Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניטור מחזור אסטרוס מכרסמים תוך שימוש בשטיפה נרתיקית: אין דבר כזה מחזור רגיל

Published: August 30, 2021 doi: 10.3791/62884
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2
1Department of Neurosurgery, Brain Injury Research Center, UCLA, David Geffen School of Medicine, 2Department of Psychology, Pepperdine University, Seaver College

Summary

מחקר זה מפרט את הגורמים המכריעים שיש לקחת בחשבון בתכנון ניסיוני המערב חולדות נקבות. במובן רחב יותר, נתונים אלה משמשים להפחתת הסטיגמה ומסייעים בפיתוח כלי אבחון והתערבות כוללניים יותר.

Abstract

המתודולוגיה הנוכחית קובעת גישה ניתנת לשחזור, סטנדרטית וחסכונית לניטור המחזור האסטרוס של חולדות מתבגרות מסוג ספראג דאולי (SD) נקבות. מחקר זה מדגים את המורכבות של מחזורים הורמונליים ואת הספקטרום הרחב של ההבנה הנדרשת לבניית טכניקת ניטור אמינה ותקפה. באמצעות בחינה מעמיקה של תכנון ניסויי עיקרי ואלמנטים פרוצדורליים, תיאור זה של המחזור ועקרונות היסוד שלו מספק מסגרת להבנה נוספת ולפירוק תפיסות מוטעות לשכפול עתידי.

יחד עם מתווה של תהליך איסוף הדגימות תוך שימוש בשטיפה נרתיקית, ההליך מתאר את המנגנון של סיווג הנתונים למודל בן ארבעת השלבים של בלטו, אסטרוס, מטסטרו ו-diestrus. שלבים אלה מאופיינים בגישה מוצעת חדשה, תוך שימוש ב-4 הדטרמיננטים המסווגים של מצב נוזל הנרתיק, סוג התאים הנוכחי, סידור התאים וכמות התאים בזמן האיסוף. וריאציות של כל שלב, דוגמאות חיוביות ושליליות, ההבחנה בין מחזוריות לאציקליות ותיאורים גרפיים של מרכיבי הסיווג שנאספו מוצגים לצד פרקטיקות פרשניות וארגוניות יעילות של הנתונים. באופן כללי, כלים אלה מאפשרים פרסום של טווחי נתונים הניתנים לכימות בפעם הראשונה, מה שמוביל לסטנדרטיזציה של גורמי סיווג עם שכפול.

Introduction

תרומות חדשות
מחזור האסטרוס של מכרסמים זוהה כאינדיקטור חיוני לבריאות. עם זאת, הטיות לא מודעות של חוקרים ופרשנויות לא מדויקות לגבי הגוף הנשי מעכבות את הקהילה המדעית. עצם האטימולוגיה של המילה "estrous" מרמזת על תחושה של נחיתות ושליליות. אוריפידס השתמש במונח כדי לתאר "טירוף" או טירוף, הומרוס כדי לתאר פאניקה, ואפלטון כדי לתאר דחף לא רציונלי. מחקר זה מדגיש כיצד נקודות מבט ראשוניות אלה משפיעות על הקהילה המדעית הנוכחית ומתייחס לחששות אלה באמצעות פרדיגמת פסיפס חדשנית – שילוב מעודכן של שיטות שנחקרו בעבר, שהורחבו בהיקפן לגישה מקיפה יותר.

המחקר והשימוש בטכניקה זו נחוצים, ראשית, מכיוון שאין טכניקת ניטור סטנדרטית ומקיפה, ושיטות פרשנות נתונים יכולות להיות לא ברורות. שנית, למרות שמאפייני מחזור האסטרוס תלויים בכך שחולדות בודדות נחקרות, הם לעתים קרובות אוניברסליים. שלישית, בעוד שמחזורים הורמונליים הם תהליכים שגרתיים ומועילים, הם מוקפים בסטיגמה מסוכנת הנחקרת בפרק 'תרגום לבני אדם'. מחקר זה נועד לטפל בשלוש הסוגיות הללו בשלוש דרכים – (A) על ידי תיאור טכניקת ניטור מחזורית אסטרוס מעמיקה והבהרת האופן שבו ניתן לפרש את התוצאות, (B) על ידי התוויית שיטות השומרות על השלמות והאינדיבידואליות של כל מחזור, ו-(C) על ידי הפניית תשומת הלב לתפיסות מוטעות המנציחות פרקטיקות לא מבוססות.

מחקר זה ייחודי גם בהתמקדותו בחולדות מתבגרות, תקופה המאופיינת בשינויים התפתחותיים מכריעים השופכים אור על ביטויים התנהגותיים, אנטומיים ופיזיולוגיים שונים בבגרות1. בניית תכנון ניסיוני סטנדרטי לניטור מחזורים הורמונליים באוכלוסייה שאינה נחקרת כראוי תוך פירוק הטיות נפוצות תאפשר פיתוח של מתאמים הורמונליים אמינים ותקפים 2,3,4 וקביעת שיבושים במחזור התלויים במצב 5,6,6,7,8,9,10 . בסופו של דבר, חידושים אלה משמשים להרחבת קריטריונים לאבחון, טיפולים והתערבויות של חששות בריאותיים שונים.

הגדרות ושימושים בסיסיים
מחזור האסטרוס הוא אוסף של תהליכים פיזיולוגיים דינמיים המתרחשים בתגובה לשלושת הורמוני המין הסטרואידים הנשיים המתנדנדים: אסטרדיול, הורמון לוטיניזציה (LH) ופרוגסטרון (איור 1A,B). אינטראקציות בין מערכת העצבים האנדוקרינית והמרכזית מווסתות את המחזור, שנמשך לרוב 4-5 ימים וחוזר על עצמו מתחילת ההבשלה המינית ועד לסנסנציה ו/או הפסקה של הרבייה. הוא מחולק לקטגוריות נפרדות המבוססות על רמות ההורמונים – לרוב ל-4 השלבים של diestrus (DIE), proestrus (PRO), estrus (EST) ו-metestrus (MET), המתקדמים באופן מעגלי. מספר החטיבות יכול לנוע בין 3 שלבים11 ל -13 שלבים12, בהתאם לאופי המחקר13. המספר הנמוך יותר של החטיבות אינו כולל לעתים קרובות את MET כשלב ומסווג אותו כתקופת מעבר קצרה למשך זמן. המספר הגבוה יותר כולל בדרך כלל תתי-סעיפים המאפשרים בחינה מדוקדקת יותר של תופעות כגון התפתחות הגידול או פסאודו-אופרגנטיה ספונטנית, המצב הפיזיולוגי של ההריון ללא השתלה עוברית 12,14,15.

במחקר זה זוהו השלבים באמצעות מרכיבים של תעלת הנרתיק, שנקראו 3 הדטרמיננטים המסווגים - סוג(ים) של תאים, סידור תאים וכמות תאים (איור 2A-D). אמנם מצבו של נוזל הנרתיק לא היה במעקב במחקר זה, אך מומלץ לכלול אותו כמרכיב סיווג רביעי. מידע נוסף על בדיקת נוזל הנרתיק ניתן למצוא ברשימת ההפניות16. ניתן לבחון את מרכיבי הסיווג על ידי חילוץ תאים באמצעות שטיפה נרתיקית, הטכניקה העיקרית המומלצת בניטור מחזורי אסטרוס מודרני. בעוד שהתהליכים הפיזיולוגיים המעמיקים בתוך כל שלב נמצאים מחוץ לתחום מחקר זה, מידע נוסף ניתן למצוא בספרות17.

השימוש והמשך הפיתוח של טכניקת ניטור מחזור אסטרוס זו מושרש בקשרים בין הורמוני סטרואידים מיניים לבין תפקוד מערכות הגוף כגון מערכת הלב וכלי הדם18, מערכת אנדוקרינית8 ומערכת העצבים המרכזית 19,20,21. יחד עם זאת, ייתכן שלא תמיד יהיה צורך בניטור מחזורי אסטרוס כאשר נקבות מכרסמים מעורבות 22,23,24,25. במקום זאת, חשוב תחילה לשקול אם דווחו הבדלים בין המינים בתחום הספציפי של המחקר, אותם ניתן לבחון עוד יותר בסקירות שפורסמו22,23. אף על פי שניטור מחזורי אסטרוס הוא חיוני במגוון רחב של מחקרים, אין לראות בו מכשול להכללת מכרסמים נקבות בניסויים. בעוד שטכניקה זו עשויה להיראות מורכבת וגוזלת זמן רב, ההליך עצמו יכול להימשך פחות מ -15 דקות, תלוי בחוקר, והוא חסכוני. באופן כללי, הכללתם של מכרסמים נקבות במחקרים מדעיים היא יתרון להבנת מערכות הגוף, מצבים ופתולוגיות שונות ובריאות כללית, שכן התפתחויות אלה התבססו בעיקר על תבנית הגוף הגברי.

פרמטרים אוניברסליים ושונות טבעית במכרסם
קביעת טווחים להיבטים הנתפסים כ"טיפוסיים" נחוצה כדי להגדיר דפוסי מחזור סטנדרטיים, לקבוע פרמטרים למטרות השוואתיות ואנליטיות, ולזהות חריגות וחריגות. יחד עם זאת, חשוב גם להכיר בכך שהמחזור של כל חולדה הוא ייחודי, וצפויות סטיות המבוססות על זן בעלי חיים, תהליכים פיזיולוגיים ותנאי סביבה. למעשה, אחד ההיבטים ה"נורמליים" ביותר של מחזור האסטרוס הוא השתנות. זה נראה באורך המחזור הכולל, עם טווח של 3-38 ימים26,27; גיל ההתבגרות המינית שיכול לנוע בין 32-34 ימים למספר שבועות 28,29,30; מה שנחשב אציקלי11, והדפוסים הדטרמיננטיים המסווגים 11,13. באופן כללי, אין תבנית אוניברסלית למחזור האסטרוס, ותרגום זה הן לקהילה המדעית והן לציבור הרחב הוא חלק חשוב בתהליך הניסויי.

נקודות זמן ניסיוניות וגיל התפתחותי
הכרה בעקרון זה של השתנות מסייעת בבניית תכנון ניסיוני אמין ותקף. לדוגמה, תחילתו של ניטור מחזורי אסטרוס מסתמכת על ההתפתחות האנטומית והפיזיולוגית של החולדות, המשתנה בהתאם לגורמים סביבתיים ופיזיולוגיים. הניטור לא יכול להתחיל עד להתפתחות פתח הנרתיק (VO), שהוא פתח הנרתיק החיצוני המוקף בפות שמוביל לחלק הפנימי של תעלת הנרתיק (איור 3A-D). בעוד שה-VO מתפתח לעתים קרובות באופן מלא בין הגילאים 32 ל-34 ימים, הוא נשאר אינדיבידואלי לכל נושא, והרבה על התהליך עדיין לא ידוע. פתח זה שימש לזיהוי הופעת ההבשלה המינית, אשר נקשרה לעלייה של אסטרדיול31, ההבשלה של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-השחלות32, והביוץ הראשון בחולדות 17,33,34,35. עם זאת, פרסומים אחרונים מצאו כי הוא רק סמן עקיף של התפתחות הרבייה, שכן הוא יכול להיות מנותק מהתרחשויות הורמונליות והתפתחותיות בסביבות שליליות31 ועשוי לייצג שינויים ברמות האסטרדיול ולא התבגרות מינית33. לכן, מומלץ לא להסתמך אך ורק על VO כדי לקבוע את הגיל ההתפתחותי וכמזהה לניטור מחזור אסטרוס36 אלא גם לנצל את המראה של שלב ה- EST הראשון וקורניפיקציה של תאי האפיתל30 כדי לסמן את תחילת ההבשלה המינית.

משקל הגוף מתואם באופן בולט עם הגיל ההתפתחותי בתקופת ההתבגרות במכרסמים30,37 ולכן יכול גם לסייע בקביעת הגיל ההתפתחותי בתקופה זו. המנגנונים המוצעים הקשורים לתופעה זו כוללים גירוי של הורמונים הדרושים להתפתחות הרבייה, כגון הורמון גדילה, ועיכוב ציר יותרת הכליה ההיפותלמית-יותרת המוח (HPA) על ידי וסת התיאבון, לפטין30. עם זאת, לא מומלץ להשתמש במדד זה כאינדיקטור היחיד לגיל ההתפתחותי בשל השונות הגדולה שנראתה בין חולדות על פני מינים שונים לבין ספקי הספקים38. השונות הנראית בהתפתחות ה-VO ומשקל הגוף מדגימה את חשיבותו של המושג בתהליך הניסוי הכולל.

תרגום לבני אדם: הקשרים תרבותיים ומדעיים
מערכת היחסים התרגומית של מחקרי רבייה בין בעלי חיים לבני אדם היא דו-כיוונית. התוצאות ממחקרים המבוססים על בעלי חיים משפיעות על האופן שבו מעריכים, ניגשים ומנתחים את התהליכים האנושיים39. התפיסה של מערכת הרבייה האנושית והתהליכים הקשורים אליה משפיעים על האופן שבו נחקרים בעלי חיים. למעשה, אחת האינדיקציות הקולניות ביותר למחקר נוסף בתחום זה נובעת מאמונות חברתיות-תרבותיות מוטות הקשורות למחזורים הורמונליים המשפיעים על התהליך המדעי. רבות מהמוסכמות הללו נגזרות מסלידה תרבותית כללית מדיון במחזור החודשי, מה שהוביל לפער נתונים בידע מבוסס היטב40,41. יש לכך ספקטרום של השלכות המשתרעות בין מינוריות לקטלניות – מגובה מדפים וגודל הסמארטפון ועד התאמת שריון גוף משטרתי והחמצת אבחנות סרטן42.

התיאור של הווסת כבלתי סניטרית, הרסנית ורעילה – הנראה בטקסטים, בתקשורת, במילונים ובתורות רפואיות נערצות – נשמר על ידי פרסומים מדעיים. זה קורה באמצעות תיאורים לא מדויקים ומוטים של מחזורים הורמונליים, בידוד מערכת הרבייה ממקביליה הנוירואנדוקריניים והשפעותיה הסביבתיות, והפרספקטיבה הרדוקציוניסטית של השלמת מחזור כ'כישלון להרות'43,44. זה מוביל ליצירת פרקטיקות ניסיוניות לא מבוססות, כגון השמטת משתנים חיצוניים המשפיעים על מחזורים הורמונליים, קביעת נקודות התחלה וסיום המבוססות אך ורק על התפתחויות אנטומיות, ומדידת התקדמות המחזור באופן ליניארי ולא מעגלי. למרות הקשר הישיר בין גורמים סוציו-תרבותיים לבין השלכות ביולוגיות, הוא אינו נחשב לעתים קרובות בספרות המדעית. באמצעות בדיקה של פרסומים הוליסטיים יותר 43,44,45, חוקרים יכולים לפרק את הסטיגמות הללו וליצור עיצובים ניסיוניים אמינים ותקפים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל שיטות הטיפול והפרוצדורה המפורטות בפרוטוקול זה תואמות את הנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת פפרדיין והוועדה לחקר בעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (ARC).

1. טיפול ושימוש בבעלי חיים

  1. לרכוש חולדות נקבות, במספרים על פי ניתוח כוח, וחולדות זכריות כדי לקדם את אפקט וויטן או רכיבה עקבית יותר על אופניים46. לקבוע את הזן על סמך מטרת המחקר במאגרי מידע ידועים47.
    הערה: הנתונים הנוכחיים משקפים את זה של נקבות מתבגרות בתוכנית התקינה הגנטית הגנטית הבינלאומית של SD (IGS) בנוכחות חולדות SD זכריות הממוקמות הן באוניברסיטת פפרדין והן במעבדות UCLA כחלק ממחקר משותף. חולדות אלה הגיעו לקבוצות נפרדות בגיל 28 ימים, והתקדמות מחזור האסטרוס הייתה במעקב במשך 10 או 20 יום כדי להדגים הבדלים ברמות אקוטיות וכרוניות, החל מגיל 34 ימים (לאחר תקופת התאקלמות של 7 ימים).
  2. לפני הטיפול, יש לאפשר הסגר ו/או תקופת התאקלמות לייצוב פיזיולוגי לאחר הובלה והתאמה לסביבה החדשה.
    הערה: צוינה תקופת מינימום של 3 ימים, עם תקופה של 7 ימים מומלצת 48,49,50,51,52. באופן כללי, זה תלוי בתנאי ההובלה, בזן של בעלי החיים ובמטרות המחקר.
  3. ודא כי הלחץ מופחת עם השימוש בתקופת התאקלמות, כמו מתח יכול לשבש תפקוד תקין של מערכת הרבייה53. עם זאת, אין לפצות יתר על המידה על ידי ניסיון לחסל אותו, שכן כמות מתונה של מתח מועילה לרווחתם של בעלי החיים51.
  4. חולדות מארחות בסביבה של טמפרטורה (68-79 מעלות פרנהייט, כלומר 20-26 מעלות צלזיוס) וסביבה מבוקרת לחות (30-70%) על ידי יצירת קשר עם הוויבריום או עם מנהלי המעבדות והבטחת תכונות אלה. הפיצו מים ו-chow ad libitum עם רכיבים מזינים המופיעים באתר החברה וניקוי כלובים פעם בשבוע.
    הערה: במחקר זה, החולדות שוכנו בקבוצות של 2 מופרדות על ידי מין בכלובי פלסטיק רב פעמיים שקופים בגודל 19 אינץ' x 10 אינץ' x 8 אינץ', והייתה להן גישה למצעי קוביות תירס שהוחלפו פעם בשבוע. הטמפרטורה נשמרה על 70 מעלות צלזיוס ולחות ב 35-79%, עם ממוצע של 62%.
  5. בדוק את התפתחותו של זנב טבעת או נמק איסכמי של הזנב והבהונות לקבלת עדות לרמות לחות יחסיות נמוכות וטמפרטורות קיצוניות, שעלולות לגרום לשינוי בתגובות הביולוגיות.
    הערה: הטמפרטורה והלחות חשובות למערכת הרבייה, להתבגרות המינית ולמחזוריותהאסטרוס 54,55,56,57,58.
  6. הבטיחו תאורה נכונה ומאוזנת בכל חלל המגורים על ידי הפקדת כמויות שוות של מקורות אור ברחבי חלל המעבדה הפועלים על מערכת אור:חושך מבוקרת זמן.
    הערה: כאן, מחזור אור:חושך של 12:12 שעות, עם אורות דולקים בין השעות 06:00-18:00 שעות, נשלט על ידי נורות LED ליניאריות של 2,550 לומן.
  7. עקוב אחר דרישות לוקס שסופקו52 בהתבסס על וריאציות של פיגמנטציה, גיל, מתח, מין ומצב הורמונלי של בעלי חיים.
    הערה: כאשר חוקרים מסווגים את דגימות התאים שנאספו, תאורה עקבית תאפשר זיהוי חזותי נכון ובימוי אמין59. משך האור ועוצמתו קשורים ישירות למערכת הרבייה, להתבגרות המינית ולרכיבת האסטרוס 54,55,56,56,57,60,61.

2. ציוד והכנת ניסויים

  1. סקור את הדטרמיננטים המסווגים (נראה באיור 2A): כיצד לזהות כל שלב במחזור האסטרוס וכיצד להפעיל את המיקרוסקופ ואת ציוד המצלמה.
  2. ודא שכל נושא שיש לעקוב אחריו הגיע להתבגרות מינית ומציג אינדיקטורים מתאימים להתפתחות – VO, משקל גוף וגיל. שקלו את החולדות ובדקו אותן ל-VO בין באותה השעה בכל יום להשוואות מדויקות והעבירו אותן בשיטת טיפול מאושרת. יש להתייעץ עם הווטרינר המסונף לאוניברסיטה אם בעל חיים מאבד יותר מ-20% ממשקל גופו הקודם.
    הערה: ה-VO נשאר קאודלי לפתח השופכה ולגולגולת לפי הטבעת, הממוקם בין השניים, כפי שמתואר באיור 3.
  3. מכיוון שגורמים אלה תלויי מאמץ, בדקו עם הספק אם יש מפרטים ושקלו גורמים סביבתיים ספציפיים למעבדה62.
    הערה: באופן כללי, זה יתרחש בין גיל 32-34 ימים למשקל גוף ממוצע הנע בין 75-150 גרם63 לחולדות SD והוא מסומן על ידי פתח בצורת מעגל שכוסה בעבר על ידי נדן ממברני.
  4. בחר תקופת איסוף דגימות המתאימה לקבוצת החולדות הנמצאות במעקב כדי למנוע איסוף דגימות מעבר. ראשית, יש לדגום כמה בעלי חיים ב-2 או 3 נקודות זמן שונות במהלך היום כדי לקבוע את השעה שבה נמצאים רוב שלבי המחזור (למשל, דגימה בשעה 12:00, 13:00 שעות ו-14:00 שעות עבור בעלי חיים שונים). השלם את שטיפת הנרתיק באותה השעה בכל יום לקבלת בימוי עקבי ואמין.
    הערה: דווח כי השעות שבין 12:00 ל-14:00 שעות הן הטובות ביותר ללכידת כל השלבים. במחקר זה, ניטור מחזורי אסטרוס התרחש בין השעות 12:00 ל-14:00 שעות, וטופל באמצעות החזקה בסגנון דחיסה (ראו שלב 3.4). החשיבות של תזמון ניטור מחזורי אסטרוס ביחס להתערבויות ניסיוניות אחרות (למשל, התניה התנהגותית, תרופות) היא תחום מחקר מתפתח וניתן לחקור אותה עוד11. קביעת משך הניטור של מחזור האסטרוס תלויה במחקר וניתן לבחון אותה עוד יותר במחקרים שפורסמו11,33.
  5. הסר את כיסוי המגן מהמיקרוסקופ והצמד את המצלמה למחשב על ידי הסרת כיסוי עדשת המצלמה המגן והצבת העדשה מעל עינית המיקרוסקופ.
  6. לאחר מכן, פתח את התוכנה שנבחרה מראש במחשב. כדי להשתמש בתוכנה שנבחרה במחקר זה, בחר את המצלמה המחוברת ל- USB הממוקמת בצד שמאל של המסך, תחת הלשונית שכותרתה רשימת מצלמה. ודא שמצלמת ה- USB מחוברת כראוי למחשב, אשר יקרא את No Device תחת הכרטיסייה שכותרתה רשימת מצלמה, אם לא.
  7. לאחר שמצלמת ה- USB נבחרה תחת הכרטיסייה, הפעל את מתג האור של המיקרוסקופ הממוקם בבסיס.
  8. צור תיקייה במחשב המיועדת לתמונות לדוגמת התא. צור תיקיית קבצים עבור כל יום נפרד שבו הנתונים נאספים, מוכנים מראש לפני צילום התמונות.
  9. עם הכנת הציוד, שלפו את כלוב הנבדק ממקום ההחזקה שלו והביאו אותו לתחנת איסוף הדגימות.

3. איסוף תאי הנרתיק

  1. שלפו מזרק חד פעמי ומלאו כל אחד מהמזרקים ב-0.2 מ"ל של NaCl סטרילי 0.9%. אם קיימות בועות אוויר, סובבו בעדינות את מזרק הקנה עד שכל בועות האוויר הגיעו לקצה הפתוח של המזרק וגירשו את האוויר. אם עדיין קיימות בועות אוויר, הוציאו את התמיסה בחזרה לכלי הקיבול של NaCl ומלאו אותה מחדש עד שאין כאלה.
    הערה: הבהוב מוגזם עלול לגרום להיווצרות של בועות אוויר רבות יותר.
  2. מחזירים כל מזרק לעטיפת הניילון כדי לשמור על שדה סטרילי, עם קצה המזרק בתוך החלק האטום של העטיפה.
  3. פתחו את הכלוב והרימו בעדינות את הנושא על ידי בסיס הזנב או תא המטען של הגוף, סוגרים את מכסה הכלוב כדי למנוע מאחרים לצאת. בחר שיטת החזקה מתוך אלה המפורטים להלן בהתבסס על העדפה אישית ותגובת בעלי חיים.
  4. השתמשו באחיזה בסגנון דחיסה לחולדות מתבגרות על ידי הצבת הנבדק על אזור החזה העליון, כאשר האף של המצולם מצביע כלפי מטה על הקרקע. לפני תחילת המטוש, יש לוודא שהנבדק דחוס מספיק כדי למנוע תנועה, אך הוא נוח ובטוח באחיזה. חשוף את תעלת הנרתיק של הנושא על ידי כיפוף בעדינות של הזנב לפני החדרת המזרק.
  5. השתמשו בהרמת הרגליים האחוריות עבור חולדות בוגרות על ידי הנחת המצחים של החיה על החלק העליון או הצדדי של הכלוב, בעוד שהזנב והאחוריים מרוסנים באחיזה עדינה בין האצבע הראשונה לשנייה, ומשאירים את האגודל פנוי להפעלת המזרק64.
  6. לאפשר לבעלי החיים להתאקלם לטיפול ולניטור. טפלו בבעלי החיים בעדינות אך בבטחה כדי להפחית את הלחץ העודף ולהגן על החוקר מפני תוקפנות כגון נשיכה.
    הערה: ייתכן שהימים הראשונים של הניטור לא יניבו את התוצאות הרצויות מכיוון שבעלי החיים מתאקלמים לתנאיהם. טיפול בבעלי החיים לאיסוף משקלי גוף במהלך תקופת ההתאקלמות יכול לסייע במעבר זה33.
  7. תוך כדי החזקת המזרק יציב עם האצבע הקדמית והאצבע האמצעית, יש להכניס את קצה המזרק (לא יותר מ-2 מ"מ) בזווית מקבילה לתעלת הנרתיק. לאט לאט לגרש את ה-NaCl לתעלה על ידי דחיפת הבוכנה פנימה. אין להכניס את המזרק עוד יותר לתעלה, שכן הדבר עלול לשבש את מחזור האסטרוס.
  8. הוציאו את ה-NaCl מתעלת הנרתיק על ידי משיכת הבוכנה של המזרק הרחק מציפוי האפיתל (כלפי מעלה). אם יש קושי לשמור על הנושא באחיזה במהלך תהליך זה, החזירו אותו לכלוב לתקופת מנוחה קצרה לפני שתנסה לחלץ את NaCl.
  9. לאחר איסוף דגימת התא, הניחו את הנבדק בחזרה בכלוב וחזרו על הליך זה עבור כל חיה לפני שכל הדגימות יוערכו תחת המיקרוסקופ.
    הערה: לחלופין, ניתן לאסוף ולהעריך כל דגימה לפני המעבר לבעל החיים הבא. בעל חיים עשוי לדרוש שטיפה שנייה אם לא ניתן לסווג את הדגימה. ניתן לעשות שימוש חוזר באותו מזרק מהאוסף הראשוני אם הוא אינו יוצר קשר עם המלוח ישירות במיכל ורק עבור אותה חיה.

4. הערכה לדוגמה

  1. התחל את הסיווג על ידי בחינת דגימת הנוזל הנרתיקי שחולצה. תעד את הצמיגות כצמיגות או לא-ויזואלית ואת הצביעה כאטומה או שקופה במסמך התיאור או במערכת הקלטה אחרת.
    הערה: ניתן לבצע חלק זה של הפרוטוקול בזמן איסוף הדגימה או מאוחר יותר.
  2. הוציאו 2-3 טיפות של נוזל על מגלשת מיקרוסקופ והניחו זכוכית כיסוי מיקרוסקופ על גבי המגלשה. הניחו את זכוכית הכיסוי על החלקה של המיקרוסקופ מהחלק העליון של המגלשה לתחתית או מצד אחד של המגלשה לצד השני כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. במידת האפשר, השאירו כמחצית מהדגימה שנאספה במזרק אם נדרשת בדיקה נוספת וכדי למנוע הנחת כמות עודפת של נוזל על המגלשה.
  3. אתר את התאים שנאספו על ידי הזזת החלקת המיקרוסקופ על פני הבמה. אם יש מעט מדי תאים או כמות גבוהה של פסולת, הוציאו את הנוזל הנותר למגלשה חדשה ובחנו מחדש. אם כמות הדגימה שנותרה במזרק אינה מספיקה, או אם הטיפה השנייה מציגה בעיות דומות, אספו דגימה נוספת מהנבדק לפני שתתנסו לזהות את שלב מחזור האסטרוס.
  4. לאחר שהתאים אותרו ולפני שהם נוגעים במחשב או במקלדת המחשב, הסר את הכפפה האחת כדי למנוע לכלוך את המקלדת.
  5. השג תמונות של דגימות התא על-ידי לחיצה על הפונקציה המסומנת Snap בצד שמאל של לוח התוכנה.
  6. לאחר מכן, שמור את הקובץ על-ידי לחיצה על שמור כמו תחת סמל הקובץ בפינה הימנית העליונה של הדף. שמור את התמונה תחת תיקייה עם תווית מראש במחשב.
    הערה: תבנית תווית לדוגמה: עדשה #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective בשימוש.
  7. צלם יותר מתמונה אחת בכל עדשה אובייקטיבית אם אין תאים רבים בתוך כל פריים.
    הערה: תוויות לדוגמה עבור תמונות מרובות: #1_01/09/2021_EST_4x1 ו - #1_01/09/2021_EST_4x2.
  8. חזור על ההליך עבור כל דגימה שנאספה תחת עדשות אובייקטיביות מרובות. כלול לפחות החפצה אחת קטנה יותר, כגון 4x, ולפחות החפצה אחת גדולה יותר, כגון 20x.
  9. העלה את התמונות לכונן/תיקיה משותפים או לכונן קשיח חיצוני כדי שלכל החוקרים המעורבים תהיה גישה לקבצים ויהיו עותקי גיבוי זמינים.

5. סיווג שלבים

  1. הגדר את מסך המחשב כך שיציג בו-זמנית את התמונות שצולמו ואת גיליון ההקלטה (איור 4A-C).
    הערה: פעולה זו תאפשר לתיעוד להתרחש בעת הצגת הדגימה שנאספה. חלק זה של הפרוטוקול יכול להסתיים בזמן איסוף הדגימה או מאוחר יותר.
  2. קבע אילו סוגי תאים קיימים בדגימה. בחר מבין ארבע האפשרויות המפורטות בשלבים 5.2.1-5.2.4 באמצעות הקריטריונים ותעד את הממצאים.
    1. אפיתל קרטיניזציה (AKE)/תאי אפיתל קורנים
      1. חפשו תאים משוננים או בעלי קצוות זוויתיים, כפי שניתן לראות באיור 2B ובאיור 5C, שלמרות המחסור בגרעינים, עשויים להראות אזורים עגולים בהירים (רוחות רפאים גרעיניות) בתוך התא שמייצגים את המקום שבו גרעין היה קיים בעבר. השתמש בהגדלה גבוהה יותר, כגון פי 20 ומעלה, כדי להבדיל בין תאים מנוקלים כאלה לבין תאים מחונכים.
      2. השתמש בהגדלה גבוהה יותר כדי להבחין בין החלק הקרטיני או הקורנדי של התא – שכבה דקה של תאים חסרי גרעינים ומלאים בקרטין – אם תרצה בכך.
        הערה: בנוסף למראה המשונן שלהם, ניתן להבחין בהם גם על ידי האופן שבו הם יכולים להתקפל או לפרק, וליצור מבנים משוננים ומוארכים המכונים חטיפי קרטין.
    2. תאי אפיתל גרעיניים גדולים (LNE)
      1. חפשו את התאים האלה, שבדרך כלל הם עגולים עד מצולעים, עטופים בגבולות לא סדירים, משוננים או זוויתיים.
      2. שימו לב כיצד הגרעינים שלהם עשויים ללבוש צורות שונות, החל משלמים ועד מנוונים או פיקונטיים, הקשורים לעיבוי בלתי הפיך של הכרומטין בגרעין של תא שעובר מוות או הידרדרות, כפי שניתן לראות באיור 2B ובאיור 5D1,2. שימו לב כיצד גרעינים אלה תופסים פחות מקום מאשר הציטופלסמה בתוך התא, עם יחס גרעיני לציטופלסמי נמוך יותר (N:C) מאשר תאי האפיתל הקטנים. חפשו גרגירים ציטופלסמיים שניתן לראות בהגדלה גבוהה יותר13.
    3. לויקוציטים (LEUs)/נויטרופילים/תאים פולימורפונוקליאריים
      1. חפשו את התאים הקומפקטיים והכדוריים האלה עם גרעינים מרובי-בולטים (ולכן, המכונים תאים פולימורפונוקליאריים), שנעלמים ככל שהתא מתבגר (איור 2B ואיור 5A). ניתן להשתמש בהגדלה גבוהה יותר (למשל, פי 40) כדי לצפות בגרעינים הרב-תחומיים.
        הערה: בעת האיסוף וההכנה, תאים אלה עלולים להתעבות, להתקפל או להיקרע.
    4. תאי אפיתל גרעיניים קטנים (SNE)
      1. חפשו את התאים העגולים עד הסגלגלים האלה, הגדולים יותר מהנויטרופילים שתוארו לעיל.
      2. שימו לב לגרעינים העגולים של תאי האפיתל הלא-קריאטיניים האלה (איור 2B), שתופסים שטח גדול יותר מהציטופלסמה בתוך התא, ויוצרים יחס N:C גבוה יותר ביחס לתאי אפיתל גדולים.
        הערה: בעת האיסוף וההכנה, תאים אלה עשויים להתקפל או לחפוף כדי ליצור צורה הדומה למחרוזת או לפס, כפי שמודגם באיור 5B1.
  3. בדוק כיצד התאים הקיימים בדגימה מאורגנים עבור כל אובייקטיוויקציה. השתמש בהחפצה התחתונה, כגון 4x, כדי להציג תצוגה מייצגת של סידור התאים הכולל. רשמו אם התאים גושים יחד (C), מפוזרים באופן שווה (ED) או מפוזרים באופן אקראי (RD) (ראו איור 4C), ושימו לב לארגון הספציפי של כל סוג תא (לדוגמה, תאי אפיתל גרעין קטנים מתקבצים, ונייטרופילים מתפלגים באופן שווה).
  4. לאחר מכן, להעריך באופן חזותי ולתעד את כמות התא הכוללת (כמות בינונית, בינונית, מרובה) ואת כמויות התאים הבודדות (אחוז מכל סוג תא קיים).
    הערה: smidge מייצג את המספר הקטן ביותר של תאים שנמצאים שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את סיווג הדגימה, רבים מייצגים נוכחות של מספר אינסופי של תאים המהווים את רוב אם לא את כל השטח בשקופית או נערמים זה על גבי זה, ומספר מתון של תאים מייצג מספר ממוצע יחסית של תאים (דוגמאות שנראו באיור 5A-D ובאיור 6A-D).
  5. שימו לב אם יש סטיות מהקריטריונים המפורטים או מהיבטים האופייניים לנושא הספציפי בקטגוריית 'חריגות' והתייעצו עם וטרינר במידת הצורך.
  6. קבע איזה שלב מחזור אסטרוס מוצג במדגם תוך שימוש ברכיבי הסיווג ובתיאורים שלהלן.
    1. למות
      1. חפשו את ה-LEUs כסוג התא הדומיננטי או היחיד הקיים, המסודרים בצורה מגושמת בתחילת DIE אך מפוזרים יותר בשלבים מאוחרים.
        הערה: בעת המעבר ל-DIE, כמות התאים עשויה לרדת ככל שתאי האפיתל מתחילים להתפרק, כפי שניתן לראות באיור 6D1. במקביל, מספר ה- LEUs מתחיל לגדול, והם נוטים להיות מסודרים בצורה מגושמת בתחילה ולהתפזר עם הזמן.
      2. שים לב שהכמות הכוללת של התאים עשויה להיות נמוכה יחסית, לרוב בשלבים המאוחרים יותר של תקופת DIE, ביום השני או השלישי.
      3. שימו לב לכמות הגבוהה של הריר שעשויה להיות נוכחת בשלב זה, המוצגת כ גדילים מרוכזים של LEUs (איור 5A1). חפשו גושים קטנים או גדילים תאיים של תאי SNE המלווים את ה-LEUs בשלבים מאוחרים במעבר ל-PRO (איור 5A1,2).
      4. שימו לב למראה הצמיג והאטום של נוזל הנרתיק בעת המעבר, המעבר המלא ל-DIE ומעבר אליו.
        הערה: משך הזמן הממוצע של שלב זה הוא 48 שעות במהלך מחזור של 4 ימים ואולי 72 שעות במהלך מחזור של 5 ימים.
    2. מקצוען
      1. חפשו את תאי ה-SNE כתאים הדומיננטיים ואת תאי ה-LEUs, ה-LNE ו/או ה-AKE שניתן לראותם במספרים נמוכים. השתמשו בהחפצה גבוהה כדי לצפות במראה הגרגירי של תאי ה-SNE המסודרים בדרך כלל באשכולות, ביריעות או בגדילים בשלב זה (איור 5B1,2).
      2. שימו לב למראה הצמיג והאטום של נוזל הנרתיק בעת מעבר מ-DIE ל-PRO, וכיצד הוא הופך ללא-ויזואלי ושקוף לאחר המעבר המלא לשלב ה-PRO (משך זמן ממוצע של 14 שעות בחולדות).
    3. EST
      1. חפשו דומיננטיות של תאי AKE, ירידה של תאי ה-SNE ב-EST ועלייה במספר ובגודל התאים ככל ש-EST ממשיךב-11,13.
      2. שימו לב לתכונה המבדילה של הסידור המקובץ לעתים קרובות של תאי AKE, בצורה של פסי קרטין או המכילים גרעיני רפאים, שיכולים להתפזר באופן אקראי יותר במעבר מ-PRO (איור 6B) ול-MET (איור 6C).
      3. שימו לב לנוזל הנרתיקי הלא-ויזואלי והשקוף האופייני, שניתן לצפות לו כאשר החולדות עוברות לתוך ה-EST, עוברות אליו באופן מלא ועוברות אותו מ-EST.
        הערה: ההתקדמות של EST כוללת גיוון רב (איור 5C ואיור 6B, C). השלב מתרחש בדרך כלל במשך 24 שעות בממוצע במחזור של 4 ימים או אולי 48 שעות במחזור של 5 ימים.
    4. פגשתי
      1. חפשו מספרים גבוהים יותר של תאי SNE ו-LNE כאשר החולדה עוברת ל-MET, בין אם הם דומיננטיים מבחינת פרופורציה של התאים בתוך התעלה או קרוב ליחס שווה ל-LEUs11,13. יתר על כן, שים לב לכמות הגדולה יותר של פסולת ב- MET ולמעברים מאשר בשלבים אחרים עקב דעיכת תאי האפיתל בעקבות EST ומעבר ל- DIE.
      2. שימו לב להיעדר סידור עקבי כאשר כל סוגי התאים נראים ובכמויות שונות (איור 5D1-3). עם זאת, חפשו את ה-LEUs הארוזים או הדחוסים בסמיכות לתאי האפיתל בשלבים הראשונים שעשויים לחזור לסידור הגושני בעת המעבר ל-DIE.
      3. שימו לב למראה הלא-ויזואלי והשקוף של נוזל הנרתיק בשלב זה ולשינוי למראה צמיג ואטום יותר תוך כדי מעבר ל-DIE.
        הערה: משך הזמן הממוצע של שלב זה הוא 6-8 שעות.
  7. תייג דוגמאות במעברים עם השלב שאליו הנושא מתקדם, עם המעבר בסוגריים כדי לעקוב אחר מועדי איסוף אלה. מידע נוסף על אופן ההבחנה בין 4 שלבים אלה לבין המעברים שלהם ניתן למצוא בתוצאות המייצגות.
    הערה: מכיוון שהדגימות שנאספו הן סטטיות והמחזור הוא דינמי, השקופיות עשויות לתאר מעברים בין שלבים (ניתן לראות באיור 6A-D).
  8. השלם תהליך זה עבור כל בעל חיים עד להשלמת שלב הניטור.
  9. בכל יום 11 (גיל 45 ימים) או 21 (גיל 55 ימים), המתים את החולדות עם 5% איזופלורן ו-2% חמצן לפני עריפת גיליוטינה. נקודות זמן אלה עשויות להשתנות בהתאם לאופי המחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנתונים הנוכחיים משקפים את זה של תוכנית התקינה הגנטית הבינלאומית של SD מתבגרת (IGS) בנוכחות חולדות SD זכריות. בעלי חיים אלה היו ממוקמים הן באוניברסיטת פפרדין והן במעבדות UCLA כחלק ממחקר משותף. איור 5 מציג וריאציות מרובות של 4 שלבי המחזור. איור 5A1 זוהה כדגימת דיסטרוס עם מספר סוגי תאים נוכחים. דוגמה זו מדגימה כי דגימות עם מספר גדול יותר של תאי אפיתל נחשבות ל-diestrus כאשר הן עומדות בכישורים האחרים של הרכיבים המסווגים, כגון דומיננטיות של LEUs. דגימה זו הדגימה גם את סידור גדילי הריר המורכב מ-LEUs הנראים לעתים קרובות בשלב זה, הדומים לגדילים המורכבים מתאי SNE הנראים בשלב ה-PRO. כדי להבחין בין גדיל ליחה בשלב ה-DIE לבין הגדילים המופיעים בשלב ה-PRO המורכבים מתאי SNE, חשוב לזהות את הדומיננטיות של ה-LEUs. איור 5A2,3 מציג התקדמות של סידור תאים שנצפתה לעתים קרובות – גוש ראשוני של ה-LEUs שאוספים ועוברים ל-RD אקראי (RD) או אפילו לתשלום (ED) בדגימות שנאספו בתקופות מאוחרות יותר של שלב ה-DIE. באופן ספציפי, איור 5A2 היה דגימת DIE עם תאים רבים נוכחים. זה משקף כיצד ה-LEUs עשויים להיות מלווים גם במספר גבוה של תאי אפיתל (איור 5A1,2), הנבדלים מ-metestrus על ידי דומיננטיות של LEUs והיעדר חטיפי קרטין. לעומת זאת, איור 5A3 מדגים כי ספירת תאים כוללת נמוכה (smidge) נראתה בדרך כלל בשלב המאוחר יותר של שלב ה-DIE, כגון במהלך היום השני או השלישי. במהלך שלב ה-PRO, תאי ה-SNE סודרו לעתים קרובות לתוך גדילים עם תאים רבים שנערמו זה על גבי זה (איור 5B1) או גוש של תאים המסודרים בגושים קטנים יותר (איור 5B2). איור 5B3 מדגים דגימת PRO עם גוש אופייני דמוי יריעה של תאי SNE החופפים ויוצרים פסים שניתן לבלבל אותם עם פסי הקרטין המורכבים מתאי AKE הנמצאים בשלב ה-EST. כדי להבחין בין השניים, חשוב לזהות את הדומיננטיות של תאי SNE ב-PRO ושל תאי AKE ב-EST.

איור 5C1,2 מדגים את התגוששות האופיינית ואת ההפרשה האקראית של תאי AKE שנראו ב-EST, כאשר הראשון כולל תאים רבים והאחרון מספר מתון. גרעיני רפאים, תצורות מוט קרטין וחיידקים שנאספו לעתים קרובות בשלב זה נראים בדוגמאות אלה. תאי SNE היו מיוצגים לעתים במהלך שלב ה-EST (איור 5C1) כשרידים של שלב ה-PRO הקודם. שלב ה-EST המאוחר, שבו תאי SNE מתחילים לצוץ כשהנבדק נע לעבר MET, טועה לעתים קרובות לגבי שלב ה-PRO. כדי להבחין בין השניים, חשוב לקחת בחשבון את הגודל הגרעיני. באופן כללי, לתאי הגרעין של PRO יש יחס N:C גבוה יותר. הדגימה המוצגת באיור 5C3 הציגה סידור דמוי גדיל של תאי AKE רבים שלא נתפס כמאפיין של שלב ה-EST. זה מדגים כי כל בעל חיים הוא ייחודי, כי ייתכנו סטיות מהקריטריונים, וכי יש לבחון את הגורמים המסווגים בשילוב.

כדי להבחין בין EST ל-PRO כאשר קיימים תאי SNE, נראה כי יחס N:C נמוך יותר התרחש בתאים אלה במהלך שלב ה-EST. כדי להבחין בין פסי הקרטין הקיימים ב-EST לבין אלה הנוצרים על-ידי חפיפה או גלגול של תאי SNE בשלב ה-PRO (איור 5B3) לבין אלה הנוצרים על-ידי דעיכת תאי אפיתל במעבר מ-MET (איור 6D1), חשוב לזהות את סוג התא הדומיננטי, הסידור והכמות כדי להבחין בין השלב המיוצג. לבסוף, איור 5D1,2 מדגים את השילוב של כל סוגי התאים הקיימים בחלוקה האקראית המייצגת את שלב ה-MET. בנוסף לתאים הרבים הקיימים בדוגמאות אלה, היה מקובל לאסוף כמות גבוהה יותר של פסולת בשלב זה (איור 5D2) עקב דעיכת תאי אפיתל בעקבות EST והמעבר ל- DIE עם דומיננטיות של LEUs המתפקדים כדי לנקות את תעלת הנרתיק מתאי אפיתל. איור 5D2 גם מראה כיצד ניתן להבחין בין MET ל-DIE על ידי הריכוז הגבוה יותר של תאי אפיתל ונוכחותם של חטיפי קרטין. באופן כללי, ייצוגים אלה מתארים את הספקטרום הרחב שקיים בתוך כל שלב ואינם אקסהאוזיים.

ייצוגים של 4 שלבי המעבר מוצגים באיור 6. בעוד שמחקר זה סיווג דגימות במעבר כאחד מארבעת שלבי מחזור האסטרוס, עדיין חשוב לזהות את שלבי המעבר כראוי. במעבר מ-DIE ל-PRO (איור 6A), לעתים קרובות חלה ירידה כוללת במספר ה-LEUs ועלייה במספר תאי ה-SNE. תאי LNE ו-AKE היו נוכחים לעתים במעבר זה, אם כי לא בכמויות גבוהות (איור 6A1). איור 6A2-4 מתאר את המספר הגבוה יותר של תאי SNE דחוסים ומפוזרים באופן אקראי שנאספו לעתים קרובות במהלך מעבר זה, עם מספר נמוך של תאי LEUs המפוזרים באופן אקראי ואחיד. באופן כללי, כאשר מבחינים משלבי מעבר אחרים, היה חשוב לציין את הדומיננטיות של תאי SNE ואת תחילתם של גושים ותצורות גדילים שנראו ב- PRO. כל הדוגמאות באיור 6A מייצגות ספירת תאים רבים, למעט איור 6A4, עם smidge. באיור 6B, התמונה מציגה דוגמה לתאי SNE ו-AKE רבים שנראים במעבר מ-PRO ל-EST.

במהלך המעבר הזה, תאי SNE נראים במספרים גבוהים יותר עם פחות גושים ויותר תשלומים אקראיים של תאי AKE מאשר במהלך EST. איור 6C מראה את הופעתם של AKE, SNE ו-LNE ואת הירידה בתאי AKE במעבר מ-EST ל-MET עם מספר גבוה של תאים. הפסולת הקיימת מייצגת את תאי ה-AKE המתפוררים משלב ה-estrus הקודם שנראה לעתים קרובות ב-metestrus. ניתן לראות זאת גם בשלב המעבר הסופי, מ-MET ל-DIE, שבו תאי האפיתל החלו להתפורר ולייצר פסולת (איור 6D1,2), כאשר תאים רבים נמצאים בראשון ומספר מתון באחרונים. נתונים אלה מציגים את התופעה של גידול במספר ה-LEUs כדי להפוך לסוג התא הדומיננטי במעבר ל-diestrus. עבור הקבוצה שנוטרה במשך 20 יום (n = 3), היו 12 ימים שבהם נאספו דגימות מעבר, עם ממוצע של 4. עבור הקבוצה שנוטרה במשך 10 ימים (n = 3), היו 9 ימים שבהם נאספו דגימות מעבר, עם ממוצע של 3.

איור 7 מייצג אוספי דגימות תאים שליליים, שרובם הצדיקו שטיפות חוזרות. איור 7A1 מראה מסה של תאי קשקש שנאספו עקב החדרה ומיצוי של מזרק לא תקין, מה שגורם לתאי קשקש להישאב מדופן התעלה הנרתיקית. ניתן להבחין בין תאים אלה לבין תאי אפיתל דחוסים או LEUs בשל הצפיפות הגבוהה והקומפקטיות של המסה והגבולות הייחודיים שלה. איור 7B מייצג אוסף של פסולת, שבה לא הוצאו תאים, מישור המיקוד שגוי, או שהשקופית לא נסרקה במלואה לאיתור תאים. ניתן להבחין בין פסולת לתאים באמצעות היכרות עם סוגי התאים ועם הגודל הקטן והגושים הייחודיים לעתים קרובות. פסולת זו נובעת לעתים קרובות ממצעים של בעלי חיים, שיער או ריקבון תאים. איור 7C מתאר שקופית המכילה ספירת תאים שנמצאת מתחת לשקע. בעוד שספירת תאים נמוכה נצפתה בדרך כלל במהלך ה-MET המאוחר וה-DIE המוקדם, הדבר מייצג שקופיות שיש להן מעט מדי תאים מכדי לסווג אותן במדויק לשלב מסוים.

איור 7D מראה שתי דוגמאות של תמיסת מיצוי NaCl בשילוב עם נוזל נרתיקי מהתעלה בשקופית המיקרוסקופ. בתמונה הראשונה, איור 7D1, הנוזל היה נוכח ולא בפוקוס, מה שחסם את היכולת לסווג במדויק. באיור 7D2, הנוזל התפשט על פני המגלשה במעגלים מלוכדים לצד ה-LEUs. בעוד שדוגמה זו אינה דורשת שטיפה חוזרת בשל נוכחות התאים הגבוהה, חשוב לקחת בחשבון את כמות הנוזלים המונחת על המגלשה ואת מיקום מגלשת כיסוי המיקרוסקופ כדי למנוע מריחות. באופן כללי, תמונות אלה מדגישות את החשיבות של לכידת תמונות מייצגות באיכות לצורך סיווג נכון. זה כולל התחשבות באופן חילוץ התאים, במישור המיקוד ובתוכן התמונה על ידי סריקת כל שקופית לפני לכידת תמונה.

לאחר סיווג כל חיה בקבוצות הניסוי, מקובל לשרטט את התקדמות הבמה בגרף עמודות או קו. זה מאפשר לחוקרים לבחון את דפוס המחזור הכולל ולזהות מתי החיה מציגה התקדמות לא סדירה של שלבי האסטרוס, הידועים בשם acyclicity. לאחר מכן ניתן לנתח את הדגימות לפי אורך המחזור ודפוס התקדמות השלב בכלי ניתוח זה. רעיון זה, המוצג באיור 8A,B, כולל הקצאת פסים בגבהים משתנים, במקרה של מחקר זה, לשלבים הבודדים ותרגום הנתונים המוקלטים (איור 4B) על פני ציר ה-x. בדוגמאות אלה, MET ו- DIE מיוצגים על ידי הנמוך ביותר, PRO על ידי האמצע, ו- EST על ידי גבהי הבר הגבוהים ביותר. בשל משך הזמן הקצר של שלב MET, הוא משולב עם שלב DIE לפס אחד. למרות שישנן שיטות שונות למדידת השלמות מחזור, מקובל לספור מחזור שלם אחד כתנועה מ-EST אחד למשנהו11. עם זאת, זה לא משקף השלמת מחזור אלא משך שלב EST של יומיים כאשר ישנם שלבי EST עוקבים.

איור 8A משקף נתונים מחולדה שמתקדמת בהתקדמות עקבית וחוזרת על עצמה דרך MET/DIE, PRO ו-EST. בנוסף, חולדה זו נפלה בטווח של מחזורים של 4 עד 5 ימים באורך ממוצע של 4.375. כל שלב אינו חורג מטווחי האורך הסטנדרטיים, עם ממוצע של 1.0625 ימים המושקעים ב- EST, הערכה אופיינית לאציקליות. אם הנתונים שחולצו עוקבים אחר דפוס זה של EST עד EST בקביעות, זה מאשר לא רק כי רמות ההורמונים של הנושא נשארו בטווחים מקובלים, אלא גם כי ההליך נערך מבלי להפריע באופן משמעותי את האופי המחזורי של התהליך. לבסוף, חולדה זו השלימה 16 מחזורים, שנקבעו על ידי ספירת מספר הפסים EST עד EST.

איור 8B מייצג סוגים נפוצים של ציקליות, כולל שלבים מורחבים (הנראים כ-EXT) ושל שלבים לא מתועדים. נתון זה גם מדגיש את החשיבות של בחינת דפוס המחזור ואת אורך ומספר הימים המושקעים בכל שלב. באופן ספציפי, בדוגמה זו, בעוד שאורך המחזור הממוצע ומספר הימים ב- EST נופלים בפרמטרים המתוארים, דפוס המחזור של התקדמות השלב חשף חריגות. לכן, חשוב לבחון את מחזור האסטרוס באופן מקיף. שני שלבי DIE המורחבים (שסומנו כ-Ext Diest) ו-EST (שסומנו כ-Ext Est) הוקלטו לאורך המחזורים המוצגים באיור, והיו מספר מחזורים שבהם שלב ה-PRO לא הוקלט. דוגמה זו גם מדגימה את החשיבות של בחינת מספר השלבים העוקבים הנראים, הנמצאים מחוץ לטווחים האופייניים, ולא רק בבחינת האורך הממוצע של המחזור והימים ב- EST, הנמצאים בטווחים אופייניים.

הגורמים והמתאמים של דוגמאות אלה יכולים לכלול גורמים כגון הפרעות פיזיולוגיות (גידולים, פסאודו-אורגנציה, סטרס ממושך), תנאים סביבתיים מזיקים (תאורה ממושכת, חשיפה לכימיקלים רעילים, דיור בודד), תזמון לא תקין של איסוף דגימות, טעות חוקר (איסוף דגימות לקוי, לכידת תמונה, היערכות לא נכונה), תופעות הקשורות לגיל (אי סדירות נפוצה הנראית בגיל ההתבגרות ובסנסנציית הרבייה), או סטיות ייחודיות לספציפית בעל חיים. כדי להפריד בין טעות חוקר או תזמון לא תקין של איסוף דגימות וחריגות פיזיות או תופעות הקשורות לגיל, כדאי לבחון את 4 הרכיבים המסווגים בפירוט רב יותר. זה יכול לסייע בקביעת הגורמים האפשריים לאי סדרים או, במובן רחב יותר, ניתן להשתמש במחקרים החוקרים את מאפייני המחזור האסטרוס מקרוב יותר.

איור 9 ממחיש בדיקה מדוקדקת זו על-ידי הכללת כמויות התאים הכוללות והבודדות על ציר ה-y, סוגי התאים המיוצגים על-ידי צבעי מילוי עמודות שונים, וסידורי תאים המיוצגים על-ידי תבניות מילוי עמודות שונות, המשורטטות לאורך תקופת הניטור הכוללת. שיטת ניתוח זו אפשרה בחינה של המספר הכולל של המחזורים שהושלמו, אורך כל מחזור, התקדמות שלבים ורכיבי הסיווג בפירוט רב יותר עבור כל חולדה בודדת. איור 9A מייצג חולדה שהייתה לה מספר מחזורים נמוך מהממוצע, עם סך של 3 מחזורים מלאים ב-10 הימים המנוטרים - שני מחזורים של 3 ימים ומחזור אחד של 5 ימים (ממוצע של 3.67). אי-הסדרים שנראו בהתקדמות השלב עם 50% מהימים כללו שלב אחד או יותר שלא תועדו ו-30% מהדגימות שנאספו היו במעבר - יום 2 כ-MET-DIE, יום 5 כ-EST-MET ויום 8 כמעבר PRO-DIE. ייתכן שהדבר נבע מעיתוי לא תקין של איסוף דגימות, טעות חוקר, תופעה הקשורה לגיל או סטיות ייחודיות. ניטור נוסף יכול היה לספק בהירות לגבי מה חל.

הסידורים הדומיננטיים האופייניים, סוגי התאים וכמויות התאים האינדיבידואליות והכולות נצפו בכל אחד מהשלבים שתועדו. בשלבי ה-EST נצפו תאי AKE מגושמים (25% מהדגימות), מתונים (25% מהדגימות) ורבים (50% מהדגימות) תאי AKE מגושמים, עם נוכחות נמוכה יותר של תאי LEUs, SNE ו-LNE. בשלב ה-MET היחיד שנלכד, נכח שילוב של מספר רב של תאי LEUs המפוזרים באופן אקראי (50%), תאי AKE (20%), LNE (15%) ו-SNE (15%). עבור שלבי ה-DIE, נצפתה כמות של smidge (50% מהדגימות) וכמות רבה (50% מהדגימות) של פיזור אקראי, פיזור שווה, ושילוב של LEUs דומיננטיים המשולבים עם תאי AKE, LNE ו-SNE. בשלב ה-PRO היחיד שנאסף, נמצאו חבורה של תאי LEUs המפוזרים באופן אקראי (60% מהתאים הנוכחים) ותאי SNE (40% מהתאים הנוכחים), שהיו בשילוב של סידורים, המייצגים מעבר מ-DIE ל-PRO.

באיור 9B, לחולדה המיוצגת היו בסך הכל 3 מחזורים שלמים, עם תבנית מחזור של 4 ימים. הדגימות שנאספו לא ייצגו התקדמות שלב עקבית, עם תקופת DIE ממושכת (ימים 6-9) ו-5 מקרים אחרים של שלבים לא מתועדים (2 שלבי MET לא מוקלטים, 2 שלבי PRO לא מוקלטים ושלב EST אחד לא מוקלט). מכיוון שרק 20% מהדגימות היו במעבר (יום 3 כ-DIE-PRO, יום 5 כ-EST-MET, יום 18 כ-MET-DIE, ויום 19 כ-DIE-PRO), ורק 3 שלבים לא תועדו מחוץ לשלב ה-MET ולתקופת ה-DIE הממושכת, הוסק כי עיתוי איסוף הדגימות מתאים לבעל חיים ספציפי זה. מכיוון שעשרת הימים האחרונים שנבדקו כללו התקדמות מסודרת דרך 4 השלבים, ניתן היה לייחס את אי-הסדרים הראשוניים לגיל המתבגר. משך הניטור המוגבר יותר (20 יום) איפשר למסקנה זו להתרחש.

בדיקת הרכיבים המסווגים גילתה טווחים אופייניים. שלבי ה-EST שיקפו דומיננטיות של כמות מתונה (50% מהדגימות) לכמות רבה (50% מהדגימות) של תאי AKE מגושמים עם פחות תאי LEUs, SNE ו-LNE. בדגימות ה-MET שנאספו, היה שילוב של SNE מתון (33.33% מהדגימות) למספר רב (66.67% מהדגימות) המפוזרות באופן אקראי ומגושמות (עם טווח כמויות של 10-90%), SNE דחוס (0-30%), LNE מפוזר באופן אקראי (0-10%), ותאי AKE דחוסים ומפוזרים באופן אקראי (10-90%). שלבי ה-DIE שיקפו דומיננטיות של כמות מתונה (20%) עד כמות גדולה (80% מהדגימות) של תאי LEUs המפוזרים באופן שווה, מפוזרים באופן אקראי ומגושמים (טווח של 50-100%) בנוכחות שני תאי AKE ו-SNE המפוזרים באופן אקראי. שלבי ה-PRO זוהו על ידי הדומיננטיות של smidge (3.33% מהדגימות) וכמות רבה (66.67% מהדגימות) של תאי SNE מפוזרים באופן אקראי ודחוסים (10-99%) בנוכחות תאי LEUs, AKE ו-LNE.

אפשרות נוספת בעת ניתוח הנתונים שחולצו היא יצירת פרופילי מחזור אסטרוס על-ידי הכללת הרכיבים שתוארו קודם לכן – כמויות התאים הכוללות והבודדות על ציר ה-y, סוגי התאים המיוצגים על-ידי צבעי מילוי עמודות שונים, וסידורי תאים המיוצגים על-ידי תבניות מילוי עמודות שונות, המשורטטות לאורך תקופת הניטור הכוללת עבור כל שלב מחזור. ניתן להשלים זאת לכל חולדה או ממוצעים של הקבוצה כולה. מטרתו של כלי ניתוח זה היא לבחון את סיווג מגמות הרכיבים לפי שלב, המסייע לקהילה המדעית הכוללת באפיון הבחנות הרכיבים המסווגות הספציפיות לסיווג שלב המחזור האסטרוס. באיור 10A1, פרופיל DIE של 10 ימים הפגין דומיננטיות של כמות מתונה (50% מהדגימות) ומספר רב (50% מהדגימות) של יחידות LEUs המפוזרות באופן שווה (ממוצע של 78.25%) לצד פחות תאי SNE, AKE ו-LNE. באיור 10A2, פרופיל ה-diestrus ל-20 יום הפגין דומיננטיות של כמות מתונה (20% מהדגימות) ורבות (80% מהדגימות) של תאי LEUs המפוזרים באופן שווה, דחוסים ומפוזרים באופן אקראי (ממוצע של 82% כפי שנוכח בכל 10 הימים) לצד מספר נמוך יותר של תאי AKE ו-SNE.

שלב ה-PRO שהוצג באיור 10B1 הראה דומיננטיות של מספר מתון של תאי SNE המפוזרים באופן אקראי (60%) בנוכחות תאי LEUs ותאי AKE. פרופיל שלב ה-PRO של 20 יום באיור 10B2 הראה דומיננטיות של כמות של smidge (33.33% מהדגימות) וכמות רבה (66.67% מהדגימות) של שילוב של סידורים ותאי SNE המפוזרים באופן אקראי (ממוצע של 66.33% כפי שנוכח בכל 3 הדגימות) לצד תאי LEUs ו-AKE. פרופיל EST של 10 ימים שנצפה באיור 10C1 הפגין דומיננטיות של כמות מתונה (50% מהדגימות) או כמות גדולה (50% מהדגימות) של תאי AKE (ממוצע של 80% ביומיים הנוכחיים) בשילוב של סידורים, לצד מספר נמוך יותר של תאי LEUs, SNE ו-LNE. באיור 10C2, פרופיל ה-EST בן 20 הימים הפגין דומיננטיות של מספר מתון (75% מהדגימות) או כמות גדולה (15% מהדגימות) של תאי AKE המפוזרים באופן אקראי (ממוצע של 57.5% ב-4 הימים הנוכחיים) או כאלה בשילוב של סידורים, לצד מספר נמוך יותר של תאי LEUs, SNE ו-LNE.

פרופיל שלב ה-MET של 10 ימים באיור 10D1 כלל מספר רב של תאי LEUs המפוזרים באופן אקראי (50%), תאי AKE (20%) ותאי SNE (30%) רבים שהתפזרו באופן אקראי. פרופיל שלב ה-MET בן 20 הימים באיור 10D2 הציג כמות מתונה (3.33% מהדגימות) או כמות גדולה (6.667% מהדגימות) של LEUs (ממוצע של 50% בכל 3 הדגימות), SNE (ממוצע של 15% כנוכח בכל 3 הדגימות), תאי AKE (עם 23.33% ב-3 הדגימות הקיימות), תאי LNE (ממוצע של 15% בכל 2 הדגימות הקיימות). מחצית מה-LEUs היו מפוזרים באופן אקראי (מדגם אחד) ו-50% הנותרים היו שילוב של סידורים (מדגם אחד). שני שלישים מתאי ה-SNE פוזרו באופן אקראי כאשר הם קיימים, בעוד ש-33.33% הנותרים היו בשילוב של סידורים כאשר היו נוכחים (1 מתוך 3 דגימות). לבסוף, 66.67% מתאי ה-AKE רוכזו בדגימות הנוכחיות (יומיים), בעוד ש-33.33% הנותרים היו בשילוב של הסדרים (יום אחד). טבלה 1 כוללת את הממוצעים המספריים של הדטרמיננטות המסווגות משתי הקבוצות. בעוד שהנתונים באיור 9A,B ובאיור 10A-D כוללים מידע על הדטרמיננטות המסווגות מבעלי חיים בודדים, טבלאות אלה כוללות ממוצעים לשלב ה-estrus כדוגמה. כאשר הם משוחזרים במעבדות אחרות, פרמטרים אלה יכולים להפוך לסטנדרט לזיהוי שלבים. זה, בתורו, יכול להפחית את רמת הסובייקטיביות המעורבת כיום בתהליך ההיערכות.

סטטיסטיקה
באופן כללי, ישנם כמה פרמטרים שיש לקחת בחשבון כאשר מפרשים את מאפייני המחזור, אם כי יש חוסר הסכמה על מה שנחשב "חריג", וסטיות אופייניות. גולדמן ואחרים מזהים "רגיל" כמחזור של 4-5 ימים עם 24-48 שעות EST ו-48-72 שעות DIE שלבים11. סטייה מפרמטרים אלה יכולה לנבוע מגורמים שונים, כולל חריגה פיזיולוגית אחת או יותר, תזמון איסוף לא תקין, או הציקליות הראשונית שחוותה לעתים קרובות חולדות מתבגרות ככל שרמות ההורמונים הבשילו. בנוסף להתייעצות עם הווטרינר במעבדה, המאפשרת תקופת איסוף ניסויים כדי להבטיח תזמון נכון, וניטור בעלי חיים מעבר לגיל ההתבגרות כדי לקבוע ציר זמן השוואתי, ניתוחים סטטיסטיים יכולים להיות מועילים לייחס סיבתיות ו/או קורלציה לחריגות כלשהן. לאחר אפיון המחזורים לקטגוריות (למשל, עקביות ולא חריגות), ניתוח צ'י-ריבועי יכול לסייע בהשוואת הקבוצות. בנוסף, ניתן להשוות את הרכיבים המסווגים או את מאפייני המחזור הכלליים לאחר ההתערבות באמצעות ניתוח שונות (ANOVA)11. עם זאת, סטיות כאלה עשויות שלא להיות בעלות משמעות ביולוגית, כפי שנדון במבוא, ולכן יש לקחת בחשבון את ההקשר הניסויי.

Figure 1
איור 1: קצביות ההורמונלית בשלבי מחזור האסטרוס. התקדמות השלב מתחילה ומסתיימת במטסטרו כדי להדגים את רמות הורמון הבניין ואת ההתקדמות המעגלית של התהליך. מותאם ממקור חיצוני11. (B) זרימה של הורמוני סטרואידים מיניים ממערכת העצבים המרכזית למערכת הרבייה דרך זרם הדם. נראה כי רמות ההורמונים מוגברות באמצעות אותות מההיפותלמוס ובלוטת יותרת המוח באמצעות הורמון משחרר גונדוטרופין (GrH או LHRH) והשילוב של הורמון מגרה זקיק והורמון לוטאין, בהתאמה. זה כולל לולאות משוב חיוביות ושליליות בהתאם לריכוז של אסטרדיול ופרוגסטרון. מידע17 ותמונות שאותרו ממקורות חיצוניים 65,66,67. קיצור: LHRH = לוטאין הורמון משחרר הורמונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מחזור אסטרוס המסווג דטרמיננטות שנמדדו. (A) המפורטים כאן הם הרכיבים המשמשים בעת ביצוע דגימות התאים שנאספו והרכיבים הדומיננטיים עבור כל שלב. חשוב לזכור כי מדובר בפרמטרים כלליים וצפויים הבדלים. (B) להלן סוגי התאים הדומיננטיים הקיימים בכל שלב. בעוד שמדובר בחלוקות כלליות, ניתן למצוא כל סוג תא בכל השלבים. (C) המוצגים כאן הם סוגי סידור התאים שנמצאו במחקר זה. (D) התמונה כאן משקפת את כמויות התאים האופייניות הקיימות בכל אחד מארבעת שלבי מחזור האסטרוס, כאשר נפח הרביע מייצג את כמויות התאים המשוערות. מקורו במקור חיצוני13 והותאם בעבר68. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: פתח נרתיקי בחולדות Sprague Dawley. (A) כיוון אנטומי של איברי המין החיצוניים הלא מפותחים ופתח הנרתיק שמובילים לתעלת הנרתיק ביחס לפתח השופכה. (B) ייצוג חזותי של האזור הלא מפותח, המסומן בחץ. (C) אוריינטציה אנטומית של איברי המין החיצוניים המפותחים ופתח הנרתיק ביחס לפתח השופכה, המתרחשת בדרך כלל בסביבות גיל 34 ימים. (D) ייצוג חזותי מקביל של האזור המפותח המתואר בתמונה A. כל הנתונים שמקורם במקור חיצוני29. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: סיווג תבנית הקלטת נתונים של דטרמיננטות. כולל תיאורים של סיווג דטרמיננטות. יש להשתמש בו מדי יום, אחד לכל חולדה במעקב. (B) תבנית זו היא אפשרות להזנת נתונים, עם הקלטה פשוטה יותר של הגורמים המסווגים וזיהוי חולדות. הדבר מאפשר להזין הערות בגליון הנתונים בסיווג PRO השני. הצבע בשורה העליונה משקף את הצבע שהוקצה לקבוצת הניסוי המיוצגת, מה שעוזר להבחין בין קבוצה אחת לאחרת. (ג) אפשרות תבנית אחרת; כולל את כל הגורמים המסווגים וניתן לשנותם על סמך העדפה אישית או מטרות המחקר. קיצורים: AKE = אפיתל קרטיניזציה מחונך; LEU = לויקוציטים; LNE = אפיתל גרעין גדול; SNE = אפיתל גרעין קטן; C = גושים; ED = מפוזר באופן שווה; RD = מפוזר באופן אקראי; COM = משולב; SMD = smidge; MOD = בינוני; NUM = רבים; EXE = תרגיל; SED = בישיבה; Est = estrus; למות = diestrus; met-die = מעבר metestrus-diestrus; Pro = בולט; pro-Est = proestrus-estrus transition; ** = דוגמה איכותית שיכולה להועיל בפרסום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: וריאציות דטרמיננטיות המסווגות את השלב. (A) סדרת תמונות זו מתארת דוגמאות שונות של שלב הדיסטרוס. התמונה הראשונה (A1) מתארת משקע של ריר המיוצג על ידי גדילים של LEUs מרוכזים, כאשר תאי אפיתל נמצאים בתשלומים אקראיים. זוהי דוגמה לחשיבות השימוש הן בהגדלה של פי 4 והן בהגדלה של פי 10. הגדלה זו של 4x נראית דומה לגדיל בולט אך לאחר בדיקה מדוקדקת יותר של פי 10, מציגה דומיננטיות של LEUs. התמונה השנייה (A2) מתארת את מה שנראה לעתים קרובות בשלבי diestrus - דומיננטיות של LEUs שנראתה לצד סידור דחוס של תאי אפיתל: תאי SNE, LNE ו-AKE. התמונה האחרונה בסדרה זו (A3) משקפת חלוקה אקראית של LEUs, הנראית לעתים קרובות בשלב ה-diestrus בעיצומן של טיפות נוזל נרתיקי ומלוח. (B) סדרת תמונות זו מתארת דוגמאות שונות של שלב הבליטה. התמונה הראשונה (B1) מתארת סידור מגושם של תאי SNE לתוך גדילים. התמונה השנייה (B2) משקפת שקופית עם ספירת תאים כוללת נמוכה יותר וגוש של תאי SNE. התמונה השלישית (B3) מתארת את ההתגוששות הנפוצה והתשלום האקראי יותר של תאי SNE ומספר נמוך של תאי LEUs ו-AKE. (C) סדרת תמונות זו מתארת דוגמאות שונות של שלב האסטרוס. התמונה הראשונה (C1) מתארת סידור מגושמים נפוץ של תאי AKE, עם תצורות מוט קרטין, בנוכחות תאי SNE. התמונה השנייה (C2) מציגה את הגוש של תאי AKE עם גרעיני רפאים וחיידקים. התמונה האחרונה (C3) מציגה סידור דמוי גדיל של תאי AKE. (D) סדרת תמונות זו מתארת דוגמאות שונות של שלב המטסטרוס. התמונה הראשונה (D1) מתארת את התשלום וההתגוששות האקראית של תאי LEUs, תאי SNE, תאי AKE ותאי LNE בנוכחות פסולת. התמונה השנייה (D2) משקפת את כל סוגי התאים הנמצאים בסידור גושים, לצד מוטות קרטין. התמונה האחרונה (D3) מציגה סידור מקיף יותר של תאי LEUs, SNE, AKE ו-LNE הקיימים. נתונים אלה, שצולמו באובייקטיביזציה של 4x (A1, A2, B2, B3, D1 ו-D3) או 10x (A3, C1, C2, C3 ו-D2), הוגדלו כדי לאפשר הדמיה מוגברת של רכיבי הסיווג. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. להתייחסות לגודל; לתאי AKE יש קוטר של כ-40-52 מיקרומטר, תאי LEUs של כ-10 מיקרומטר, תאי LNE של 36-40 מיקרומטר ותאי SNE של כ-25-32 מיקרומטר16. קיצורים: SNE = אפיתל גרעין קטן; LNE = אפיתל גרעין גדול; AKE = אפיתל קרטיניזציה מחורץ; LEUs = לויקוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: דוגמאות שלב המעבר.(A) סדרת תמונות זו מתארת דוגמאות למעבר בין שלבי DIE ו-PRO. התמונה הראשונה (A1) מציגה גושים גדולים וחלוקה אקראית של תאי LEUs, SNE, LNE ו-AKE. התמונה השנייה (A2) כוללת מסה גדולה של LEUs ו-SNE דחוסים עם גדילים משולבים של LEUs. התמונה השלישית (A3) כוללת גושים ואפילו תשלומים של LEUs וכמות קטנה של SNEs. התמונה הרביעית והאחרונה (A4) מתארת הן תאי SNE מגולפים והן תאי SNE מפורקים אקראיים ו- LEUs. (B) תמונה זו מתארת דוגמה למעבר בין שלבי PRO ו- EST עם התגוששות של תאי SNE ו- AKE. (C) תמונה זו מתארת את ההתגוששות וההשלמה האקראית של תאי AKE, SNE ו-LNE שנראו בעיצומם של פסולת כדי לייצג את המעבר מ-EST ל-MET. (D) התמונה הראשונה (D1) מתארת דוגמה למעבר בין שלבי MET ו-DIE, כאשר תאי אפיתל מתפוררים מלווים בעלייה ב-LEUs. התמונה השנייה (D2) מתארת תאי AKE בנוכחות תאי LEUs ו-SNE מגושמים שתוארו קודם לכן. נתונים אלה, שצולמו בהגדלה של 4x (A1, A2, A3, B ו-C) או 10x (A4, D1 ו-D2), הוגדלו כדי לאפשר הדמיה מוגברת של רכיבי הסיווג. סרגלי קנה מידה = 100 מ '. לייחוס גודל, לתאי AKE יש קוטר של כ-40-52 מיקרומטר, LEUs של כ-10 מיקרומטר, תאי LNE של 36-40 מיקרומטר ותאי SNE של כ-25-32 מיקרומטר16. קיצורים: AKE = אפיתל קרטיניזציה מחונך; LEUs = לויקוציטים; LNE = אפיתל גרעין גדול; SNE = אפיתל גרעין קטן; C = גושים; EST = estrus; DIE = diestrus; PRO = בולט; MET = metestrus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: אוספי דגימות תאים שליליים. (A) בשתי התמונות הללו, תאי קשקש נשאבו מדופן התעלה הנרתיקית, בנוסף ל-LEUs שהתפזרו באופן אקראי. (B) תמונה זו כוללת כמות נמוכה של פסולת, שבה תאים לא נראו או לא נאספו. (C) בדוגמה זו נצפתה ספירת תאים נמוכה כוללת. (D) בשתי התמונות הללו (D1 ו-D2), תמיסת מיצוי הנתרן כלורי (NaCl) ונוזל הנרתיק נראו והתפשטו ברחבי שקופיות המיקרוסקופ. נתונים אלה, שצולמו בהגדלה של 4x (A1, A2 ו-D1) או 10x (B, C ו-D2), הוגדלו כדי לאפשר הדמיה מוגברת של רכיבי הסיווג. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לייחוס גודל, לתאי AKE יש קוטר של כ-40-52 מיקרומטר, LEUs של כ-10 מיקרומטר, תאי LNE של 36-40 מיקרומטר ותאי SNE של כ-25-32 מיקרומטר16. קיצורים: AKE = אפיתל קרטיניזציה מחונך; LEUs = לויקוציטים; LNE = אפיתל גרעין גדול; SNE = אפיתל גרעין קטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: מדגם תבנית מחזור קבועה ולא סדירה. (A) תמונה זו משקפת בסך הכל 16 מחזורים שלמים שמתקדמים בתבנית שחוזרת על עצמה ועקבית, ומשקפת את התנודה הרגילה של הורמוני סטרואידים מיניים. בתוך זה, diestrus מיוצג על ידי הנמוך ביותר, בולט על ידי האמצע, ו estrus מיוצג על ידי המוט בגובה הגבוה ביותר. נתונים אלה מנותחים על ידי מעקב אחר הימים שבין שלבי האסטרוס, כאשר כל estrus-to-estrus מייצג מחזור אחד מלא. נתונים אלה משקפים נתונים של נקבות החולדות ששוכנו באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס. (B) תמונה זו מייצגת שילוב תיאורטי של דפוסים א-מחזוריים שונים של 22 חולדות. ניתן לראות אסטרוסים מורחבים עם מספר ימים חוזרים ונשנים של פסים בגובה מלא, דיסטרוסים מורחבים הנראים עם מספר ימים חוזרים על עצמם בגובה המוט הנמוך ביותר, והיעדר התבנית המחזורית של התקדמות מדיסטרוס דרך מטסטרו. קיצורים: Est = estrus; Diest/Die = diestrus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: דטרמיננטות סיווג בודדות. (A) גרף עמודות מוערם זה משקף כל רכיב של הכלים המשמשים לסיווג דגימות בודדות שנאספו לשלבי הדגימה האסטרוזיים. כאן, נושא שהיה במעקב במשך 10 ימים מראה מגוון של סוגי תאים, כמויות וסידורים. זה צפוי עבור בעלי חיים מתבגרים, שכן רמות הורמונליות בדרך כלל אינן הופכות עקביות או מסתדרות עד לבגרות. (ב) כאן מוצג פרופיל אסטרוס עבור בעל חיים שהיה במעקב במשך 20 יום. אי סדרים דומים ניתן לראות כאן, כאשר הנושא נשאר ב diestrus במשך 4 ימים לעומת טיפוסי 1-2. נתונים אלה מייצגים את 6 נקבות החולדות ששוכנו באוניברסיטת פפרדין. קיצורים: AKE = אפיתל קרטיניזציה מחונך; LEU = לויקוציטים; LNE = אפיתל גרעין גדול; SNE = אפיתל גרעין קטן; C = גושים; ED = מפוזר באופן שווה; RD = מפוזר באופן אקראי; COM = משולב; SMD = smidge; MOD = בינוני; NUM = רבים; EXE = תרגיל ; SED = בישיבה; Est = estrus; למות = diestrus; Pro = בולט; Met = metestrus.

Figure 10
איור 10: פרופילי שלבים. (A) חלק זה מתאר את הנתונים הקובעים המסווגים עבור חולדות בודדות במהלך כל יום המסווגים כ-diestrus. התמונה הראשונה (A1) מייצגת נתונים שנאספו במשך 10 ימים והשנייה (A2) במשך 20 יום. (B) סעיף זה מתאר נתונים על חולדות בודדות במהלך כל יום המסווגים כבליטות. התמונה הראשונה (B1) מייצגת נתונים שנאספו במשך 10 ימים והשנייה (B2) במשך 20 יום. (C) זה מתאר נתונים על חולדות בודדות במהלך כל יום שזוהה כשלב estrus. התמונה הראשונה (C1) מייצגת נתונים שנאספו במשך 10 ימים והשנייה (C2) במשך 20 יום. (ד) חלק זה של הסדרה מתאר את נתוני הרכיבים המסווגים עבור חולדות בודדות במהלך כל יום שזוהה כשלב מטסטרו. התמונה הראשונה (D1) מייצגת נתונים שנאספו במשך תקופה של 10 ימים והשנייה (D2) במשך 20 יום. הנתונים בנתונים אלה משקפים את זה של 6 חולדות נקבות ששוכנו באוניברסיטת פפרדין. קיצורים: AKE = אפיתל קרטיניזציה מחונך; LEU = לויקוציטים; LNE = אפיתל גרעין גדול; SNE = אפיתל גרעין קטן; C = גושים; ED = מפוזר באופן שווה; RD = מפוזר באופן אקראי; COM = משולב; SMD = smidge; MOD = בינוני; NUM = רבים; EXE = תרגיל ; SED = בישיבה; Est = estrus; למות = diestrus; Pro = בולט; Met = metestrus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

EST: 10 ימים משך (ימים) AKE(%) LEU (%) LNE (%) SNE (%) ספירת תאים כוללת (%)
3 88 2.78 1.89 7.33 MOD: 44.44 NUM: 44.44 SMD: 11.11
טווחים 2–4 70–100 0–10 0–17 0–20 Smidge–רבים
סידור ג: 50
ED: 0
RD: 50		 ג: 0
ED: 0
RD: 100		 ג: 0
ED: 0
RD: 100		 ג: 50
ED: 0
RD: 50
EST: 20 יום משך (ימים) AKE(%) LEU (%) LNE (%) SNE (%) ספירת תאים כוללת (%)
4 71.92 5.5 2.92 19.67 MOD: 50 NUM: 50 SMD: 0
טווחים 4–4 10–100 0–20 0–20 0–80 Smidge–רבים
סידור ג: 60
ED: 6.67
RD: 33.33		 ג: 0
ED: 12.5
RD: 87.5		 ג: 33.33
ED: 0
RD: 66.67		 ג: 44.44
ED: 0
RD: 55.56

טבלה 1: מדגם דטרמיננטות שלב ממוצע. טבלאות אלה מתארות את הממוצעים עבור הגורמים המסווגים ואת הסקירה הכללית של כל שלבי ה- EST שנאספו. הטבלה העליונה משקפת את הממוצעים עבור כל בעלי החיים המנוטרים במשך 10 ימים ואת הטבלה התחתונה במשך 20 יום. זה כולל את משך מחזור האסטרוס, את סוגי התאים והאחוזים, ואת סידורי התאים ואת האחוזים של כל סידור שנראה עבור כל סוג תא. נתונים אלה משקפים נתונים של 6 חולדות נקבות ששוכנו באוניברסיטת פפרדין. קיצורים: AKE = אפיתל קרטיניזציה מחונך; LEU = לויקוציטים; LNE = אפיתל גרעין גדול; SNE = אפיתל גרעין קטן; C = גושים; ED = מפוזר באופן שווה; RD = מפוזר באופן אקראי; EST = estrus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעדים מרכזיים ושיקולים חשובים
שלבים קריטיים מסוימים בפרוטוקול המסופק דורשים דגש, במיוחד באוסף תאי הנרתיק. במהלך מיצוי נוזל הנרתיק, הבטחת הזווית והעומק הנכונים של החדרת המזרק היא המפתח להפקת תוצאות משביעות רצון ובסופו של דבר למניעת גירוי, פציעה או גירוי צוואר הרחם לבעל החיים. הגירוי של צוואר הרחם יכול להיות מקור אחד של אינדוקציה pseudopregnancy, המצוין על ידי 12-14 ימים של כתם נרתיקי של לויקוציטים בלבד11. במהלך שלב הערכת המיקרוסקופ, חיוני להתמקד במישור החזותי המציג את תאי הנרתיק שנאספו. זה הושלם על ידי זיהוי תא אחד או שניים והתאמת ההדמיה עד להשגת המיקוד.

לאחר מכן, לכידת תמונות מייצגות של תאי הנרתיק לצורך בימוי מתרחשת על ידי סריקת כל שקופית המיקרוסקופ. זה מבטיח שהתמונות שצולמו משקפות תיאור מדויק של מה שנאסף ונוכח בתעלת הנרתיק של בעלי החיים. לפני הסיווג, יש צורך בהיכרות עם הדטרמיננטות המסווגות, כגון הבחנה בין סוגי התאים לבין הטרנספורמציות השונות שכל סוג תא יכול להכיל. מומלץ שכל משתתף יוכשר כראוי ויתרגל זיהוי שלבים באמצעות שקופיות תרגול מוכנות מראש.

כדי להפחית את כמות ההטיה והסובייקטיביות הכרוכה בתהליך, מומלץ לכלול שני משתתפים בשלב הסיווג, שניהם נשארים עיוורים למשימות קבוצת הטיפול תוך ידיעה על זיהויי שלבים שנרשמו בעבר עבור כל בעל חיים. הקצאת שני משתתפים לסיווג דגימות מאפשרת כנס וירידה בסובייקטיביות בזיהויים. עם זאת, אם המשתתפים רוצים לסווג דגימות בנפרד, מומלץ שתהיה תקופת שיתוף פעולה ראשונית להגברת האמינות הבין-מדרגית עם פיתוח המומחיות. ניתן להשתמש במערכת בדיקות משניות כדי למנוע ממצאים לא עקביים, כגון החלפת מערכי נתונים לאחר הסיווג ושימוש בתמונות כדי לאשר את ההערכות הראשוניות.

מגבלות ושינויים
מגבלות הטכניקה הנוכחית כוללות את משך הכדאיות. בשל הפציעה או הגירוי שעלולים להתלוות להחדרה חוזרת ונשנית של מזרק, ניטור ממושך וחוזר ונשנה אינו מתיישב עם טיפול ושימוש נאותים בבעלי חיים. לכן, בעת ביצוע מחקר אורך, ייתכן שיהיה צורך לשנות את ההליך על ידי הפחתת התדירות של שטיפה. לדוגמה, במקום לנטר כל חיה פעם ביום, ניתן לחלק את החולדות לקבוצות המנוטרות בימים שונים במהלך השבוע. מגבלה שנייה כרוכה בהיעדר צביעת דגימה בתהליך המתואר, ללא הפרדת רכיבים תאיים לפי צבע, מה שיוצר הסתמכות רבה יותר על קובעי הסיווג המפורטים בפרוטוקול לעיל.

בנוסף, בתוך דטרמיננטות סיווג כאלה, ישנם אלמנטים של סובייקטיביות שיכולים להגביל שכפול מדויק. באופן ספציפי, אחוזי כמות התאים בדגימות שנאספו מבוססים על הערכות אישיות. שינויים בהקשר זה עשויים לכלול פיתוח אלגוריתם מתמטי לכימות סוגי התאים הבודדים הקיימים. שינויים חלופיים יכולים לכלול את מספר הדגימות שהופקדו על שקופית מיקרוסקופ אחת, שניתן להגדיל בהתאם לגודל המגלשה והכיסוי. מגבלות נוספות עשויות לכלול את המחסור בנתוני נוזלים נרתיקיים במחקר זה – שינוי של מחקרים עתידיים עשוי לכלול רישום התנאים של הנוזל הנרתיקי שנאסף כתרומה לסיווג שלבים. שינויים נוספים בפרוטוקול עשויים לכלול שימוש בנוזל איזוטוני אחר למיצוי תאים, מה שיניב את אותן תוצאות, כגון מי מלח13 עם אגירת פוספט. לבסוף, בעת החלת הליך זה על חולדות בגילאים או זנים שונים, ייתכן שיידרשו שינויים כגון טכניקות לטיפול בבעלי חיים בשל גודל הגוף או רמת הפעילות. זה יכול לכלול את שיטת האחיזה69 ואת שיטות Forelimb Crisscross64 למבוגרים ואת שיטת האיפוק ביד אחת ושתיים64 המשמשת חולדות צעירות יותר.

שיטות חלופיות
בהשוואה לשיטות חלופיות של ניטור מחזור אסטרוס, שטיפת הנרתיק ייחודית בדיוק שלה, בכמות המידע המיוצרת, בפולשנות מינימלית ובעלויות הנלוות הנמוכות. ניתן להשתמש בבדיקה ההיסטולוגית של הרחם והשחלות כדי לזהות שלבי מחזור, אך היא פולשנית יותר ואינה מאפשרת ניטור רציף. בעוד שמדידת רמות הורמון הסטרואידים המין מסייעת בניטור מחזור האסטרוס, היא דורשת איסוף דם ואינה מאפשרת אפיון של פרופיל הנוזלים התאיים או הנרתיקיים הייחודי של כל נבדק. מכיוון שהתפתחות איברי המין החיצוניים מתואמת בעקיפין עם רמות הורמון הסטרואידים במין, בדיקת פתח הנרתיק יכולה לספק מידע על הבשלה מינית. בנוסף, צביעת הרקמה, רמת הלחות, הגודל והנפיחות של פתח הנרתיק נמצאה בקורלציה עם שלב מחזור האסטרוס70. עם זאת, הפיזיולוגיה המדויקת שהובילה לפתיחת תעלת הנרתיק בחולדות טרם דווחה במלואה. פרסומים אחרונים מצאו כי זהו רק סמן עקיף של התפתחות הרבייה ולא תמיד מתיישב עם pubescence31,34. הניתוח הביוכימי של דגימות שתן הוא חסכוני ומתנהל בקלות, אך אינו מאפשר את הספציפיות והאמינות של שיטות אחרות71. לכן, זה לא אמין או תקף כמו בחינת התאים הקיימים בתעלת הנרתיק.

בנוסף, מדידת העכבה החשמלית נוצלה לניטור מחזור האסטרוס והיא פחות מגרה פיזית מאשר שטיפת הנוזל. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת מידע רב כל כך על הרכיבים המסווגים. מכשיר זה תוכנן במיוחד כדי לייעל את התזמון של הזדווגות מכוונת, תוך מדידת מתי רמות הורמון הסטרואידים במין הן הגבוהות ביותר 72,73,74. בנוסף, דווח כי שיטה זו יעילה להבחנה בין EST ל- nonEST אך מוגבלת ביכולתה לנטר את מחזור האסטרוס מחוץ ל-75 זה. בסך הכל, שיטה זו דווחה כלא אמינה, לא תמיד חסכונית, ואינה מנוצלת לעתים קרובות בספרות המובילה להיעדר נתונים דומים74. בעוד ספוגית הנרתיק דומה ביותר לשטיפה במידע שהיא מספקת, היא כוללת סיכון מוגבר לגירוי או לפציעה מכיוון שהיא דורשת מגע ישירות עם רירית תעלת הנרתיק כדי לאחזר תאים. לבסוף, בעוד שצביעת שקופיות המיקרוסקופ עשויה לספק ניגודיות חדה יותר בין סוגי התאים ולאפשר שימור דגימות, זהו מאמץ גוזל זמן ויקר יותר מאשר הר הרטוב53. באופן כללי, לכל טכניקת ניטור יש את המגבלות והיתרונות שלה, וזה יכול להיות מועיל להשתמש בשילוב של שיטות אלה כדי לקבל בדיקה מקיפה של מחזור אסטרוס מכרסם.

יישומים
עדיין חשוב לראות את המחקר הנוכחי בהקשר של הקהילה המדעית הרחבה יותר והציבור הרחב. ניתן להשתמש במתודולוגיה זו בכל פרויקט הכולל בחינת נקבות של בעלי חיים – לא רק במסגרת מחקרים המתמקדים ברבייה מכוונת, כדי להדיר בעלי חיים הסובלים מחריגות, ו/או את תפקודו של הציר ההיפותלמי-יותרת המוח-שחלות, אלא גם עבור תובנות עיקריות בתוך קבוצות טיפול. באופן ספציפי יותר, הליך זה הוא בעל השפעה בתוך i) מחקרים פרמקולוגיים, כמו תרופות וכימיקלים שונים לשבש או לשנות את מערכת הרבייה ואת מחזור estrous 11,27,76; ב) מחקרים נוירולוגיים, כגון אלה המתמקדים בפגיעות מוח טראומטיות, קוגניציה או הפרעות ניווניות, עקב אינטראקציות בין הורמוני סטרואידים מיניים לבין מערכת העצבים77; 3) מחקר מערכת הדם עקב קולטני הורמון סטרואידים מין הממוקמים על מיוציטים והאינטראקציות הבאות77; 4) מחקר הקשור לצמיחת עצם38; למערכת האנדוקרינית11,78; ו-ה) מחקרים לא-רבייתיים אחרים3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נערך באמצעות שיתוף פעולה במימון NIH בין המרכז לחקר פגיעות מוחיות באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (BIRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera AmScope Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5 https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV&
keywords=usb+camera+for+microscope&
qid=1572477663&s=industrial
&sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel Fischer Scientific 14-815-526 https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8 NEWCO 93009 https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass Fischer Scientific 12-553-7A https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses Fischer Scientific 12-553-464 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply Fischer Scientific 06-666 https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001  NEWCO Specialty and LabDiet 5012 https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm Grainger 36UX10 https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_
LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7
zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4
cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696
!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id=
CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW
1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ
Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo
Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc=
PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9% Live Action Safety ABB079830939 https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies BH Supplies ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821 https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7&
keywords=1ml+sterile+syringe&qid=
1572478649&s=industrial
&sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa=
ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy
PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm
VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ
yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy
eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM
0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h
bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja
1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2
xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen Allentown LV40326013 https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad Medline EAN: 0480196288558
 Global Trade Identification Number: 40080196288558		 https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853&
sr=8-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell and Tissue Research. 354 (1), 99-106 (2013).
  2. Camacho-Arroyo, I., Montor, J. M. Beyond reproductive effects of sex steroids. MiniReviews in Medicinal Chemistry. 12 (11), 1037-1039 (2012).
  3. Shah, S. I. A. Systemic non-reproductive effects of sex steroids in adult males and females. Human Physiology. 44, 83-87 (2018).
  4. Wierman, M. E. Sex steroid effects at target tissues: mechanisms of action. Advances in Physiology Education. 31 (1), 26-33 (2007).
  5. An, G., et al. Pathophysiological changes in female rats with estrous cycle disorder induced by long-term heat stress. BioMed Research International. 2020, 4701563 (2020).
  6. Donato, J., et al. The ventral premammillary nucleus links fasting-induced changes in leptin levels and coordinated luteinizing hormone secretion. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5240-5250 (2009).
  7. Fortress, A. M., Avcu, P., Wagner, A. K., Dixon, C. E., Pang, K. Experimental traumatic brain injury results in estrous cycle disruption, neurobehavioral deficits, and impaired GSK3β/β-catenin signaling in female rats. Experimental Neurology. 315, 42-51 (2019).
  8. Hatsuta, M., et al. Effects of hypothyroidism on the estrous cycle and reproductive hormones in mature female rats. European Journal of Pharmacology. 486 (3), 343-348 (2004).
  9. Jaini, R., Altuntas, C. Z., Loya, M. G., Tuohy, V. K. Disruption of estrous cycle homeostasis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 279, 71-74 (2015).
  10. Tropp, J., Markus, E. J. Effects of mild food deprivation on the estrous cycle of rats. Physiology and Behavior. 73 (4), 553-559 (2001).
  11. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Research. Part B, Developmental and Reproductive Toxicology. 80 (2), 84-97 (2007).
  12. Thung, P. J., Boot, L. M., Muhlbock, O. Senile changes in the oestrous cycle and in ovarian structure in some inbred strains of mice. Acta Endocrinologica. 23 (1), 8-32 (1956).
  13. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  14. Bosch, L. Biochemical and endocrinological studies of normal and neoplastic tissue: The metabolism of estrogen-producing ovarian tumors and other malignancies in the mouse. , Available from: https://www.translatetheweb.com/?from=nl&to=en&ref=SERP&dl=en&rr=UC&a=https%3a%2f%2frepository.tudelft.nl%2fislandora%2fobject%2fuuid%253A8776d58a-6695-4a38-99ca-0abf607480f0 109-111 (2021).
  15. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta Physiologica Pharmacologica Neerlandica. 4 (3), 442-444 (1955).
  16. Paccola, C., Resende, C., Stumpp, T., Miraglia, S., Cipriano, I. The rat estrous cycle revisited: a quantitative and qualitative analysis. Animal Reproduction. 10 (4), 677-683 (2013).
  17. Knobil, E., Neill, J. D. Puberty in the rat. The Physiology of Reproduction. , Raven Press Ltd. New York. 363-409 (1994).
  18. Schallmayer, S., Hughes, B. M. Impact of oral contraception and neuroticism on cardiovascular stress reactivity across the menstrual cycle. Psychology, Health & Medicine. 15 (1), 105-115 (2010).
  19. Barreto-Cordero, L. M., et al. Cyclic changes and actions of progesterone andallopregnanolone on cognition and hippocampal basal (stratum oriens) dendritic spinesof female rats. Behavioural Brain Research. 379, 112355 (2020).
  20. de Zambotti, M., Trinder, J., Colrain, I. M., Baker, F. C. Menstrual cycle-related variation in autonomic nervous system functioning in women in the early menopausal transition with and without insomnia disorder. Psychoneuroendocrinology. 75, 44-51 (2017).
  21. Maghool, F., Khaksari, M., Khachki, A. S. Differences in brain edema and intracranial pressure following traumatic brain injury across the estrous cycle: Involvement of female sex steroid hormones. Brain Research. 1497, 61-72 (2013).
  22. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex as a biological variable: Who, what, when, why, and how. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 386-396 (2017).
  23. Becker, J. B., Prendergast, B. J., Liang, J. W. Female rats are not more variable than male rats: a meta-analysis of neuroscience studies. Biology of Sex Differences. 7, 34 (2016).
  24. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  25. Joel, D., McCarthy, M. M. Incorporating sex as a biological variable in neuropsychiatric research: where are we now and where should we be. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 379-385 (2017).
  26. Long, J. A., Evans, H. M. The oestrous cycle in the rat and its associated phenomena. Memoirs of the University of California. 6, 1 (1922).
  27. Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: A practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
  28. Lenschow, C., Sigl-Glöckner, J., Brecht, M. Development of rat female genital cortex and control of female puberty by sexual touch. PLoS Biology. 15 (9), 2001283 (2017).
  29. Lewis, E. M., Barnett, J. F., Freshwater, L., Hoberman, A. M., Christian, M. S. Sexual maturation data for Crl Sprague-Dawley rats: Criteria and confounding factors. Drug and Chemistry Toxicology. 25 (4), 437-458 (2002).
  30. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 24 (4), 417-463 (2000).
  31. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: the puberty ovarian maturation score (pub-score). Scientific Reports. 7, 46381 (2017).
  32. da Silva Faria, T., da Fonte Ramos, C., Sampaio, F. J. Puberty onset in the female offspring of rats submitted to protein or energy restricted diet during lactation. Journal of Nutritional Biochemistry. 15 (2), 123-127 (2004).
  33. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. 48 (1), 1 (2009).
  34. Engelbregt, M. J., et al. Delayed first cycle in intrauterine growth-retarded and postnatally undernourished female rats: follicular growth and ovulation after stimulation with pregnant mare serum gonadotropin at first cycle. Journal of Endocrinology. 173 (2), 297-304 (2002).
  35. Pescovitz, O. H., Walvoord, E. C. When puberty is precocious: Scientific and clinical aspects. , Humana Press. (2007).
  36. USEPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. Standard Evaluation Procedure Test Guidelines 890.1450: Pubertal development and thyroid function in intact juvenile/peripubertal female rats assay. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/final_890.1450_female_pubertal_assay_sep_8.24.11.pdf (2011).
  37. Kennedy, G. G., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. Journal of Physiology. 166 (2), 408-418 (1963).
  38. Sengupta, S., Arshad, M., Sharma, S., Dubey, M., Singh, M. M. Attainment of peak bone mass and bone turnover rate in relation to estrous cycle, pregnancy and lactation in colony-bred Sprague-Dawley rats: Suitability for studies on pathophysiology of bone and therapeutic measures for its management. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 94 (5), 421-429 (2005).
  39. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
  40. Koff, E., Rierdan, J., Stubbs, M. L. Conceptions and misconceptions of the menstrual cycle. Women & Health. 16 (3-4), 119-136 (1990).
  41. Sahay, N. Myths and misconceptions about menstruation: A study of adolescent school girls of Delhi. Journal of Women's Health and Development. 3 (3), 154-169 (2020).
  42. Criado-Perez, C. The deadly truth about a world built for men - from stab vests to car crashes. , Available from: https://www.theguardian.com/lifeandstyle/2019/feb/23/truth-world-built-for-men-car-crashes (2019).
  43. Chrisler, J. C. The menstrual cycle in a biopsychosocial context. Women's Psychology. Psychology of Women: A Handbook of Issues and Theories. Denmark, F. L., Paludi, M. A. , Praeger Publishers/Greenwood Publishing Group. 193-232 (2008).
  44. Rea, H. H. Re-cycling the menstrual cycle: A multidisciplinary reinterpretation of menstruation. , Available from: https://scholarworks.wmich.edu/masters_theses/3942 (1998).
  45. Sato, J., Nasu, M., Tsuchitani, M. Comparative histopathology of the estrous or menstrual cycle in laboratory animals. Journal of Toxicologic Pathology. 29 (3), 155-162 (2016).
  46. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
  47. Smith, J. R., et al. The year of the rat: The Rat Genome Database at 20: a multi-species knowledgebase and analysis platform. Nucleic Acids Research. 48 (1), 731-742 (2020).
  48. Capdevila, S., Giral, M., Ruiz de la Torre, J. L., Russell, R. J., Kramer, K. Acclimatization of rats after ground transportation to a new animal facility. Laboratory Animals. 41 (2), 255-261 (2007).
  49. Conour, L., Murray, K., Brown, M. Preparation of animals for research-issues to consider for rodents and rabbits. ILAR journal. 47 (4), 283-293 (2006).
  50. National Academies Press (US) Committee on Guidelines for the Humane Transportation of Laboratory Animals. Guidelines for the Humane Transportation of Research Animals. National Academies Press. , (2006).
  51. Obernier, J., Baldwin, R. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR Journal. 47 (4), 364-369 (2006).
  52. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. US) . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. , National Academies Press. US. (2011).
  53. Pantier, L. K., Li, J., Christian, C. A. Estrous cycle monitoring in mice with rapid data visualization and analysis. Bio-protocol. 9 (17), 1-17 (2019).
  54. Cohen, I., Mann, D. Seasonal changes associated with puberty in female rats: effect of photoperiod and ACTH administration. Biology of Reproduction. 20 (4), 757-776 (1979).
  55. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J Mice: I. cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
  56. Pennycuik, P. R. Seasonal changes in reproductive productivity, growth rate, and food intake in mice exposed to different regimens of day length and environmental temperature. Australian Journal of Biological Sciences. 25 (3), 627-635 (1972).
  57. Piacsek, B. E., Hautzinger, G. M. Effects of duration, intensity and spectrum of light exposure on sexual maturation time of female rats. Biology of Reproduction. 10 (3), 380-387 (1974).
  58. Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of the estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
  59. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  60. Campbell, C., Schwartz, N. The impact of constant light on the estrous cycle of the rat. Endocrinology. 106 (4), 1230-1238 (1980).
  61. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Osterburg, H. H., Finch, C. E. Altered profiles of estradiol and progesterone associated with prolonged estrous cycles and persistent vaginal cornification in aging C578L/6J mice. Biology of Reproduction. 24 (4), 784-794 (1981).
  62. Rivest, R. W. Sexual maturation in female rats: Hereditary, developmental and environmental aspects. Experientia. 47 (10), 1026-1038 (1991).
  63. Charles River Laboratories. CD® (Sprague Dawley) IGS Rat. Charles River Laboratories. , Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-sd-igs-rat?region=3611 (2021).
  64. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. JoVE. , (2020).
  65. Circulatory System. Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_circulatory.html (2021).
  66. Urogenital System. n.d.). Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_urogenital.html (2021).
  67. Kiernan, J. A. Anatomical foundations of neuroscience: Mini-atlas of rat's brain. Anatomy and Cell Biology 9535b. , University of Western Ontario. Available from: https://instruct.uwo.ca/anatomy/530/535downs.htm (2008).
  68. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7 (4), 1-5 (2012).
  69. Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
  70. Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
  71. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6 (5), (2020).
  72. Bartos, L. Vaginal impedance measurement used for mating in the rat. Laboratory Animals. 11 (1), 53-55 (1977).
  73. Belozertseva, I. V., Merkulov, D. D., Vilitis, O. E., Skryabin, B. V. Instrumental method for determining the stages of the estrous cycle in small laboratory rodents. Laboratory Animals for Scientific Research. (4), (2018).
  74. Ramos, S. D., Lee, J. M., Peuler, J. D. An inexpensive meter to measure differences in electrical resistance in the rat vagina during the ovarian cycle. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 667-670 (2001).
  75. Singletary, S. J., et al. Lack of correlation of vaginal impedance measurements with hormone levels in the rat. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (6), 37-42 (2005).
  76. Bretveld, R. W., Thomas, C. M., Scheepers, P. T., et al. Pesticide exposure: the hormonal function of the female reproductive system disrupted. Reproductive Biology Endocrinology. 4 (30), (2006).
  77. MacDonald, J. K., Pyle, W. G., Reitz, C. J., Howlett, S. E. Cardiac contraction, calcium transients, and myofilament calcium sensitivity fluctuate with the estrous cycle in young adult female mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 306 (7), 938-953 (2014).
  78. Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 174 נקבה מתבגרת ספראג דאולי חולדה הורמוני סטרואידים מיניים מחזור אסטרוס שטיפה בנרתיק
ניטור מחזור אסטרוס מכרסמים תוך שימוש בשטיפה נרתיקית: אין דבר כזה מחזור רגיל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robert, H., Ferguson, L., Reins, O., … More

Robert, H., Ferguson, L., Reins, O., Greco, T., Prins, M. L., Folkerts, M. Rodent Estrous Cycle Monitoring Utilizing Vaginal Lavage: No Such Thing As a Normal Cycle. J. Vis. Exp. (174), e62884, doi:10.3791/62884 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter