Gnager estrous syklus overvåking ved hjelp av vaginal lavage: ingen slik ting som en normal syklus

Summary

Denne studien beskriver de avgjørende faktorene å vurdere i eksperimentelle design som involverer kvinnelige rotter. I større forstand tjener disse dataene til å redusere stigma og bistå i utviklingen av mer inkluderende diagnostiske og intervensjonsverktøy.

Abstract

Den nåværende metodikken etablerer en reproduserbar, standardisert og kostnadseffektiv tilnærming til overvåking av østrogensyklusen til kvinnelige Sprague Dawley (SD) ungdomsrotter. Denne studien viser kompleksiteten i hormonelle sykluser og det brede spekteret av forståelse som kreves for å konstruere en pålitelig og gyldig overvåkingsteknikk. Gjennom en grundig undersøkelse av grunnleggende eksperimentell design og prosedyreelementer gir denne beskrivelsen av syklusen og dens grunnleggende prinsipper et rammeverk for videre forståelse og dekonstruerer misforståelser for fremtidig replikering.

Sammen med en oversikt over prøveinnsamlingsprosessen som bruker vaginal lavage, beskriver prosedyren mekanismen for datakategorisering i firetrinnsmodellen av proestrus, østrus, metestrus og diestrus. Disse stadiene er preget av en ny foreslått tilnærming, ved hjelp av de 4 kategoriserende determinantene av vaginal væsketilstand, celletype (er) til stede, cellearrangement og cellemengde på innsamlingstidspunktet. Variasjoner av hvert trinn, gunstige og ugunstige prøver, skillet mellom syklisitet og acykliitet og grafiske skildringer av de innsamlede kategoriseringskomponentene presenteres sammen med effektiv fortolkende og organisatorisk praksis av dataene. Samlet sett tillater disse verktøyene publisering av kvantifiserbare dataområder for første gang, noe som fører til standardisering av kategoriseringsfaktorer ved replikering.

Introduction

Nye bidrag
Gnagerens østrogensyklus har blitt identifisert som en viktig indikator på velvære. Imidlertid hindrer ubevisste fordommer av etterforskere og unøyaktige tolkninger angående kvinnekroppen det vitenskapelige samfunnet. Selve etymologien til ordet "estrous" innebærer en følelse av underlegenhet og negativitet. Euripides brukte begrepet for å beskrive en "vanvidd" eller galskap, Homer for å beskrive panikk, og Platon for å beskrive en irrasjonell stasjon. Denne studien fremhever hvordan disse urbefolkningsperspektivene påvirker det nåværende vitenskapelige samfunnet og adresserer disse bekymringene gjennom et nytt mosaikkparadigme – en oppdatert kombinasjon av tidligere studerte metoder, utvidet i omfang for en mer omfattende tilnærming.

Studiet og bruken av denne teknikken er nødvendig, for det første, da det ikke er noen standardisert og omfattende overvåkingsteknikk, og datatolkningspraksis kan være uklar. For det andre, selv om østrogen syklusegenskaper er avhengige av individuelle rotter som studeres, blir de ofte universalisert. For det tredje, mens hormonelle sykluser er rutinemessige og fordelaktige prosesser, er de omgitt av farlig stigma utforsket i delen "Oversettelse til mennesker". Denne studien tar sikte på å løse disse tre problemene på tre måter – (A) ved å beskrive en dyptgående estrous syklusovervåkingsteknikk og avklare hvordan resultatene kan tolkes, (B) ved å skissere metoder som opprettholder integriteten og individualiteten til hver syklus, og (C) ved å rette oppmerksomheten mot misforståelser som opprettholder ubegrunnet praksis.

Denne studien er også unik i sitt fokus på unge rotter, en periode preget av viktige utviklingsendringer som kaster lys over ulike atferdsmessige, anatomiske og fysiologiske manifestasjoner i voksen alder¹. Å bygge en standardisert eksperimentell design for å overvåke hormonelle sykluser i en underforsket befolkning mens dekonstruerer vanlige skjevheter, vil tillate utvikling av pålitelige og gyldige hormonelle korrelasjoner ^2,3,4 og bestemmelse av tilstandsavhengige syklusforstyrrelser ^5,6,7,8,9,10 . Til syvende og sist tjener disse nyhetene til å utvide diagnostiske kriterier, behandlinger og intervensjoner av ulike velværeproblemer.

Grunnleggende definisjoner og bruksområder
Den estrous syklus er en samling av dynamiske fysiologiske prosesser som oppstår som svar på de tre oscillerende kvinnelige sex steroid hormoner: østradiol, leuteinizing hormon (LH), og progesteron (Figur 1A, B). Interaksjoner mellom det endokrine og sentralnervesystemet regulerer syklusen, som oftest vedvarer i 4-5 dager og gjentar seg fra utbruddet av seksuell modning til reproduktiv senescence og / eller opphør. Den er delt inn i separate kategorier basert på hormonnivåer – oftest i de 4 stadiene av diestrus (DIE), proestrus (PRO), østrus (EST) og metestrus (MET), som utvikler seg på en sirkulær måte. Antall divisjoner kan variere fra 3 trinn¹¹ til 13 trinn¹², avhengig av arten av studien¹³. Det lavere antallet divisjoner utelukker ofte MET som et stadium og klassifiserer det som en overgangsperiode med kort varighet. Det høyere tallet inkluderer vanligvis subseksjoner som muliggjør en nærmere inspeksjon av fenomener som tumorutvikling eller spontan pseudopregnancy, den fysiologiske tilstanden til graviditet uten embryonal implantasjon 12,14,15.

I denne studien ble stadiene identifisert gjennom komponenter i vaginalkanalen, kalt de 3 kategoriserende determinantene-celletype (er) til stede, cellearrangement og cellemengde (figur 2A-D). Mens tilstanden til vaginalvæsken ikke ble overvåket i denne studien, anbefales det å inkludere den som en fjerde kategoriserende komponent. Ytterligere informasjon om å undersøke vaginalvæsken finnes i referanselisten¹⁶. De kategoriserende komponentene kan undersøkes ved å trekke ut celler via vaginal lavage, den primære teknikken som anbefales i moderne østrogen syklus overvåking. Mens de dyptgående fysiologiske prosessene i hvert trinn er utenfor omfanget av denne studien, finnes mer informasjon i litteraturen¹⁷.

Bruken og fortsatt utvikling av denne østrogen syklus overvåking teknikken er forankret i sammenhenger mellom sex steroid hormoner og funksjonen av kroppslige systemer som kardiovaskulærsystemet¹⁸, endokrine system⁸, og sentralnervesystemet 19,20,21. Samtidig kan estrous syklus overvåking ikke alltid være nødvendig når kvinnelige gnagere er involvert 22,23,24,25. Snarere er det viktig først å vurdere om kjønnsforskjeller er rapportert i det spesifikke studieområdet, som kan utforskes nærmere i publiserte vurderinger^22,23. Selv om estrous syklus overvåking er viktig i et bredt spekter av forskningsundersøkelser, bør det ikke ses på som et hinder for å inkludere kvinnelige gnagere i eksperimenter. Selv om denne teknikken kan virke kompleks og tidkrevende, kan selve prosedyren ta mindre enn 15 minutter å fullføre, avhengig av undersøkeren, og er kostnadseffektiv. Totalt sett er inkludering av kvinnelige gnagere i vitenskapelige studier fordelaktig for forståelsen av kroppslige systemer, ulike forhold og patologier, og generell velvære, da denne utviklingen hovedsakelig har vært basert på den mannlige kroppsmalen.

Universelle parametere og naturlige variasjoner i gnageren
Etablering av områder for aspekter sett på som "typiske" er nødvendig for å definere standard syklusmønstre, angi parametere for komparative og analytiske formål og oppdage abnormiteter og outliers. Samtidig er det også viktig å erkjenne at hver rottes syklus er unik, og avvik basert på dyrestamme, fysiologiske prosesser og miljøforhold forventes. Faktisk er en av de mest "normale" aspektene av østrogensyklusen variasjon. Dette ses i den totale sykluslengden, med et område på 3-38 dager^26,27; alderen på seksuell modning som kan variere fra 32-34 dager til flere uker 28,29,30; hva regnes som acyklisk¹¹, og kategoriserende determinante mønstre^11,13. Totalt sett er det ingen universell mal for østrogensyklusen, og oversettelse av det til både det vitenskapelige samfunnet og allmennheten er en viktig del av den eksperimentelle prosessen.

Eksperimentelle tidspunkter og utviklingsalder
Å gjenkjenne dette prinsippet om variasjon hjelper til med å bygge en pålitelig og gyldig eksperimentell design. For eksempel er starten på estrous sykling overvåking avhengig av rottens anatomiske og fysiologiske utvikling, som varierer basert på miljømessige og fysiologiske faktorer. Overvåking kan ikke begynne før utviklingen av vaginalåpningen (VO), som er den eksterne vaginale åpningen omgitt av vulvaen som fører til den indre delen av vaginalkanalen (figur 3A-D). Mens VO ofte utvikler seg fullt ut mellom 32 og 34 dager, forblir det individualisert til hvert emne, og mye om prosessen forblir ukjent. Denne åpningen har blitt brukt til å identifisere utbruddet av seksuell modning, som har vært knyttet til økningen av østradiol³¹, modning av hypothalamus-hypofyse-ovarieaksen³², og den første eggløsningen hos rotter 17,33,34,35. Nyere publikasjoner har imidlertid funnet ut at det bare er en indirekte markør for reproduktiv utvikling, da det kan bli usammenhengende fra hormonelle og utviklingsmessige forekomster i ugunstige miljøer³¹ og kan representere endringer i østradiolnivåer i stedet for kjønnsmodning³³. Derfor anbefales det å ikke stole utelukkende på VO for å bestemme utviklingsalder og som en kvalifikator for estrous syklusovervåking³⁶, men også å utnytte utseendet på den første EST-fasen og cornification av epitelcellene³⁰ for å markere utbruddet av seksuell modning.

Kroppsvekt er spesielt korrelert med utviklingsalder i ungdomstiden hos gnagere^30,37 og kan derfor også bidra til å bestemme utviklingsalder i denne perioden. Foreslåtte mekanismer relatert til dette fenomenet inkluderer stimulering av hormoner som er nødvendige for reproduktiv utvikling, for eksempel veksthormon, og hemming av hypothalamus-hypofysen binyre (HPA) aksen av appetittregulatoren, leptin³⁰. Det anbefales imidlertid ikke å bruke dette tiltaket som eneste indikator på utviklingsalder på grunn av den store variansen sett mellom rotter på tvers av arter og leverandørleverandører³⁸. Variasjonen sett i utviklingen av VO og kroppsvekt eksemplifiserer betydningen av konseptet i den generelle eksperimentelle prosessen.

Oversettelse til mennesker: kulturelle og vitenskapelige sammenhenger
Det translasjonelle forholdet mellom dyre-til-menneske reproduktive studier er toveis. Resultatene fra dyrebaserte studier påvirker hvordan de menneskelige prosessene vurderes, nærmer seg og analyseres³⁹. Oppfatningen av det menneskelige reproduktive systemet og dets relaterte prosesser påvirker hvordan dyr studeres. Faktisk stammer en av de høyeste indikasjonene for videre forskning på dette området fra partisk sosiokulturell tro knyttet til hormonelle sykluser som påvirker den vitenskapelige prosessen. Mange av disse konvensjonene er avledet fra en generell kulturell aversjon mot å diskutere menstruasjon, noe som har ført til et datagap i velbegrunnet kunnskap^40,41. Dette har et spekter av konsekvenser som spenner fra mindre til dødelige - fra hyller høyde og smarttelefonstørrelse til politiets kroppspansertilpasning og tapte kreftdiagnoser⁴².

Beskrivelsen av menstruasjon som uhygienisk, destruktiv og giftig – sett i ærverdige tekster, medier, ordbøker og medisinske læresetninger – bevares av vitenskapelige publikasjoner. Dette skjer gjennom unøyaktige og partiske beskrivelser av hormonelle sykluser, isolering av reproduktive systemet fra nevroendokrine kolleger og miljøpåvirkninger, og det reduksjonistiske perspektivet på fullføring av en syklus som en "unnlatelse av å ^tenke'43,44. Dette fører til opprettelsen av unsound eksperimentell praksis, for eksempel utelatelse av eksterne variabler som påvirker hormonelle sykluser, bestemmer start og endepunkter basert utelukkende på anatomisk utvikling, og måler syklusutvikling på en lineær snarere enn sirkulær måte. Til tross for den direkte sammenhengen mellom sosiokulturelle faktorer og biologiske konsekvenser, vurderes det ikke ofte i vitenskapelig litteratur. Gjennom inspeksjon av mer helhetlige publikasjoner 43,44,45 kan forskere dekonstruere disse stigmaene og skape mer pålitelige og gyldige eksperimentelle design.

Protocol

Alle håndterings- og prosedyremetoder som er skissert i denne protokollen er i tråd med Nasjonale institutter for helse (NIH) dyrepleie og bruksretningslinjer og er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Pepperdine University og UCLA Chancellor's Animal Research Committee (ARC).

1. Dyrepleie og bruk

1. Skaff kvinnelige rotter, i antall i henhold til kraftanalyse, og mannlige rotter for å fremme Whitten-effekten eller mer konsistent sykling⁴⁶. Bestemme belastningen basert på målet for studien i kjente databaser⁴⁷.
   MERK: Dagens data gjenspeiler at av kvinnelige ungdommer SD International Genetic Standardization Program (IGS) i nærvær av mannlige SD rotter lokalisert ved både Pepperdine University og UCLA laboratorier som en del av en samarbeidsstudie. Disse rottene kom i separate grupper ved 28 dagers alder, og østrogen syklusprogresjonen ble overvåket i enten 10 eller 20 dager for å demonstrere forskjeller på akutte og kroniske nivåer, som begynner ved 34 dager (etter en 7-dagers akklimatiseringsperiode).
2. Før håndtering, tillate karantene og/eller akklimatiseringsperiode for fysiologisk stabilisering etter transport og tilpasning til det nye miljøet.
   MERK: En 3-dagers minimumsperiode er sitert, med en 7-dagers periode anbefalt 48,49,50,51,52. Samlet sett er dette avhengig av transportforhold, dyrestamme og studiemål.
3. Forsikre deg om at stress reduseres ved bruk av en akklimatiseringsperiode, da stress kan forstyrre riktig reproduktivt system som fungerer⁵³. Men ikke overkompensere ved å forsøke å eliminere det, da en moderat mengde stress er gunstig for dyrenes velvære å være⁵¹.
4. Vertrotter i et temperatur- (68-79 °F, dvs. 20-26 °C) og fuktighetskontrollert (30-70%) miljø ved å kontakte vivarium- eller laboratorieledere og sikre disse funksjonene. Distribuer vann og chow ad libitum med næringskomponenter oppført på selskapets nettside og burrengjøring en gang i uken.
   MERK: I denne studien ble rottene plassert i grupper på 2 adskilt av sex i 19 " x 10 " x 8 " klare gjenbrukbare plastbur og hadde tilgang til corncob sengetøy som ble endret en gang i uken. Temperaturen ble opprettholdt ved 70 °F og fuktighet ved 35-79%, med et gjennomsnitt på 62%.
5. Se etter utvikling av ringhale eller iskemisk nekrose i halen og tærne for tegn på lave relative fuktighetsnivåer og ekstreme temperaturer, noe som kan føre til veksling av biologiske responser.
   MERK: Temperatur og fuktighet er viktig for reproduktive systemet, kjønnsmodning og østrogen sykliskhet 54,55,56,57,58.
6. Sikre riktig og balansert belysning i hele boligrommet ved å deponere like store mengder lyskilder i hele laboratorierommet som virker på et tidsstyrt lys:mørkt system.
   MERK: Her ble en 12:12-timers lys:mørk syklus, med lys på fra 06:00-18:00 h, kontrollert av 2550-lumen lineære LED-pærer.
7. Følg lux-kravene som er gitt⁵² basert på variasjoner av dyrs pigmentering, alder, belastning, kjønn og hormonell status.
   MERK: Når forskere kategoriserer celleprøvene som samles inn, vil konsekvent belysning gi riktig visuell deteksjon og pålitelig iscenesettelse⁵⁹. Varigheten og intensiteten av lys er direkte relatert til reproduktive systemet, seksuell modning, og estrous sykling 54,55,56,57,60,61.

2. Utstyr og eksperiment forberedelse

1. Gjennomgå de kategoriserende determinantene (sett i figur 2A): hvordan du identifiserer hvert trinn i østrogensyklusen og hvordan du bruker mikroskopet og kamerautstyret.
2. Forsikre deg om at hvert emne som skal overvåkes har nådd seksuell modning og viser passende indikatorer for utvikling - VO, kroppsvekt og alder. Vei rottene og undersøk dem for VO mellom samtidig hver dag for nøyaktige sammenligninger og overfør dem med en godkjent håndteringsmetode. Konsulter den universitetstilknyttede veterinæren hvis et dyr mister mer enn 20% av sin tidligere kroppsvekt.
   MERK: VO forblir kaudal til urinrørsåpningen og kranialen til anusen, som ligger mellom de to, som vist i figur 3.
3. Siden disse faktorene er belastningsavhengige, må du ta kontakt med leverandøren for spesifikasjoner og vurdere miljøfaktorer som er spesifikke for laboratoriet⁶².
   MERK: Generelt vil dette skje mellom 32-34 dager og en gjennomsnittlig kroppsvekt fra 75-150 gram⁶³ for SD-rotter og indikeres ved en sirkulær formet åpning tidligere dekket av en membranøs kappe.
4. Velg en prøveinnsamlingsperiode som passer for gruppen rotter som overvåkes for å hindre innsamling av overgangsprøver. Prøv først noen få dyr på 2 eller 3 forskjellige tidspunkter i løpet av dagen for å bestemme tiden der de fleste syklusstadier er til stede (f.eks. prøvetaking kl. 12:00, 13:00 timer og 14:00 timer for forskjellige dyr). Fullfør vaginal lavage til samme tid hver dag for konsistent og pålitelig iscenesettelse.
   MERK: Det har blitt rapportert at timene mellom 12:00 og 14:00 h er best for å fange alle stadier. I denne studien skjedde estrous syklus overvåking mellom 12:00 og 14:00 h, håndtert med kompresjon-stil hold (se trinn 3.4). Betydningen av estrous syklus overvåking timing i forhold til andre eksperimentelle intervensjoner (f.eks, atferdsmessig kondisjonering, medisinering) er et utviklingsområde for forskning og kan utforskes videre¹¹. Å bestemme varigheten av østrogen syklus overvåking er studieavhengig og kan videre utforskes i publiserte studier^11,33.
5. Fjern beskyttelsesdekselet fra mikroskopet og fest kameraet til datamaskinen ved å fjerne beskyttelseskameralinsedekselet og plassere objektivet over mikroskopets okular.
6. Åpne deretter den forhåndsvalgte programvaren på datamaskinen. Hvis du vil bruke programvaren som er valgt i denne studien, velger du kameraet som er koblet til USB-en på venstre side av skjermen, under fanen kameraliste. Forsikre deg om at USB-kameraet er riktig koblet til datamaskinen, som ikke vil lese Ingen enhet under fanen merket Kameraliste, hvis ikke.
7. Når USB-kameraet er valgt under fanen, slår du på mikroskoplysbryteren på basen.
8. Opprett en mappe på datamaskinen som er beregnet på celleeksempelbildene. Opprett en filmappe for hver enkelt dag dataene samles inn, forhåndsforberedt før bilder tas.
9. Når utstyret er klargjort, henter du motivets bur fra holdeplassen og tar det med til prøvesamlingsstasjonen.

3. Innsamling av vaginale celler

1. Hent en engangssprøyte og fyll hver av sprøytene med 0,2 ml steril 0,9% NaCl. Hvis det er luftbobler til stede, sveiper du forsiktig tønnesprøyten til alle luftboblene har nådd den åpne spissen av sprøyten og utviser luften. Hvis det fortsatt er luftbobler til stede, kan du utvise oppløsningen tilbake i NaCl-beholderen og fylle på til det ikke er noen.
   MERK: Overdreven flikking kan føre til dannelse av flere luftbobler.
2. Returner hver sprøyte til plastinnpakningen for å opprettholde et sterilt felt, med spissen av sprøyten inne i den forseglede delen av innpakningen.
3. Åpne buret og løft motivet forsiktig enten ved foten av halen eller stammen av kroppen, lukk lokket på buret for å forhindre at andre går ut. Velg en holdemetode fra de som er oppført nedenfor basert på personlig preferanse og dyrerespons.
4. Bruk kompresjonsstilholdet for ungdomsrotter ved å plassere motivet mot øvre brystregion, med motivets nese som peker ned på bakken. Før du begynner vattpinnen, må du sørge for at motivet er komprimert nok til å forhindre bevegelse, men er komfortabel og trygg i lasterommet. Utsett motivets vaginale kanal ved å bøye halen forsiktig før du setter inn sprøyten.
5. Bruk hindbensheisen for voksne rotter ved å plassere dyrets forpaws på enten toppen eller siden av buret, mens halen og bakbenene er begrenset med et forsiktig hold mellom første og andre fingre, slik at tommelen er fri til å betjene sprøyten⁶⁴.
6. La dyrene akklimatisere seg til håndtering og overvåking. Håndter dyrene forsiktig, men sikkert for å redusere overflødig stress og for å beskytte forskeren mot aggresjon som biting.
   MERK: De første dagene med overvåking gir kanskje ikke de ønskede resultatene, da dyrene akklimatiseres til forholdene. Håndtering av dyrene for å samle kroppsvekt i akklimatiseringsperioden kan hjelpe denne overgangen³³.
7. Mens du holder sprøyten stødig med pekefingeren og langfingeren, setter du inn spissen av sprøyten (ikke mer enn 2 mm) i en vinkel parallelt med vaginalkanalen. Trekk NaCl sakte ut i kanalen ved å skyve stempelet innover. Ikke sett sprøyten lenger inn i kanalen, da dette kan forstyrre østrogensyklusen.
8. Trekk ut NaCl fra vaginalkanalen ved å trekke stempelet på sprøyten bort fra epitelforingen (oppover). Hvis det er problemer med å holde motivet i lasterommet under denne prosessen, plasser dem tilbake i buret i en kort hvileperiode før du prøver NaCl-utvinning.
9. Når celleprøven er samlet inn, plasserer du motivet tilbake i buret og gjentar denne prosedyren for hvert dyr før alle prøver evalueres under mikroskopet.
   MERK: Alternativt kan hver prøve samles inn og evalueres før du går videre til neste dyr. Et dyr kan kreve en annen lavage hvis prøven ikke kan kategoriseres. Den samme sprøyten fra den første samlingen kan gjenbrukes hvis den ikke kontakter saltvann direkte i beholderen og bare for samme dyr.

4. Eksempelevaluering

1. Begynn kategoriseringen ved å undersøke vaginalvæskeprøven som ekstraheres. Registrer viskositeten som enten viskøs eller nonviscous og fargen som enten ugjennomsiktig eller gjennomsiktig på beskrivelsesdokumentet eller et annet opptakssystem.
   MERK: Denne delen av protokollen kan utføres på tidspunktet for prøveinnsamlingen eller senere.
2. Utvis 2-3 dråper væske på et mikroskop og legg et mikroskopdekselglass på toppen av lysbildet. Plasser dekselglasset på mikroskopet fra toppen av lysbildet til bunnen eller fra den ene siden av lysbildet til den andre for å forhindre dannelse av luftbobler. Hvis det er mulig, la omtrent halvparten av den innsamlede prøven stå i sprøyten hvis ytterligere undersøkelse er nødvendig og for å forhindre at en overflødig mengde væske plasseres på lysbildet.
3. Finn cellene som er samlet inn ved å flytte mikroskopet over scenen. Hvis det er for få celler eller en høy mengde rusk, utviser du den gjenværende væsken på et nytt lysbilde og reeksamin. Hvis mengden prøve som er igjen i sprøyten ikke er tilstrekkelig, eller hvis den andre dråpen presenterer lignende problemer, samle en annen prøve fra motivet før du prøver å identifisere østrogensyklusfasen.
4. Når cellene er plassert og før du berører datamaskinen eller tastaturet, fjerner du den ene hansken for å forhindre tilsmussing av tastaturet.
5. Hent bilder av celleprøvene ved å klikke på funksjonen merket Snap på venstre side av programvarepanelet.
6. Deretter lagrer du filen ved å klikke på Lagre som under Fil-ikonet øverst til venstre på siden. Lagre bildet under en forhåndsmerket mappe på datamaskinen.
   MERK: Eksempeletikettmal: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective linsen som brukes.
7. Ta mer enn ett bilde ved hvert objektiv hvis det ikke er mange celler i hver ramme.
   MERK: Eksempeletiketter for flere bilder: #1_01/09/2021_EST_4x1 og #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. Gjenta prosedyren for hver innsamlede prøve under flere objektive objektiver. Inkluder minst én mindre objektivisering, for eksempel 4x, og minst én større objektivisering, for eksempel 20x.
9. Last opp bildene til en delt stasjon / mappe eller en ekstern harddisk, slik at alle involverte forskere har tilgang til filene, og det er sikkerhetskopier tilgjengelig.

5. Kategorisering av fase

1. Konfigurer dataskjermen til å vise bildene som er tatt samtidig, og opptaksarket (figur 4A-C).
   MERK: Dette gjør det mulig å se på dokumentasjonen mens du ser på prøven som er samlet inn. Denne delen av protokollen kan fullføres på tidspunktet for eksempelsamlingen eller senere.
2. Bestem hvilke celletyper som finnes i eksemplet. Velg blant de fire alternativene som er oppført i trinn 5.2.1-5.2.4 ved hjelp av kriteriene og registrer funnene.
   1. Anuklet keratinisert epitel (AKE)/cornified epitelceller
      1. Se etter taggete eller kantede celler, som vist i figur 2B og figur 5C, som til tross for mangel på kjerner, kan vise lyse runde områder (kjernefysiske spøkelser) i cellen som representerer hvor en kjerne en gang var til stede. Bruk høyere forstørrelse, for eksempel 20x og over, for å skille mellom slike nukleerte og anukserte celler.
      2. Bruk høyere forstørrelse til å skille den keratiniserte eller cornified delen av cellen – et tynt lag med celler som mangler kjerner og fylt med keratin – om ønskelig.
         MERK: I tillegg til deres hakkede utseende, kan disse også preges av hvordan de kan brette eller demontere, og skape hakkede og langstrakte strukturer kjent som keratinstenger.
   2. Store nukleerte epitelceller (LNE)
      1. Se etter disse vanligvis runde, polygonale cellene som er omsluttet av uregelmessige, ujevne eller kantede kantlinjer.
      2. Vær oppmerksom på hvordan deres kjerner kan ta på seg ulike former, alt fra intakt til degenerert eller pykontisk, relatert til irreversibel kondensering av kromatin i kjernen av en celle som gjennomgår død eller forverring, som vist i figur 2B og figur 5D1,2. Legg merke til hvordan disse kjernene opptar mindre plass enn cytoplasma i cellen, med et lavere kjernefysisk til cytoplasmisk (N:C) forhold enn de små epitelcellene. Se opp for cytoplasmatiske granulater som kan ses ved høyere forstørrelser¹³.
   3. Leukocytter (LEUer)/nøytrofiler/polymorfoukleære celler
      1. Se etter disse kompakte, sfæriske cellene med multilobuerte kjerner (derav kjent som polymorforukære celler), som forsvinner når cellen modnes (figur 2B og figur 5A). Høyere forstørrelse (f.eks. 40x) kan brukes til å observere de multilobubuerte kjernene.
         MERK: Ved innsamling og tilberedning kan disse cellene kondensere, brette eller briste.
   4. Små nukleerte epitelceller (SNE)
      1. Se opp for disse runde til ovalformede cellene som er større enn nøytrofiler beskrevet ovenfor.
      2. Vær oppmerksom på de runde kjernene i disse ikke-kapatiniserte epitelcellene (figur 2B), som tar opp en større mengde plass enn cytoplasma inne i cellen, og skaper et høyere N: C-forhold i forhold til store epitelceller.
         MERK: Ved innsamling og klargjøring kan disse cellene brette eller overlappe for å lage en form som ligner en streng eller stolpe, som vist i figur 5B1.
3. Undersøk hvordan cellene i eksemplet er organisert for hver objektivisering. Bruk den lavere objektiviseringen, for eksempel 4x, til å vise en representativ visning av den totale celleordningen. Registrer om cellene er klumpet sammen (C), jevnt spredt (ED) eller tilfeldig spredt (RD) (se figur 4C), og noter den spesifikke organiseringen av hver celletype (f.eks. små nukleerte epitelceller er klumpete, og nøytrofiler fordeles jevnt).
4. Deretter beregner og registrerer du det totale celleantallet visuelt (en smidge, moderat, mange) og de enkelte cellemengdene (prosentandelen av hver celletype som finnes).
   MERK: En smidge representerer det minste antallet celler som finnes som kan brukes til å bestemme prøvekategoriseringen, mange representerer tilstedeværelsen av et utallige antall celler som enten står for det meste, om ikke hele plassen på lysbildet eller er stablet oppå hverandre, og et moderat antall celler representerer et relativt gjennomsnittlig antall celler (eksempler sett i figur 5A-D og figur 6A-D).
5. Legg merke til om det er avvik fra enten de oppførte kriteriene eller aspektene som er typiske for det spesifikke emnet i kategorien "abnormiteter" og rådfør deg med en veterinær om nødvendig.
6. Bestem hvilket estrous syklusstadium som presenteres i eksemplet ved hjelp av kategoriseringskomponentene og beskrivelsene nedenfor.
   1. Dø
      1. Se etter LEUer som den dominerende eller eneste celletypen som er tilstede, ordnet på en klumpet måte i begynnelsen av DIE, men mer spredt i sene stadier.
         MERK: Når du går over til DIE, kan mengden celler reduseres etter hvert som epitelcellene begynner å brytes ned, som vist i figur 6D1. Samtidig begynner antall LEUer å øke, og de har en tendens til å bli arrangert på en klumpet måte i utgangspunktet og spre seg over tid.
      2. Legg merke til at den totale mengden celler kan være relativt lav, oftest i de senere stadiene av DIE-perioden, på den andre eller tredje dagen.
      3. Vær oppmerksom på den høye mengden slim som kan være til stede i dette stadiet, som presenterer som konsentrerte tråder av LEUer (figur 5A1). Se opp for små klumper eller cellulære tråder av SNE-celler som følger med LEUene i sene faser i overgangen til PRO (figur 5A1,2).
      4. Vær oppmerksom på det viskøse og ugjennomsiktige utseendet til vaginalvæsken når du går over til, helt overgang til og overgang ut av DIE.
         MERK: Den gjennomsnittlige varigheten av dette stadiet er 48 timer i løpet av en 4-dagers syklus og muligens 72 timer i løpet av en 5-dagers syklus.
   2. Proff
      1. Se etter SNE-celler som dominerende celler og for LEUer, LNE og/eller AKE-celler som kan ses i lave tall. Bruk høy objektivisering til å observere det detaljerte utseendet til SNE-cellene som vanligvis er ordnet i klynger, ark eller tråder i dette stadiet (figur 5B1,2).
      2. Vær oppmerksom på det viskøse og ugjennomsiktige utseendet til vaginalvæsken når du beveger deg fra DIE til PRO, og hvordan den blir nonviscous og gjennomsiktig når den er fullstendig overført til PRO-scenen (gjennomsnittlig varighet på 14 timer hos rotter).
   3. Est
      1. Se etter dominans av AKE-celler, en reduksjon av SNE-cellene i EST, og en økning i antall og størrelse på celler som EST fortsetter^11,13.
      2. Noter deg det særegne ved det ofte grupperte arrangementet av AKE-celler, i form av keratinstenger eller som inneholder spøkelseskjerner, som kan bli mer tilfeldig spredt i overgangen fra PRO (figur 6B) og til MET (figur 6C).
      3. Vær oppmerksom på den karakteristiske ikke-utviklende og gjennomsiktige vaginale væsken, som kan forventes når rottene går over til, helt overgang til og overført ut av EST.
         MERK: Utviklingen av EST inkluderer mye diversifisering (figur 5C og figur 6B, C). Scenen oppstår vanligvis i gjennomsnitt 24 timer i en 4-dagers syklus eller muligens 48 timer i en 5-dagers syklus.
   4. Møtte
      1. Se etter høyere antall SNE- og LNE-celler etter hvert som rotten går over til MET, enten dominerende når det gjelder celleproporsjoner i kanalen eller nær like stor andel av LEUene^11,13. Videre kan du notere deg større mengde rusk i MET og overgangene enn i andre stadier på grunn av epitelcellens forfall etter EST og flytting til DIE.
      2. Vær oppmerksom på mangelen på konsistent ordning ettersom alle celletyper ses og i forskjellige mengder (figur 5D1-3). Se imidlertid etter LEUene som er pakket eller klumpet i nærheten av epitelcellene i startfasen som kan gå tilbake til det klumpede arrangementet når du går over til DIE.
      3. Vær oppmerksom på det ikke-utydelige og gjennomsiktige utseendet til vaginalvæsken i dette stadiet og endringen til et mer viskøs og ugjennomsiktig utseende mens du beveger deg inn i DIE.
         MERK: Den gjennomsnittlige varigheten av dette stadiet er 6-8 timer.
7. Merk prøver i overganger med scenen motivet beveger seg mot, med overgangen i parentes for å spore når disse samles inn. Nærmere informasjon om hvordan man skiller mellom disse 4 stadiene og deres overganger finner du i de representative resultatene.
   MERK: Ettersom prøvene som samles inn, er statiske og syklusen er dynamisk, kan lysbildene skildre overganger mellom faser (ses i figur 6A-D).
8. Fullfør denne prosessen for hvert dyr til overvåkingsfasen er fullført.
9. På hver dag 11 (45 dager gammel) eller 21 (55 dager), euthanize rotter med 5% isofluran og 2% oksygen før en giljotin halshugging. Disse tidspunktene kan variere avhengig av studiens art.

Representative Results

De nåværende dataene gjenspeiler den for kvinnelige ungdommer SD International Genetic Standardization Program (IGS) i nærvær av mannlige SD-rotter. Disse dyrene var lokalisert ved både Pepperdine University og UCLA laboratorier som en del av en samarbeidsstudie. Figur 5 viser flere variasjoner av de fire syklusstadiene. Figur 5A1 ble identifisert som en diestrus-prøve med flere celletyper til stede. Dette eksemplet viser at prøver med et større antall epitelceller kvalifiserer som diestrus når de oppfyller de andre kategoriserende komponentkvalifikasjonene, for eksempel en dominans av LEUer. Denne prøven viste også mucus strand ordningen sammensatte LEUer ofte sett i dette stadiet, som ligner trådene som består av SNE celler sett i PRO scenen. For å skille en slimstreng i DIE-scenen fra trådene som vises i PRO-scenen som består av SNE-celler, er det viktig å identifisere dominansen til LEUer. Figur 5A2,3 viser en cellearrangementsprogresjon som ofte observeres – en innledende klumping av LEUene som samler inn og flytter til en tilfeldig (RD) eller til og med utbetaling (ED) i prøver samlet inn i senere perioder av DIE-fasen. Nærmere bestemt var figur 5A2 en DIE-prøve med mange celler til stede. Dette gjenspeiler hvordan LEUene også kan ledsages av et høyt antall epitelceller (figur 5A1,2), skilt fra metestrus av en dominans av LEUer og fravær av keratinbarer. I motsetning til dette viser figur 5A3 at et lavt totalt celleantall (en smidge) ofte ble sett i den senere fasen av DIE-fasen, for eksempel i løpet av den andre eller tredje dagen. Under PRO-fasen ble SNE-cellene ofte ordnet i tråder med mange celler stablet oppå hverandre (figur 5B1) eller en cellemidge ordnet i mindre klumper (figur 5B2). Figur 5B3 eksemplifiserer en PRO-prøve med den karakteristiske arklignende klumpingen av SNE-celler som overlapper og danner stolper som kan forveksles med keratinstengene som består av AKE-celler som finnes i EST-fasen. For å skille de to er det viktig å identifisere dominansen av SNE-celler i PRO og av AKE-celler i EST.

Figur 5C1,2 viser den typiske klumpingen og tilfeldig utbetaling av AKE-celler sett i EST, med førstnevnte inkludert mange celler og sistnevnte et moderat tall. Spøkelseskjerner, keratinbarformasjoner og bakterier som ofte samles inn i dette stadiet, ses i disse eksemplene. SNE-celler var til tider representert under EST-fasen (figur 5C1) som rester av forrige PRO-fase. Den sene EST-fasen, når SNE-celler begynner å dukke opp når motivet beveger seg mot MET, blir ofte forvekslet med PRO-scenen. For å skille de to er det viktig å ta hensyn til atomstørrelsen. Generelt har nukleerte celler i PRO et høyere N: C-forhold. Prøven vist i figur 5C3 presenterte et strandlignende arrangement av mange AKE-celler som ikke ble sett på som et kjennetegn ved EST-scenen. Dette viser at hvert dyr er unikt, at avvik fra kriteriene kan forekomme, og at de kategoriserende determinantene skal undersøkes i kombinasjon.

For å skille mellom EST og PRO når SNE-celler er til stede, ble det sett at et lavere N: C-forhold oppstod i disse cellene under EST-fasen. For å skille keratinstengene som finnes i EST fra de som dannes av overlapping eller rulling av SNE-celler i PRO-fasen (figur 5B3) og de som dannes ved å forfalle epitelceller i overgangen fra MET (figur 6D1), er det viktig å identifisere den dominerende celletypen, arrangementet og mengden for å skille scenen som representeres. Til slutt eksemplifiserer figur 5D1,2 kombinasjonen av alle celletyper som finnes i den tilfeldige utbetalingen som representerer MET-fasen. I tillegg til de mange cellene som er tilstede i disse eksemplene, var det vanlig å samle en høyere mengde rusk i løpet av dette stadiet (figur 5D2) på grunn av forfall av epitelceller etter EST og overgangen til DIE med en dominans av LEUer som fungerer for å fjerne vaginalkanalen av epitelceller. Figur 5D2 viser også hvordan MET kan skilles fra DIE ved sin høyere konsentrasjon av epitelceller og tilstedeværelsen av keratinstenger. Samlet sett skildrer disse representasjonene det brede spekteret som eksisterer i hvert trinn og er ikke-eksisterende.

Representasjoner av de 4 overgangsfasene er vist i figur 6. Mens denne studien kategoriserte prøver i overgangen som et av de 4 estrous syklusstadiene, er det fortsatt viktig å identifisere overgangsfasene riktig. I overgangen fra DIE til PRO (figur 6A) var det ofte en generell nedgang i antall LEUer og en økning i antall SNE-celler. LNE- og AKE-celler var til tider til stede i denne overgangen, men ikke i store mengder (figur 6A1). Figur 6A2-4 viser det høyere antallet klumpede og tilfeldig spredte SNE-celler som ofte ble samlet inn under denne overgangen, med et lavt antall tilfeldige og jevnt spredte LEUer. Totalt sett, når man skiller seg fra andre overgangsstadier, var det viktig å merke seg dominansen av SNE-celler og begynnelsen av klumper og strandformasjoner sett i PRO. Alle eksemplene i figur 6A representerer et mange celleantall unntatt figur 6A4, med en smidge. I figur 6B viser bildet et eksempel på mange klumpete SNE- og AKE-celler som ses i overgangen fra PRO til EST.

Under denne overgangen er SNE-celler sett på som i høyere antall med mindre klumpete og mer tilfeldige utbetalinger av AKE-celler enn under EST. Figur 6C viser fremveksten av AKE, SNE og LNE og nedgangen i AKE-celler i overgangen fra EST til MET med et høyt antall celler. Restene som er tilstede representerer de forfallende AKE-cellene fra forrige østrusstadium som ofte ses i metestrus. Dette er også sett i den siste overgangsfasen, fra MET til DIE, hvor epitelcellene begynte å forfalle og produsere rusk (figur 6D1,2), med mange celler tilstede i førstnevnte og et moderat antall i sistnevnte. Disse tallene viser fenomenet LEUer som øker i antall for å bli den dominerende celletypen i overgangen til diestrus. For gruppen som ble overvåket i 20 dager (n = 3), var det 12 dager da overgangsprøver ble samlet inn, med et gjennomsnitt på 4. For gruppen som ble overvåket i 10 dager (n = 3), var det 9 dager da overgangsprøver ble samlet inn, med et gjennomsnitt på 3.

Figur 7 representerer ugunstige celleprøvesamlinger, hvorav de fleste berettiget gjentatte toaletter. Figur 7A1 viser en masse kvadumceller samlet på grunn av feil sprøyteinnsetting og ekstraksjon, noe som fører til at squamousceller suges av vaginal kanalvegg. Disse cellene kan skille seg fra klumpete epitelceller eller LEUer på grunn av massens høye tetthet og kompaktitet og dens særegne grenser. Figur 7B representerer en samling rusk, der ingen celler ble trukket ut, fokusplanet er feil eller lysbildet ikke ble fullstendig skannet for celler. Rusk kan skille seg fra celler gjennom kjennskap til celletypene og den ofte karakteristiske lille størrelsen og klumpingen. Dette rusk stammer ofte fra dyre sengetøy, hår eller celle forfall. Figur 7C viser et lysbilde som inneholder et celleantall som er under en smidge. Mens lave celletall ofte ble sett under sen MET og tidlig DIE, representerer dette lysbilder som har for få celler til å kategoriseres nøyaktig i et stadium.

Figur 7D viser to eksempler på NaCl ekstraksjonsløsning kombinert med vaginal væske fra kanalen på mikroskopet lysbilde. I det første bildet, figur 7D1, var væsken til stede og ute av fokus, noe som hindret evnen til å kategorisere nøyaktig. I figur 7D2 ble væsken spredt over skredet i sammenhengende sirkler sammen med LEUene. Selv om dette eksemplet ikke krever gjentatt lavage på grunn av høy celletilstedeværelse, er det viktig å vurdere mengden væske som er plassert på lysbildet og plasseringen av mikroskopdeksellyset for å forhindre smøring. Totalt sett understreker disse bildene viktigheten av å fange kvalitetsrepresentantbilder for riktig kategorisering. Dette inkluderer å vurdere hvordan celleuttrekking, fokusplan og innholdet i bildet er ved å skanne hvert lysbilde før du tar et bilde.

Etter å ha kategorisert hvert dyr i eksperimentell(e) gruppe(r), er det vanlig å grafe sceneprogresjonene på enten en stolpe eller linjegraf. Dette gjør det mulig for forskere å undersøke det generelle syklusmønsteret og identifisere når dyret presenterer en uregelmessig progresjon av østrogenstadiene, kjent som acyklisitet. Prøvene kan deretter analyseres av sykluslengden og faseprogresjonsmønsteret i dette analyseverktøyet. Vist i figur 8A,B, inkluderer dette konseptet tildeling av stenger av varierende høyder, når det gjelder denne studien, til de enkelte stadiene og oversettelse av de registrerte dataene (figur 4B) over x-aksen. I disse eksemplene representeres MET og DIE av de laveste, PRO i midten og EST av de høyeste barhøydene. På grunn av den korte varigheten av MET-scenen, kombineres den med DIE-scenen i en bar. Selv om det finnes forskjellige metoder for å måle syklusfullføringer, er det vanlig å telle en komplett syklus som bevegelsen fra en EST til en annen¹¹. Dette gjenspeiler imidlertid ikke en syklusfullføring, men en 2-dagers EST-trinnsvarighet når det er påfølgende EST-stadier.

Figur 8A gjenspeiler data fra en rotte som utvikler seg gjennom en konsistent og repeterende progresjon gjennom MET/DIE, PRO og EST. I tillegg falt denne rotten innenfor området 4- til 5-dagers sykluser med en gjennomsnittlig lengde på 4,375. Hvert trinn overskrider ikke de standardiserte lengdeområdene, med et gjennomsnitt på 1,0625 dager brukt i EST, en typisk evaluering for acyklisitet. Hvis dataene som ekstraheres følger dette mønsteret av EST til EST med regelmessighet, bekrefter dette ikke bare at subjektets hormonnivåer forblir innenfor akseptable områder, men også at prosedyren ble utført uten å forstyrre prosessens sykliske karakter betydelig. Til slutt fullførte denne rotten 16 sykluser, bestemt ved å telle antall EST til EST-barer.

Figur 8B representerer vanlige typer asykliitet, inkludert utvidede (sett på som EXT) og ikke-registrerte stadier. Denne figuren fremhever også viktigheten av å undersøke både syklusmønsteret og lengden og antall dager brukt i hvert trinn. Spesielt i dette eksemplet, mens gjennomsnittlig sykluslengde og antall dager i EST faller innenfor skisserte parametere, avslørte syklusmønsteret for stadiumprogresjon abnormiteter. Derfor er det viktig å undersøke østrogensyklusen grundig. Både utvidet DIE (merket som Ext Diest) og EST (merket som Ext Est) stadier ble registrert gjennom syklusene vist i figuren, og det var flere sykluser der PRO-scenen ikke ble registrert. Dette eksemplet viser også viktigheten av å undersøke antall påfølgende stadier sett, som faller utenfor typiske områder, i stedet for bare å undersøke gjennomsnittlig lengde på syklusen og dagene i EST, som faller innenfor typiske områder.

Årsakene og korrelasjonene i disse eksemplene kan omfatte faktorer som fysiologiske abnormiteter (svulster, pseudopregnans, langvarig stress), skadelige miljøforhold (langvarig belysning, eksponering for giftige kjemikalier, ensomt hus), feil tidspunkt for prøvetaking, forskerfeil (dårlig prøvetaking, bildefangst, feil iscenesettelse), aldersrelaterte fenomener (vanlig uregelmessighet sett i ungdomsårene og reproduktiv senescence), eller avvik som er unike for den spesifikke dyr. For å skille forskerfeil eller feil tidspunkt for prøvetaking og fysiske abnormiteter eller aldersrelaterte fenomener, er det nyttig å undersøke de 4 kategoriserende komponentene mer detaljert. Dette kan bidra til å bestemme mulige årsaker til uregelmessigheter eller i bredere forstand kunne brukes i studier som studerer østrogen syklusegenskapene nærmere.

Figur 9 illustrerer denne nærmere inspeksjonen ved å inkludere totale og individuelle cellemengder på y-aksen, celletype(r) representert av forskjellige stolpefyllfarger, og celleoppsett representert av ulike stolpefyllmønstre, som er fremhevet over den totale overvåkingsperioden. Denne analysemetoden tillot undersøkelse av totalt antall sykluser fullført, lengden på hver syklus, stadiumprogresjon og kategoriseringskomponentene mer detaljert for hver enkelt rotte. Figur 9A representerer en rotte som hadde et lavere enn gjennomsnittlig antall sykluser, med totalt 3 fulle sykluser i løpet av de 10 dagene overvåket-to 3-dagers sykluser og en 5-dagers syklus (gjennomsnitt på 3,67). Uregelmessigheten sett i sceneprogresjonen med 50% av dagene inkluderte ett eller flere uinnspilte stadier og 30% av prøvene som ble samlet inn var i overgang - dag 2 som MET-DIE, dag 5 som en EST-MET, og dag 8 som en PRO-DIE-overgang. Dette kan ha vært på grunn av feil tidspunkt for utvalgsinnsamling, forskerfeil, et aldersrelatert fenomen eller unike avvik. Videre overvåking kunne ha gitt klarhet i hvilken som gjaldt.

De typiske dominerende arrangementene, celletypene og individuelle og totale cellemengder ble sett i hvert av stadiene som ble registrert. Innenfor EST-stadiene ble det sett en smidge (25 % av prøvene), moderate (25 % av prøvene) og mange (50 % av prøvene) klumpede AKE-celler, med lavere tilstedeværelse av LEUer, SNE og LNE-celler. I det ene MET-stadiet som ble tatt opp, var en kombinasjon av mange tilfeldig spredte LEUer (50 %), AKE-celler (20 %), LNE (15 %) og SNE-celler (15 %) til stede. For DIE-stadiene ble en smidge (50% av prøvene) og mange (50% av prøvene) mengde tilfeldig spredt, jevnt spredt, og en kombinasjon av dominerende LEUer ble sett ispedd AKE-, LNE- og SNE-celler. I det ene PRO-stadiet som ble samlet inn, var en smidge av tilfeldig spredte LEUer (60% av cellene tilstede) og SNE-celler (40% av cellene tilstede), som var i en kombinasjon av ordninger, til stede, noe som representerer en overgang fra DIE til PRO.

I figur 9B hadde den representerte rotten totalt 3 komplette sykluser, med et 4-dagers syklusmønster. De innsamlede prøvene representerte ikke en konsistent faseprogresjon, med en utvidet DIE-periode (dag 6-9) og 5 andre forekomster av ikke-innspilte stadier (2 uinnspilte MET-stadier, 2 uinnspilte PRO-stadier og 1 uinnspilt EST-fase). Ettersom bare 20% av prøvene var i overgang (dag 3 som DIE-PRO, dag 5 som EST-MET, dag 18 som MET-DIE, og dag 19 som DIE-PRO), og bare 3 stadier ikke ble dekket utenfor MET-scenen og den langvarige DIE-perioden, ble det konkludert med at tidspunktet for prøveinnsamling var egnet for dette spesifikke dyret. Ettersom de siste 10 dagene som ble overvåket inkluderte en bestilt progresjon gjennom de 4 stadiene, kunne de første uregelmessighetene tilskrives ungdomsalderen. Jo mer økt overvåkingsvarighet (20 dager) som gjør det mulig å finne ut av denne konklusjonen.

Undersøkelsen av kategoriseringskomponentene avslørte typiske områder. EST-stadiene reflekterte en dominans av en moderat (50% av prøvene) til en rekke mengde (50% av prøvene) av klumpede AKE-celler med færre LEUer, SNE og LNE-celler. I MET-prøvene som ble samlet inn, var det en kombinasjon av en moderat (33,33% av prøvene) til mange (66,67% av prøvene) tilfeldig spredte og klumpete LEUer (med et mengdeområde på 10-90%), klumpete SNE (0-30%), tilfeldig dispergert LNE (0-10%), og klumpete og tilfeldig spredte AKE-celler (10-90%). DIE-stadiene reflekterte en dominans av en moderat (20%) til en rekke (80% av prøvene) mengde jevnt spredt, tilfeldig spredt og klumpete LEUer (område på 50-100%) i nærvær av både tilfeldig spredte AKE- og SNE-celler. PRO-stadiene ble identifisert ved dominansen av en smidge (3,33% av prøvene) og mange (66,67% av prøvene) mengde tilfeldig spredt og klumpet SNE (10-99%) celler i nærvær av LEUer, AKE og LNE-celler.

Et annet alternativ når du analyserer dataene som trekkes ut, er opprettelsen av estrous syklusprofiler ved å inkludere elementene som tidligere er beskrevet – totalt og individuelt celleantall på y-aksen, celletype(r) representert av forskjellige stolpefyllfarger, og celleoppsett representert av forskjellige stolpefyllmønstre, som er grafert over den totale overvåkingsperioden for hvert syklustrinn. Dette kan fullføres per rotte eller gjennomsnitt av hele gruppen. Formålet med dette analyseverktøyet er å undersøke kategorisering av komponenttrender per trinn, noe som hjelper det generelle vitenskapelige samfunnet med å karakterisere kategorisering av komponentforskjeller som er spesifikke for de estetiske syklusfasekategoriseringene. I figur 10A1 viste den 10 dagers DIE-profilen en dominans av moderate (50 % av prøvene) og en rekke (50 % av prøvene) av jevnt spredte LEUer (gjennomsnitt på 78,25 %) sammen med færre SNE-, AKE- og LNE-celler. I figur 10A2 viste den 20 dagers diestrus-profilen en dominans av moderate (20% av prøvene) og mange (80% av prøvene) mengde jevnt spredt, klumpet og tilfeldig spredte LEUer (gjennomsnittlig 82% som til stede i alle 10 dager) sammen med et lavere antall AKE- og SNE-celler.

PRO-fasen som ble utstilt i figur 10B1 , viste en dominans av et moderat antall tilfeldig spredte SNE-celler (60 %) i nærvær av LEUer og AKE-celler. Den 20 dagers PRO-sceneprofilen i figur 10B2 viste en dominans av en smidge (33,33% av prøvene) og en rekke (66,67% av prøvene) av en kombinasjon av ordninger og tilfeldig spredt SNE (gjennomsnitt på 66,33% som til stede i alle 3 prøver) celler sammen med LEUer og AKE-celler. Den 10 dagers EST-profilen sett i figur 10C1 viste en dominans av en moderat (50% av prøvene) eller en rekke (50% av prøvene) mengde AKE-celler (gjennomsnitt på 80% for de 2 dagene som er til stede) i en kombinasjon av ordninger, sammen med et lavere antall LEUer, SNE og LNE-celler. I figur 10C2 viste den 20 dagers EST-profilen en dominans av moderate (75% av prøvene) eller en rekke mengde (15% av prøvene) antall tilfeldig spredte AKE (gjennomsnitt på 57,5% for de 4 dagene som er til stede) celler eller de i en kombinasjon av ordninger, sammen med et lavere antall LEUer, SNE og LNE-celler.

Den 10 dagers MET-sceneprofilen i figur 10D1 inkluderte mange tilfeldig spredte LEUer (50 %), AKE-celler (20 %) og SNE-celler (30 %). Den 20 dagers MET-sceneprofilen i figur 10D2 viste en moderat (3,33 % av prøvene) eller en rekke (6,667 % av utvalgene) av LEUer (gjennomsnitt på 50 % i alle3 prøver), SNE (gjennomsnitt på 15 % per nå i alle de 3 prøvene), AKE-celler (med 23,33 % i de 3 prøvene til stede), LNE-celler (gjennomsnitt på 15 % i alle de 2 prøvene som finnes). Halvparten av LEUene ble tilfeldig spredt (1 prøve) og de resterende 50 % var en kombinasjon av ordninger (1 prøve). To tredjedeler av SNE-cellene ble tilfeldig spredt når de var til stede, mens de resterende 33,33% var i en kombinasjon av ordninger når de var til stede (1 av 3 prøver). Til slutt ble 66,67% av AKE-cellene klumpet i prøvene til stede (2 dager), mens de resterende 33,33% var i en kombinasjon av ordninger (1 dag). Tabell 1 inneholder de numeriske gjennomsnittene av de kategoriserende determinantene fra de to gruppene. Mens dataene i figur 9A, B og figur 10A-D inkluderer informasjon om kategoriserende determinanter fra individuelle dyr, inkluderer disse tabellene gjennomsnitt for østrusstadiet som et eksempel. Når disse parametrene reproduseres i andre laboratorier, kan de bli standarden for stadiumidentifikasjon. Dette kan igjen redusere subjektivitetsnivået som for tiden er involvert i iscenesettelsesprosessen.

Statistikk
Generelt er det noen få parametere å vurdere når man tolker syklusegenskapene, selv om det er mangel på konsensus om hva som anses som "unormalt", og avvik er typiske. Goldman et al. identifiserer "vanlig" som en 4-5 dagers syklus med 24-48 h EST og 48-72 h DIE trinn¹¹. Avvik fra disse parametrene kan skyldes ulike faktorer, inkludert en eller flere fysiologiske abnormiteter, feil innsamlingstid eller den første acykliceniteten som ofte oppleves av ungdomsrotter når hormonnivåene modnes. I tillegg til å konsultere laboratorieveterinæren, muliggjøre en prøveinnsamlingsperiode for å sikre riktig timing, og overvåke dyr forbi ungdomsårene for å etablere en komparativ tidslinje, kan statistiske analyser være nyttige for å tilskrive årsakssammenheng og / eller korrelasjon til eventuelle abnormiteter. Etter å ha karakterisert syklusene i kategorier (f.eks. konsistent og unormal), kan en kjikvadratanalyse bidra til å sammenligne gruppene. I tillegg kan kategoriseringskomponentene eller de generelle syklusegenskapene sammenlignes med postintervention ved hjelp av variansanalyse (ANOVA)¹¹. Slike avvik kan imidlertid ikke være biologisk meningsfylte, som omtalt i innledningen, og derfor må den eksperimentelle konteksten vurderes.

Figur 1: Hormon rytmiskhet i østrogen syklus stadier. (A) De varierende kjønn steroid hormon nivåer under fremtredende østrogen syklus stadier er skissert og oppsummert. Stadiumprogresjonen begynner og slutter med metestrus for å demonstrere bygningshormonnivået og den sirkulære progresjonen av prosessen. Tilpasset fra en ekstern kilde¹¹. (B) Flyt av sex steroid hormoner fra sentralnervesystemet til reproduktive systemet via blodet. Det er sett at hormonnivåene økes gjennom signaler fra hypothalamus og hypofysen via gonadotropin-frigjørende hormon (GrH eller LHRH) og kombinasjonen av follikkelstimulerende hormon og luteiniserende hormon, henholdsvis. Dette inkluderer både positive og negative feedback sløyfer avhengig av konsentrasjonen av østradiol og progesteron. Informasjon¹⁷ og bilder sporet fra eksterne kilder 65,66,67. Forkortelse: LHRH = luteiniserende hormonfrigjørende hormon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Estrous syklus kategorisering av determinanter målt. (A) Her er komponentene som brukes ved klargjøring av celleprøvene som samles inn, og de dominerende komponentene for hvert trinn. Det er viktig å huske at dette er generelle parametere og forskjeller forventes. (B) Her er de dominerende celletypene som finnes i hvert trinn. Selv om dette er generelle inndelinger, finnes hver celletype i alle faser. (C) Presentert her er cellearrangementstypene som finnes i denne studien. (D) Bildet her gjenspeiler de typiske cellemengdene som finnes i hvert av de fire østrogensyklusstadiene, med kvadrantvolumet som representerer de omtrentlige cellemengdene. Hentet fra en ekstern kilde¹³ og tidligere tilpasset⁶⁸. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Vaginal åpning i Sprague Dawley rotter. (A) Anatomisk orientering av uutviklede ytre kjønnsorganer og vaginal åpning som fører til vaginal kanal i forhold til urinrørsåpningen. (B) Visuell representasjon av det uutviklede området, merket med en pil. (C) Anatomisk orientering av utviklede ytre kjønnsorganer og vaginal åpning i forhold til urinrørsåpningen, vanligvis forekommende rundt 34 dager gammel. (D) Tilsvarende representasjon av det utviklede området skissert i bilde A. Alle tall hentet fra en ekstern kilde²⁹. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Kategorisere determinanter dataregistreringsmal. (A) Ett alternativ for dataregistrering; inneholder beskrivelser av kategorisering av determinanter. Dette skal brukes daglig, en for hver rotte overvåket. (B) Denne malen er et alternativ for dataregistrering, med en forenklet registrering av kategoriserende determinanter og rotteidentifikasjon. Dette gjør at notater kan legges inn i dataarket i den andre PRO-kategoriseringen. Fargen på den øverste raden gjenspeiler fargen som er tilordnet den eksperimentelle gruppen som er representert, noe som bidrar til å skille en gruppe fra en annen. (C) Et annet malalternativ; omfatter alle kategoriserende determinanter og kan endres basert på studiens personlige preferanser eller mål. Forkortelser: AKE = anuklet keratinisert epitel; LEU = leukocytter; LNE = stor nukleert epitel; SNE = liten nukleert epitel; C = klumpet; ED = jevnt spredt; RD = tilfeldig spredt; COM = kombinert; SMD = smidge; MOD = moderat; NUM = mange; EXE = trening; SED = stillesittende; Est = østrus; Die = diestrus; met-die = metestrus-diestrus overgang; Pro = proestrus; pro-Est = proestrus-østrus overgang; ** = kvalitetseksempel som kan være nyttig i en publikasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Scenekategoriserende determinante variasjoner. (A) Denne bildeserien viser ulike eksempler på diestrus-scenen. Det første bildet (A1) skildrer en forekomst av slim representert av tråder av konsentrerte LEUer, med epitelceller tilstede i tilfeldige utbetalinger. Dette er et eksempel på viktigheten av å bruke både 4x og 10x forstørrelse. Denne 4x forstørrelsen ser ut som en proestrusstreng, men ved nærmere inspeksjon ved 10x viser en dominans av LEUer. Det andre bildet (A2) skildrer det som ofte ble sett i diestrus stadier-en dominans av LEUer sett sammen med et klumpet arrangement av epitelceller: SNE, LNE og AKE celler. Det siste bildet i denne serien (A3) gjenspeiler en tilfeldig utbetaling av LEUer, ofte sett i diestrus-fasen midt i vaginale og saltvannsvæskedråper. (B) Denne serien med bilder viser ulike eksempler på proestrusstadiet. Det første bildet (B1) viser et klumpete arrangement av SNE-celler i tråder. Det andre bildet (B2) gjenspeiler et lysbilde med et lavere totalt celleantall og en klump av SNE-celler. Det tredje bildet (B3) viser den vanlige klumpingen og mer tilfeldig utbetaling av SNE-celler og lavt antall LEUer og AKE-celler. (C) Denne serien av bilder viser ulike eksempler på østrus scenen. Det første bildet (C1) viser et vanlig klumpete arrangement av AKE-celler, med keratinstolpeformasjoner, i nærvær av SNE-celler. Det andre bildet (C2) presenterer klumpingen av AKE-celler med spøkelseskjerner og bakterier. Det siste bildet (C3) presenterer et strandlignende arrangement av AKE-celler. (D) Denne bildeserien viser ulike eksempler på metestrusstadiet. Det første bildet (D1) viser tilfeldig utbetaling og klumping av LEUer, SNE-celler, AKE-celler og LNE-celler i nærvær av rusk. Det andre bildet (D2) gjenspeiler alle celletyper som finnes i et klumpete arrangement, sammen med keratinlinjer. Det siste bildet (D3) viser et mer omfattende arrangement av LEUs-, SNE-, AKE- og LNE-cellene som finnes. Disse tallene, tatt ved objektifiseringen av enten 4x (A1, A2, B2, B3, D1 og D3) eller 10x (A3, C1, C2, C3 og D2), er zoomet inn for å muliggjøre økt visualisering av kategoriseringskomponentene. Skalastenger = 100 μm. For størrelsesreferanse; AKE-celler har en diameter på ca. 40-52 μm, LEUer på ca. 10 μm, LNE-celler på 36-40 μm og SNE-celler på ca. 25-32 μm¹⁶. Forkortelser: SNE = liten nukleert epitel; LNE = stor nukleert epitel; AKE = anuklet keratinisert epitel; LEUer = leukocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Eksempler på overgangstrinn. (A) Denne bildeserien viser eksempler på overgangen mellom DIE- og PRO-stadiene. Det første bildet (A1) presenterer store klumper og tilfeldig utbetaling av LEUer, SNE-, LNE- og AKE-celler. Det andre bildet (A2) inneholder en stor masse klumpete LEUer og SNE med interspersed tråder av LEUer. Det tredje bildet (A3) inkluderer klumper og til og med utbetalinger av LEUer og en liten mengde SNEer. Det fjerde og siste bildet (A4) viser både klumpete og tilfeldige ut utbetalte SNE-celler og LEUer. (B) Dette bildet viser et eksempel på overgangen mellom PRO- og EST-stadier med klumping av SNE- og AKE-celler. (C) Dette bildet viser klumpete og tilfeldig utbetaling av AKE-, SNE- og LNE-celler sett midt i rusk for å representere overgangen fra EST til MET. (D) Det første bildet (D1) skildrer et eksempel på overgangen mellom MET- og DIE-stadier, med forfallende epitelceller som følger med en økning i LEUer. Det andre bildet (D2) viser AKE-celler i nærvær av klumpede LEUer og SNE-celler som tidligere er beskrevet. Disse tallene, tatt ved enten 4x (A1, A2, A3, B og C) eller 10x (A4, D1 og D2) forstørrelse, har blitt zoomet inn for å muliggjøre økt visualisering av kategoriseringskomponentene. Skalastenger = 100 m. For størrelsesreferanse har AKE-celler en diameter på ca. 40-52 μm, LEUer på ca. 10 μm, LNE-celler på 36-40 μm og SNE-celler på ca. 25-32 μm¹⁶. Forkortelser: AKE = anuklet keratinisert epitel; LEUer = leukocytter; LNE = stor nukleert epitel; SNE = liten nukleert epitel; C = klumpet; EST = østrus; DIE = diestrus; PRO = proestrus; MET = metestrus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Ugunstige celleprøvesamlinger. (A) I disse to bildene ble squamousceller sugd fra vaginal kanalvegg, i tillegg til tilfeldig spredte LEUer. (B) Dette bildet inneholder en lav mengde rusk, der celler enten ikke ble sett eller ikke samlet inn. (C) I dette eksemplet ble det sett et totalt lavt celleantall. (D) I disse to bildene (D1 og D2) ble natriumklorid (NaCl) ekstraksjonsløsning og vaginalvæske sett og spredt over mikroskopets lysbilder. Disse tallene, tatt ved enten 4x (A1, A2 og D1) eller 10x (B, C og D2) forstørrelse, har blitt zoomet inn for å muliggjøre økt visualisering av kategoriseringskomponentene. Skalastenger = 100 μm. For størrelsesreferanse har AKE-celler en diameter på ca. 40-52 μm, LEUer på ca. 10 μm, LNE-celler på 36-40 μm og SNE-celler på ca. 25-32 μm¹⁶. Forkortelser: AKE = anuklet keratinisert epitel; LEUer = leukocytter; LNE = stor nukleert epitel; SNE = liten nukleert epitel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Regelmessig og uregelmessig sykkelmønsterprøve. (A) Dette bildet gjenspeiler totalt 16 komplette sykluser som utvikler seg gjennom et repeterende og konsistent mønster, noe som gjenspeiler den vanlige svingningen av kjønns steroidhormoner. Innenfor dette er diestrus representert av den laveste, proestrus av midten, og østrus er representert av baren i høyeste høyde. Disse dataene analyseres ved å spore dagene mellom østrusstadier, med hver østrus-til-østrus som representerer en full syklus. Disse dataene gjenspeiler data fra de kvinnelige rottene som ligger ved UCLA. (B) Dette bildet representerer en teoretisk kombinasjon av ulike asykliske mønstre på 22 rotter. Utvidet østrus kan sees med flere repeterende dager med barer i full høyde, utvidede diestrus sett med flere repeterende dager av laveste barhøyde, og fraværet av det sykliske mønsteret av progresjon fra diestrus gjennom metestrus. Forkortelser: Est = østrus; Diest/Die = diestrus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: Individuell kategorisering av determinanter. (A) Denne stablede stolpediagrammet gjenspeiler hver komponent i verktøyene som brukes til å kategorisere individuelle prøver som samles inn i de estrøse prøvestadiene. Her viser et emne som ble overvåket i 10 dager en rekke celletyper, mengder og ordninger. Dette forventes for ungdomsdyr, da hormonelle nivåer vanligvis ikke blir konsistente eller regulariserer til voksen alder. (B) Her presenteres en estrous profil for et dyr som ble overvåket i 20 dager. Lignende uregelmessigheter kan ses her, hvor motivet forble i diestrus i 4 dager vs. den typiske 1-2. Disse dataene representerer de 6 kvinnelige rottene som ligger ved Pepperdine University. Forkortelser: AKE = anuklet keratinisert epitel; LEU = leukocytter; LNE = stor nukleert epitel; SNE = liten nukleert epitel; C = klumpet; ED = jevnt spredt; RD = tilfeldig spredt; COM = kombinert; SMD = smidge; MOD = moderat; NUM = mange; EXE = trening ; SED = stillesittende; Est = østrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus.

Figur 10: Sceneprofiler. (A) Denne delen viser kategorisering av determinante data for individuelle rotter i løpet av hver dag kategorisert som diestrus. Det første bildet (A1) representerer data samlet inn over 10 dager og det andre (A2) i 20 dager. (B) Denne delen viser data for individuelle rotter i løpet av hver dag kategorisert som proestrus. Det første bildet (B1) representerer data samlet inn over 10 dager og det andre (B2) i 20 dager. (C) Dette viser data for individuelle rotter i løpet av hver dag identifisert som østrusstadium. Det første bildet (C1) representerer data samlet inn over 10 dager og det andre (C2) i 20 dager. (D) Denne delen av serien viser kategorisering av komponentdata for individuelle rotter i løpet av hver dag identifisert som metestrusstadium. Det første bildet (D1) representerer data som samles inn over en periode på 10 dager og det andre (D2) i 20 dager. Dataene i disse tallene gjenspeiler at av 6 kvinnelige rotter plassert ved Pepperdine University. Forkortelser: AKE = anuklet keratinisert epitel; LEU = leukocytter; LNE = stor nukleert epitel; SNE = liten nukleert epitel; C = klumpet; ED = jevnt spredt; RD = tilfeldig spredt; COM = kombinert; SMD = smidge; MOD = moderat; NUM = mange; EXE = trening ; SED = stillesittende; Est = østrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

EST: 10 dager	Varighet (dager)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	SNE (%)	Totalt celleantall (%)
	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44.44 NUM: 44.44 SMD: 11.11
Områder	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge –mange
	Ordning	C: 50 ED: 0 RD: 50	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 50 ED: 0 RD: 50
EST: 20 dager	Varighet (dager)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	SNE (%)	Totalt celleantall (%)
	4	71.92	5.5	2.92	19.67	MOD: 50 NUM: 50 SMD: 0
Områder	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge –mange
	Ordning	C: 60 ED: 6.67 RD: 33.33	C: 0 ED: 12.5 RD: 87.5	C: 33.33 ED: 0 RD: 66.67	C: 44.44 ED: 0 RD: 55.56

Tabell 1: Gjennomsnittlig fasedeterminantprøve. Disse tabellene viser gjennomsnittet for kategorisering av determinanter og oversikt for alle EST-stadier som samles inn. Den øvre tabellen gjenspeiler gjennomsnittet for alle dyr som overvåkes i 10 dager og det nedre bordet i 20 dager. Dette inkluderer varigheten av estrous syklusen, celletyper og prosenter, og cellearrangementer og prosentandelen av hver ordning sett for hver celletype. Disse dataene gjenspeiler data fra 6 kvinnelige rotter plassert ved Pepperdine University. Forkortelser: AKE = anuklet keratinisert epitel; LEU = leukocytter; LNE = stor nukleert epitel; SNE = liten nukleert epitel; C = klumpet; ED = jevnt spredt; RD = tilfeldig spredt; EST = østrus.

Discussion

Viktige trinn og viktige hensyn
Visse kritiske trinn i den medfølgende protokollen krever vekt, spesielt innenfor samlingen av vaginale celler. Under vaginal væskeutvinning er det viktig å sikre riktig vinkel og dybde for sprøyteinnsetting for å produsere tilfredsstillende resultater og til slutt forhindre irritasjon, skade eller cervical stimulering til dyret. Stimuleringen av livmorhalsen kan være en kilde til pseudopregnancy induksjon, indikert med 12-14 dager med en leukocytt-bare vaginal smør¹¹. Under mikroskopevalueringsfasen er det avgjørende å fokusere på det visuelle planet som viser vaginalcellene som samles inn. Dette fullføres ved å identifisere en eller to celler og justere visualiseringen til fokus er oppnådd.

Etter dette oppstår fangst av representative bilder av vaginalcellene for iscenesettelse ved å skanne hele mikroskopet. Dette sikrer at bildene som er tatt gjenspeiler en nøyaktig skildring av hva som samles og presenteres i dyrenes vaginale kanal. Før kategorisering er det nødvendig med kjennskap til de kategoriserende determinantene, for eksempel å skille celletypene og de forskjellige transformasjonene hver celletype kan ha. Det anbefales at hver deltaker er riktig opplært og praktiserer sceneidentifikasjon gjennom forhåndsforberedte øvelseslysbilder.

For å redusere mengden bias og subjektivitet som er involvert i prosessen, anbefales det å inkludere to deltakere i kategoriseringsfasen, begge forblir blinde for behandlingsgruppeoppgavene mens de kjenner tidligere registrerte sceneidentifikasjoner for hvert dyr. Hvis du tilordner to deltakere til å kategorisere prøver, kan du delta på konferansen og redusere subjektiviteten i identifikasjonene. Men hvis deltakerne skal kategorisere prøver separat, anbefales det at det er en innledende samarbeidsperiode for å øke påliteligheten mellom rater etter hvert som kompetanse utvikles. Et sekundært eksamenssystem kan brukes for å forhindre inkonsekvente funn, for eksempel utveksling av datasett etter kategorisering og bruk av bildene for å bekrefte de første vurderingene.

Begrensninger og modifikasjoner
Begrensninger i den nåværende teknikken inkluderer varigheten av levedyktighet. På grunn av skaden eller irritasjonen som kan følge med repeterende innsetting av en sprøyte, er langvarig og tilbakevendende overvåking ikke i tråd med riktig pleie og bruk av dyr. Derfor, når du utfører en langsgående studie, kan det være nødvendig å endre prosedyren ved å redusere lavens frekvens. For eksempel, i stedet for å overvåke hvert dyr en gang per dag, kan rottene deles inn i grupper som overvåkes på forskjellige dager i løpet av uken. En annen begrensning innebærer fravær av prøvefarging i prosessen skissert, uten separasjon av cellulære komponenter etter farge, noe som skaper større avhengighet av kategoriseringsdeterminantene som er oppført i protokollen ovenfor.

I tillegg, innenfor slike kategoriseringsdeterminanter, er det elementer av subjektivitet som kan begrense presis replikering. Spesielt er cellemengdeprosentene i innsamlede prøver basert på personlige beregninger. Endringer i denne forbindelse kan omfatte å utvikle en matematisk algoritme for å kvantifisere de enkelte celletypene som finnes. Alternative modifikasjoner kan omfatte antall prøver som er avsatt på ett mikroskopsklie, som kan økes avhengig av størrelsen på lysbildet og dekselet. Ytterligere begrensninger kan omfatte mangel på vaginale væskedata i denne studien – en modifikasjon av fremtidige studier kan omfatte registrering av forholdene i vaginalvæsken samlet inn som et bidrag til scenekategorisering. Ytterligere modifikasjoner av protokollen kan omfatte bruk av en annen isotonisk væske for celleutvinning, noe som vil gi de samme resultatene, for eksempel fosfatbufret saltvann¹³. Til slutt, når du bruker denne prosedyren på rotter i forskjellige aldre eller stammer, kan det være nødvendig med modifikasjoner som dyrehåndteringsteknikker på grunn av kroppsstørrelse eller aktivitetsnivå. Dette kan omfatte^{gripemetoden 69} og Forelimb Crisscross^64-metodene for voksne og en- og tohånds Restraint^64-metoden som brukes for yngre rotter.

Alternative metoder
Sammenlignet med alternative metoder for estrous syklus overvåking, vaginal lavage er unik i sin nøyaktighet, mengde informasjon produsert, minimal invasivitet, og lave tilknyttede kostnader. Den histologiske undersøkelsen av livmor og eggstokkene kan brukes til å identifisere syklusstadier, men er mer påtrengende og tillater ikke kontinuerlig overvåking. Mens måling av kjønn steroid hormon nivåer hjelper med overvåking av østrogen syklus, det krever blod samling og tillater ikke karakterisering av den unike cellulære eller vaginal væske profilen til hvert emne. Som utviklingen av eksterne kjønnsorganer er indirekte korrelert med sex steroid hormon nivåer, undersøkelsen av vaginal åpning kan gi informasjon om seksuell modning. I tillegg har fargen på vevet, fuktighetsnivået, størrelsen og hevelsen i vaginalåpningen blitt korrelert med østrogensyklusstadiene⁷⁰. Imidlertid har den nøyaktige fysiologien som fører til åpningen av vaginalkanalen hos rotter ennå ikke blitt fullstendig rapportert. Nyere publikasjoner har funnet ut at dette bare er en indirekte markør for reproduktiv utvikling og ikke alltid stemmer overens med pubescence^31,34. Den biokjemiske analysen av urinprøver er kostnadseffektiv og enkelt utført, men tillater ikke spesifisitet og pålitelighet av andre metoder⁷¹. Derfor er det ikke så pålitelig eller gyldig som å undersøke cellene som er tilstede i vaginalkanalen.

I tillegg har måling av elektrisk impedans blitt brukt til å overvåke østrogensyklusen og er mindre fysisk irriterende enn flytende lavage. Denne metoden gir imidlertid ikke så mye informasjon om kategoriseringskomponentene. Denne enheten er spesielt designet for å optimalisere tidspunktet for forsettlig parring, måle når sex steroid hormon nivåer er høyest 72,73,74. I tillegg har det blitt rapportert at denne metoden er effektiv for å skille mellom EST og ikkeEST, men er begrenset i sin evne til å overvåke østrogensyklusen utenfor den⁷⁵. Samlet sett har denne metoden blitt rapportert å være upålitelig, ikke alltid kostnadseffektiv, og brukes ikke ofte i litteraturen som fører til mangel på sammenlignbare data⁷⁴. Mens vaginal vattpinnen er mest lik lavage i informasjonen den gir, inkluderer den økt risiko for irritasjon eller skade, da det krever å kontakte foringen av vaginalkanalen direkte for å hente celler. Til slutt, mens farging av mikroskopskredene kan gi en skarpere kontrast mellom celletyper og tillate prøvebevaring, er det en mer tidkrevende og kostbar bestrebelse enn den våte braketten⁵³. Totalt sett har hver overvåkingsteknikk sine begrensninger og fordeler, og det kan være gunstig å bruke en kombinasjon av disse metodene for å motta en omfattende undersøkelse av gnagerens østrogensyklus.

Programmer
Det er fortsatt viktig å se den aktuelle studien i sammenheng med det større vitenskapelige samfunnet og allmennheten. Denne metodikken kan benyttes i ethvert prosjekt som innebærer å undersøke kvinnelige dyr – ikke utelukkende innenfor studier som fokuserer på forsettlig avl, for å utelukke dyr som presenterer med abnormiteter, og/eller funksjonen til hypothalamus-hypofyse-ovarieaksen, men også for hovedinnsikt innen behandlingsgrupper. Mer spesifikt er denne prosedyren virkningsfull i i) farmakologiske studier, da ulike medisiner og kjemikalier forstyrrer eller endrer reproduksjonskanalen og østrogensyklusen 11,27,76; ii) nevrologiske studier, som de som fokuserer på traumatiske hjerneskader, kognisjon eller degenerative lidelser, på grunn av interaksjoner mellom kjønns steroidhormoner og nervesystemet⁷⁷; iii) sirkulasjonssystem forskning på grunn av sex steroid hormon reseptorer ligger på myocytter og de påfølgende interaksjoner⁷⁷; iv) forskning relatert til beinvekst³⁸; til det endokrine systemet ^11,78; og v) andre ikke-produksjonsstudier³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4