virulenstest. Molekylær identifikasjon anbefales også hvis lagringsplassen er begrenset. - Tilsett 250 μL 0,03% overflateaktiv løsning (materialbord) og 250 μL 60% glyserol i 1,5 ml mikrosentrifugerør ved hjelp av en mikropipette; deretter virvel i 10 s.
- Forsegle det 1,5 ml mikrosentrifugerøret med parafinfilm og forkjøl det i et -20 °C kjøleskap i 24 timer. Overfør deretter de ferdigkjølte sopplagrene til et -80 °C kjøleskap for kryopreservering.
MERK: Ekstra rene soppkulturplater (bortsett fra de kryokonserverte prøvene) ble brukt i pkt. 1.4.
- Klipp 3 av de 5 mm agarblokkene på kanten av hver isolerte rene soppkulturerte plate med korkborer og legg den i et 1,5 ml mikrosentrifugerør når man replikerer.
- Første patogenisitetsskjerm for soppisolasjoner
- Plasser fem T. molitor larver direkte på overflaten av hver ren soppkulturplate ved 25 °C.
- Observer og registrer mykose og dødelighet i 10 dager. Velg soppisolering for videre analyse.
MERK: Soppisolasjoner som forårsaker 100% dødelighet er valgt for andre virulenstest for å bekrefte deres virulens til T. molitor larver. Alternativt kan forskeren justere kriteriene i henhold til egen studie.
- Andre virulenstest av soppisolasjoner
MERK: Basert på den første patogenisitetsskjermen, gjenopprett de valgte soppisolasjonene fra -80 °C for den andre virulenstesten. Hensikten med den andre virulenstesten er å kvantifisere patogenisiteten til de valgte soppisolasjonene etter første runde med screening.- Høst conidia av hver sopp isolere ved vortexing i 1 min og telle antall conidia ved hjelp av et hemocytometer.
- Juster conidia-suspensjonen til en konsentrasjon på 1 x 107 conidia/ml i en 0,03 % overflateaktiv løsning (Materialfortegnelse).
- Spred 10 μL av soppfjæringen på 55 mm 1/4 SDA-plater og vokse i 7 dager ved 25 °C i mørket.
- Plasser fem T. molitor larver direkte på overflaten av hver ren soppkulturplate (ca. 6 x 107 conidia). Forsegle platene med parafinfilm og inkuber ved 25 °C i mørket.
- Observer og registrer mykose og dødelighet i 10 dager.
- Gjenta testen (fra trinn 1,51 til 1,5,5) i triplikat for hver soppisolasjon.
MERK: Soppisolasjoner som forårsaker 100% dødelighet er valgt for tredje virulenstest for å bekrefte deres virulens for å målrette.
- 3. virulenstest av soppisolasjoner for mål (Spodoptera litura som eksempel)
- Gjenta trinn 1.5.2 til 1.5.6 med utvalgte isolasjoner fra andre virulens for å teste virulens mot mål.
- Beregn LT50 for hver soppisolering22.
MERK: LT50 av hver soppisolasjon ble beregnet gjennom generaliserte lineære modeller (GLMer) ved hjelp av R studio (versjon 3.4.1); den kvasibinomiske feilfordelingen og en loggkoblingsfunksjon kan brukes til å ta høyde for overdispersion.
2. Molekylær identifikasjon av EPF
- Ekstraksjon av soppgenomisk DNA
- Samle c.a. 1 cm2 EPF fra 7-dagers 1/4 SDA-platen.
- Trekk ut det soppgenomiske DNA-et ved hjelp av et soppgenomisk DNA-ekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner23 (Materialfortegnelse).
- PCR-forsterkning og DNA-sekvensering
- Forsterk Fungal ITS-regionen ved PCR av DNA-prøven21 ved hjelp av PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R primer set24 (tabell 1) med følgende PCR-program: 94 °C i 1 min, og deretter 35 sykluser på 94 °C i 30 s, 55 °C i 30 s og 72 °C i 1 min, etterfulgt av en 7 min endelig forlengelse ved 72 °C.
MERK: ITS1F/ITS4R primer-settet er for identifikasjon på slektsnivå. - Sekvenser PCR etter kommersiell sekvenseringstjeneste.
- Bruk NCBI BLAST-søk etter lignende sopp i NCBI-databasen og velg de relative sopptypeartene for fylogenetisk analyse.
MERK: Soppartene som tilhører slekten Metarhizium eller Beauveria bør identifiseres ytterligere til artsnivå med tef-983F/tef-2218R primer set25 (gjenta trinn 2.1.1 til 2.2.3). For sopp som ikke tilhører slekten Metarhizium eller Beauveria, kan andre molekylære markører brukes til å identifisere arten, inkludert DNA-lyase (APN2), beta tubulin (BTUB), RNA-polymerase II største underenhet (RPB1), RNA-polymerase II nest største underenhet (RPB2) og 3' del av oversettingsforlengelsesfaktor 1 alfa (TEF)25,25,2 .
- Forsterk Fungal ITS-regionen ved PCR av DNA-prøven21 ved hjelp av PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R primer set24 (tabell 1) med følgende PCR-program: 94 °C i 1 min, og deretter 35 sykluser på 94 °C i 30 s, 55 °C i 30 s og 72 °C i 1 min, etterfulgt av en 7 min endelig forlengelse ved 72 °C.
- Fylogenetisk analyse
- Bruk ClustalX 2.1 software27 til å justere flere sekvenser fra trinn 2.2.2 og 2.2.3. Trim området for bevarte sekvenser manuelt med GeneDoc28.
- Utfør den fylogenetiske analysen av MEGA7 software29 basert på minimum evolusjon (ME), Neighbor-Joining (NJ) og maksimal sannsynlighet (ML) metoder.
MERK: Å utføre alle tre metodene kan bidra til å bekrefte og nøyaktig avslutte klassifiseringsstatusen. Svampisolasjonene som vises av den første patogenisitetsskjermen, brukes til molekylær identifikasjon på slektsnivå. Soppisolasjonene som måles av den andre virulenstesten, brukes til artens molekylære og morfologiske identifikasjon.
3. Morfologisk identifisering av EPF
- Observasjon av soppkolonimorfologien
- Bruk et kamera for å fange soppkulturkoloniens vekst i 7 dager, og registrer veksten, formen (fluffy, fast) og fargen på koloniene.
- Observasjon av conidia og conidiophores
- Skrap conidia fra den rene kultur soppkolonien med en inokulasjonssløyfe og overfør sporene til et glasssklie med 0,1% Tween 80-løsning. Dekk deretter med en dekslelip for lett mikroskopisk observasjon av conidia.
- Bruk en skalpell til å kutte en 5 mm2 agarblokk av hyphalstrengen på kanten av soppkolonien, og overfør deretter agarblokken til et glasssklie.
- Utfør rengjøringen på følgende måte: Tilsett 0,1% Tween 80-løsningen på agarblokken med en plastdråper og vask av det meste av overflødig conidia ved hjelp av pinsett. Dekk den deretter med en dekslelip for lysmikroskopisk observasjon.
MERK: 0,1 % Tween 80 kan erstattes med et annet mer potent overflateaktivt middel (Materialbord) avhengig av sopparter og hydrofobitet. - Mål og registrer bredden og lengden på conidia og conidiophores for å sammenligne forskjellene mellom forskjellige soppisolasjoner.
- Bruk Welchs ANOVA-test og Games-Howell-test (post-hoc-test) for å analysere den konidiale bredden og lengden på hver stamme ved hjelp av R studio (versjon 3.4.1).
MERK: Dataanalyse av morfologiske tegn kan justeres etter tilfeller. Soppisolasjonene som vises med den tredje virulenstesten, brukes til fysiologisk karakterisering og ECN-rangering i avsnitt 4 og 5.
4. Undersøkelse av konidial produktivitet og termototoleranse
- Konidial produksjonsanalyse
- Kultur den valgte sopp isolerer på 1/4 SDA medium ved 25 ± 1 °C i mørket i 10 dager.
- Forbered 1 ml av den konidiale suspensjonen av soppisoleringen i 0,03% overflateaktiv løsning og juster til 1 x 107 conidia / ml som beskrevet ovenfor.
- Slipp tre dråper med 10 μL konidial suspensjon på 1/4 SDA og inkuber ved 25 °C i mørket i 7, 10 og 14 dager for å telle sporuleringen av sopp.
MERK: 10 μL er det beste volumet for å samle 5 mm blokken med jevn soppstimulering etter soppvekst i 7-14 dager. - Bruk korkboreren til å løsne 5 mm agarblokk fra midten av kolonien og overfør til 1 ml 0,03% overflateaktiv løsning (Materialbord) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør til enhver tid.
- Virvel røret ved 3000 rpm ved romtemperatur i 15 min og bruk et hemocytometer for å telle antall conidia.
MERK: Formelen som brukes til telling er antall conidia per 25 kvadrater av den minste cellen (størrelse = 0,025 mm2; kammerdybde = 0,1 mm):
Totalt antall Infiendtlige på 5 ruter ÷ 80 × (4 × 106) - Gjenta tre ganger for hver isolering.
- Thermototoleranse analyse
- Kultur den valgte sopp isolerer på 1/4 SDA medium ved 25 ± 1 °C i mørket i 10 dager.
- Forbered 1 ml av den konidiale suspensjonen av soppisolasjon i 0,03% overflateaktiv løsning og juster til 1 x 107 conidia / ml som beskrevet ovenfor.
- Virvel konidial suspensjon og varm den i et 45 °C tørt bad i 0, 30, 60, 90 og 120 min. Slipp tre dråper på 5 μL av konidialfjæringen på 55 mm 1/4 SDA-medium ved hvert tidspunkt etter varmeeksponering og inkuber ved 25 ± 1 °C i 18 timer.
MERK: Unngå å spre soppdråpene for å kunne fokusere bedre på området. - Tell antall spirende konidiasporer med fem tilfeldig utvalgte felt under 200x lysmikroskopi for å bestemme spiringshastigheten.
- Utfør tre replikeringer for hver isolering.
5. Effektiv conidia nummer (ECN) rangering
- ECN-beregning
MERK: Innhente konidial produksjon og termotoleransdata for hver potensiell soppstamme før du beregner den totale ECN21.- Beregn foldeendringen (FC) av konidial produksjon på hvert tidspunkt:
hvor, x = tidspunkt for datainnsamling; ncp = antall conidia etter hver dag med vekst; og I = første antall frø conidia. - Beregn conidia-tallet under stressbehandlingen ved hvert tidspunkt ved hjelp av følgende formel:
Hvor, y = ECN av tidspunktet under behandling; TT0 = spiringshastigheten til conidia som ikke gjennomgår varmestress (= spiringshastighet på 0 min varmebehandling); TTz = stresskoeffisient er conidia germination rate på forskjellige tidspunkter for varmebehandling (z). - Beregn det totale ECNEN ved hjelp av følgende formel:
- Sammenlign ECN for hver soppstamme.
- Beregn foldeendringen (FC) av konidial produksjon på hvert tidspunkt:
- Hovedkomponentanalyse (PCA) av soppstammer
MERK:PCA-analysen bekrefter rangeringen av ECN og bidrar til å forstå sammenhengen mellom de fysiologiske karakterverdiene. Sammenlign ECN-verdiene, og velg EPF-isolasjoner som har høyere ECN-verdier. - Bruk R-programvare til å lage PCA ved hjelp av koding:
#Input PCA datafil
a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)- # Behandle eksempeldata
row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
X=rad.navn(a)
df<- a[2:11] - #PCA beregning
pca <- prcomp(df, center = TRUE, skala = SANN)
vars <- (pca$sdev)^2
pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
verdi = pca$x - #Output PCA-visualiseringsfil
png(fil = 'pca.png', høyde = 2000, bredde = 2000, res = 300)
MERK: Bruk 7 til 14 dagers konidial produksjon og alle termototoleransedata for å utføre hovedkomponentanalyse (PCA) for å bekrefte ECN-rangeringen.
- # Behandle eksempeldata
- Velg de best presterende soppstammene basert på ECN eller PCA og utfør virulenstesten av mål for videre forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolasjon og utvelgelse av potensielle Entomopathogenic sopp (EPF)
Ved å bruke Tenebrio molitor-mediert Entomopathogenic sopp (EPF) bibliotek konstruksjonsmetode, ville antall sopp uten insekt-drepende aktivitet bli utelukket; Dermed kan isolasjonseffektiviteten og utvelgelsen av EPF i stor grad økes. Under anvendelsen av denne metoden ble det registrert informasjon om prøvetakingssteder, jordprøver og soppspredningsratene (tabell 2). Basert på våre tidligere data ble totalt 101 soppisolasjoner hentet fra 172 jordprøver, noe som indikerer en høy isolasjonseffektivitet på 64%. Blant de 101 soppisolasjonene viste 26 isolasjoner insekticid aktivitet mot T. molitor (100% dødelighet) etter første patogenisitetsscreening, og dermed var eliminering av soppisolasjoner 26/101 = 25,7%. I den andre virulenstesten ble den høye virulensen av de 26 soppisolasjonene mot T. molitor ytterligere demonstrert, hvorav 12 viste høy patogenisitet mot T. molitor larver (100% dødelighet ved 5 dager post inokulering) (Figur 2A). Disse ble brukt til å evaluere virulenstesten mot landbruksskade. Basert på dataene fra den tredje virulenstestdødeligheten og LT50, er totalt seks soppisolasjoner (NCHU-9, 11, 64, 69, 95 og 113) avdekket rask insektdrepende aktivitet mot Spodoptera litura (LT50 = 2,94, 2,22, 2,84, 2,57, 2,96 og 1,13), vurdert ved hjelp av fysiologisk analyse og effektivt conidia-nummer (ECN) (figur 2B).
Molekylær identifikasjon av EPF
For bedre å forstå de sopp taksonomiske posisjonene, ble 26 isolasjoner fra første patogenisitetsscreening utsatt for molekylær analyse basert på ITS-regionen (figur 3A). Resultatet viste at disse soppisolasjonene tydelig kunne deles inn i syv slekter, inkludert Beauveria, Clonostachys, Fusarium, Cordyceps, Penicillium, Purpureocillium og Metarhizium (figur 3A). Basert på ITS1-5.8S-ITS2-regionen ble slektsklassifiseringen av EPF nøyaktig bekreftet, mens artenivået fortsatt ikke skiller seg ut. Derfor brukes sekvensen av tef-regionen til å klart klassifisere arten nivå for 12 lovende EPF isolerer fra virulenstesten mot landbruksskade. Den molekylære identifikasjonen av de 12 isolasjonene viste at 11 isolasjoner tilhører Metarhizium og inneholdt fire arter, inkludert M. lepidiotae (NCHU-9, NCHU-102), M. pinghaense (NCHU-10, NCHU-11, NCHU-30, NCHU-32, NCHU-64), M. brunneum (NCHU-27, NCHU-29) og M. anisopliae (NCHU-69, NCHU-95). Den gjenværende isolasjonen ble identifisert som B. australis (NCHU-113) (figur 3B,C). Ifølge det ovennevnte resultatet kan sekvensregionen av tef effektivt skille slekten Metarhizium på artsnivå, mens andre arter må finne andre sekvensregioner som molekylære markører for å skille arten.
Morfologisk identifikasjon av EPF
Gjennom rengjøringsmetoden (trinn 3.2.3) av soppmorfologiske observasjoner kunne strukturene til conidiophores ses tydelig med 0,1% Tween 80-løsning (figur 4A), og disse observasjonene kan tjene som en referanse for å måle størrelsen på strukturen og ta en fotorekord. Fargen, formen og arrangementet av conidia kan ses gjennom mikroskopiske observasjoner av kolonien conidia (Figur 4B, C). Etter observasjon kan størrelsen på conidia- og konidioforeformer måles ytterligere og sammenlignes statistisk (tabell 3).
Undersøkelse av konidial produktivitet, termototoleranse og ECN-rangering
ECN-formelen, som ble foreslått av forrige rapport21, kunne hjelpe med valg av en høy stresstoleranse EPF-basert fysiologisk karakter. ECN kombinerer konidiaproduksjons- og termototoleransedataene for hver EPF (figur 5A,B), noe som betyr høy levedyktighet for soppstamme når ECN-verdien er høy (figur 5). Videre ble visualisering av hovedkomponentanalyse (PCA) brukt til å verifisere resultatene fra ECN-formelen. Resultatet avdekket en høy koordinering mellom PCA og ECN, noe som tyder på at ECN-formelen kan brukes til å evaluere hierarkiet av levedyktighetsrelaterte parametere og utviklingspotensial for sopp til feltapplikasjon og videre kommersialisering (figur 5C, D).
Figur 1: Illustrasjon av Tenebrio molitormediert Entomopathogenic fungi (EPF) bibliotek konstruksjon. Del 1: Soppisolasjon fra jordprøve; Del 2: Patogenitet og virulensbasert screening og soppidentifikasjon; Del 3. Fysiologisk karakterisering og sopprangering. ECN = Effektivt conidia-nummer; og PCA = Hovedkomponentanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dødelighet av måltidsorm og Spodoptera litura for valg av lovende Entomopathogenic sopp (EPF) isolerer. (A) 26-valgt sopp andre måltidorm virulens test; Mykosene av 12 raske drap og høy virulens soppisolasjoner er vist parallelt. (B) 12 soppisolasjoner ble valgt ut til virulenstest mot S. litura. Test på hver soppstamme ble gjentatt tre ganger. d.p.i. = dager etter inokulering. Endret figur og forklaring gjengitt med tillatelse fra Fronteris21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Den fylogenetiske analysen av entomopathogene soppstammer (EPF) på (A) slektsnivå basert på ITS-regionen og (B-C) artsnivå basert på tef. Den fylogenetiske analysen av ITS-regionen og tef ble konstruert ved hjelp av maksimal sannsynlighet (ML), minimum evolusjon (ME) og nabo-sammenføyning (NJ) metoder. Bootstrap-analyser ble utført for å evaluere robustheten til fylogeniene ved hjelp av 1000 replikeringer, og bootstrap-proporsjoner større enn 50% er angitt over grener. Fet = Ex-type stammer. De røde og grønne pilene angir den lovende EPF. Endret figur og forklaring gjengitt med tillatelse fra Fronteris21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mikroskopisk undersøkelse av entomopatogeniske sopp (EPF) (M. anisopliae) morfologi. Observasjon av conidiophores (A) etter vask. (B) Observasjon av conidia form og farge. (C) Arrangement av conidia og bunter av sporestrenger (SS) av M. anisopliae; Cp = conidiophores; cc = sylindrisk conidia. Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fysiologisk karakterisering av seks potensielle isolasjoner og effektiv conidia-nummeranalyse (ECN). (B) Termototoleranseanalyse. (C) Stolpetegningen av ECN-verdier. (D) Hovedkomponentanalyse viste fordelingen av hver stamme. Endret figur og forklaring gjengitt med tillatelse fra Fronteris21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primer-navn | Amplicon Størrelse (bp) | Sekvens(5'-3') | Region | Referanse | |
| DENS1F | 550 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | DENS | 25 | |
| DENS4R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||||
| tef-983F | 1000 | GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT | tef | 26, 27, 41, 42 | |
| tef-2218R | ATGACACCRACRGCRACRGTYTG | ||||
Tabell 1: Primerpar for soppidentifikasjon.
Tabell 2: Parameterne som er registrert for Tenebrio molitormediert EPF-bibliotekkonstruksjonsmetode, er oppført nedenfor. NIU = campus til National Ilan University. NCHU = campus til National Chung Hsing University. Endret tabell og forklaring gjengitt med tillatelse fra Fronteris21. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
| Art | Belastning | Phialides μm±SD* | Conidia μm±SD* |
| Metarhizium lepidiotae | NCHU-9 | Sylindrisk, 7.3±0.67b×2.4±0.36a | Sylindrisk, 6,5±0,45a×2,7±0,13b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-11 | Sylindrisk, 8,6±0,68ab×2,6±0,30a | Sylindrisk, 6.3±0.41b×2.7±0.16b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-64 | Sylindrisk, 10,5±1,54a×2,4±0,32a | Sylindrisk, 6,8±0,53a×2,9±0,31a |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-69 | Sylindrisk, 9,4±1,58a×2,7±0,32a | Sylindrisk, 6,3±0,34b×2,6±0,19b |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-95 | Sylindrisk, 9,6±0,87a×2,6±0,29a | Sylindrisk, 6.0±0.82b×2.9±0.29a |
| Beauveria australis | NCHU-113 | Ellipsoid, NA×2,6±0,57 | Globose, 2.3±0.24×2.3±0.24 |
| *Statistisk analyse ble utført basert på Welchs ANOVA-test ved hjelp av R-studio. | |||
| § Endret tabell og legende gjengitt med tillatelse fra Fronteris (23). | |||
Tabell 3: Et eksempel på morfologiske observasjoner av seks lovende entomopathogene soppisolasjoner. Statistisk analyse ble utført basert på Welchs ANOVA-test ved hjelp av R-studio. Endret tabell og forklaring gjengitt med tillatelse fra Fronteris21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Entomopathogene sopp (EPF) har blitt brukt til insektkontroll. Det finnes flere metoder for å isolere, velge og identifisere EPF30,31,32. Sammenligning av de forskjellige typer insekt agn metoder, Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae ble ofte funnet i insekt baits6,12,13,14. Blant disse insekt agnene viste Galleria mellonella og Tenebrio molitor høye utvinningsgrader av Beauveria og Metarhizium spp. Faktisk ble nytten av måltidsorm (T. molitor)-agnmetoden demonstrert som en bekvemmelighetsmetode for isolering av EPF fra jordprøver17,21. Likevel har det blitt rapportert at brukte insekter som agn ville vise skjevheten for å isolere spesifikke sopparter3,33. Derfor kan kombinasjon av forskjellige insektarter (dvs. Galleria mellonella og T. molitor sammen) for å lokke EPF fra jordprøvene øke mangfoldet i EPF34.
For å evaluere insektdrapsaktiviteten er det to runder med screening av måltidsorm (T. molitor) i den nåværende protokollen for å velge de lovende soppstammene for videre studier. Etter denne prosessen kan antall soppisolasjoner, som er isolert fra jordprøver, reduseres dramatisk og begrenses til soppisolasjoner som viste høy insektmiddelaktivitet etter første og andre screening. Stor reduksjon av soppisolasjoner for neste runde med screening sparer tidskostnader og arbeidskrevende. Det kan også bemerkes at de valgte soppisolasjoner viste lignende trender av patogenitet mellom måltidsorm (T. molitor) og tobakkskuttorm (Spodoptera litura), som demonstrerer en konsekvent testing av patogenitet av forskjellige insektarter og kan utvides ytterligere til andre skadedyr21. I tillegg kan beregningen av ECN basert på de fysiologiske testene lette valget av potensielle soppstammer som skal brukes i avlingsfelt. Lignende selektive metoder ble nevnt av andre rapporter, mens faktorene som abiotiske og stammeegenskaper ikke er inkludert12,8,31,35,36,37. Derfor kan disse stammene påvirkes av miljøfaktorer som resulterer i innflytelse på ytelsen til soppspredning og dermed vanskeligheter med å bli kommersialisert. Denne konsekvensen er også hovedårsaken til manglende evne til laboratoriestammer i feltet38.
Fra den morfologiske identifikasjonen bør videre innsats rettes mot å finne den klare strukturen av conidiophore og observere de forskjellige egenskapene til hver soppstamme. Studier kan omfatte ulike metoder for å løse den vanskelige morfologiske identifikasjonen39. Den morfologiske identifikasjonen klarer imidlertid ikke å skille nært beslektede sopparter; Derfor er det nødvendig å integrere dataene for molekylær identifikasjon. Den interne transkriberte spacer (ITS) regionen viste slektsnivå diskriminering, mens andre molekylære markører (dvs. tef for Metarhizium, blokk for Beauveria) er nødvendig for identifisering på arten nivå26,40,41.
I den fysiologiske karakteriseringen, for å redusere standardavviket for forsøkene, foreslås enten maskinen eller manuell virvel i minst 10 minutter ved maks rpm21. Grundig blandet conidia suspensjon ville øke konsistensen av resultatene av termotoleransanalyse og konidial produksjonsanalyse. På den annen side, i den konidiale produksjonsanalysen, økte det talte conidia-nummeret under et fast område (5 mm blokk i den sentrale delen av soppkolonien i denne studien) på den kultiverte platen på forskjellige tidspunkter vekst problemet at forskjellige sopparter og til og med forskjellige stammer avslørte forskjellig ytelse av hyphaens vekstkomprimitet, som kan føre til at prøvetakingen ikke er representativ. Derfor kan en streng testmetode for conidia-produksjon forbedre problemet, for eksempel nøyaktig telle antall conidia av hele soppkolonien og normalisere med vekstområdet42.
Den effektive conidia number (ECN) formelen er designet basert på påvirkning av miljøbelastning mot EPF-conidia, det vil si simulere conidia under betingelse av vilt miljø for å velge de lovende soppstammene for kommersialisering21. I denne protokollen ble dataene om conidia produksjon og varmebehandling brukt til beregning av den totale ECN-verdien av hver lovende soppstamme, etter forrige studie21. Videre, under et naturlig miljø, unntatt temperaturen, kan annet miljøstress, som fuktighet, ultrafiolett stråling (UV), og vert påvirke conidia spiring. Spesielt er UV-stresset en hovedfaktor som påvirker conidia-spiring fordi de høyenergifrie radikalene (som peroksider, hydroksylgrupper og singlet oksygen) generert av UV kan redusere patogenitet og utholdenheten til mikrobielle plantevernmidler43. Dermed kan UV-stress inkluderes ytterligere i ECN-formelen i fremtiden. For å unngå UV-stress, bør formelen inneholde olje eller natriumalginat for å øke UV-toleransen til conidia44,45,46, som bekrefter at potensielle stammer har praktisk for skadedyrsbekjempelse47.
Den nåværende protokollen ga en metode for rask og presis isolering av potensielle EPF-stammer for å konstruere T. molitormediert EPF-bibliotek. Dette er grunnlaget og er nødvendig for utvikling av biologisk kontrollforskning. Videre kan ECN-formelen forbedres fleksibelt for å hjelpe forskere med å forstå potensialet i EPF og utvikle den til en vare for bruk i landbrukssystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt involvert i dette arbeidet.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra Vitenskaps- og teknologidepartementet (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , Frederiksberg Denmark. Department of Ecology 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The 'Galleria bait method'for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D. Manual of Techniques in Insect Pathology. Lacy, L. , Academic. Amsterdam. 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Fungal database WorldWide Collection of Entomopathogenic Fungi. University of Vermont. , Available from: http://www.uvm.edu/~entlab/Fungus.html (2019).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17. , Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- National Resource for Biomedical Supercomputing. GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Pittsburgh Supercomputing Center's National Resource for Biomedical Supercomputing. , Available from: http://www.nrbsc.org/downloads (1997).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -Y., Choi, J. -B., Bae, S. -M., Koo, H. -N., Woo, S. -D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method'as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. Manual of techniques in insect pathology. , Elsevier. 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
